Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Влияние лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов при псориазе, обоснование и эффективность комплексного метода лечения

На правах рукописи

РЫБКИНА Валентина Львовна

ВЛИЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ НА ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЕРАТИНОЦИТОВ ПРИ ПСОРИАЗЕ, ОБОСНОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО МЕТОДА

ЛЕЧЕНИЯ

14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Научно-исследовательском кожно-венерологическом институте МЗ Республики Казахстан

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Николаевич Мордовцев доктор медицинских наук, профессор Геннадий Иванович Суколин доктор медицинских наук, профессор Жанна Ильдаровна Авдеева

Ведущее учреждение -Российский государственный медицинский университет

Защита состоится « {/И/РурМ^ >2005 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д208.115.01 при Государственном учреждении Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д.З., кор.4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.

Автореферат разослан

Ю

2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Н.К. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Псориаз в настоящее время признаётся мульти-факториальным заболеванием, обусловленным генетическими и средовыми факторами [В.Н. Мордовцев, 1995]. Это хронический дерматоз, в основе которого лежат нарушения пролиферации и дифференцировки эпидермиса и воспаление [Valdimarsson, 1986]. В настоящее время высказывается предположение о возможности существования двух типов псориаза: первого - генетически обусловленного и второго - формирующегося под влиянием неблагоприятного воздействия внешних факторов [С. Bonifati, 1997]. Одним из возможных пусковых механизмов в развитии псориатического процесса является активация иммунной системы, которая приводит к реализации генетически обусловленной повышенной готовности эпидермиса к нарушению процессов пролиферации и дифференцировки [J. I. Chang et al.,1997, К. Ferenczi et al., 2002].

Эти данные подтверждаются благоприятным эффектом от назначения системных иммуносупрессивных препаратов, таких, как глюкокортикоиды, ци-тостатики, иммунодепрессанты [А.А. Кубанова, 1995]. Однако эти и другие препараты могут вызывать тяжелые побочные эффекты. Это диктует необходимость выработки новых терапевтических стратегий.

В последнее годы благодаря своим иммуносупрессивным свойствам пристальное внимание исследователей привлекли макролиды. В контексте их возможного применения для лечения псориаза, они интересны тем, что некоторые из них, в частности кларитромицин, способны подавлять синтез провоспали-тельных цитокинов IL-1, 2, 6, 8 и стимулировать выработку противовоспалительного IL-10 [С.М. Mac Leod, 2000]. Этот препарат выгодно отличается от других иммунодепрессантов: не нарушает процессы выработки антител и фагоцитарных реакций, не ослабляет цитотоксических свойств лимфоцитов, то есть, не разрушает противоинфекционную защиту организма [К. Morikawa, 1994]. Кроме того, этот препарат не обладает тяжелыми побочными эффектами, свойственными многим иммунодепрессантам.

Причины, приводящие к активации иммунной системы при псориазе, окончательно не установлены. Большое значение в этом процессе придается инфекции [D.Y. Leung et al., 1995]. Поэтому, применение антибиотиков для санации очагов хронической инфекции - это воздействие на еще одну патогенетическую мишень.

Все вышеизложенное обусловливает актуальность проведения данного исследования.

Цель работы: Создание модели иммунопатогенеза псориаза in vitro и разработка на основе полученных результатов метода иммуномодулирующей терапии.

Задачи исследования:

• Изучить влияние CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом in vitro.

• Исследовать влияние CD 20+ В-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом in vitro.

• Выявить влияние СЗ компонента комплемента на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов больных псориазом in vitro.

• Оценить влияние антигенов стафилококков и стрептококков на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов in vitro.

• Изучить влияние антигенов кератиноцитов на экспрессию кластеров дифференцировки и функциональную активность лимфоцитов больных псориазом.

• Определить наиболее значимые иммунологические показатели при обследовании больных псориазом.

• Обосновать возможность применения кларитромицина для лечения больных псориазом.

• Доказать эффективность и безопасность применения кларитроми-цина у больных псориазом.

Научная новизна. Создание модели in vitro позволило изучить роль различных субпопуляций лимфоцитов, СЗ компонента комплемента, антигенов стафилококка и стрептококка в патогенезе псориаза. Установлено, что аутоло-гичные CD4+ Т-лимфоциты, В-лимфоциты и СЗ компонент комплемента усиливают пролиферацию и снижают степень дифференцировки кератиноцитов пораженных и не пораженных участков кожи больных псориазом, чего не отмечается у клинически здоровых людей и больных атопическим дерматитом. Следовательно, эти элементы иммунной системы могут играть роль пусковых факторов в развитии псориатического процесса. Доказано также, что антигены стафилококка и стрептококка могут усиливать процессы пролиферации и ослаблять процессы дифференцировки кератиноцитов в пораженных и непораженных участков кожи больных псориазом как непосредственно, так и посредством взаимодействия их с лимфоцитами, что также свидетельствует об их возможной триггерной роли в патогенезе псориаза. Выявлено, что аутологич-ные CD8+ лимфоциты, напротив, снижали пролиферативную активность кера-тиноцитов и увеличивали относительное содержание высокодифференциро-ванных кератиноцитов. Эти факты свидетельствуют о возможной роли этой субпопуляции лимфоцитов в затухании псориатического процесса. Установлено, что лимфоциты больных псориазом развивают пролиферативный ответ на аутоантигены кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, что может явиться одной из причин активации иммунной системы при псориазе. Необходимость снижения активации иммунной системы при псориазе послужила поводом для исследования кларитромицина, обладающего иммуноде-прессивными свойствами. Установлено, что этот препарат посредством подав-

ления активации иммунной системы приводит к снижению пролиферации и повышению степени дифференцировки кератиноцитов как in vivo, так и in vitro.

Впервые установлена возможность применения кларитромицина для лечения больных псориазом, доказана его клиническая эффективность и безопасность.

Практическая значимость работы. На основе полученных результатов разработан метод иммунокорригирующей терапии больных псориазом с применением кларитромицина. Доказано, что данный метод лечения высоко эффективен при обычном и экссудативном псориазе с PASI не более 20, не вызывая при этом побочных эффектов и осложнений, удлиняя ремиссию. Особенно эффективен этот препарат при наличии сопутствующих заболеваний воспалительного характера. Модель исследования механизма влияния кларитромицина на процессы пролиферации и дифференцировки in vitro может быть использована для исследования механизмов действия других лекарственных препаратов, которые могут быть предложены для лечения псориаза. Выявлены наиболее значимые иммунологические показатели при обследовании больных псориазом. Установлено, что содержание CD25+ лимфоцитов может служить критерием активности псориатического процесса и использоваться для ранней диагностики обострения заболевания. Выявление конкретных триггерных факторов в развитии псориатического процесса, а также компонентов иммунной системы, способствующих его разрешению, позволит разработать более целенаправленные методы иммунокорригирующей терапии этого заболевания. Полученные данные о патогенезе псориаза могут быть использованы для чтения курса лекций по дерматовенерологии для студентов и врачей.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Аутологичные CD4+ Т-лимфоциты, В лимфоциты, СЗ компонент комплемента in vitro усиливают пролиферативную активность и снижают степень дифференцировки кератиноцитов пораженной и непораженной кожи больных псориазом, чего не происходит у клинически здоровых людей и больных атоническим дерматитом.

• CD8+ лимфоциты приводят к снижению в культуре содержания активно пролиферирующих низкодифференцированньгх кератиноцитов.

• Антигены стафилококка и стрептококка in vitro усиливают процессы пролиферации и снижают степень дифференцировки кератиноцитов больных псориазом как непосредственно, так и посредством активации CD4+ лимфоцитов

• Лимфоциты больных псориазом отвечают пролиферацией на воздействие антигенов аутологичных кератиноцитов

• Кларитромицин in vitro снижает количество активированных лимфоцитов, уменьшает пролиферативную способность лимфоцитов, через по-

средство Т- лимфоцитов снижает пролиферативную активность и увеличивает степень дифференцировки кератиноцитов. In vivo этот препарат приводит к снижению содержания CD4+, CD25+, В - лимфоцитов, пролиферативной активности лимфоцитов, иммуноглобулинов класса М, концентрации и активности компонентов среднего звена системы комплемента в периферической крови больных псориазом. При этом происходит снижение пролиферативной активности и повышение степени дифференцировки кератиноцитов больных псориазом. Выявленные свойства предопределяют возможность использования этого препарата для лечения псориаза.

• Кларитромицин эффективен и безопасен при применении его в комплексном лечении псориаза.

Внедрение полученных результатов. Метод лечения внедрен в Научно-исследовательском кожно-венерологическом институте Республики Казахстан, Алматинском городском кожно-венерологическом диспансере, Алматинском областном кожно-венерологическом диспансере.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях ученого совета Научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ Республики Казахстан, Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992г.), VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996), Конгрессе Европейской академии дерматовенерологии(1998), Конгрессе Американской академии дерматовенерологии (1999), съезде дерматовенерологов Казахстана (2000), IV Российском съезде иммунологов (2001), 11 конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Прага, 2002).

Публикации: Результаты исследования опубликованы в 30 научных работах. Получено 1 авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 325 источников, 42 из них на русском языке, 283 - на иностранных. Диссертация иллюстрирована 57 таблицами, 6 рисунками.

Диссертация выполнена в соответствии с планами НИР Научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ Республики Казахстан (№ гос. регистрации 0100 РК 00507).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Характеристика обследованных пациентов и лиц контрольной группы

Влияние различных факторов врожденного и приобретенного иммунитета на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов больных псориазом in vitro изучалось на культурах кератиноцитов, выделенных из биоптатов, взятых из пораженных и непораженных участков кожи 240 больных различными формами псориаза (100 обычным распространенным псориазом, 20 обычным ограниченным псориазом, 60 - экссудативным, 30 больных псориатической эритро-дермией, 30 больных псориатической артропатией), пораженных участков кожи 50 больных атоническим дерматитом и кожи 100 клинически здоровых людей. Влияние кларитромицина на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов больных псориазом и клинически здоровых людей in vitro изучалось на культурах кератиноцитов, выделенных из биоптатов пораженной и непораженной кожи 240 больных обычным псориазом с PASI не более 20 и 100 клинически здоровых людей. Определение иммунологических показателей до и после лечения, а также исследования эффективности и безопасности применения кларитромицина в комплексной терапии больных псориазом проводилось в группе из 140 больных обычным псориазом с PASI не более 20. Контрольную группу на этом этапе исследований составили 100 больных псориазом с PASI не более 20. Во всех группах было приблизительно равное количество мужчин и женщин, возраст был от 18 до 60 лет. Всем больным проводились стандартные клинические исследования. Оценка состояния кожного процесса проводилась визуально с помощью формулы Fredericksson-Petersson (1978) - Psoriatic area and severity index (PASI).

Лабораторные методы исследования

Методика исследования влияния различных иммунологических и не иммунологических факторов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitro

Культивирование кератиноцитов проводилось по методу [Rheinwald T.G., Green H., 1975]. Биоптаты кожи больных и здоровых добровольцев были взяты после обезболивания 0,25% раствором новокаина с пораженных и непораженных участков кожи больных псориазом и с аналогичных областей кожного покрова клинически здоровых людей. Больные не получали никакой местной и системной терапии в течение 3 месяцев. Биоптат помещался в среду 199, которая содержала пенициллин в концентрации 1x106 ЕД /л и 0,5 г/л стрептомицина. Затем отделяли жировую клетчатку и часть дермы. Потом их помещали в 25% раствор трипсина на фосфатном буфере на 18 часов при 4°С. После этого отделяли остатки дермы от эпидермиса и последний погружали в 0,125% раствор трипсина на PBS при 37°С на 5-8 минут. Добавляли 1% ЭТС по истечении

5 минут при комнатной температуре. Затем осадок ресуспендировали в небольшом количестве среды для культивирования, подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева и доводили ее до 300 тыс. /мл средой для культивирования: DMEM и F12 1:1 с 10% ЭТС и ростовыми добавками (эпидермальный фактор роста 10 нг/л, инсулин 5мкг/мл, изопротеренолЮ"5 моль/л.)( Sigma, США).

Для получения лимфоцитарной взвеси использовали гепаринизирован-ную кровь больных (20 ЕД гепарина на 1 мл). Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (плотность 1,077) по методу [Boyum A, 1988]. Выделение Т-лимфоцитов проводили с помощью реакции розеткообра-зования с нативными эритроцитами барана, [Фримель Г., 1987]. Затем клетки отмывали и проводили разделение на субпопуляции с помощью реакции розет-кообразования с эритроцитами быка, нагруженными антителами класса М против эритроцитов быка (для выделения Т(Д -лимфоцитов) и класса G для выделения Ту- лимфоцитов. Затем проводили центрифугирование и выделение на градиенте плотности аналогично Т-лимфоцитам каждой из вышеназванных субпопуляций. Процент живых клеток определялся с помощью трипанового синего, он составил 95%. Сохранность функций выделенных клеток определяли в тесте бласттрансформации лимфоцитов в ответ на ФГА. Она составила в среднем 50±5%. Чистоту выделения субпопуляций проверяли с помощью реакции непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами против кластеров дифференцировки Т-лимфоцитов: CD3- общей популяции, СО4-хелперной, CD8 - цитотоксической, CD20- В-лимфоцитов [Фри-мель Г., 1987].

Для изучения влиянияразличных компонентов иммунной системы, бактериальных антигенов и кларитромщина на пролиферацию и дифференцировку аутологичных кератиноцитов проводилась совместная инкубация кератиноци-тов с отдельными субпопуляциями лимфоцитов, их супернатантами, СЗ компонентом комплемента, антигенами стафилококка и стрептококка, кларитромици-ном. Каждый вариант опыта дублировался в 3-х лунках 96-луночного планшета. В контрольных лунках инкубировались только кератиноциты, в опытных -кератиноциты с добавлением одного из видов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD204). Концентрация лимфоцитов в лунках составила 2х10б кл/мл, кератиноцитов - 3х105 кл/мл. Соотношение кератиноцитов и лимфоцитов выбрано исходя из данных литературы о соотношении этих клеток в псориатическом инфильтрате [Adamicova К., Fetisovova Z., Cingel P. et al, 2001]. Объем смешанной культуры составлял 200 мкл. Инкубация проводилась в течение 3-х суток при 37° с в атмосфере, содержащей 5% СО2. Для того, чтобы исключить увеличение включения радиоактивной метки за счет лимфоцитов в отдельных лунках инкубировались различные субпопуляциями лимфоцитов с предварительно обработанными митомицином С аутологичными кератиноцитами с последующим добавлением ЗН-тимидина. Аутологичные кератиноциты из пораженных участков кожи получали из биоптатов путем механической обработки и трипсини-зации эпидермиса с последующей инкубацией их в течение 30 мин при 37°с

митомицином С в концентрации 50мкг/мл. Культивирование проводили в условиях, аналогичных описанным выше. Концентрации и объемы ингредиентов также были аналогичными. Показатели радиоактивности этих культур впоследствии вычитали из показателей культур с использованием нативных кератино-цитов. Такую же процедуру проделывали при определении концентрации ДНК.

Супернатанты CD3+, CD4+, CD8+, СО20+лимфоцитов получали следующим образом: эти лимфоциты (предварительно выделенные, как описано выше) инкубировали в DMEM и F 1 2 1:1 с 10% ЭТС и ростовыми добавками (эпи-дермальный фактор роста 10 нг/л, инсулин 5мкг/мл, изопротеренол10-5 моль/л.) и антибиотиками в течение суток. Концентрация лимфоцитов во взвеси составляла 2х106кл/мл. После окончания культивирования взвеси центрифугировали, надосадочную жидкость вносили по 200 мкл в лунки планшета, затем вносили в них аутологичные кератиноциты в концентрации 300 тыс. /мл и инкубировали в течение 3-х суток для изучения влияния супернатантов лимфоцитов на пролиферативную активность кератиноцитов и степень их дифференциров-ки.

Для изучения влияния СЗ компонента комплемента на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов больных псориазом СЗ компонент комплемента добавляли в культуру кератиноцитов в концентрации Юмг/мл, что соответствует концентрации этого компонента в сыворотке крови обследованных больных различными формами псориаза.

Для изучения влиянияантигенов стафилококка эпидермального и стрептококка гемолитического (предприятие по производству бак препаратов Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций, Россия) на пролиферацию и диффе-ренцировку кератиноцитов их инкубировали в условиях, описанных выше, с добавлением 1x10' микробных тел на мл.

Изменение пролиферативной активности кератиноцитов и степени их дифференцировки под действием кларитромщина изучалось при инкубации кератиноцитов в условиях, аналогичным описанным выше, с добавлением в среду кларитромицина, концентрация которого составляла 2мкг/мл, что соответствовало его лечебной дозе в сыворотке крови. Культивация кератиноцитов в этих вариантах опытов проводилась в условиях, аналогичных вышеописанным при исследовании влияния лимфоцитов. Инкубация во всех вариантах опыта проводилась в течение 3-х суток при 37° с в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Влияние кларитромщина на экспрессию кластеров дифференцировки лимфоцитов изучали следующим образом: лимфоциты в концентрации 1х106 кл/мл больных псориазом и клинически здоровых людей и инкубировали их в КРМ1 с добавлением 10% ЭТС, и 2мкг/мл клариромицина в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. Контрольную пробу лимфоцитов в той же концентрации инкубировали в тех же условиях в течение аналогичного срока. Затем определяли экспрессию кластеров дифференцировки кератиноцитов опытной и контрольной пробы с помощью моноклональных антител [Фримель Г., 1987].

Пролиферативная активность кератиноцитов оценивалась по содержанию ДНК [Leyra A., 1974] в них, исследование их метаболической активности по включению3Н-тимидина [Liu S.C., 1979], митотическая активность - по методу [Elgjo К., 1976]. Степень дифференцировки кератиноцитов определялась по их способности экспрессировать инволюкрин методом мембранной иммунофлюо-ресценции с помощью моноклональных антител против инволюкрина [Фри-мель Г., 1987].

Для исследования способности лимфоцитов больных псориазом и клинически здоровых людей образовывать розетки с кератиноцитами использовали аутологичные дезинтегрированные нативные кератиноциты, полученные из биоптатов пораженных участков кожи больных псориазом и аналогичных участков кожи клинически здоровых людей. Получали их как описано выше. Концентрация лимфоцитов во взвеси составила 2x103 кл/мкл, кератиноцитов -6x103 кл/мкл. 200 мкл смеси кератиноцитов и лимфоцитов центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин, затем инкубировали 1 час при 370С. Из взвеси готовили 2 мазка на предметных стеклах, фиксировали их в метаноле, затем окрашивали по Романовскому. Проводили подсчет процента розеток (лимфоциты, присоединившие 3 и более кератиноцитов) под световым микроскопом при увеличении 90x7.

Пролиферативный ответ на аутологичные кератиноциты изучали при инкубации лимфоцитов в концентрации 500 кл/мкл с обработанными митоми-цином С кератиноцитами в концентрации 300 кл/мкл в среде 199 с добавлением 10% ЭТС и антибиотиками при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 3-х суток. За сутки до окончания инкубации добавляли Н3тимидин. Пролиферативную активность оценивали по включению радиоактивной метки на Р-счетчике.

Для изучения влияния супернатантов кератиноцитов на экспрессию кластеров дифференцировки лимфоцитов кератиноциты пораженных участков кожи больных псориазом и кожи клинически здоровых людей выделяли как описано выше и инкубировали инкубировали в DMEM и F12 1:1 с 10% ЭТС и ростовыми добавками (зпидермальный фактор роста 10 нг/л, инсулин 5мкг/мл, изопротеренолЮ"5 моль/л.) и антибиотиками в течение суток, затем открепляли, центрифугировали, осадок отбрасывали, а в супернатант добавляли аутологич-ные лимфоциты в концентрации 1х106/мл (экспрессию кластеров дифференци-ровки у которых исследовали до инкубации) и инкубировали в течение суток при 37°С. Затем определяли экспрессию кластеров дифференцировки этих с помощью моноклональных антител [Фримель Г., 1987].

Методы оценки состояния иммунитета

Определение субпопуляций лимфоцитов проводилось методом непрямой мембранной флюоресценции, пролиферативная активность лимфоцитов оценивалась с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов - по методу [Фримель Г., 1987]. Использовалась также реакция торможения миграции лей-

и

коцитов [Новиков Д. К., Новикова В.И., 1979]. Иммуноглобулины классов M,G,A определялись согласно методу [ManciniL, 1965]. Количественное определение общей активности комплемента проводилось методом иммунного гемолиза [Вавилова Л.М., 1990]. Определение содержания отдельных компонентов комплемента как антигенов осуществлялось с помощью метода [Mancini I., 1965]. Определение функциональной активности компонентов комплемента осуществлялось с помощью метода [Вавилова Л.М., 1990].

Клинические испытания эффективности и безопасности применения кларитромицина в комплексной терапии больныхпсориазом

Клинические испытания эффективности и безопасности применения кла-ритромицина в комплексной терапии больных псориазом были одноцентровы-ми, открытыми, контролируемыми. Непреднамеренность распределения проводилась методом простой рандомизации с помощью таблицы случайных чисел. Сопоставимость и однородность выборок обеспечена включением в них лиц обоего пола с обычным псориазом в возрасте от 18 до 60 лет с PASI менее 20. Из клинических испытаний были исключены больные с артропатическим псориазом и псориатической эритродермией; с сердечной, почечной, и печеночной недостаточностью, инфекционными заболеваниями, а также получавшие глюкокортикоиды, ретиноиды, цитостатики. Численность наблюдений составила 240 больных.

Метод терапии с применением кларитромицина апробирован на 140 пациентах. Дозы кларитромицина назначались, исходя из результатов исследований in vitro. Больные получали по 500мг препарата 2 раза в день в течение 14 дней. Кроме того, пациентам этой группы назначалась стандартная фоновая терапия: внутривенные вливания 30% натрия тиосульфата по 10мл ежедневно в течение 10 дней в прогрессивной стадии заболевания; внутримышечные инъекции 5% раствора пиридоксина и 0,5% раствора цианкоболамина по 1мл через день, чередуя пиридоксин и цианкоболамин; подкожные инъекции экстракта алоэ по 1мл в стационарной стадии. Больным с жалобами на зуд назначался антигистаминный препарат диазолин по 0,1г 2 раза в день после еды. В прогрессивной стадии заболевания местно была применена 2% салициловая мазь на вазелиновой основе, в стационарной-5% ихтиоловая мазь. После лечения антибиотиком для нормализации кишечной флоры назначались эубиотики. Контрольная группа составила 100 человек, которые получали стандартную фоновую терапию. Всем больным проводились стандартные клинические исследования. Оценка состояния кожного процесса проводилась визуально (PASI).

Статистическая обработка проводилась с помощью параметрических и непараметрических методов математической статистики. Статистически значимыми считали результаты с уровнем вероятности не менее 95% ( р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование процессов пролиферации и дифференцировки кератиноци-тов больных псориазом в условиях in vitro под влиянием Т-и В-лимфоцитов и СЗ компонента системы комплемента

Для выяснения роли различных компонентов иммунной системы в патогенезе псориаза изучали взаимодействие кератиноцитов пораженной и непораженной кожи больных псориазом, пораженной кожи больных атопическим дерматитом и клинически здоровых людей с различными субпопуляциями ау-тологичных лимфоцитов и СЗ компонентом комплемента.

Таблица 1

Влияние аутологичных СБ4+ лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов больных псориазом

Включение радиоактивной метки, имп/мин NN(n=100) PN(n=240) РР(п=240) AD (п=50)

а)89±7 81±8 94±8 76±6

б)83±8 271±20* 433±19* 71±5

Число инволюкрин-положительных клеток на100кл а)41±3 33+2 27±3 39±3

б)42±2 17±2* 11 ±2* 38±2

Примечание: строка а- показатели культур кератиноцитов без добавления CD4 -лимфоцитов, строка б - показатели культур кератиноцитов с добавлением CD4+-лимфоцитов.*-показатель статистически значимо отличается от такового без добавления лимфоцитов. NN - нормальная кожа, PN - не пораженная кожа больных псориазом, РР-пораженная кожа больных псориазом, AD-кожа больных атопическим дерматитом.

При инкубации с аутологичными СБ4+-лимфоцитами возрастала проли-феративная и метаболическая активность кератиноцитов больных псориазом и снижалась степень их дифференцировки. Кератиноциты пораженной кожи больных псориазом отвечали на воздействие хелперно-индукторной популяции Т-лимфоцитов более активно (табл.1).

Аутологичные СD8+-лимфоциты снижали пролиферативную активность кератиноцитов, способствовали увеличению количества

высокодифференцированных кератиноцитов (табл.2). Аутологичные CD3+,CD4+ CD8+-лимфоциты не оказывали влияния на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов клинически здоровых людей, больных аллергическим дерматитом и непораженной кожи больных псориазом.

Основной механизм влияния лимфоцитов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов обусловлен цитокинами. [Kupper T.S., 1995]. Набор ци-токинов СО4+лимфоцитов превалирует во влиянии на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов в этой части эксперимента, оказывает, в основном,

стимулирующее влияние на пролиферацию и снижающее - на дифференциров-ку кератиноцитов.

Таблица 2

Влияние аутологичных СD8*-лимфои,итов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом

NN^=100) РЫ(п=240) РР(п=240) А0(п=50)

Включение радиоактивной метки, имп/мин а)89±7 81±8 94+8 76±6

б)85±7 79±4 31±2* 74+5

Число инволюкрин-положительных клеток на 100кл а)41±3 33±2 27±3 39±3

б)40+2 37+3 61±2* 37±2

лимфоцитов, строка б - показатели культур кератиноцитов с добавлением CD8+-лимфоцитов. * - показатель отличается статистически достоверно от такового без добавления лимфоцитов. МЫ-нормальная кожа, PN-не пораженная кожа больных псориазом, РР-пораженная кожа больных псориазом, АО-кожа больных атопическим дерматитом.

Разницу во влиянии лимфоцитов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов пораженной и непораженной кожи больных псориазом можно объяснить разной степенью экспрессии рецепторов к цитокинам в этих участках [Бага-Сющо /.8. й а1. 1995].

Причины угнетения пролиферативной активности и увеличения степени дифференцировки кератиноцитов можно объяснить развитием Т-зависимого киллинга пораженных кератиноцитов аутологичными лимфоцитами. Киллинг может быть обусловлен наличием атипичных антигенов на поверхности кера-тиноцитов больных псориазом или патологией распознавания, которая может иметь место у больных псориазом [81^1 в, 1996].

В-лимфоциты и их супернатанты не оказывали влияния на процессы пролиферации и дифференцировки клинически здоровых людей и больных аллергическим дерматитом. В-лимфоциты и их супернатанты статистически достоверно увеличивали пролиферативную и метаболическую активность керати-ноцитов больных псориазом и уменьшали степень их дифференцировки, при этом влияние на кератиноциты пораженной кожи было более сильным, чем непораженной. Кератиноциты пораженной кожи больных псориазом отвечали на воздействие как В-лимфоцитов, так и их супернатантов более активно. Влияние В-лимфоцитов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов можно объяснить действием выделяемых ими цитокинов, усиливающих пролиферацию кератиноцитов и снижающих степень их дифференцировки.

СЗ-компонент комплемента не влиял на процессы пролиферации и диф-ференцировки кератиноцитов больных аллергическим дерматитом и клинически здоровых людей. СЗ компонент комплемента усиливал процессы пролиферации и уменьшал степень дифференцировки кератиноцитов больных псориа-

зом, причем на кератиноциты пораженной кожи он оказывал более сильное влияние, чем на кератиноциты непораженной кожи.

ТаблицаЗ

Влияние антигенов стафилококка и стрептококка на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов

NN (п=100) PN(n=240) РР (п=240) AD (п=50)

Включение радиоактивной метки, ими/мин а)89±7 81±8 94±8 76+7

б)87±6 175±7* 233±15* 77+7

в)88±8 213±9* 289+11* 75+6

Число инво-люкрин-положительных клеток на100кл а)41±3 33±2 27+3 39+3

6)38+5 14±2* 15+2* 37+4

в)37±6 11±1* 13+1* 36+5

Примечание: строка а - показатели культур без добавления антигенов, б - с добавлением стафилококкового антигена, в - с добавлением стрептококкового антигена. * - показатель достоверно отличается от такового без добавления антигена. NN - нормальная кожа, PN-не пораженная кожа больных псориазом, РР - пораженная кожа больных псориазом, AD-кожа больных атопическим дерматитом.

Исследования установили ассоциацию некоторых бактериальных инфекций, в частности стафилококковых и стрептококковых, с развитием псориаза. [Davidson S.C., 1999]. Основной задачей данного фрагмента работы явилось изучение как непосредственного, так и опосредованного лимфоцитами влияния стафилококкового и стрептококкового антигенов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов больных псориазом. В результате проведенных исследований установлено, что стафилококковый и стрептококковый антигены усиливали in vitro процессы пролиферации и дифференцировки керати-ноцитов больных псориазом, влияние стрептококкового антигена было более выражено (табл.3). Влияние стафилококкового и стрептококкового антигенов было более сильным при инкубации кератиноцитов в присутствии CD4+-лимфоцитов. Это свидетельствует о том, что антигены стафилококка и стрептококка могут провоцировать развитие псориатического процесса. CD8+-лимфоциты в присутствии антигенов стафилококка и стрептококка не оказывали существенного влияния на процессы пролиферации и дифференцировки ке-ратиноцитов.

Лимфоциты больных псориазом образовывали розетки с дизентегриро-ванными аутологичными кератиноцитами. Кроме того, лимфоциты больных псориазом пролиферировали в ответ на воздействие антигенов аутологичных кератиноцитов. Интенсивность розеткообразования и пролиферативного ответа коррелировала с распространенностью и тяжестью псориатического процесса.

Лимфоциты клинически здоровых людей и больных атопическим дерматитом не связывались с антигенными детерминантами кератиноцитов и не развивали пролиферативный ответ на них. Это свидетельствует о том, что причиной активации иммунной системы при псориазе могут быть антигены кератиноцитов пораженных участков кожи. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности развития иммунного ответа лимфоцитов больных псориазом на антигенные детерминанты кератиноцитов больных псориазом. Не зависимо от того, первичный или вторичный характер носят аутоиммунные реакции при псориазе, их вклад в патогенез этого заболевания очевиден, это приводит к усилению воспалительной реакции в коже и замыканию патологического круга иммуно - эпидермальных взаимодействий при псориазе.

Необходимо отметить, что во всех исследованиях in vitro, касающихся влияния различных субпопуляций и популяций лимфоцитов, комплемента, антигенов стафилококка и стрептококка на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, а также влияния антигенов кератиноцитов больных псориазом на пролиферативную активность лимфоцитов и розеткообразования лимфоцитами с аутологичными кератиноцитами установлено, что интенсивность этих взаимодействий была наибольшей при артропатическом псориазе, затем по степени убывания следовали эритродермия, экссудативный и обычный псориаз.

Таким образом, схематично развитие псориатического процесса представляется следующим. Самым ранним событием является инфильтрация эпидермиса макрофагами и активированными CD4+ Т-лимфоцитами. Пораженная псориатическая кожа содержит активированные Т-лимфоциты памяти, продуцирующие м-РНК для лимфокинов, таких как IL-2 и IFNy, TNFa, экспрессия которой повышена по сравнению со здоровой и не вовлеченной кожей. Т-клеточная активация и продукция цитокинов играют критическую роль в поддержании гиперплазии. Продуцируемый Т-лимфоцитами IFNy стимулирует экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса на ке-ратиноцитах, а также молекул адгезии. IFNy , являющийся сам по себе ингибитором роста в купе с другими продуцируемыми Т-клетками факторами роста, вызывает индукцию роста кератиноцитов. Кроме того, по сравнению с нормальными стволовыми клетками, стволовые клетки кератиноцитов больных псориазом (бета 1 интегрин+ К1/К10(-) более чувствительны к цитокинам, стимулирующим рост, вырабатываемыми Т-лимфоцитами в очаге поражения. Такая аномалия реактивности, вероятнее всего, обусловлена генетически [J.T. ElderJ, 1994]. Поскольку пораженный эпидермис продуцирует повышенное количество факторов, которые в дальнейшем потенцируют Т-клеточную активацию, самоподдерживающийся цикл может замкнуться в окружении Т-клеток.

Не исключена возможность развития псориатического процесса и по другому сценарию, который может развернуться при пусковом воздействии не иммунологических факторов. Когда эпидермальные кератиноциты стимулируются травмой, бактериальными токсинами или ультрафиолетом, приводится в движение цитокинный каскад. IL-1 может стимулировать образование сосед-

ними кератиноцитами TL-6, IL-8, TNFa и GM-CSF. IL-1 и IL-8 могут вызвать миграцию нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток в место повреждения. Затем Т-клетки в месте повреждения могут освобождать каскад других цитокинов, включая IL-2,4,5, который может вызвать действие В-клеток и других лейкоцитов. Цитокины, взаимодействуя с клетками-мишенями, могут модулировать экспрессию молекул адгезии. Т-лимфоциты, на которых имеется лимфоцитар-ные молекулы адгезии -1(LFA-1) связываются с кератиноцитами посредством ICAM-1. Экспрессия ICAM-1 на кератиноцитах может быть усилена IL-1 и ИФН-гамма и ФНО. Такие воспалительные реакции возникают при псориазе, когда происходит высвобождение IL-6 и IL-8. Это ведет к миграции воспалительных клеток и Т-клеток в кожу. ИЛ-1, усиливая экспрессию ICAM-1 на ке-ратиноцитах, вызывает приток Т-клеток в эпидермис. Эти Т-клетки могут быть активированы разнообразными цитокинами кератиноцитов, включая IL-1, IL-6 и GM-CSF. Активированные Т-лимфоциты затем выделяют интерферон-гамма, который вызывает дальнейшее усиление экспрессии ICAM-1, активацию кератиноцитов, усиление экспрессии цитокиновых рецепторов, таких как IL-1 рецептор. Первичный стимул этого каскада еще предстоит определить, но это может быть местный инфекционный агент. Независимо от первичного стимула, этот каскад включает амплификационные механизмы, перечисленные выше, которые вносят вклад в общую картину заболевания.

При анализе собственных результатов и данных литературы можно предположить, что пусковыми моментами в развитии псориаза могут быть многие компоненты иммунной системы, а также неиммунологические факторы, в частности, инфекционные. Повышенная склонность псориатических ке-ратиноцитов к пролиферативному ответу при этом, по-видимому, реализуется на рецепторном или пострецепторном уровне, что требует проведения дальнейших исследований.

Обоснование применения кларитромщина в комплексной терапии

псориаза

Целью данного этапа исследований явилось изучения механизма влияния кларитромицина на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов in vitro.

Исследование свойств кларитромицина in vitro свидетельствует о наличии у него свойств, позволяющих добиться положительного клинического эффекта in vivo. Кларитромицин не вызывал изменений пролиферации и диффе-ренцировки чистой культуры кератиноцитов. Этот препарат оказывал ингиби-рующее влияние на пролиферативную активность и стимулирующее - на дифференцировку кератиноцитов больных псориазом только в присутствии CD4+ лимфоцитов (табл.4).

Таблица 4

Влияние кларитромицина и CD4+ - лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitro

NN(n=100) PN(n=240) РР (п=240)

Включение радиоактивной метки, имп/мин а)89±7 81±8 94±8

6)91±7 80±7 91±9

в)93±8 160+9* 233+19*

г)90±9 95±8** 98±8**

Число инволюкрин-положительных клеток на ЮОкл а)41±3 33±2 27±3

б)42±2 32±3 29±3

в)40±3 21 + 1* 18+2*

г)45±4 32±3** 28±3**

Примечание: графа а - данные культур клеток без добавления лимфоцитов, б - данные культур клеток с добавлением кларитромицина, в - данные культур клеток с добавлением лимфоцитов, г - данные культур клеток с добавлением лимфоцитов и кларитромицина. * -результаты статистически достоверно отличаются от таковых без добавления лимфоцитов, ** - результаты отличаются от таковых без добавления кларитромицина NN- культура кератиноцитов здоровых людей, PN-культура кератиноцитов непораженной кожи больных псориазом, РР-культура кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом

Пролиферативная активность и степень дифференцировки кератиноцитов клинически здоровых людей не менялась под воздействием кларитромицина в присутствии CD4+ лимфоцитов. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что пролиферативная и метаболическая активность кератиноцитов снижались, а степень дифференцировки увеличивалась под действием кларитромицина. Однако очевидно, что это влияние было опосредованным, поскольку в чистых культурах кератиноцитов не проявлялось, а сказывалось только в смешанных культурах, где пролиферативная активность кератиноцитов была усилена CD4+ лимфоцитами. Механизм влияния кларитромицина на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, вероятнее всего, связан с подавлением синтеза провоспалительных цитокинов лимфоидными клетками, что подтверждается исследованиями [К. Morikawa, 1996]. Поскольку кларитро-мицин оказывает положительное влияние на некоторые патогенетические звенья псориаза: снижает синтез цитокинов СО4+-клетками, что способствует нормализации процессов пролиферации и дифференцировки и затуханию воспалительных явлений, этот препарат может быть включен в схему лечения псориаза.

Следующий раздел работы посвящен изучению влияния кларитромицина на некоторые показатели иммунной системы in vitro.

СD25-лимфоциты - это субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2. Это маркер активированных лимфоцитов. Экспрессия CD25 была повышена у больных псориазом. После инкубации лимфоцитов больных псориазом с кларитромицином она снизилась до показателей клинически здо-

ровых людей. У клинически здоровых людей исследованные показатели не претерпели значительных изменений. Спонтанная и ФГА-индуцированная пролиферации лимфоцитов у больных псориазом была увеличена. Добавление кларитромицина к культуре лимфоцитов приводило к уменьшению спонтанной и ФГА - индуцированной пролиферации лимфоцитов как у больных псориазом так и у клинически здоровых людей. Следовательно, кларитромицин in vitro оказывал ингибирующее влияние на следующие феномены: экспрессию рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах больных псориазом, пролиферативную активность лимфоцитов у больных псориазом и клинически здоровых людей, способность синтезировать фактор угнетающий миграцию лейкоцитов у больных псориазом и клинически здоровых людей также снижалась. Исследования in vitro послужили основанием для включения этого препарата в схему лечения больных обычным и экссудативным псориаза с PASI не более 20.

Влияние лечения с применением кларитромицина на иммунологические показатели больных псориазом

Таблица 5

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови больных псориазом до лечения

Мо- Псориаз (п=240) Клинически здоровые люди

нокАТ (п=100)

% Абс кл/мкл % Абс кл/мкл

CD3 57,7±3,2 173+136* 59,1+3,1 1064+108

CD4 38,2+1,6 1146+94* 38,4+2,9 691+63

CD8 20,5±1,3 615+52* 20,8+1,4 374+25

CD4/CD8 2,0±0,2 2,0+0,2 2,0+0,2 2,0+0,2

CD20 12,1+1,1* 363+29* 7,0+0,7 126+10

CD25 4,4±0,7* 132+11* 0,2+0,01 3,6+0,2

Примечание:* - результаты статистически достоверно отличаются от референтной группы

До лечения относительное количество CD3+ -лимфоцитов у больных псориазом статистически достоверно не отличалось от показателей клинически здоровых людей, абсолютное их содержание было повышено по сравнению с клинически здоровыми людьми (табл. 5). Относительное содержание Т-лимфоцитов с маркерами хелперной субпопуляции изменено не было, абсолютное их число было повышено по сравнению с соответствующим показателем контроля. Аналогичная картина выявлена при определении цитотоксиче-ской субпопуляции: неизмененное относительное содержание и повышенное абсолютное. Абсолютное и относительное содержание В-лимфоцитов было повышено по сравнению с референтной группой Резкое повышение абсолютного и относительного количества клеток отмечено также в отношении содер-

жания активированных лимфоцитов, имеющих рецепторы к ИЛ-2. Корреляционный анализ показал, что содержание этих клеток прямо зависело от РА81 (г=0,76),р<0,05.

Таблица 6

Влияние фоновой терапии на экспрессию кластеров дифференциров-ки лимфоцитов больных псориазом

Монок.А.Т. Псориаз (п=100) Клинически здоровые(п=100)

% Абс. кл/мкл % Абс. кл/мкл

СБ3 а)58,2±3,1 1750±135* 59,1+3,1 1064+108

б)58,9±3,3 1264+110**

СБ4 а)38,7±1,9 1213+103* 38,4±2,9 691±63

б)38,9+2,3 825±72**

CDS а)20,6±1,8 620±56* 20,8±1,4 374+25

б)21,1±2,0 571+43*

СО4/СО8 а)2,0±0,2 2,2±0,3 2,0+0,2 2,0±0,2

б)2,1± 0,3 1,4+0,1***

СБ20 а)13,4±1,4* 376±33* 7,0+0,7 126± 10

6)8,7+0,8** 141+12**

СБ25 а)4,8± 0,5* 142+12* 0,2±0,01 3,6±0,2

б)4,0±0,3* 132+ 14*

Примечание:* - показатель статистически достоверно отличается от соответствующего показателя референтной группы **- показатель достоверно отличается от такового до лечения •** - показатель достоверно отличается от такового до лечения и референтной группы; а - показатель до лечения б - после лечения.

После фоновой терапии относительное содержание Т-лимфоцитов не изменилось, абсолютное - снизилось до показателей клинически здоровых людей (табл. 6). Количество хелперов в относительном выражении не изменилось, в абсолютном - снизилось до показателей клинически здоровых людей Относительное содержание цитотоксической субпопуляции Т-лимфоцитов не изменилось, абсолютное количество уменьшилось, достигнув при этом показателей здоровых. Абсолютное и относительное количество В-лимфоцитов снизилось до показателей клинически здоровых людей. Количество активированных лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2 (СБ25+) не претерпело существенных изменений.

После лечения с применением кларитромицина относительное содержание Т-лимфоцитов существенно не изменилось, абсолютное снизилось до показателей клинически здоровых людей (табл.7). Относительное количество хелперов уменьшилось, значение это стало ниже показателей клинически здоровых людей, абсолютное снизилось до показателей контроля. Абсолютное и относительное содержание цитотоксической субпопуляции лимфоцитов не

претерпело существенных изменений. Абсолютное и относительное содержание В-лимфоцитов снизилось и достигло показателей клинически здоровых людей. Количество активированных лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2, снизилось как в абсолютном так и в относительном выражении.

Таблица 7

Влияние лечения с применением кларитромицина на экспрессию кластеров дифференцировки мононуклеаров больных псориазом

Мон.А.Т Псориаз (п=140) Клинически здоровые (п=100)

% Абс. кл/мкл % Абс. кл/мкл

СБ3 а)56,9±2,3 1638+131* 59,1±З,1 1064±108

б)58,2±3,1 1100± 124**

СБ4 а)37,9±1,8 1090±81* 38,4±2,9 691+63

б)30,5+1,2*** 625±55**

СБ8 а)20,3±1,1 600±48* 20,8+1,4 374±25

б)21,1± 1,6 390+54**

СБ4/СБ8 а)1,9±0,2 1,8+0,2 2,0±0,2 2,0±0,2

б)1,5±0,1 1,4±0,1

СБ20 а)11,9±1,2* 355±28* 7,0±0,7 126± 10

б)7,0 ±0,7** 128±11**

СБ25 а)4,1±0,5* 131±10* 0,2±0,01 3,6±0,2

б)1,0 ±0,1*** 30 ±2 7***

Примечание:* - показатель статистически достоверно отличается от соответствующего показателя референтной группы ** - показатель достоверно отличается от такового до лечения *** - показатель достоверно отличается от такового до лечения и референтной группы; а - показатель до лечения, б- после лечения.

Как видно из приведенных результатов, лечение с применением кларит-ромицина оказало более выраженный иммуносупрессивный эффект: снизилось даже ниже нормы относительное содержание СБ4+-лимфоцитов, абсолютное их число нормализовалось. Само по себе снижение содержание хелперной субпопуляции ниже показателей клинически здоровых людей нельзя признать фактором благоприятным. Но, учитывая тригтерную роль СБ4+-лимфоцитов в патогенезе псориаза, этот факт можно назвать положительно влияющим на основные патогенетические звенья заболевания.

Кроме того, лечение с применением кларитромицина вызывало снижение содержания активированных Т-лимфоцитов, имеющим рецепторы к ИЛ-2, что также является важным моментом, прерывающим цепь цитокинных взаимодействий, приводящих при псориазе к нарушению пролиферации и дифферен-цировки кератиноцитов.

Функциональное состояние Т-звена системы иммунитета оценивалось с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов в ответ на воздействие

поликлональным стимулятором Т-лимфоцитов - ФГА(Мигех Biotech LTD, Великобритания). При псориазе повышены как спонтанная, так и индуцированная ФГА пролиферация лимфоцитов (табл. 8).

Таблица 8

Пролиферативная активность лимфоцитов у больных псориазом до

лечения

Группы обследованных Число об- Пролиферативная активность

следован- лимфоцитов (ими/мин)

ных спонтанная ФГА- индуцированная

псориаз 240 2300+150* 67000+2200*

клинически здоровые 100 1000±110 54000+1800

Примечание: * - показатель достоверно отличается от референтной группы.

Полученные данные согласуются с результатами J.I.Chang (1997), обнаружившим повышенную пролиферацию Т-лимфоцитов в пораженных участках кожи больных псориазом. W.B.Edward (1995) установил также повышение пролиферативной активности лимфоцитов в периферической крови больных псориазом, которое коррелировало с тяжестью процесса.

Таблица 9

Пролиферативная активность лимфоцитов у больных псориазом, получавших фоновую терапию

Группы обследованных Пролиферативная активность лимфоцитов (имп/мин)

Спонтанная ФГА-индуцированная

Больные псориазом до лечения(п=100) 2400+140* 68000+2300*

Больные псориазом после лечения (п=100) 2300+137* 66000+2458*

Клинически здоровые (п=100) 1000+110 54000+1800

Примечание* - показатель статистически достоверно отличается от референтной группы

У пациентов, получавших фоновую терапию, в результате проведенного лечения статистически достоверных изменений пролиферативной активности (как спонтанной, так и ФГА-индуцированной) не произошло (табл.9). Следовательно, при таком методе лечения, несмотря на клиническое улучшение или выздоровление, функциональная активность Т-лимфоцитов оставалась повышенной, что, возможно, чревато скорым рецидивом заболевания.

Таблица 10

Пролиферативная активность лимфоцитов у больных псориазом, леченных с применением кларитромицина

Группы обследованных Пролиферативная активность лимфоцитов (имп/мин)

Спонтанная ФГА - индуцированная

Больные псориазом до лечения (п=140) 2250+146* 66000+2330*

Больные псориазом после лечения (п=140) 1300+137** 56000+2458**

Клинически здоровые (п=100) 1000+110 54000+1800

Примечание*- показатель статистически достоверно отличается от референтной группы, **-показатель статистически достоверно отличается от такового до лечения.

Лечение с применением кларитромицина оказало существенное влияние на пролиферативную активность лимфоцитов больных псориазом (табл. 10). При этом резко снизилась как спонтанная, так и ФГА-индуцированная пролиферация лимфоцитов. Эти показатели практически достигли уровня здоровых лиц.

Таблица 11

Содержание иммуноглобулинов классов M,G,A у больных псориазом

Группы обследован- ^М ДО

ных мг/мл мг/мл мг/мл

Псориаз(п=240) 1,62+0,11* 12,2+0,62* 3,48+0,20*

Референтная группа 1,04+0,12 9,58+0,41 1,71+0,10

(п=100)

Примечание: *- показатель статистически достоверно отличается от референтной

группы

Содержание иммуноглобулинов всех классов у больных обычным псориазом до лечения было повышено (табл. 11).

Таблица 12

Содержание иммуноглобулинов классов М^Д у больных псориазом, получавших стандартную фоновую терапию

Группы обследованных ^М (мг/мл) ДО (мг/мл) (мг/мл)

Больные псориазом до лечения (п=1 00) 1,60+0,10* 12,4+0,59* 3,47+0,21*

Больные псориазом после лечения (п= 100) 1,10+0,11** 12,0+0,47* 3,0+0,25*

Референтная группа (п=100) 1,04+0,12 9,58+0,41 1,71+0,10

Примечание: '"'-показатель статистически достоверно отличается от референтной группы, **- показатель статистически достоверно отличается от такового до лечения.

Анализ данных, отражающих динамику содержания иммуноглобулинов в группе больных псориазом, получавших стандартную фоновую терапию показал некоторое снижение содержания ^М, в количестве иммуноглобулинов классов О и А существенных изменений не произошло (табл. 12).

Таблица 13

Содержание иммуноглобулинов классов М,в,А у больных псориазом, получавших стандартную фоновую терапию и кларитромицин

Группы обследованных ^М ДО

(мг/мл) (мг/мл) (мг/мл)

Больные псориазом до 1,63+0,10* 12,0+0,61* 3,50+0,21*

лечения

(п=140)

Больные псориазом после 1,20+0,09** 12,8+0,57* 3,40+0,22*

лечения

(п=140)

Референтная группа 1,04+0,12 9,58+0,41 1,71+0,10

(п=100)

Примечание: *-показатель статистически достоверно отличается от референтной группы, **- показатель статистически достоверно отличается от такового до лечения.

При лечении с применением кларитромицина изменение иммунологических показателей было аналогичным, то есть содержание иммуноглобулинов класса М уменьшилось, классов в и А — существенно не изменилось.

Таблица 14

Активность системы комплемента у больных обычным псориазом (средние титры)

Компоненты комплемента Клинически здоровые (п=100) М±т Больные псориазом в прогрессирующей стадии (п=240) М±т

С^ 97,1 ±4,9 115,6±2,1*

С1 58,9 ±2,5 62,8± 1,5

С2 21,9±0,8 23,4±1,0

сз 32,0 ±0,9 38,0±0,9*

С4 127,0± 6,3 144,0±4,1*

С5 57,5 ± 2,7 78,4± 2,8*

Собщ 26,7 ±0,7 44,4± 1,6*

Примечание: *- показатель достоверно отличается от референтной группы

Учитывая огромную роль комплемента как в иммунорегуляторных процессах в частности, так и в регуляции постоянства внутренней среды организма в целом, существенный интерес представляет изучение роли системы комплемента в патогенезе псориаза. В этой связи важно, что СЗЬ стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов и кератиноцитов [Б. МекИеге, 1995]. Общая гемолитическая активность системы комплемента у больных псориазом в прогрессирующей стадии была повышена (табл.14). Существенных изменений в активности С1 и С2 у больных псориазом выявлено не было. Компоненты средней части звена (СЗ,С4, С5) были активированы.

Таблица 15

Концентрация отдельных компонентов системы комплемента у больных псориазом, г/л

Компоненты комплемента Клинически здоровые (п=100) М±т Больные псориазом в прогрессирующей стадии (п=240) М±т

СИпу 2,40 ±0,11 3,20 ± 0,08*

С1 0,50 ± 0,03 0,72 + 0,04*

С2 0,80 ±0,08 0,96 + 0,05*

СЗ 8,20 ±0,12 10,30 ±0,11*

С4 3,00 ± 0,05 5,00±0,06*

С5 0,80± 0,08 0,90± 0,01

С1д 1,50 ±0,14 1,60±0,13

Примечание: * - статистически достоверные отличия (р<0,05) от референтной группы.

Концентрация С1, С2, СЗ, С4 и С5 компонентов комплемента была повышена у больных вульгарным псориазом в прогрессирующей стадии (табл. 15). Содержание С1инактиваторатакже было повышено.

Таким образом, концентрация и активность среднего звена системы комплемента повышена у больных вульгарным ограниченным псориазом в прогрессирующей стадии, что свидетельствует о наличии нормальной реакции системы комплемента на антигенное раздражение у больных псориазом. Причиной этой активации могут явиться различные микробные антигены, в особенности антигены стафилококка и стрептококка, которым в последние годы отводят существенную роль в патогенезе псориаза. Кроме того, активировать систему комплемента могут комплексы аутоантиген-аутоантитело, так как известно, что при псориазе выявляются аутоантитела к антигенам псориатиче-ских кератиноцитов [N. Basset Seguin, 1987].

Таблица 16

Активность системы комплемента у больных псориазом (средние титры), получавших стандартную фоновую терапию

Компоненты комплемента Референт нал группа М+т (n=100) Больные псориазом в прогрессирующей стадии (n=100)

До лечения М+m После лечения М+т

Clq 97,1+4,9 114,9+2,0* 94,9+1,8**

С1 58,9±2,5 62,7+1,5 61,3+2,0

С2 21,9+0,8 23,0+1,4 22,1 +0,9

СЗ 32,0+0,9 38,4+ 0,8* 36,0+1,5*

С4 127,0+6,3 145,0+3,9* 143,4+5,4*

С5 57,5+2,7 78,8+2,6* 64,4+1,7***

Собщ 26,7+0,7 45,2+1,5* 34,7+1,5***

примечание: Т-показатель достоверно отли*

** - показатель отличается от такового до лечения, такового до лечения и референтной группы

Фоновая терапия привела к снижению до показателей нормы активности С1д компонента комплемента, активность С1 и С2 при этом, как и до начала лечения оставалась в пределах нормы, активность СЗ и С4 существенных изменений не претерпела и по-прежнему превышала показатели клинически здоровых людей (табл. 16). Общая гемолитическая активность и активность 5 компонента комплемента снизились но не достигли показателей контрольной группы.

Таблица 17

Концентрация отдельных компонентов системы комплемента у больных псориазом, получавших стандартную фоновую терапию, г /л

Компоненты Клинически Больные псориазом в прогрессирующей ста-

комплемента здоровые дии (п=100)

(п=100) До лечения После лечения

М+т М±т М±т

СНпу 2,40+0,11 3,30± 0,08* 2,35±0,12**

С1 0,50± 0,03 0,70± 0,05* 0,54+0,03**

С2 0,80+0,08 0,96+0,05* 0,75+0,06**

сз 8,20+0,12 10,40+0,7* 8,20±0,6**

С4 3,00+0,05 5,60+0,4* 4,55±0,3***

С5 0,80+0,08 0,90±0,01* 0,91±0,09*

С1д 1,50+0,14 1,60±0,13 1,45±0,12

Примечание: '-показатель достоверно отличается от референтной группы ** - показатель отличается от такового до лечения, ***- показатель достоверно отличается от такового до лечения и референтной группы

Динамика концентрации отдельных компонентов комплемента была примерно аналогична активности: С1,СИпу, С2 и СЗ снизилась до показателей клинически здоровых людей, С4 хотя и снизилась, но не достигла показателей здоровых, С1д не изменилась и осталась на уровне контрольной группы, С5 также не претерпела изменений и осталась повышенной (табл. 17).

Таким образом, фоновая терапия не привела к полной нормализации общей гемолитической активности комплемента, концентрации и активности компонентов среднего звена этой системы (СЗ, С4, С5).

Таблица 18

Активность системы комплемента у больных псориазом, леченных с

применением кларитромицина (средние титры)

Компонен- Клинически здоровые (п=100) Больные псориазом в прогрес-

ты ком- М±т сирующей стадии (п=100)

племента До лечения М+т После лечения М±т

СЦ 97,1±4,9 115,6±2,1* 95,5±1,9**

С1 58,9±2,5 62,8±1,5 50,1±2,0***

С2 21,9±0,8 23,4±1,0 23,2±0,9

СЗ 32,0±0,9 38,0±0,9 * 30,0±1,5**

С4 127,0±6,3 144,0±4,1* 123,4±6,0**

С5 57,5±2,7 78,4±2,8* 54,4±1,7**

Собщ 26,7±0,7 44,4±1,6* 24,9±1,5**

Примечание: *-показатель достоверно отличается от референтной группы ** - показатель отличается от такового до лечения, ***- показатель достоверно отличается от такового до лечения и референтной группы

После лечения с применением кларитромицина активность всех изученных компонентов комплемента и общая гемолитическая активность снизились до уровня контрольной группы, лишь активность 1 компонента комплемента упала ниже показателей клинически здоровых людей (табл. 18).

Концентрации всех изученных компонентов комплемента после лечения с применением кларитромицина снизились до показателей клинически здоровых людей (табл. 19).

Следовательно, лечение с применением кларитромицина привело к нормализации основных показателей системы комплемента. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что включение в схему лечения больных вульгарным ограниченным псориазом кларитромицина привело к нормализации уровня активированных лимфоцитов, имеющих рецепторы к 1Ь-2, снижению спонтанной и ФГА - индуцированной пролиферации лимфоцитов, нормализации активности компонентов среднего звена системы комплемента, не оказало существенного влияния на содержания иммуноглобулинов.

Таблица19

Концентрация отдельных компонентов системы комплемента у больных псориазом, леченных с применением кларитромицина, г/л

Компоненты Клинически здоровые Больные псориазом в прогрес-

комплемента (п=100) сирующей стадии (п=140)

М±т До лечения М±т После лечения М+т

СНпу 2,40+0,11 3,20+0,08* 2,35+0,14**

С1 0,50±0,03 0,72+0,04* 0,54+0,03**

С2 0,80+0,08 0,96+0,05* 0,75+0,06**

СЗ 8,20+0,12 10,30+0,11* 8,30+0Л11**

С4 3,00+0,05 5,00+0,06* 3,50+0,07**

С5 0,80+0,08 0,80+0,08 0,75+0,05

С1д 1,50+0,14 1,60+0,13 1,45+0,12

Примечание: *- показатель достоверно отличается от референтной группы ** - показатель отличается от такового до лечения.

Это свидетельствует о благоприятном воздействии этого препарата на отдельные патогенетические звенья псориатического процесса, позволяющем снизить активность воспаления, не снижая способность к выработке антител, что могло бы неблагоприятным образом сказаться на состоянии антибактериальной защиты организма больных псориазом.

Проведенные испытания выявили более низкий показатель РЛ81 после лечения (р<0,05), достигнутый в испытуемой группе (табл. 20).Стабилизация кожного процесса также наступила достоверно раньше в испытуемой группе. Клиническое выздоровление в испытуемой группе наступало чаще, чем в кон-

трольной (р<0,05). Наиболее эффективным было применение кларитромицина при наличии у больных псориазом сопутствующих заболеваний воспалительного характера. Побочных эффектов применения кларитромицина зарегистрировано не было. Показатели печеночного и почечного профилей не отличались от соответствующих параметров клинически здоровых людей ни до, ни после лечения. В общем анализе мочи также не выявлено отклонений ни у одного из пациентов ни до, ни после лечения. Как показывают данные проведенных исследований, включение в схему лечения кларитромицина приводило к более эффективному снижению активности воспалительного процесса, о чем свидетельствует снижение спонтанной миграционной способности лейкоцитов и содержания активированных лимфоцитов, имеющих рецепторы к ИЛ-2- СБ25. Этот метод лечения также оказал более благоприятное воздействие на степень дифференцировки кератиноцитов - содержание инволюкрин - положительных клеток увеличилось в коже больных псориазом.

Таблица 20

Эффективность включения кларитромицина в комплексную терапию больных обычным псориазом

Показатель Контрольная группа Испытуемая группа

(n=100) (n=140)

РЛ51 после лечения, Х±т, % 14±1 9±1*

Время достижения стабилиза- 12+1 9±1*

ции кожного процесса, сутки

Клиническое выздоровление, % 33 51,4*

Значительное улучшение, % 46 45

Улучшение, % 21 3,6

Ухудшение, % 0 0

Примечание: *- достоверные (р<0,05) различия с контролем

Следовательно, можно сделать вывод, что включение в схему лечения кларитромицина приводило к более ранней стабилизации кожного процесса, более выраженному снижению PASI после курса лечения. Кроме того, этот метод оказывал более сильное влияние на параклинические критерии эффективности лечения псориаза. Это позволяет рекомендовать этот препарат для лечения ограниченных форм обычного псориаза.

ВЫВОДЫ

1. CD4+ -лимфоциты, вызывают усиление процессов пролиферации (в пределах 2,2-10,9 раз в непораженных и в 2,7-23,4 в пораженных участках кожи по данным разных методов) и нарушение дифференцировки кератиноцитов больных псориазом in vitro. Влияние CD4+ лимфоцитов на вышеуказанные про-

процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи, чем не пораженной, и обусловлено гуморальными факторами.

2. В-лимфоциты вызывают усиление процессов пролиферации и нарушение дифференцировки кератиноцитов больных псориазом in vitro. Влияние их на эти процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи (пролиферация усиливалась в 1,5-9,2 раза), чем не пораженной (пролиферация усиливалась в 1,4-6,1 раза по данным разных методов) и обусловлено гуморальными факторами.

3. СЗ-компонент комплемента вызывает усиление процессов пролиферации и нарушение дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом in vitro. Влияние его на эти процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи (пролиферация усиливалась в 1,7-6,7 раз), чем не пораженной (пролиферация усиливалась в 1,7-6,3 раза).

4. CD8+ лимфоциты снижают количество активно пролиферирующих низкодифференцированных кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, что уменьшает общую пролиферативную активность кератино-цитов in vitro в 3,03-4,8 раза.

5. Лимфоциты больных псориазом демонстрируют аутоиммунные реакции при взаимодействии с аутологичными кератиноцитами in vitro (аутологич-ные лимфоциты больных псориазом образовывали розетки с кератиноцитами пораженной кожи больных псориазом, кератиноциты пораженной кожи больных псориазом усиливали бластгрансформацию аутологичных лимфоцитов, комплекс антигенов дезинтегрированных кератиноцитов пораженной кожи больных псориазом вызывал образование фактора угнетающего миграцию лейкоцитов аутологичными лимфоцитами).

6. Содержание CD25+ лимфоцитов коррелировало с PASI (r=0,76, р<0,05). Этот показатель может служить критерием тяжести и распространенности процесса при псориазе.

7. Антигены стафилококков и стрептококков in vitro усиливают процессы пролиферации в 2,1-11,1 раза и снижают степень дифференцировки кератино-цитов у больных псориазом. Влияние этих антигенов может быть как прямым, так и опосредованным CD4+ и CD20+ лимфоцитами, более выражено в отношении кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, чем не пораженных.

8. Кларитромицин в концентрации 2 мкг/мл, адекватной одной терапевтической дозе, оказывал ингибирующее влияние в 1,8-9,6 раза на пролиферацию и стимулирующее - на дифференцировку кератиноцитов больных псориазом, более выраженное в отношении кератиноцитов пораженной кожи больных псориазом. Действие кларитромицина было опосредовано CD4+ лимфоцитами. Эти факты послужили основанием для применения этого препарата при лечении псориаза.

9. Включение в схему лечения псориаза кларитромицина в суточной дозе 500 мг в течение 14 дней приводит к ускорению регрессии кожного процесса на 4 дня по сравнению с фоновой терапией, не сопровождается выраженными

побочными явлениями. При назначении кларитромицина происходит снижение абсолютного количества СБ4+ лимфоцитов на 42,6%, СБ25 на 77,3%. После проведения фоновой терапии изменений данных показателей не произошло. Предложенный метод лечения более эффективен при обычном и экссудативном псориазе с РЛ51 менее 20 % и наличии сопутствующих заболеваний воспалительного характера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Включать кларитромицин в схему лечения больных обычным ограниченным псориазом.

2. Использовать определение содержания СБ25+ лимфоцитов в качестве критерия активности псориаза.

3. Исследовать иммунограмму больных псориазом перед назначением терапии.

4. Использовать полученные данные о патогенезе псориаза при чтении курса лекций по дерматовенерологии студентам и врачам.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыбкина В.Л., Кешилева З.Б. Иммунологическая оценка эффективности терапии псориаза//Сб. Некоторые вопросы клиники и терапии кожных болезней.- 1990.- С.72-82.

2. Прогностическое значение количественных характеристик субпопуляций Т-лимфоцитов/ Рыбкина В.Л, Абдрахманова А.О., Кешилева З.Б. и др.//Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии. Тезисы докладов. Алма-Ата, 28 сентября-1 октября 1992. Клиническая иммунология. Алма-Ата, 1992. - С. 15.

3. Иммуномодуляторы в терапии псориаза /Рыбкина В.Л., Абдрахманова

A.О., Тимофеева Л.Н. и др.// Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии. Тезисы докладов. Алма-Ата, 28 сентября-1 октября 1992. Клиническая иммунология. Алма-Ата, 1992.- С.26.

4. Лимфоциты с поверхностными рецепторами к эритроцитам барана иих функциональная активность у больных псориазом /Абдрахманова А.О., Кешилева З.Б., Рыбкина В. Л. и др.//Рукопись бс.-Деп. В КазГосИНТИ):.94.-Регис.№5043-Ка.

5. Нурлыбаева Л.М., Тимофеева Л.Н. Рыбкина В.Л. Лимфоциты с поверхностными рецепторами к аутологичным эритроцитам// Рукопись бс.-Деп. В КазГосИНТИ):.94.-Регис.№5042-Ка.

6. Иммунограмма при распространенном псориазе в прогрессивной стадии до и после лечения и влияние на нее показателей сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта/Абдрахманова А.О., Кешилева З.Б. Рыбкина

B.Л. и др. //Здравоохранение Казахстана.-1994.-№9.-С.22-25.

7. Тимофеева Л.Н., Нурлыбаева Л.М., Рыбкина В.Л., Утепова А.К. Патогенетическое значение регуляторных субпопуляций у больных псориазом//Сб. Медико-социальные аспекты дермато-венерологии. - Алматы. - 1994. - С. 164177.

8. Свешников В.А., Рыбкина В.Л., Нурлыбаева Л.М.,Тимофеева Л.Н. Чувствительность лимфоцитов к иммуномодуляторам у больных псориазом и си-филисом//Сб. Медико-социальные аспекты дермато - венерологии. -Алматы, 1994.-С.42-46.

9. Тимофеева Л.Н., Кемайкина В.Н., Рыбкина В. Л., Свешников В.А Зависимость поглотительной и переваривающей активности нейтрофилов от концентрации иммуноглобулинов М, G, А у больных псориазом и их родствен-ников//Сб. Клиническая биохимия, иммунология и терапия псориаза. - Алматы, 1996.-С. 42-45.

10. Рыбкина В.Л. Значение отдельных компонентов системы комплемента в патогенезе псориаза//Сб. Новое в диагностике и лечении заболева-ний,передающихся половым путем и болезней кожи.-Москва, 1997.-С.-81.

11. Рыбкина В.Л. Активность контрасупрессоров у больных псориазом/Тезисы докладов VII Российского съезда дерматологов и венерологов.ч. 1 Казань, 1996. СЮ.

12. Akyshbaeva G., Rybkina V.L. Clinical and immunological features ofpsoriasis in children//JEADV.-1998V.ll.-№9.-P.47.

13.Rybkina V.L.The preliminary investigation of the CD8+ lymphocytes role in the pathogenesis ofpsoriasis//JAADV.-1999.-V.23.-№10.-P.l 13.

14.Рыбкина В.Л. Роль антигенов стафилококка и стрептококка в патогенезе псориаза//Новое в медицине и фармации.-2000.-№5-6.-С.З-12.

15.Урустенова А.С., Рыбкина В.Л., Фищук Е.В. Обоснование применения кларитромицина для лечения больных псориазом// Новое в медицине и фарма-ции.-2000.-№5-6.-С. 16-23.

16.Рыбкина В.Л., Урустенова А.С., Фищук Е.В. Влияние некоторых субпопуляций лимфоцитов и факторов естественной резистентности организма на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitroZ/Второй конгресс дерматовенерологов Республики Казахстан. 4-6 октября 2ООО.-Тезизы докл. Алматы, 2000.-С.117-118.

17.Рыбкина В.Л., Урустенова А.С., Литовченко Е.Г., Жунусова Г.А., Влияние некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов на пролиферацию и диффе-ренцировку кератиноцитов in vitro у больных псориазом/ЛЗопросы дерматологии и венерологии.-2000.-С.38-42.

18.Рыбкина В.Л. Роль иммунной системы в формировании псориатиче-ского фенотипа/ЛВопросы дерматологии и венерологии.-2000.-№3.-С.20-25.

19. Рыбкина В.Л. Влияние киллерно - супрессорной субпопуляции Т-лимфоцитов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов in vitro у больных псориазом/ЛВопросы дерматологии и венерологии.-2000.-№3.-С.52-55.

20. Рыбкина В.Л., Урустенова А.С., Литовченко Е.Г. Способ лечения псо-риаза.-А.С. №10743 от24.03.2000

21.Рыбкина В.Л. Роль антигенов стафилококка и стрептококка в патогенезе псориаза//Новое в медицине и фармации.-2000. - № 5-6.-С.З-12.

22. Рыбкина В.Л., Урустенова А.С., Фищук Е.В. Влияние некоторых субпопуляций лимфоцитов и факторов естественной резистентности организма на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitro//C6. Актуальные проблемы дерматовенерологии. -Ташкент, 2001.-С.32.

23. Урустенова А.С., Рыбкина В.Л., Литовченко Е.Г. Влияние кларитро-мицина на функциональное состояние Т-звена системы иммунитета у больных псориазом.// Актуальные проблемы дерматовенерслогии.-Ташкент, 2001.-С.53-54.

24. Рыбкина В.Л., Урустенова А.С.Тенге котыргы кларитромицинш ко-мепмен иммунитетп реттей отырып емдеу//Денсаульж.-2001.-№7.-С.28-29.

25.Урустенова А.С., Рыбкина В.Л. Влияние кларитромицина на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов in vitro у больных псориазом/Медицина .-2001.-№3.-С.74-76.

26. Рыбкина В.Л., Урустенова А.С., Фищук Е.В., Даниленко Ж.Ю. Изменение кластеров дифференцировки лимфоцитов и их функциональной активности под влиянием гуморальных продуктов кератиноцитов in vitro//HoBOcra дерматологии и венерологии.-2001.-№1-2.- С.66-69.

27. Рыбкина В.Л. Взаимодействие различных субпопуляций лимфоцитов с поверхностными антигенными структурами кератиноцтов больных псориа-зом//Поиск. -2001 .-№3 .-С. 100-104.

28.Рыбкина В.Л. Взаимодействие супернатантов Т-лимфоцитов с керати-ноцитами больных псориазом//Поиск.-2001.-№4,5.-С.54-59.

29.Rybkina V.L. Akyshbaeva G, Urustenova A. S. The role of staphylococcal and streptococcal antigens in the pathogenesis of psoriasis// ШАБУ.- V. 16.- 2002.-S. 1.-P.296.

30. Рыбкина В.Л. Обоснование включения кларитромицина в комплексную терапию больных псориазом//Вестн. дерматол. и венерол. 2005.-№1.- С.50-51.

V

Актуальность работы. Псориаз в настоящее время признаётся мульти-факториальным заболеванием, обусловленным генетическими и средовыми факторами [9, 30, 78]. Это хронический дерматоз, в основе которого лежат нарушения пролиферации и дифференцнровки эпидермиса и воспаление [307]. В настоящее время высказывается предположение о возможности существования двух типов псориаза: первого - генетически обусловленного и второго - формирующегося под влиянием неблагоприятного воздействия внешних факторов [88]. Одним из возможных пусковых механизмов в развитии псориатического процесса является активация иммунной системы, которая приводит к реализации генетически обусловленной повышенной totobhoctpi эпидермиса к нарушению процессов пролиферации и дифференцнровки [62, 72, 73, 104, 105,.131].

Эти данные подтверждаются благоприятным эффектом от назначения системных иммуносупрессивных препаратов, таких, как глюкокортикоиды, ци-тостатики, иммунодепрессанты [22]. Однако эти и другие препараты могут вызывать тяжелые побочные эффекты. Это диктует необходимость выработки новых терапевтических стратегий.

В последнее годы благодаря своим иммуносупрессивным свойствам пристальное внимание исследователей привлекли макролиды. В контексте их возможного применения для лечения псориаза, они интересны тем, что некоторые из них, в частности кларитромицин, способны подавлять синтез провоспали-тельных цитокинов IL-1, 2, 6, 8 и стимулировать выработку противовоспалительного IL-10 [216]. Этот препарат выгодно отличается от других иммуноде-прессантов: не нарушает процессы выработки антител и фагоцитарных реакций, не ослабляет цитотоксических свойств лимфоцитов, то есть, не разрушает противоинфекционной защиты организма [228]. Кроме того, этот препарат не обладает тяжелыми побочными эффектами, свойственными многим иммуноде-прессантам.

Причины, приводящие к активации иммунной системы при псориазе, окончательно не установлены. Большое значение в этом процессе придается инфекции [207]. Поэтому, применение антибиотиков для санации очагов хронической инфекции - это воздействие на еще одну патогенетическую мишень.

Все вышеизложенное обусловливает актуальность проведения данного исследования.

Цель работы: Создание модели иммунопатогенеза псориаза in vitro и разработка на основе полученных результатов метода иммуномодулирующей терапии.

Задачи исследования:

• Изучить влияние CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом in vitro.

• Исследовать влияние В-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцнровки кератиноцитов у больных псориазом in vitro.

• Выявить влияние СЗ компонента комплемента на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов больных псориазом in vitro.

• Оценить влияние антигенов стафилококков и стрептококков на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов in vitro.

• Изучить влияние антигенов кератиноцитов на экспрессию кластеров дифференцировки и функциональную активность лимфоцитов больных псориазом.

• Определить наиболее значимые иммунологические показатели при обследовании больных псориазом.

• Обосновать возможность применения кларитромицина для лечения больных псориазом.

• Доказать эффективность и безопасность применения кларитроми-цина у больных псориазом.

Научная новизна. Создание модели in vitro позволило изучить роль различных субпопуляций лимфоцитов, СЗ компонента комплемента, антигенов стафилококка pi стрептококка в патогенезе псориаза. Установлено, что аутоло-гичные CD4+ Т-лимфоциты, В-лимфоциты и СЗ компонент комплемента усиливают пролиферацию и снижают степень дифференцировки кератиноцитов пораженных и не пораженных участков кожи больных псориазом, чего не отмечается у клинически здоровых людей и больных атопическим дерматитом. Следовательно, эти элементы иммунной системы могут играть роль пусковых факторов в развитии псориатического процесса. Доказано также, что антигены стафилококка и стрептококка могут усиливать процессы пролиферации и ослаблять процессы дифференцировки кератиноцитов в пораженных и непораженных участков кожи больных псориазом как непосредственно, так и посредством взаимодействия их с лимфоцитами, что также свидетельствует об их триггерной роли в патогенезе псориаза. Выявлено, что аутологичные CD8+ лимфоциты, напротив, снижали пролиферативную активность кератиноцитов и увеличивали относительное содержание высокодифференцированных кератиноцитов. Эти факты свидетельствуют о возможной роли этой субпопуляции лимфоцитов в затухании псориатического процесса. Установлено, что лимфоциты больных псориазом развивают пролиферативный ответ на аутоантигены кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, что может явиться одной из причин активации иммунной системы при псориазе. Необходимость снижения активации иммунной системы при псориазе послужила поводом для исследования кларитромицина, обладающего иммунодепрессивны-ми свойствами. Определено, что этот препарат посредством снижения активации иммунной системы приводит к снижению пролиферации и повышению степени дифференцировки кератиноцитов как in vivo, так и in vitro.

Впервые установлена возможность применения кларитромицина для лечения больных псориазом, изучена его клиническая эффективность и безопасность.

Практическая значимость работы. На основе полученных результатов разработан метод иммунокорригирующей терапии больных псориазом с применением кларитромицина. Доказано, что данный метод лечения высоко эффективен при обычном и экссудативном псориазе с PASI не более 20, не вызывая при этом побочных эффектов и осложнений, удлиняя ремиссию. Особенно эффективен этот препарат при наличии сопутствующих заболеваний воспалительного характера. Модель исследования механизма влияния кларитромицина на процессы пролиферации и дифференцировки in vitro может быть использована для исследования механизмов действия других лекарственных препаратов, которые могут быть предложены для лечения псориаза. Выявлены наиболее значимые иммунологические показатели при обследовании больных псориазом. Установлено, что содержание CD25+ лимфоцитов может служить критерием активности псориатического процесса и использоваться для ранней диагностики обострения заболевания. Выявление конкретных триггерных факторов в развитии псориатического процесса, а также компонентов иммунной системы, способствующих его разрешению, позволит разработать более целенаправленные методы иммунокорригирующей терапии этого заболевания. Полученные данные о патогенезе псориаза могут быть использованы для чтения курса лекций по дерматовенерологии для студентов и врачей.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Аутологичные CD4+ Т-лимфоциты, В лимфоциты, СЗ компонент комплемента in vitro усиливают пролиферативную активность pi снижают степень дифференцировки кератиноцитов пораженной и непораженной кожи больных псориазом, чего не происходит у клинически здоровых людей и больных атопическим дерматитом.

• CD8+ лимфоциты приводят к снижению в культуре содержания активно пролиферирующих низкодифференцированных кератиноцитов.

• Антигены стафилококка и стрептококка in vitro усиливают процессы пролиферации и снижают степень дифференцировки кератиноцитов больных псориазом сильнее, чем кератиноцитов клинически здоровых людей как непосредственно, так и посредством активации CD4+ лимфоцитов.

• Лимфоциты больных псориазом отвечают пролиферацией на воздействие антигенов аутологичных кератиноцитов

• Кларитромицин in vitro снижает количество активированных лимфоцитов, уменьшает пролиферативную способность лимфоцитов, через посредство Т- лимфоцитов снижает пролиферативную активность и увеличивает степень дифференцировки кератиноцитов. In vivo этот препарат приводит к снижению содержания CD4+, CD25+, В - лимфоцитов, пролиферативной активности лимфоцитов, иммуноглобулинов класса М, концентрации и активности компонентов среднего звена системы комплемента в периферической крови больных псориазом. При этом происходит снижение пролиферативной активности и повышение степени дифференцировки кератиноцитов больных псориазом. Выявленные свойства предопределяют возможность использования этого препарата для лечения псориаза.

• Кларитромицин эффективен и безопасен при применении его для лечения псориаза.

Внедрение полученных результатов Метод лечения внедрен в Научно-исследовательском кожно-венерологическом институте Республики Казахстан, Алматинском городском кожно-венерологическом диспансере, Алматинском областном кожно-венерологическом диспансере.

Апробация работы Основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях ученого совета Научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ Республики Казахстан, Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992г.), VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996), Конгрессе Европейской академии дерматовенерологии(1998), Конгрессе Американской академии дерматовенерологии (1999), съезде дерматовенерологов Казахстана (2000), IV Российском съезде иммунологов (2001), 11 конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Прага, 2002).

Публикации: Результаты исследования опубликованы в 29 научных работах. Получено 1 авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 325 источников, 42 из них на русском языке, 283 - на иностранных. Диссертация иллюстрирована 57 таблицами, 6 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. CD4+ -лимфоциты, вызывают усиление процессов пролиферации (в пределах 2,2-10,9 раз в непораженных и в 2,7-23,4 в пораженных участках кожи по данным разных методов) и нарушение дифференцировки кератиноцитов больных псориазом in vitro. Влияние CD4+ на вышеуказанные процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи, чем не пораженной, и обусловлено гуморальными факторами.

2. В-лимфоциты вызывают усиление процессов пролиферации и нарушение дифференцировки кератиноцитов больных псориазом in vitro. Влияние их на эти процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи (пролиферация усиливалась в 1,5-9,2 раза), чем не пораженной (пролиферация усиливалась в 1,4-6,1 раза по данным разных методов) и обусловлено гуморальными факторами.

3. СЗ-компонент комплемента вызывает усиление процессов пролиферации и нарушение дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом in vitro. Влияние его , на эти процессы более выражено в отношении кератиноцитов пораженной кожи (пролиферация усиливалась в 1,7-6,7 раз), чем не пораженной (пролиферация усиливалась в 1,7-6,3 раза).

4. CD8+ лимфоциты снижают количество активно пролиферирующих низкодифференцированных кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, что уменьшает общую пролиферативную активность кератиноцитов in vitro в 3,03-4,8 раза.

5. Лимфоциты больных псориазом демонстрировали аутоиммунные реакции при взаимодействии с аутологичными кератиноцитами in vitro (аутологичные лимфоциты больных псориазом образовывали розетки с кератиноцитами пораженной кожи больных псориазом, кератиноциты пораженной кожи больных псориазом усиливали бласттрансформацию аутологичных лимфоцитов, комплекс антигенов дезинтегрированных кератиноцитов пораженной кожи больных псориазом вызывал образование фактора угнетающего миграцию лейкоцитов аутологичными лимфоцитами).

6. Содержание CD25 лимфоцитов коррелировало с PASI (г =0,76, р<0,05). Этот показатель может служить критерием тяжести и распространенности процесса при псориазе.

7. Антигены стафилококков и стрептококков in vitro усиливают процессы пролиферации в 2,1-11,1 раза и снижают степень дифференцировки кератиноцитов у больных псориазом. Влияние этих антигенов может быть как прямым, так и опосредованным CD4+ и CD20 лимфоцитами, более выражено в отношении кератиноцитов пораженных участков кожи больных псориазом, чем не пораженных.

8. Кларитромицин в концентрации 2 мкг/мл, адекватной одной терапевтической дозе, оказывал ингибирующее влияние в 1,8-9,6 раза на пролиферацию и стимулирующее - на дифференцировку кератиноцитов больных псориазом, более выраженное в отношении кератиноцитов пораженной кожи больных псориазом. Действие кларитромицина было опосредовано CD4, CD20 лимфоцитами. Эти факты послужили основанием для применения этого препарата при лечении псориаза.

9. Включение в схему лечения псориаза кларитромицина в суточной дозе 1000 мг в течение 28 дней приводит к ускорению регрессии кожного процесса на 3 дня по сравнению с фоновой терапией, не сопровождается выраженными побочными явлениями. При назначении кларитромицина происходит снижение абсолютного количества CD4+ лимфоцитов на 42,6%, CD25 на 77,3%. После проведения фоновой терапии изменений данных показателей не произошло. Предложенный метод лечения более эффективен при обычном и экссудативном псориазе с PASI менее 20 % и наличии сопутствующих заболеваний воспалительного характера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Включать кларитромицин в схему лечения больных обычным ограниченным псориазом.

2. Использовать определение содержания CD25 лимфоцитов в качестве критерия активности псориаза.

3. Определять иммунный статус больных псориазом до и после лечения.

4. Использовать полученные данные о патогенезе псориаза для чтения курса лекций по дерматовенерологии студентам и врачам.