Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Экспериментальное изучение остеопластических свойств новых гелиевых композиций на основе гиалуроновой кислоты для замещения дефектов челюстной кости

На правах рукописи

Сарычев Валерий Викторович

УДК 616.311.2-002-087.311

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ ГЕЛИЕВЫХ КОМПОЗИЦИЙ НА ОСНОВЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ ЧЕЛЮСТНОЙ КОСТИ

14.00. 21 - «Стоматология» 14. 00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ УЧРЕЖДЕНИИ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МЗ РФ

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, Лауреат государственной премии РФ по науке и технике, доктор медицинских наук, профессор Александр Ильич Воложин доктор медицинских наук Дробышев Алексей Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Топольницкий Орест Зиновьевич, доктор биологических наук, профессор Вальцева Инга Алексеевна

Ведущая организация:

Защита состоит)

Центральный научно - исследовательский институт стоматологшьЛ13 СР РФ

« ИЯ1

институт

.2005 г., в

часов на заседании

диссертационного совета К 208.041.02 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» МЗ РФ по адресу: 127 493 Москва, ул. Делегатская, 20/1

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке университета по адресу: Москва, ул. Вучетича, Д.Юа. у О л/Ъ, Автореферат разослан « ' » 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

Кандидат медицинских наук О.П.Дашкова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Актуальной проблемой современной медицины и, в том числе, стоматологии является разработка остеопластических материалов, обладающих способностью инициировать построение костной ткани. Эти материалы должны быть полностью лишены токсических свойств, не вызывать сенсибилизации организма, резорбироваться с замещением полноценной костной тканью и легко стерилизоваться. Важным качеством остеопластического материала является удобство применения в клинических условиях и невысокая стоимость. К настоящему времени разработан ряд остеопластических материалов (А.И.Воложин и соавт., 1998 - 2003; С.Г. Курдюмов и соавт., B.C. Агапов и соавт., 2000 - 2002; А.Ю.Дробышев, 2002). В основном - это композиты, состоящие из минерального компонента (синтетических или природных) и коллагена или искусственных полимеров, обладающих и другими свойствами: ранозаживляющими, бактерицидными и т.д., в зависимости от их химической природы и добавок. Остеопластическис материалы широко используются в стоматологии, и особенно при лечении заболеваний пародонта (Г.М.Барер и соавт., 1999,2002; О.О. Янушевич, 2001).

Одним из недостатков этих препаратов является их многокомпонентное! ь. Кроме того, выпускаемые формы препаратов в виде порошка, гранул, полосок и пластин не всегда удобны при использовании в практической деятельности для заполнения костных дефектов. Одной из прогрессивных форм остеопластических материалов является его глиевая форма. Экспериментально изучены полиакриламидные гели, наполненные гидроксиапатитом (ГАП). Показано, что этот гель способствует регенерации костной ткани при заполнении полостей (А.И. Воложин и соавт.,1998; А.В. Воинов, 2001). Его недостатком, отмеченным как в клинике, так и в эксперименте, является повышенный риск дистрофических осложнений, особенно при метаболических нарушениях и иммунодефицитном состоянии

пациента. Таким образом, актуальной является проблема создания геля, обладающего остеопластическими свойствами и лишенного отрицательных свойств ранее разработанных гелиевых субстанций. Анализ состояния вопроса показывает, что основой геля для заполнения костных дефектов может быть гиалуроновая кислота (ГК). Этот полимер является важнейшим компонентом межклеточного вещества соединительной ткани и обладае1 полифункциональными свойствами, сочетая в себе широкий спектр различных биологических эффектов. ГК - это полисахарид, он усиливает регенерацию различных тканей, в том числе, костной ткани, ускоряет рассасывание рубцов, уменьшает проницаемость кровеносных сосудов и других биологических мембран. ГК разрешена к применению в клинической практике. Свойства этого вещества могут быть использованы для приготовления остеопластического геля путем его соединения с другим биогенным веществом - гидроксиапатитом (ГАП).

Остеопластические материалы, содержащие ГАП и трикальцийфосфат широко используются в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и травматологии. Важная роль принадлежит свойствам минерального наполнителя, которые зависят от источника его получения и способа синтеза. Можно ожидать, что гель, созданный на основе ГК и ГАП, окажется эффективным средством для заполнения костных дефектов в челюсти. Для изучения этого важного для стоматологии вопроса необходимо пред клиническое изучение разных вариантов геля: гиалуроновая кислота -гидроксиапатит (ГК / ГАП).

Цель работы: разработка оптимальной композиции геля с ос геопластическими свойствами: гиалуроновая кислота - гидроксиапатит, его лабораторное и доклиническое (экспериментальное) изучение, как средства способствующего заживлению дефекта костной ткани челюсти.

Задачи:

1. Изучить влияние 2% геля гиалуроновой кислоты, введенного в воспроизведенные костные дефекты на развитие регенераторных процессов в эксперименте.

2. Оценить роль мелкокристаллического синтетического ГАП и пористого гранулята ГАП, введенного в состав геля гиалуроновой кислоты, в механизме заживления костной раны.

3. Провести сравнение характера репаративного процесса в костной ткани при использовании композиции геля гиалуроновой кислоты с фторгидроксиапатитом и гидроксиапатитом при его введении в экспериментально воспроизведенные костные дефекты.

4. Исследовать гистогенез превращения недифференцированных костных клеток в зрелые остеобластические элементы, окружающих гранулы и активно врастающих в их поры.

5. Сравнить динамику репаративного остеогенеза в эпифизе бедренной кости крысы и челюсти кролика под влиянием геля ГК / ГАП.

6. Сформулировать рекомендации по апробации геля ГК / ГАП для применения в клинической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии при заполнении костных дефектов.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение 2% геля гиалуроновой кислоты костные дефекты в эксперименте приводит к торможению развития регенераторных процессов. Регенерация хряща на ранних сроках эксперимента в области его повреждения усиливается, а затем наблюдается истощение его регенерационного потенциала.

2. Введение композиции геля гиалуроновой кислоты с мелкокристаллическим ГАП в костные дефекты способствует заживлению костной раны вследствие интенсификации хондропоэза в области костных ран с последующим перихондральным и энхондральным остеогенезом.

3. Композиция геля гиалуроновой кислоты и фторгидроксиапатита при инокуляции в костные дефекты оказывает слабое тормозящее действие на развитие регенераторных процессов в области костной раны.

4. Наиболее эффективным стимулятором регенерации костной ткани в экспериментах на крысах и кроликах является композиция геля гиалуроновой кислоты с гранулированным ГАП. Эта композиция стимулирует замещение костными структурами гранул за счет превращения недифференцированных клеток в зрелые остеобласты.

Научная новизна

Впервые показано, что введение 2% геля гиалуроновой кислоты в экспериментально воспроизведенные костные дефекты вызываег в костной ране торможение развития регенераторных процессов. На ранних сроках эксперимента наблюдается интенсификация регенерации хряща в области его повреждения, а в последующем - истощение его регенерационного потенциала. Новыми являются данные о том, что введение композиции геля гиалуроновой кислоты с мелкокристаллическим ГАП в экспериментально воспроизведенные костные дефекты заметно ускоряет заживление костной раны. Интенсификация новообразования костных структур обусловлена усиленным хондропоэзом в области костных ран с последующим перихондральным и энхондральным остеогенезом. Композиция геля гиалуроновой кислоты и фторгидроксиапатита при ее инокуляции в экспериментально воспроизведенные костные дефекты оказывает небольшое тормозящее действие на развитие регенераторных процессов в области костной раны. Практическая ценность

Практическое значение имеют данные о том, что наиболее эффективным стимулятором регенерации костной ткани является композиция геля гиалуроновой кислоты с гранулированным ГАП. При введении этого геля происходит интенсивное замещение костными структурами гранул ГАП за счет превращения в зрелые остеобласты

недифференцированных клеток, окружающих гранулы и активно врастающих в их поры. Введение ГАТТ (мелкокристаллического или гранулированного) в состав геля гиалуроновой кислоты вызывают отчетливую интенсификацию репаративного остеогенеза в дефектах нижней челюсти кроликов. Результаты экспериментального исследования показали, что гель, состоящая из 2% гиалуроновой кислоты с введенным с ее состав гранулированным ГАП, может быть рекомендована для апробации в клинической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для заполнения костных дефектов.

Положения, выносимые на защиту

1 .Введение 2% геля гиалуроновой кислоты костные дефекты в эксперименте приводит к торможению развития регенераторных процессов. Регенерация хряща на ранних сроках эксперимента в области его повреждения усиливается, а затем наблюдается истощение его регенерационного потенциала.

2. В ведение композиции геля гиалуроновой кислоты с мелкокристаллическим ГАП в костные дефекты способствует заживлению костной раны вследствие интенсификации хондропоэза в области костных ран с последующим перихондральным и энхондральным остеогенезом.

3.Композиция геля гиалуроновой кислоты и фторгидроксиапатита при инокуляции в костные дефекты оказывает слабое тормозящее действие на развитие регенераторных процессов в области костной раны.

4.Наиболее эффективным стимулятором регенерации костной ткани в экспериментах на крысах и кроликах является композиция геля гиалуроновой кислоты с гранулированным ГАП. Эта композиция стимулирует замещение костными структурами гранул за счет превращения недифференцированных клеток в зрелые остеобласты.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 75 российских автора и 93 иностранных. В диссертации представлено 3 таблицы и 36 рисунков.

Апробация работы Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на совместном совещании сотрудников кафедр госпитальной хирургической стоматологии и имплантологии, кафедры патофизиологии стоматологического факультета и кафедры госпитальной терапевтической стоматологии 15 января 2005 года.

Внедрение результатов работы

Разработанные композиции остеоинтегративного геля внедрены в научную работу и передаются на клинические испытания на кафедру госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, а также в учебном процессе и научной работе кафедры патологического физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ МЗ РФ.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на:

Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием, Москва 2004, 3-й конференции молодых ученых России с международным участием, посвященной 60-летию Российской академии наук. М., 2004,20-24 января 2004 г., совместном совещании сотрудников кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, кафедры патофизиологии стоматологического факультета и кафедры госпитальной терапевтической стоматологии 15 января 2005 года.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 48 крысах «Вистар» с исходным весом 180 -220 грамм. У животных под гексеналовым наркозом, открытым доступом с помощью зубоврачебного бора при малых оборотах создавали круглый дефект в области дистального эпифиза бедренной кости. Размер дефекта: диаметр около 2,5 мм, глубина 2 мм. Животные разделены на 4 равные группы: 1, 2 и 3-я — основные и 4-я — контрольная группа. Оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях. В 1-й группе дефект заполнялся 2% гелем гиалуроновой кислоты содержащим мелкодисперсный гидроксиапатит кальция (ГАП, размер частиц около 1 мкм), производства ЗАО «Полистом». 1 грамм 2% гиалуроновой кислоты содержал 500 мг ГАП.

Во 2-й группе дефект был заполнен 2% гелем гиалуроновой кислоты содержащим мелкодисперсный фторгидроксиапатит кальция (ГАП, размер частиц около 1 мкм), производства ЗАО «Полистом». Количество фтора в кристаллах - не более 1% по весу.

В 3-й группе в дефект вводили гидроксиапатит кальция в виде гранул (размер гранул 0,25 мм), производства ЗАО «Полистом».

В 4-й группе (контроль) в дефект вводили только 2% гиалуроновую кислоту.

С целью удержания геля в костной ране ее закрывали тонкой коллагеновой пленкой, сверху укладывали мягкие ткани, на кожу накладывали швы из шелка. Рана заживала первичным натяжением. Животных выводили из опыта через 15,30,60 и 90 суток после начала опыта по 3 крысы на каждый срок исследования. Схема проведения эксперимента на крысах приведена в табл. 1

Схема проведения эксперимента на крысах и количество животных в

группах Таблица 1

Группы животных

Сроки Гиал. к-та Гиал. к-та Гиал. к-та Гиал. к-та

опыта, + ГАП + + ГАП (контроль)

сутки фторГАП гранулы

15 3 3 3 3

30 3 3 3 3

60 3 3 3 3

90 3 3 3 3

Выделяли эпифизы бедренной кости, фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в трилоне Б и после общепринятой обработки заливали в парафин. Срезы толщиной около 7-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты рассматривали в световом микроскопе.

Опыты ставили на 18 кроликах Шиншилла массой около 2000 г. У животных под калипсоловым наркозом воспроизводили в теле нижней челюсти посредством перфорации бором кортикальной пластины и частично губчатого костного вещества стандартные костные дефекты диаметром 2,5 мм и глубиной 1 мм. Животных разделили на 3 равные группы. В костные дефекты вводили 2% гиалуроновую кислоту + гидроксиапатит в порошке (1-я группа), 2% гиалуроновую кислоту + фторгидроксиапатит в гранулах (2-я группа), 2% гиалуроновую кислоту (контроль). Животных выводили под гексаналовым наркозом из опыта в сроки 15, 30 и 90 суток после операции.

В работе использована гиалуроновая кислота производства AMI. Этот продукт получают биотехнологическим путем из растительного сырья с использованием бактериальных культур (Manuskiatti W., Maibach H.I. 1996).

Для этого, как правило, применяют культуру бактериальных клеток Streptococcus zooepidermicus на пшеничном субстрате.

Биотехнологический путь позволяет получать большие количества продукта с заданным молекулярным весом и стандартизированными реологическими свойствами. По технологии AMI получается гиалуроновая кислота с молекулярным весом 1000 кД, который является оптимальным для формирования геля. В таблице 2 приведены параметры 1% раствора гиалуроновой кислоты.

Гиалуроновая кислота, 1%-й раствор (1% Hyaluronic acid) Таблица 2. Органолептический анализ

Внешний вид гель

Растворимость в воде растворим

Растворимость в органических растворителях не растворим Физико-химические свойства:

6,5 ±1,0 1000 кДа

Микробиологический анализ

Общее число колоний на чашке Петри Дрожжи и плесневые грибки

< 100 /г 0/г

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из актуальных направлений в остеопластике является создание гелиевой субстанции, которая при введении в костную рану, могла бы стимулировать ее заживление в оптимальные сроки. При создании такого геля наиболее важным является вопрос о выборе глиевой субстанции. На основании данных литературы можно высказать предположение о том, что в качестве такой субстанции может быть использована гиалуроновая кислота, которая выделена в чистом виде и имеется разрешение для ее практического использования в медицине. Влияние геля гиалуроновой кислоты, а также при ведении в ее состав ГАП на заживление костной раны не изучено, в связи с чем было проведено настоящее исследование.

Работа была проведена в 2 этапа. На первом этапе проведены опыты на крысах с использованием стандартной модели регенерации костной ткани дистального эпифиза бедра. Эта модель неоднократно использовалась для оценки влияния различных факторов и, в том числе, остеопластических материалов на регенерацию костной ткани. На втором этапе проведены исследования на челюсти кроликов, принимая во внимание особенности метаболизма этой кости и отсутствие хрящевой ткани, которая включается в метаболизм после травмы эпифиза бедра, особенно в присутствии I иалуроновой кислоты.

Как показало проведенное нами исследование, в процессы регенерации костной ткани в экспериментально воспроизведенных дефектах мыщелка бедренной кости в присутствии композиций на основе гиалуроновой кислоты с добавлением ГАП вовлекаются как остеогенные элементы, так и (а возможно, и преимущественно) специфические предшественники клеток хряща. В группах наших экспериментальных наблюдений прослеживались различные формы осуществления костеобразовательного процесса через фазы построения хрящевой либо хрящеподобной ткани и последующего ее преформирования в костную ткань.

По нашим наблюдениям, формирование костных структур в экспериментально воспроизведенных костных дефектах происходило путем энхондрального либо перихондрального остеогенеза. Обычно оба вида костеобразования развивались в костных ранах параллельно. При этом перихондральный и энхондральный остеогенез протекали зачастую рука об руку с гиперплазией гиалинового хряща, разрастания которого нередко образовывали в области травмы своеобразные выросты в губчатое костное вещество мыщелка.

При энхондральном остеогенезе наблюдалось прорастание мелких сосудов в хрящевую ткань, и обнаруживались признаки повреждения хондроцитов, их дегенерация и замещение ткани хряща новообразованными костными балочками.

При перихондральном окостенении происходила дедифференцировка клеточных элементов в момент их деления, с их превращением в клетки, синтезирующие костное вещество (остеоид), в виде кольца охватывающего клетки-продуценты. Постепенно эти клетки приобретали цитологические характеристики остеобластов. Указанные превращения клеточных элементов можно было проследить в различных микроучастках хряща, в том числе, и в непосредственной близости от зон энхондрального окостенения.

В некоторых участках число клеток в отложениях остеоида возрастало, они приобретали атипические для кости черты, и сильно напоминали вытянутые довольно компактные клетки волокнистого хряща, однако матрикс таких участков был скорее костным, чем хондроидным.

Особого внимания достойно замещение хряща костной тканью при включении механизма перихондрального окостенения. В результате регенерационной пролиферации и, как следствия, увеличения обшей массы хрящевых клеток в области травмы, часть новых клеточных элементов на периферии хряща, оказавшихся в оптимальных трофических условиях начинала продуцировать остеоидное вещество, чем знаменовалось их превращение в костные элементы. Постепенно отдельные отложения

остеоида сливались, а клетки-продуценты остеоида уплотнялись, кое-где становились вытянутыми, приобретая цитологические характеристики костных клеток.

При всем при том, по соседству с описанными участками перихондрального окостенения, как правило, можно было наблюдать течение костеобразовательного процесса из хрящевой ткани по другому типу. В массивы хрящевой ткани врастали мельчайшие кровеносные сосуды. Вокруг них энергично пролиферировали недифференцированные клеточные элементы, появлялись гигантские многоядерные клетки. Хрящ по соседству подвергался резорбции, в образовавшихся нишах резорбции происходило построение костных балочек. Такое течение костеобразования присуще энхондральному остеогенезу.

Подобные же картины наблюдались и при инокуляции в костные раны композиции гиалуроновой кислоты с фторгидроксиапатитом. Однако в целом создавалось впечатление, что заживление костных дефектов в этой группе опытов протекало несколько медленнее, чем при инокуляции в костную рану композиций с гидроксиапатитом.

Указанная особенность гистогенеза костного регенерата наблюдаемого при введении в костные раны гиалуроновой кислоты с добавлением гидроксиапатита либо фторапатита, на наш взгляд, была связана с нижеследующими тремя факторами:

• с гистогенетическими особенностями избранного для экспериментального моделирования анатомического образования, каковым являлся мыщелок бедренной кости;

• с видом экспериментального животного (крысы);

• с непосредственным эффектом введения в костные дефекты гиалуроновой кислоты и композиций на ее основе.

В связи со сказанным отметим, что дефекты воспроизводили в костном образовании (мыщелке бедренной кости), суставная поверхность которого, от природы покрыта гиалиновым хрящом, то есть в анатомическом регионе,

имеющем богатые клеточные источники для хондропоэза, что естественно, способствовало включению элементов хряща в регенераторный процесс.

Использование лабораторных животных, а конкретно крыс, вовсе не исключает возможность экстраполяции результатов и положений нашею исследования ни на другие виды сложно организованных биологических сисчем (в том числе и на человека), ни на другие анатомические регионы (в том числе челюстно-лицевую область). Это связано со следующими обстоятельствами.

1. Энхондральный остеогенез - это один из наиболее распространенных, в том числе и у высокоорганизованных животных, путей костеобразования на этапах эмбриогенеза большинства костей, в том числе и челюстных у человека;

2. Перихондральный остеогенез наблюдается у крыс в эмбриогенезе нижней челюсти (З.П. Антипова, 1968) и описан при костно-воспалительных процессах различной локализации у человека (Русаков, Виноградова).

Очевидно, что виды гистогенеза костной ткани через стадию хондропоэза, которые мы наблюдали в наших экспериментах, представляет собой проявление более общей закономерности биологии развития костной системы, связанное с филогенезом опорного аппарата позвоночных, развившегося на определенных этапах эволюции биологических систем на основе хряща.

Следует особо подчеркнуть, что наиболее эффективное заживление костных дефектов наблюдалось в экспериментах с инокуляцией в костные раны композиции содержащей гранулы ГАП. Этот факт объясняется тем, что, помимо наблюдаемого в других группах опытов костеобразования через усиленный хондропоэз с последующим построением костных структур посредством механизмов пери- и энхондрального остеогенеза, происходит остеогенная дифференцировка клеточных элементов, располагающихся вокруг ГАП, а так же прорастающих в него, с последующей продукцией

указанными клетками костного вещества, замещающего резорбирующееся вещество гранул.

Одной из особенностей наблюдаемых в регенерировавшей костной ткани в наших опытах с композициями на основе гиалуроновой кислоты являлось появление в костном матриксе регенерата (обычно в трабекулярной его компоненте) особой слабо окрашенной бесструктурной базофильной субстанции, в виде прожилок окаймляющей плотное оксифильное костное вещество. Мы расценили эту субстанцию как «вторичный» мукоид, генетически связанный с введенной в костную рану композицией геля гиалуроновой кислоты, подвергшейся в организме подопытного животною метаболизму. Этот, по происхождению «вторичный» мукоид по сути своей является иной субстанцией, нежели часто встречающиеся (особенно на ранние сроки опытов) в костном и хрящевом регенерате депозиты ярко окрашенного базофильного тонковолокнистого слизеподобного вещества, которое является морфологическим субстратом геля гиалуроновой кислоты.

Проведенное исследование показало, что инокуляция в костные дефекты, экспериментально воспроизведенные в мыщелках бедра у крыс, композиций на основе гиалуроновой кислоты с ГАП инициировала регенерацию костной ткани, повторяющую алгоритм остеогенеза через стадию хондропоэза, запрограммированный эволюцией скелета животных (в том числе человека), и нашедшего свое воспроизведение на известных этапах эмбриогенеза костной ткани, в частности, челюстно-лицевой области.

Что касается эффекта от введения в костный дефект одной лишь гиалуроновой кислоты, то создавалось впечатление, что она тормозит регенерацию костной ткани. Причем, если на ранних фазах эксперимента наблюдалось некоторое оживление хондропоэза в области повреждения слоя хряща, то к 60 - 90 суткам наблюдений, наблюдалась редукция, истончение слоя хряща, с одновременным сохранением обширных остаточных костных дефектов, что позволяет логически связать эти два явления.

Во второй серии была изучена динамика заживления костных дефектов нижней челюсти при введении в них композиций на основе тиалуроновой кислоты.

Было показано, что на 15-е сутки опыта введение композиции гиалуроновой кислоты и мелкокристаллического ГАП в костные дефекты челюсти особенностями гистогенеза костного регенерата явилось образование во вновь сформированном костном веществе, наряду с типичными структурами, участков костеподобного вещества, а так же очагов хондропоэза, в которых прослеживались картины энхондрального остеогенеза. На 30-е сутки происходило дальнейшее интенсивное развитие и созревание вещества костного регенерата, хотя дефект кости оставался еще значительным. Отмечалось заметное сокращение удельного веса соединительно-тканной, преимущественно грубоволокнистой, компоненты регенерата, что было особенно ощутимым при сопоставлении ее площади в различные сроки эксперимента. По краям дефекта отмечалось интенсивное образование нового костного вещества. Местами наблюдалось появление очагов хрящеподобной субстанции, иногда формировались костно-хрящевые структуры. Количество участков с явлениями резорбции костного вещества, и вместе с тем число гигантских многоядерных клеток в костном регенерате, по сравнению с предыдущим сроком, значительно снижалось. На 60-е сутки опьпа дефект нижней челюсти закрывался новообразованными костными структурами. В нем определялись поля грубоволокнистой остеогенной ткани. В остаточном дефекте отмечалось фиброзное превращение заполнившей eго соединительной ткани.

В целом в описанные сроки мы отметили чрезвычайно высокую активность костнорепараторного процесса. Причем по сравнению с предыдущими сроками наблюдениям в серии опытов поставленных на бедренной кости крыс в регенерате костных дефектов нижней челюсти кроликов процессы хондропоэза и энхондрального окостенения были выражены несколько слабее. К девяностым суткам опыта костный дефект челюсти был уже почти полностью замещен новообразованной костью. В челюсти обнаруживался остаточный дефект кости, заполненный грубо-волокнистой соединительной тканью.

Таким образом, в костном регенерате, наряду с активными костеобразовательными процессами, наблюдалось интенсивное созревание новообразованных костных структур.

В результате инокуляция композиции гиалуроновой кислоты и гранулята гидроксиапатита в костные дефекты челюсти кроликов (вторая группа опытов) репаративный процесс несколько отличался от предыдущей группы. Уже на 15-е сутки опыта новообразованные костные структуры занимали значительные территории. Ближе к соединительно-тканному содержимому дефекта новообразованное костное вещество образовывало широкопетлистую тонкотрабекулярную сеточку, внутренняя зона костного регенерата слепо заканчивалась вдающимися в соединительно-тканную часть регенерата отдельными тонкими остеоидными балочками. В результате интенсивного развития костно-регенераторного процесса отдельные гранулы ГАП как бы запаивались в новообразованную кость.

Таким образом, описанные картины самым ярким образом свидетельствовали об очень активном построении в дефекте челюсти новой костной ткани.

Что касается включения хондропоэтического ростка в регенерационные процессы в костном дефекте, то в ранние сроки наблюдений отмечалось появление в области травмы очагов хондроида, а

также костно-хрящевых структур, относительно частых в пограничной по отношению к соединительно-тканной компоненте регенерата.

На ЗО-е сутки опыта наблюдалось дальнейшее сокращение площади территории костного дефекта челюсти свободной от новообразованных костных структур. Наряду с ярко выраженной прямой остеобластической дифференцировкой, преобладающей в этой серии экспериментов, здесь наблюдалась так же тенденция к формированию промежуточных костно-хрящевых структур. Гранулы ГАП обнаруживались во множестве и повсеместно. Вокруг них отмечалось уплотнение межклеточного вещества, и формировался пояс из пучков коллагеновых волокон и пролиферирующих фибробластических элементов, нередки здесь были и гигантские многоядерные клетки. Отмечалось проникновение тяжей вытянутых, частью дистрофически измененных клеток в гранулы, наблюдались явления резорбции ГАП.

В целом в указанные сроки эксперимента отмечалось дальнейшее развитие костного регенерата, новообразование костных структур и их созревание. Основной механизм новообразования костного вещества осуществлялся посредством остеобластической дифференцировки клеток предшественников, содержащихся в мягкотканной компоненте регенерата. В то же время отмечалось включение в регенераторный процесс и хондропоэтических элементов.

Следует особо подчеркнуть, что на фоне описанной высокой костеобразовательной активности, выразившейся в значительном возрастании массы костного вещества регенерата, подвергающегося на значительных территориях компактизации, при сохранении грубоволок-нистого характера костного вещества, на периферии регенерата начиналась вторичная перестройка костного вещества с появлением участков пластинчатого строения, а так же остеонных систем.

На 60-е сутки опыта дефекты костной ткани почти полностью замещались новообразованными костными структурами. Отмечалось

интенсивное созревание костной компоненты регенерата. При превалировании в регенерате компактизировашегося новообразованного костного вещества наблюдалось расширение зоны его спонгиотизации. В то же время кое-где в регенерате обнаруживались очаги хондропоэза и все еще сохранившиеся костно-хрящевые структуры, что свидетельствовало о некоторой незавершенности дифференцировки новообразованных структур.

Межтрабекулярные пространства губчатой кости регенерат частью были заняты кроветворной тканью, частью рыхлой соединительной тканью. Костный регенерат на его периферии без видимой границы переходил в структуры материнской кости.

Через 90 суток от начала эксперимента костный дефект практически полностью заполнялся костным регенератом. На значительных по распространению территориях новая кость имела губчатое строение. Лишь вблизи от центра проекции предсуществовавшего дефекту она проявляла тенденцию к компактизации. Костное вещество здесь оставалось, преимущественно, волокнистым и тенденция к образованию остеонов лишь намечалась.

Новая кость на обширных территориях регенерата имела регулярное губчатое строение. Значительные по протяженности участки новообразованной костной ткани прошли определенный цикл вторичной перестройки и приобрели более или менее зрелый вид. Мощные балки спонгиозы были преимущественно функционально детерминированными, что находило свое отражение в их общей ориентации, расположении достаточно редких и компактных костных клеток по периферии, а более обызвествленного вещества в осевых зонах трабекул. Межтрабекулярные пространства заполняли рыхлая соединительная ткань, часто жировая клетчатка и кое-где встречались очаги красного костного мозга.

В контрольной группе животных (инокуляция в дефекты челюсти гиалуроновой кислоты) репаративные процессы были выражены слабее, что особенно проявилось на 90-е сутки, то есть на завершающем этапе работы. В этот срок костного регенерата в нем, практически, не обнаруживалось. Вновь

образованные костные структуры, очевидно, подвергались редукции, что подтверждается описанными выше проявлениями резорбции костного вещества при участии гигантских многоядерных остеокластов. Сам костный дефект был заполнен грубоволокнистой соединительной тканью. В целом по наблюдениям этого срока эксперимента можно было говорить о нарушении процесса репаративного остеогенеза и вследствие этого о торможении заживления костной раны.

Таким образом, результаты второй серии экспериментов на кроликах показали следующее. Как и в опытах с воспроизведенными костными дефектами мыщелка бедра крыс, композиции на основе гиалуроновой кислоты и ГАП (мелкокристаллического либо гранулята) будучи инокулированными в дефекты нижней челюсти кроликов, вызывала отчетливую интенсификацию репаративного остеогенеза. В то же время одна лишь гиалуроновая кислота в тех же условиях экспериментов тормозила этот процесс. На наш взгляд, важная особенность стимулирующего костеобразовательный процесс эффекта указанных композиций обусловлена включению в их состав гиалуроновой кислоты. Влияние этой композиции определило выраженное участие хондроидного ростка в механизмах регенерации кости. Отметим, что особенно ярко эта особенность проявляла себя в опытах с дефектами мыщелка бедра у крыс. Это обстоятельство может быть объяснено нами наличием в указанном анатомическом образовании собственного хряща, покрывающего суставную поверхность мыщелка. Однако, наклонность к участию хондроидного компонента в регенерации костной ткани при инокуляции указанных композиций могла быть прослежена и в опытах с костными дефектами нижней челюсти у кроликов, хотя и в значительно меньшей степени.

Таким образом, установлено, что инокуляция 2% геля гиалуроновой кислоты без минерального наполнения в экспериментально воспроизведенные костные дефекты вызывала в костной ране торможение развития регенераторных процессов. При этом на ранние сроки эксперимента наблюдалась интенсификация регенерации хряща. Введение композиции геля гиалуроновой кислоты с мелкокристаллическим ГАП в костные дефекты заметно ускоряло заживление костной раны. При этом отмечалась интенсификация новообразования костных структур, что, по-видимому, было связано с усиленным хондропоэзом в области костных ран и соответствующим включением в регенерационные процессы механизмов замещения хрящевой ткани костной через посредство перихондрального и энхондрального остеогенеза. Как оказалось, при инокуляции этой композиции в костную рану, помимо интенсивного новообразования костного вещества, происходило активное замещение костными структурами самих гранул гидроксиапатита, осуществлявшееся за счет превращения в осгеобластические элементы недифференцированных клеток, окружающих гранулы и активно врастающих в их поры.

ВЫВОДЫ

1. Введение 2% геля гиалуроновой кислоты в экспериментально воспроизведенные костные дефекты вызывает торможение развития регенераторных процессов в костной ране. На ранних сроках эксперимента наблюдается интенсификация регенерации хряща в области его повреждения, а в последующем его регенерационный потенциал истощается.

2. Введение композиции геля гиалуроновой кислоты с мелкокристаллическим ГАП в костные дефекты ускоряет заживление костной раны. Интенсификация новообразования костных структур связано с усиленным хондропоэзом и включением в регенерационные процессы механизмов замещения хрящевой ткани костной тканью посредством перихондрального и энхондрального остеогенеза.

3. Композиция геля гиалуроновой кислоты и фторгидроксиапатита при введении в костные дефекты не оказывает тормозящего действия на регенераторные процессы в области раны. Однако заживление костного дефекта происходит несколько медленнее, чем при введении в костную рану гелиевой композиции с обычным гидроксиапатитом.

4. Наиболее эффективным стимулятором регенерации костной ткани является композиция геля гиалуроновой кислоты с гранулированным гидроксиапатитом. При введении этого геля происходит интенсивное замещение гранул гидроксиапатита костными структурами за счет превращения в зрелые остеобласты недифференцированных клеток, окружающих гранулы и активно врастающих в их поры.

5. Введение мелкокристаллического или гранулированного гидроксиапатита в состав геля гиалуроновой кислоты вызывает интенсификацию репаративного остеогенеза в дефектах нижней челюсти кроликов, в то время как применение одной гиалуроновой кислоты в тех же экспериментальных условиях тормозила этот процесс.

6. Влияние на регенерацию кости геля гиалуроновой кислоты с ГАП опосредовано участием хондроидного ростка суставной поверхности мыщелка в репаративном остеогенезе в опытах на крысах. Участие хондроидного компонента в регенерации костной ткани при введении геля в меньшей степени выражено в опытах с костными дефектами нижней челюсти у кроликов. Результаты экспериментального исследования показали, что гель, составленный из 2% гиалуроновой кислоты с введенным с ее состав гранулированного ГАП, может быть рекомендована для апробации в клинической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии с целью заполнения костных дефектов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью создания геля с остеопластическими свойствами на основе 2% водного раствора гиалуроновой кислоты в ее состав рекомендуется ввести синтетический ГАП в соотношении 500 мг минерала на 2 грамма геля. Наиболее эффективно для костной регенерации применение гранул ГАП, менее эффективно использование мелкокристаллического порошка этого минерала. Слабым остеопластическим свойством обладает фторгидроксиапатит вследствие его низкой растворимости. Гель гиалуроновой кислоты без минерального наполнителя тормозит заживление костной раны и ее применение в чистом виде не целесообразно.

2. Экспериментальную модель воспроизведения костного дефекта в области дистального эпифиза бедренной кости крысы можно рекомендовать для предварительной оценки свойств остеопластических материалов, выполненных в гелиевой форме. Предклиническую оценку материалов, предназначенных для костной пластики в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, следует проводить с использованием экспериментальной модели воспроизведения костного дефекта на челюсти кролика.

3. Проведенная предклиническая апробация остеопластического геля на основе гиалуроновой кислоты и гранулированного ГАП выпускаемого ЗАО «Полистом» позволяет рекомендовать этот материал для клинических испытаний в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Список опубликованных работ

1. В.В.Сарычев, А.С.Григорьян, А.И.Воложин Влияние композиции гиалуроновая кислота - гидроксиапатит на заживление дефекта бедренной кости в эксперименте. В кн.: Биомедицинские технологии, 2004, № 23, С 34-38.

2. В.В.Сарычев, А.М.Ткаченко, А.И.Воложин Влияние композиции гиалуроновая кислота - гидроксиапатит на заживление костных дефектов. Материалы Третьего Российского конгресса по патофизиологии с международным участием. Дизрегуляционная патология органов и систем. Москва, 2004, С 237.

3. В.В.Сарычев Заживление костных дефектов под влиянием геля: гиалуроновая кислота - гидроксиапатит в эксперименте. Материалы 3-й конференции молодых ученых России с международным участием, 20-24 января 2004 г. Посвящается 60-летию Российской академии наук. М., 2004. - С.307.

4. В.В.Сарычев Динамика остеогенеза при введении в костную рану гиалуроновой кислоты в эксперименте. В кн.: Материалы Всесоюзного симпозиума «Актуальные проблемы стоматологии», 19 - 22 октября 2004 г. Уфа, 2004. С 30-32.

Зак.87 Подп. к печати 14.03.2005 г. Печ. л.1 Тираж 100 экз. Бумага офсета. Формат 60x84 1/16 Типография ВИА

2? H

1593