Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние изменений системы гемостаза на развитие неопластического процесса на модели лимфосаркомы Плисса

На правах рукописи

ТРАШКОВ Александр Петрович

ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА НА РАЗВИТИЕ НЕОПЛАСТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА НА МОДЕЛИ ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ □3481 1БЗ

Санкт-Петербург - 2009

003481153

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Васильев Андрей Глебович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шестакова Светлана Алексеевна

доктор медицинских наук, профессор Дергунов Анатолий Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится "_"_2009 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.090.03 ГОУ ВПО Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 197089, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д. 6/8.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 197089, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д. 6/8.

Автореферат разослан «_» «_» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного сове: доктор медицинских наук, профессор

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время; ВРП - время рекальцификации плазмы; ЛФС - лимфосаркома Плисса;

НМГ - низкомолекулярные (фракционированные) гепарины; ПВ - протромбиновое время;

РКМФ - растворимые комплексы мономерного фибрина; СМГ — среднемолекулярные (нефракдионированные) гепарины; ЦЭЦ - циркулирующие эндотелиоциты.

Актуальность проблемы: Широкая распространенность онкологических заболеваний, их медицинская, социальная и экономическая значимость, делают проблемы изучения механизмов онкогенеза и терапии злокачественных опухолей одними из ключевых в современном здравоохранении. В Российской Федерации, по данным ГУН НИИ Онкологии им. проф. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург), ежегодно регистрируются злокачественные опухоли приблизительно у 470 ООО человек, при этом отмечается неуклонный рост данного показателя во всех возрастных группах у мужчин и у женщин. Согласно прогнозам, количество впервые диагностируемых случаев заболеваний новообразованиями к 2010 году достигнет во всём мире 14-19 млн. ежегодно (Мерабишвили В.М., 2007). Значительную долю из них будут составлять лимфопролиферативные болезни, в том числе, лимфомы различных типов, степени злокачественности и устойчивости к противоопухолевой терапии, имеющие большой удельный вес в структуре онкопатологии и в настоящий момент (Байков В.В., 2007; Greenlee R.T. et al., 2000; Prijck B.De. et

При этом, по некоторым неопластическим заболеваниям наблюдаются выраженные половые различия (ЕгпЬе^ I., 2006). Так, показатели онкозаболеваемости но органам системы пищеварения у женского населения значительно ниже, по сравнению с мужским населением (27,7 % и 34,0 % соответственно). Аналогичная картина наблюдается при исследовании дыхательной системы, где заболеваемость мужчин приблизительно в 6 раз превышает таковые показатели у женщин (Мерабишвили В.М., 2006). В тоже время, по целому ряду нозологических форм (рак желудка, рак прямой кишки, миеломная болезнь и др.) половых различий практически не наблюдается (Мерабишвили В.М., 2006; Обрезан А.Г. и др., 2007). Таким образом, изучение зависимости развития опухолей от пола индивидуума представляется весьма актуальным.

ВВЕДЕНИЕ

al., 2007).

Несмотря на определённую автономность, злокачественные клетки находятся в тесном взаимодействии с защитными системами организма и испытывают их постоянное воздействие (Барышников А.Ю., 2003; Васильев А.Г., 2000). Одной из таких систем является система гемостаза. Имеющиеся сообщения, в основном, указывают на то, что различные неопластические процессы по мере своего развития могут приводить к серьёзным изменениям функционирования системы гемостаза организма, клинические проявления которых (тромбозы и эмболии) являются второй по частоте причиной смерти и инвалидизации больных в экономически развитых странах и существенно увеличивают стоимость проводимого лечения (Аяпбергенова Г.О., 2009, Levine М. et al., 1997; Prandoni Р. et al., 2005; Remiszewski P. et al, 1999).

Показано, что вероятность возникновения тромбоза у больных онкологического профиля в 10 - 100 раз выше, по сравнению с пациентами с другими заболеваниями (Конев В.Г. и др., 2005; Luzzato G., Schafer A.I., 1990). Наличие онкопатологии рассматривается как фактор высокого риска тромбозов и тромбоэмболических осложнений (ТЭО), что имеет большое значения для тактики терапии (Ходоренко С.А. и др., 2008; Prandoni Р., 1997). И, наоборот, тромбозы могут являться первым маркером развивающейся опухоли. Так, частота выявления онкологического заболевания после эпизода идиопатического тромбоза в среднем составляет 2 - 5 % и зависит от локализации и гистологического типа опухоли (Blom J.W. et al., 2005; Falanga A., Rickles F. R., 1999). Одними из наиболее часто упоминаемых злокачественных опухолей, приводящих к подобным нарушениям, являются лимфомы (Баркаган З.С., 2001).

Однако вероятно, характер взаимодействия в паре гемостаз организма -опухоль двусторонен и, в свою очередь, гемостатические и антигемостатические механизмы способны оказывать влияние на течение опухолевого процесса, ускоряя или замедляя его. В настоящее время возлагаются большие надежды на возможность изменения характера развития неопластического образования путем воздействия на его окружение, в том числе и на систему гемостаза.

Анализ опубликованных данных экспериментальных исследований и клинических наблюдений, в основном, указывает на значительное прямое влияние коррекции системы гемостаза антиагрегантами и антикоагулянтами, прежде всего низкомолекулярными гепаринами, на течение заболевания и общую выживаемость онкологических пациентов, однако механизмы этого явления до конца не понятны. Несмотря на большое количество работ, посвященных рассматриваемому вопросу, комплексное изучение нарушений системы гемостаза при развитии злокачественных опухолей не проводилось и механизмы воздействия гемостатических механизмов, в том числе при их фармакологической коррекции, на новообразование остаются не ясными.

Всё вышеизложенное определяет актуальность настоящих исследований.

Цель исследования: комплексное исследование особенностей состояния системы гемостаза при развитии неопластического процесса и влияние ее изменений на рост опухоли на модели перевиваемой лимфосаркомы Плисса (ЛФС).

Задачи исследования:

1. Разработать методику перевивки ЛФС, дающую в 60 - 80 % случаев успешную перевиваемости опухоли, что позволит с большой точностью анализировать получаемые в ходе основных серий экспериментов данные;

2. Исследовать половые особенности при перевивке ЛФС;

3. Исследовать особенности состояния системы гемостаза (сосудистый, клеточный и плазменный компоненты) крыс при развитии ЛФС;

4. Проанализировать эффективность воздействия на рост и развитие ЛФС лекарственных препаратов, влияющих на параметры системы гемостаза: антикоагулянтов прямого действия (низко- и среднемолекулярных гепаринов), прокоагулянтов, препаратов улучшающих микроциркуляцию.

Научная новизна и теоретическая значимость работы: Впервые проведено комплексное исследование изменений системы гемостаза при развитии ЛФС и влияния гемостатических механизмов на рост и развитие опухоли по 9 параметрам (количество циркулирующих эндотелиоцитов и тромбоцитов, адгезионная и агрегационная способности тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, время рекальцификации плазмы, концентрация фибриногена и уровень растворимых комплексов мономерного фибрина в плазме крови).

Установлено, что развитие ЛФС сопровождается нарушением функционирования всех компонентов системы гемостаза, проявляющимся эндотелиальной дисфункцией, активацией клеточного компонента и гиперкоагуляцией.

Показано, что рост и развитие ЛФС зависят от дозы перевиваемого опухолевого материала и пола животного, при этом самки крыс обладают большей устойчивостью к развитию лимфосаркомы. Впервые определено минимальное количество клеток ЛФС, дающее воспроизводимый рост опухоли в 60 - 80 процентов случаев, что имеет большое значение для экспериментальных исследований в различных областях клинической и фундаментальной онкологии.

Впервые проведен анализ воздействия на состояние системы гемостаза у животных с перевиваемой ЛФС лекарственных препаратов, применяющихся в онкологической практике (антикоагулянты, препараты улучшающие микроциркуляцию) и их антагонистов (прокоагулянты). Полученные на модели

лимфосаркомы Плисса данные свидетельствуют о том, что разнонаправленные воздействия на систему гемостаза оказывает значительное влияние на развитие неопластического процесса.

Применение антикоагулянтов прямого действия увеличивает вероятность успешной перевивки ЛФС («прививаемость») и ускоряет течение опухолевого процесса. Прокоагулянты, напротив, значительно снижают прививаемость ЛФС и замедляют развитие лимфосаркомы. При введении препаратов, улучшающих микроциркуляцию (ксантинола никотинат и пентоксифиллин), показано, что рост ЛФС зависит не только от их способности к коррекции нарушений гемостатических механизмов, но и от других фармакологических свойств препарата, возможно, напрямую тормозящих развитие лимфосаркомы Плисса (пентоксифиллин).

Практическая значимость: Полученные данные уточняют представления о характере изменений системы гемостаза при развитии лимфосаркомы Плисса. Показано, что рост ЛФС сопровождается активацией системы гемостаза подопытных животных. Установленный факт дисфункции гемостатических механизмов при ЛФС позволяет использовать эту модель опухолевого роста при изучении паранеопластического синдрома Труссо.

Выявленная высокая частота успешной перевивки ЛФС при применении антикоагулянтов прямого действия является основанием для инициации комплексного клинического и экспериментального исследования о целесообразности массового применения этих препаратов при злокачественных опухолях любых локализации и гистологического типа.

Внедрение в практику: Результаты диссертационного исследования используются на кафедре патологической физиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава в научно-исследовательской работе и при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами III - VI курсов.

Апробация работы: Основные положения работы доложены на Межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, ГОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова, 2007, 2008, 2009) и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Постгромботическая болезнь» (Санкт-Петербург, СПбГУ, 2009).

Публикации: По теме диссертационного исследования опубликованы 9 научных работ.

Структура диссертации: Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 9 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 5 глав с изложением результатов собственных исследования, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и библиографического указателя,

включающего 212 литературных источников, из них 142 отечественных и 70 иностранных авторов.

Степень личного вклада в результаты исследования: Весь материал, представленный в диссертации, получен, систематизирован и проанализирован лично автором. Автором осуществлен анализ научной литературы по теме диссертационного исследования за последние 15 лет, проведены эксперименты по перевивке лимфосаркомы Плисса подопытным животным и определению состояния системы гемостаза в норме и в условиях развития опухолевого процесса. Результаты исследования статистически обработаны, проанализированы и описаны лично автором. Работа выполнена на кафедре патофизиологии с курсами теоретической иммунопатологии и медицинской информатики ГОУ ВПО СП6ГТ1МА Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. При перевивке лимфосаркомы Плисса выявлена прямая зависимость частоты успешной перевивки опухоли и темпов ее роста от дозы перевиваемого опухолевого материала. Доза 550 (225) клеток/животное обеспечивает успешную перевивку опухоли у 84 (27) % крыс-самцов и 68 (25) % крыс-самок.

2. Пол животного играет значительную роль в развитии лимфосаркомы Плисса: частота успешной перевивки опухоли и темпы ее роста при использовании одинаковой перевивочной дозы у самок крыс значительно меньше чем у самцов.

3. В ходе развития перевиваемой лимфосаркомы Плисса происходит постепенное формирование дисфунгсции гемостатических механизмов, затрагивающее все компоненты системы гемостаза, в основном направленное на активацию процессов тромбообразования и свертывания крови.

4. Воздействуя на систему гемостаза крыс, можно оказывать влияние на развитие перевиваемой лимфосаркомы Плисса: уменьшение прогемостатического потенциала крови антикоагулянтами прямого действия и препаратами, улучшающими микроциркуляцию повышает частоту успешных перевивок («прививаемость») и ускоряет темпы роста опухоли; стимуляция системы гемостаза протамина сульфатом наоборот способствует снижению прививаемости опухоли и замедлению темпов ее роста.

5. Применение пентоксифиллина, препарата, улучшающего микроциркуляцию, корректируя нарушения системы гемостаза крыс, которым перевита лимфосаркома Плисса, одновременно ингибирует развитие опухоли в организме подопытных крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика клона лимфосаркомы Плисса

Использованы 541 самец и 240 самок белых крыс с массой тела 185-200 г, разведения ГП «Рапполово». Для поддержания опухоли и предварительного определения необходимого объема опухолевого материала использовались ещё 540 животных разного пола. Питание и содержание крыс соответствует нормам «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» согласно приказа МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. Экспериментальная работа проводится в соответствии с морально-этическими требованиями.

Клон лимфосаркомы Плисса (ЛФС) поддерживается путем перевивки крысам опухолевого материала подкожно на боковой поверхности туловища в дозе 0,2 мл гомогената ткани опухоли в 0,2 мл физиологического раствора.

Наблюдение за развитием ЛФС ведется по следующим критериям: 1. процент животных в группе, у которых сформировался опухолевый узел -«прививаемость», 2. срок появления пальпируемого первичного опухолевого узла (сутки), 3. динамика роста узла - определяется по увеличению объема опухолевого узла (см3) на 1, 5, 9, 13 и 15 сутки от момента выявления ЛФС, 4. срок гибели подопытных животных (сутки). При указанном объеме опухолевого материала ЛФС возникает в 100% случаев вне зависимости от возраста и пола и животного. Первичный пальпируемый узел возникает на 5,5±0,9 сутки (п = 181). Средняя продолжительность жизни крысы после перевивки ЛФС в указанной дозе составляет 17,3±3,97 дня (п =181).

Исследование зависимости развития лимфосаркомы Плисса от количества перевиваемых опухолевых клеток и пола животного

Работа выполнена работа на 511 половозрелых крысах, 271 самце и 240 самках. Ткань опухоли смешивали с физиологическим раствором, гомогенизировали и производили подсчет опухолевых клеток в единице объема в камере Горяева. Полученную взвесь, содержащую 22000, 11000, 5500, 2250, 1500 клеток в 1 мл, вводили крысам-самкам, поделенным на пять групп, в подкожную клетчатку правого бока в объеме 0,1 мл. Пяти группам крыс-самцов перевивка ЛФС производится аналогичным образом по 0,1 мл в разведениях 11000, 5500,2250, 1500, 750 клеток в 1 мл.

Исследование системы гемостаза и ее коррекции при развитии лимфосаркомы Плисса

Обследованные группы крыс (самцы):

1. группа «контроль» - для исследования параметров системы гемостаза в норме у крыс (п = 20).

2. группа «ЛФС» - животные, с перевиваемой ЛФС (стандартная доза опухолевого материала - 550 клеток на крысу) (п = 35).

3. группа «воспаление» - группа крыс с моделированием воспалительного процесса путем подкожного введения 5% взвеси клеток селезенки в физиологическом растворе полученной от живых доноров с целью исключения влияния эффектов воспаления на параметры системы гемостаза (п = 20).

4. группа «физ. раствор» - животные с перевиваемой ЛФС, которым на протяжении 7 суток подкожно вводится физиологический раствор в объеме 0,1 мл с целью исключения влияния неспецифических эффектов систематического введения лекарственных препаратов на параметры системы гемостаза при развитии опухоли (п = 35).

5. группа «Клексан» - животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится НМГ (Клексан) в дозе 150 МЕ/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС однократно подкожно (п = 35).

6. группа «Гепарин» - животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится СМГ (Гепарин натрий) в дозе 500 МЕ/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС два раза в сутки (по 250 МЕ/кг) подкожно (п = 35).

7. группа «Пентоксифиллин» - животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится пентоксифиллин в дозе 10 мг/кг в течение 7 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутривенно (п = 35).

8. группа «Ксантинол» - животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится ксантинола никотинат в дозе 6 мг/кг в течение 14 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутримышечно (п = 35).

9. 17 группа «Протамин» - животные, с перевиваемой ЛФС, которым вводится протамина сульфат в дозе 6 мг/кг в течение 3 суток от момента перевивки ЛФС однократно внутривенно (п = 35).

Взятие крови у подопытных животных и ее обработка

Взятие крови осуществляли в вакуумные системы с цитратным антикоагулянтом путем пункции сердца крысы под эфирным наркозом. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы производили центрифугирование крови с ускорением 240 % в течение 7 минут и последующим перенесением плазмы в другую пробирку. Обедненную тромбоцитами плазму получали из обогащенной путем центрифугирования с ускорением 1200 g в течение 15 минут.

Диагностика нарушений системы гемостаза

Оценку состояния системы гемостаза проводили по 9 параметрам на 3 и 15 сутки, после перевивки опухоли. Определяли: концентрацию циркулирующих эндотелиоцитов и тромбоцитов, адгезивную способность тромбоцитов, агрегационную активность тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, время рекальцификации плазмы, концентрацию фибриногена и уровень растворимых комплексов мономерного фибрина в плазме крови (качественный этаноловый тест).

Методы статистической обработки экспериментальных данных

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакета программ статистической обработки данных SPSS for Windows 13.0. Данные представлены в виде M±SD (среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение). Для проверки характера распределения применяли тест Колмогорова - Смирнова. Результаты оценивали, применяя t-критерий Стьюдента для независимых и зависимых выборок (при нормальном характере распределения), критерий Вилкоксона (при распределении отличном от нормального), дисперсионный и корреляционный анализ. Статистически значимым уровнем отличий считали вероятность не менее 95% (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние количества перевиваемых опухолевых клеток и пола животного на развитие лимфосаркомы Плисса

Отмечены следующие показатели прививаемости ЛФС: у самцов в группе, получивших 1100 клеток на крысу, - 95 %, 550 клеток - 84 %, 225 клеток - 27 %, 150 клеток - 10 %; у самок - 2200 клеток - 94 %, 1100 клеток - 88 %, 550 клеток - 68 %, 225 клеток - 25 %. Результаты трансплантации у самцов и самок коррелируют с количеством введенных опухолевых клеток (гА = 0,21; р < 0,05 и га = 0,20; р < 0,05, соответственно). Установлено, что перевивка ЛФС в объеме 75 клеток/животное (самцы) и 150 клеток/животное (самки) не вызывает роста новообразования (п = 55 и 41, соответственно).

Снижение количества клеток ЛФС приводит к увеличению времени, предшествующего появлению пальпируемого опухолевого узла от момента перевивки. У самцов, получивших по 1100 клеток/животное, оно составило 16,9±1,90 суток, 550 клеток/животное - 19,2±0,57 суток, 225 клеток/животное -22,4±2,62 суток; у самок, получивших по 2200 клеток/животное - 14,2±0,96 суток, 1100 клеток/животное - 16,7±0,82 суток, 550 клеток/животное -18,9±1,06 суток, 225 клеток/животное - 22,5±3,42 суток. При этом половые различия по регистрируемому показателю не отмечены. Наибольшие значения интервала времени предшествующего выявлению первичного узла ЛФС был установлен в группах, получивших наименьшие вызывающие рост опухоли дозы. Для самцов он составил 27 суток (доза 150 клеток/животное), для самок -33 суток (доза 225 клеток/животное).

Анализ длительности жизни крыс после перевивки ЛФС выявил отсутствие статистических различий при введении различных доз опухолевого материала, и по половому признаку. У самцов, получивших по 1100 клеток/животное, она составила 28,3±4,54 суток, 550 клеток/животное - 31,4±4,59 суток, 225 клеток/животное - 33,6±4,33 суток; у самок, получивших по 2200

клеток/животное - 27,8±5,72 суток, 1100 клеток/животное - 30,1±5,00 суток, 550 клеток/животное - 31,1±5,67 суток, 225 клеток/животное - 34,9±5,93 суток.

Анализ динамики роста ЛФС выявил статистически значимые отличия внутри большинства групп самцов (табл.1) и самок (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что количество перевиваемых клеток и пол животного играют большую роль в прививаемости и росте ЛФС. Самки обладают большей резистентностью к развитию опухоли.

Таблица 1.

№ п/п Сроки роста опухоли, сутки Объем ЛФС (см3)

1100 клеток/крыса 550 клеток/крыса 225 клеток/крыса

1 2 3

1 1 0,5 ± 0,46 0,5 ± 0.30 0,8 ±0,41

2 5 21,0 ±6.78 33,5 ±7,14 31,0±12,08

3 9 52,9±10,13 71,2 ±9,56 73,1±12,55

4 13 85,4 ± 9.36 123,5 ±8,73 -

5 15 90,9 ± 9.20 135,6 ±8,53 -

1 - различие между группами 1,2 - 2,2; 1,3 - 2,3; 1,4 - 2,4; 1,5 - 2,5 и 1,3 - 3,3-р< 0,05.

Таблица 2.

Динамика роста ЛФС (самки) (М ± SD)'_

№ Сроки Объем ЛФС (cmj)

п/п роста 2200 1100 550 225

опухоли, клеток/крыса клеток/крыса клеток/крыса клеток/крыса

сутки 1 2 3 4

1 1 0,5 ± 0,34 0,5 ± 0,27 0,8 ±0,61 1,0 ±0,68

2 5 24,7 ±6,14 31,5±10,46 44,2±5,11 38,2±18,66

3 9 43,4±11,26 60,4 ± 9,62 65,2 ± 6,76 70,0 ± 9,28

4 13 63,7 ± 9,09 66,3 ± 8,21 - -

5 15 72,4 ± 9,00 - - -

' - различие между группами 1,2-3,2; 1,2 -3,3 и 1,3 -4,3 -р< 0,05. -4,2; 2,2-3,2; 1,3-2,3; 1,3

Снижение дозы опухолевого материала вызывает закономерное уменьшение прививаемости ЛФС. Одновременно наблюдается увеличение времени, предшествующего появлению пальпируемого опухолевого узла и продолжительности жизни крыс после перевивки.

При перевивке ЛФС в объеме 550 - 225 клеток/животное отмечается рост опухоли с частотой больше 0% и меньше 100%, что позволяет рассматривать этот интервал как оптимальный для исследования характеристик роста и развития данного клона ЛФС и влияния на них различных факторов. В рассматриваемом интервале доз опухолевых клеток установлены статистически значимые половые различия. У самцов при дозе 550 клеток/животное на 15% чаще перевивка ЛФС оказывается успешной по сравнению с самками (р < 0,05). На большую резистентность женских особей крыс также указывает различие между минимальным количеством клеток лимфосаркомы, способном преодолевать противоопухолевую защиту и вызывать развитие опухоли (150 клеток/животное для самцов и 225 клеток/животное для самок).

Характеристика системы гемостаза при развитии лимфосаркомы Плисса

Перевивка ЛФС и последующий рост опухоли вызывает выраженное нарушение функционирования сосудистого компонента системы гемостаза, что проявляется увеличением концентрации циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭЦ) в крови подопытных животных (табл. 3). На 3 сутки эксперимента уровень ЦЭЦ оказался повышенным в сравнении с контрольной группой и в группе «ЛФС» (на 16 клеток/мл, р < 0,001), и в группе «Воспаление» (на 11 клеток/мл, р < 0,001). При этом отличий между группами «ЛФС» и «Воспаление» не установлено (р = 0,158). Высокая концентрация ЦЭЦ в группе «ЛФС», регистрируемая на 15 сутки эксперимента, превышает уровень ЦЭЦ не только в контрольной группе (на 64 клетки/мл, р < 0,001), но и в группе «Воспаление» (на 59 клеток/мл, р < 0,001). При этом отличий между группами «Контроль» и «Воспаление» не отмечено (р = 0,111). Анализ состояния клеточного компонента системы гемостаза установил значительное усиление функциональной активности тромбоцитов при развитии ЛФСт Наблюдается тенденция к снижению концентрации тромбоцитов в крови подопытных крыс в сравнении с контролем. Оценка адгезивной активности тромбоцитов указывает на наличие статистически значимого уровня различий между крысами группы «ЛФС» и групп «Контроль» и «Воспаление» уже на 3 сутки наблюдений (на 22% (р < 0,001) и 12% (р < 0,001), соответственно). Наряду с усилением адгезивной активности тромбоцитов наблюдается увеличение агрегационной способности тромбоцитов крыс с опухолью по сравнению по сравнению с крысами групп «Контроль» и «Воспаление». Установлена способность ЛФС активизировать плазменный компонент системы гемостаза крыс. Отмечена тенденция к уменьшению длительности тестов АЧТВ, ПВ и ВРП у подопытных животных в сравнении с крысами контрольной группы (табл. 3). При этом статистически значимые различия между группами «ЛФС» и «Воспаление» по большинству показателей обнаружены только на 15 сутки эксперимента.

Высокий уровень различий между всеми группами животных показан при сравнении концентрации фибриногена (табл. 3). При этом максимальная

концентрация отмечена у крыс группы «ЛФС» - отличие от контроля на 3 сутки наблюдений составило 2,8 г/л (р < 0,001), а на 15 сутки - 3,8 г/л (р < 0,001).

Таблица 3.

Состояние системы гемостаза у крыс с перевиваемой ЛФС (М± ББ)

Тест Сутки наблюдения Контроль Воспаление ЛФС

Циркулирующие эндотелиоциты (клетки/мл) 3 47,0±7,42 58,1±8,6 62,9±12,2'

15 45,1±11,32 50,3±9,02 109,3±12,0''3

Тромбоциты, клетки х 109/л 3 Ы5±10,\1-6 613±60,2' 621±52,2'

15 710±97,92 653±85,0 629±81,0'

Адгезивная активность тромбоцитов, % 3 33±5,0А;1 43±5,4''2 55±6,3М

15 31±4/72 38±1,б''2 56±5,1м

Агрегационная способность тромбоцитов МА, % 3 37,5±10,7А' 56,4±9,1''2 68,9±8,2М

15 40,1*15,6' 49,6±8,22 65,3±10,0''3

ВМА, секунды 3 133,0±37,0 116,5±31,1 117,0±24,6

15 152,9±45,6 135,9±25,5 124,0±21,9

АЧТВ, секунды 3 70±15А' 51±11' 50±10'

15 66±13 62±10 55±16

ПВ, секунды 3 26±42 18±6 17±3'

15 28±52 25±32 19±3М

Время рекальцификации плазмы, секунды 3 98±15АЗ 81±9' 72±19*

15 103±17^ 79±111 70±15'

Фибриноген, г/л 3 3,8±0,8^ 5,4±1,21,2 6,6±1,4''3

15 4,0±0,92':1 5,0±1,0''2 7,8±1,11*3

1 - отличия от «Контроль» - р < 0,05;2 - отличия от «ЛФС» - р < 0,05; * -отличия от «Воспаление» - р < 0,05.

Повышенный синтез полимерного фибрина при развитии опухоли закономерно вызывает появление растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) в крови подопытных животных, чего не наблюдается по результатам качественного этанолового теста в крови крыс контрольной группы. На 3 сутки эксперимента РКМФ обнаруживаются в плазме крови у 40% крыс группы «ЛФС» и у 50% крыс группы «Воспаление»; на 15 сутки

только у 25% крыс группы «Воспаление» регистрируется наличие РКМФ, тогда как у крыс группы «ЛФС» этот показатель достигает 85%.

Анализ полученных в ходе исследования данных о состоянии системы гемостаза крыс при развитии ЛФС позволяет сделать вывод о выраженной дисфункции гемостатических механизмов, усугубляющейся по мере развития опухоли. Нарушения затрагивают все компоненты гемостаза, направлены в сторону активации процессов тромбообразования и свертывания крови.

Развитие лимфосаркомы Плисса при коррекции системы гемостаза антикоагулянтами прямого действия

Коррекция системы гемостаза крыс на фоне роста опухоли с помощью СМГ и НМГ выявила различия в подопытных группах по показателям развития перевиваемой ЛФС. Прививаемость в группе «ЛФС» составила 80%, в группе «Физ. Раствор» - 73%, в группе «Клексан» - 93%, в группе «Гепарин» - 100%. Введение антикоагулянтов привело к значительному уменьшению времени, предшествующему появлению опухолевого узла от момента перевивки ЛФС. Данный показатель составил в группе «ЛФС» 16,9±1,4 суток, в группах «Физ. раствор» - 17,7±1,6 суток, «Клексан» - 15,1±2,0 суток, «Гепарин» - 14,4±0,9. Антикоагулянты, сокращая интервал времени предшествующего появлению пальпируемого узла лимфосаркомы от момента перевивки, способствуют более ранней гибели животных-опухоленосителей.

Анализ динамики роста ЛФС выявил более выраженный рост в подопытных группах на поздних стадиях (13-15 сутки от момента установления факта прививаемости), статистически значимо отличающийся от показателей группы «ЛФС». На 13 сутки объем лимфосаркомы у крыс группы «Клексан» превышал объем опухоли у крыс группы «ЛФС» (109,0±8,10 см3) на 40 см3 (р < 0,001), а на 15 сутки (133,5±7,87) - на 18 см3 (р < 0,001). Гепарин-натрий ещё более ускорял развитие опухоли. На 13 сутки объем ЛФС у крыс группы «Гепарин» превышал на 43 см3 (р < 0,001) показатель у животных группы «ЛФС», а на 15 сутки скорость роста ЛФС у крыс получивших гепарин-натрий была выше по сравнению и с группой «ЛФС» (на 40 см3, р < 0,001), и с группой «Клексан» (на 23 см3, р = 0,001). Введение физиологического раствора не оказывало влияния на рост ЛФС. Применение антикоагулянтов приводило к коррекции гемостатических механизмов. Гепарины снижают активность сосудистого и клеточного компонентов системы гемостаза, что проявляется уменьшением количества циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭЦ) в крови у крыс с перевиваемой ЛФС, восстановлением концентрации тромбоцитов до физиологического уровня, регистрируемого у контрольных крыс. При этом более выраженный эффект наблюдается при применении клексана. Анализ результатов исследования адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов не выявил способности гепаринов оказывать влияние на эти показатели.

У крыс с перевиваемой ЛФС выявлена тенденция к снижению активности факторов свертывания крови при действии антикоагулянтов (табл. 4). По большинству исследуемых показателей отличия между группой «ЛФС» и группами крыс получивших НМГ и СМГ отмечены уже на 3 сутки эксперимента. Наибольший эффект удалось получить в группе «Гепарин».

Таблица 4.

Состояние плазменного компонента системы гемостаза у крыс с перевиваемой ЛФС при применении антикоагулянтов прямого действия (М ±

Тест Сутки Контроль ЛФС Клексан Гепарин

АЧТВ, секунды 3 7Ш5* 50±10''4 51±15' 78±102'3

15 66±134 55±164 59±184

ПВ, секунды 3 26,0±3,52'* 17,4±3,9!'4 20,0±2,4''4 28,6±4,6'Д;|

15 27,5±3,32'3 18,8±4,1м'4 22,6±2,61А4 30,1±2,52-'

ВРП, секунды 3 98±15А4 72±191Д4 93±152'4 пььго'-^

15 103±172 70±151Д4 99±132 105±322

Фибриноген, г/л 3 3,8±0,82Д4 6,6±1,41Л4 5,2±1,71,2 5,1±0,9>л

15 4,0±0,92'3,4 7,8±1,1'Л4 6,5±1,3'-2 6,2±0,71,2

1 - отличия от «Контроль» - р < 0,05;2 - отличия от «ЛФС» - р < 0,05;3 -отличия от «Клексан» - р < 0,05;4 - отличия от «Гепарин» - р < 0,05.

Снижение уровня фибриногена в крови крыс с развивающейся ЛФС под действием антикоагулянтов приводит к уменьшению частоты обнаружения положительных проб на РКМФ у подопытных животных. Нарастание концентрации фибриногена, обусловленное прекращением действия препаратов, напротив, приводит к увеличению положительных проб на РКМФ. На 3 сутки эксперимента РКМФ определяется у 40% крыс группы «Гепарин»; на 15 сутки этот показатель составляет 75%. Применение низкомолекулярных гепаринов (клексан) способствует удержанию уровня РКМФ даже через неделю после отмены препарата. На 3 сутки после перевивки ЛФС РКМФ регистрируется в плазме 35% крыс группы «Клексан»; на 15 сутки - у 40%.

Развитие лимфосаркомы Плисса при коррекции системы гемостаза прокоагулянтами

В результате введения подопытным животным протамина сульфата на фоне роста опухоли отмечено достоверное снижение показателя прививаемости ЛФС. В группе «Протамин» прививаемость опухоли составила 60%, что на 20% ниже, чем в группе «ЛФС». Установлено увеличение интервала времени,

прошедшего от момента перевивки до регистрации пальпируемого опухолевого узла. Выявление узла ЛФС в группе «Протамин» (20,0±1,2 суток)происходило в среднем на 3,1 дня позднее, чем в группе «ЛФС» (16,9±1,4 суток) (р = 0,032). Позднее развитие ЛФС способствует увеличению продолжительности жизни крыс. В группе «Протамин» этот показатель статистически не отличался от группы «ЛФС» (32,1±4,5 суток) и составил 36,2±4,9 суток. Динамика развития ЛФС у крыс, получивших протамина сульфат, значительно замедлена по сравнению с группой «ЛФС».

Снижение прививаемости и замедление развития ЛФС происходят на фоне дополнительной активации системы гемостаза, обусловленной введением прокоагулянта. Значительной коррекции подвергается плазменный компонент гемостаза на начальных этапах формирования опухоли (табл. 5).

Таблица 5.

Состояние плазменного компонента системы гемостаза у крыс с перевиваемой ЛФС при применении протамина сульфата (М±БО)

Группа Сутки АЧТВ, ПВ, ВРП, Фибриноген,

Контроль 3 70±15дз 26,0±3,52'3 98±152'3 3,8±0,8ДЗ

15 66±13 27,5±3,32'3 103±132'3 4,0±0,92'3

ЛФС 3 50±10' 17,4±3,9''3 72±19и 6,6±1,4М

15 55±16 18,8±4,1' 70±15' 7,8±1,11

Протамин 3 43±9' 14,6±2,5''" 54±111,2 8,6±1,0'-'

15 54±12 16,8±2,7' 70±10' 8,0±0,8'

1 - отличия от «Контроль» - р < 0,05; 2 - отличия от «ЛФС» - р < 0,05; 3 -отличия от «Протамин» - р < 0,05.

Высокий уровень фибриногена положительно коррелирует с частотой регистрации положительных проб на РКМФ (г = 0,630). Это объясняет большие значения уровня РКМФ в группе «Протамин», сохраняющиеся в течение всего периода наблюдений. На 3 сутки эксперимента РКМФ регистрируется у 60% крыс группы «Протамин», на 15 сутки - у 50%. Тесты, определяющие состояние сосудистого и клеточного компонентов системы гемостаза, в большинстве случаев не выявили достоверного уровня отличий между группами «Протамин» и «ЛФС».

Развитие лимфосаркомы Плисса при коррекции системы гемостаза препаратами, улучшающими микроциркуляцию

При введении крысам пентоксифиллина и ксантинола никотината выявлено их разнонаправленное влияние на перевиваемую опухоль. Применение ксантинола никотината привело к стимулированию развития ЛФС, для пентоксифиллина показано ингибирующее действие на опухоль.

В группе «Пентоксифиллин» прививаемость опухоли составляет 67%, что на 13% и 33% меньше, чем в группах «ЛФС» и «Ксантинол», соответственно. Применение ксантинола никотината значительно сократило время, предшествующее регистрации первичного опухолевого узла. Оно составило 13,1±1,6 дня, что на 3,8 дня меньше, чем аналогичный показатель в группе «ЛФС» (р = 0,017). Пентоксифиллин, напротив, способствовал увеличению этого времени и у крыс группы «Пентоксифиллин» узел ЛФС выявляется на 17,6±1,0 день, что в среднем на 0,9 дня позже, чем в группе «ЛФС». Более раннее возникновение узла ЛФС в группе «Ксантинол» закономерно сокращает длительность жизни крыс. Этот показатель составляет в группе «Ксантинол» 25,8±4,3 суток, что в среднем на 6,3 дня меньше, чем в группе «ЛФС» (р = 0,048). Продолжительность жизни крыс, получивших курс пентоксифиллина, составляет 34,0 ±3,9 суток.

Разнонаправленное действие на опухолевый процесс применяемых препаратов наиболее ярко прослеживается при анализе данных по динамике роста ЛФС в экспериментальных группах. Введение подопытным животным пентоксифиллина способствует замедлению развития ЛФС. На 9 день роста объем узла ЛФС у крыс в группе «Пентоксифиллин» был на 10,3 см3 меньше, чем в группе «ЛФС» (р = 0,019). На 13 сутки - на 12,1 см3 (р = 0,010), на 15 сутки - на 7,5 см3 (р = 0,038). Применение ксантинола никотината приводит к быстрому развитию ЛФС. Уже на 5 сутки проведения измерений объем опухолевого узла в группе «Ксантинол» превышал объем в группе «ЛФС» на 17 см3 (р < 0,001). На 9 сутки отличия по данному показателю между группами составили 19 см3 (р < 0,001), на 13 сутки - 57,5 см3 (р < 0,001), на 15 сутки -56,5 см3 (р< 0,001).

Введение подопытным животным препаратов, улучшающих микроциркуляцию, приводит к коррекции нарушений системы гемостаза, сопровождающей развитие злокачественной опухоли.

Оба используемых препарата снижают уровень ЦЭЦ в группах «Пентоксифиллин» и «Ксантинол», по сравнению с группой «ЛФС». При этом большая коррекция этого показателя, достигающая значений, показанных для контрольной группы, установлена для пентоксифиллина.

Пентоксифиллин и ксантинола никотинат оказывают выраженное влияние на функциональную активность тромбоцитов крыс. Применяемые препараты увеличивают концентрацию тромбоцитов в крови крыс с ЛФС до величины сопоставимой с результатами контрольной группы, снижают показатели адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов животных-опухоленосителей. При этом статистически значимого уровня различий между группами «Пентоксифиллин» и «Ксантинол» не установлено.

Исследование коагуляциошюго гемостаза в группах «Пентоксифиллин» и «Ксантинол» выявило незначительную способность применяемых препаратов

снижать активность факторов плазменного компонента системы гемостаза крыс с перевиваемой ЛФС (табл. 6). Анализ показателей АЧТВ, ПВ и ВРП не показал наличия статистически значимых отличий между действием пентоксифиллина и ксантинола никотината. В тоже время продемонстрирована способность пентоксифиллина снижать уровень фибриногена в условиях экспериментального опухолевого роста. На 15 сутки концентрация фибриногена в крови крыс группы «Пентоксифиллин» была сопоставима с показателем в контрольной группе и значительно снижена по сравнению с группой «ЛФС» (на 3,3 г/л, р < 0,001). У крыс группы «Ксантинол» содержание фибриногена практически не изменилось в течение 15 суток от начала эксперимента. По мере снижения концентрации фибриногена в крови подопытных животных значительно реже регистрируются положительные пробы на РКМФ. В группе «Пентоксифиллин» на 3 сутки РКМФ зарегистрированы в плазме у 55% крыс; на 15 сутки - у 35%. В группе «Ксантинол» на 3 сутки РКМФ зарегистрированы у 60% крыс; на 15 сутки РКМФ-у 100%.

Таблица 6.

Состояние плазменного компонента гемостаза у крыс с перевиваемой ЛФС

при применении препаратов, улучшающих микроциркуляцию (М ± БВ)

Группа Сутки АЧТВ, ПВ, ВРП, Фибриноген,

Контроль 3 70*152 26,0*3,52 98*152 3,8±0,82''

15 66*13 27,5*3,32 103*172 4,0±0,9"'3

ЛФС 3 50±10' 17,4*3,9' 72*19' 6,6*1,4м

15 55±16 18,8±4,1' 70±15' 7,8*1,1'

Пентоксифиллин 3 49±1б' 19,4*3,0' 76±111 5,7*1,2'

15 59*12 21,0*3,6' 84±101,2 4,5*1,б2

Ксантинол 3 49±111 18,1±4,1' 69*10' 6,0*0,5'

15 57±13 19,5*3,8' 76±12' 5,7*1,4'

1 - отличия от «Контроль» - р < 0,05; 2 - отличия от «ЛФС» - р < 0,05.

Таким образом, нами выявлено разнонаправленное действие пентоксифиллина и ксантинола никотината, препаратов, обладающих сопоставимыми фармакологическими характеристиками, на развитие лимфосаркомы Плисса. Применение пентоксифиллина приводит к значительному снижению прививаемости ЛФС и замедлению всех параметров роста опухоли. Для ксантинола никотината, напротив, выявлена способность стимулировать развитие ЛФС. Для обоих используемых препаратов показана способность уменьшать активность гемостатических механизмов животных со злокачественной опухолью.

ВЫВОДЫ

1. Введение крысам массой тела 185 - 200 г. взвеси клеток лимфосаркомы Плисса в дозе 550 клеток/животное вызывает рост опухоли с частотой 60 -80%, что позволяет рассматривать эту дозу как оптимальную для исследования характеристик развития данного клона опухоли и влияния на них различных факторов.

2. Развитие лимфосаркомы Плисса зависит от пола животного. Частота успешной перевивки («прививаемость») опухоли и темпы ее роста у самок крыс ниже, чем у самцов при одинаковой дозе перевиваемого материала.

3. Развитие лимфосаркомы Плисса приводит к выраженным нарушениям всех компонентов системы гемостаза крыс, проявляющимся эндотелиальной дисфункцией, активацией клеточного компонента и гиперкоагуляцией. Степень дисфункции гемостатических механизмов нарастает по мере развития опухоли.

4. Введение антикоагулянтов прямого действия и препаратов, улучшающих микроциркуляцию, вызывающих ослабление дисфункции гемостатических механизмов, приводят к повышению прививаемости и темпов роста лимфосаркомы Плисса.

5. Усиление активации системы гемостаза крыс с развивающейся лимфосаркомой Плисса при введении протамина сульфата способствует снижению прививаемости опухоли и замедлению темпов ее роста.

6. Применение пентоксифиллина вызывает коррекцию нарушений системы гемостаза и одновременно тормозит развитие лимфосаркомы Плисса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленную дозу опухолевого материала лимфосаркомы Плисса 550 клеток/животное, вызывающую рост опухоли у 60 - 80% крыс, рекомендуется использовать для экспериментальной оценки эффекта различных факторов на рост опухоли.

2. Выявленный в ходе исследований факт дисфункции компонентов системы гемостаза крыс при развитии лимфосаркомы Плисса позволяет рекомендовать использовать эту опухоль в качестве модели для изучения паранеопластического синдрома Труссо.

3. Повышение частоты успешных перевивок лимфосаркомы Плисса при применении препаратов, улучшающих микроциркуляцию и ослабляющих прогемостатический потенциал крови, является первичным обоснованием проведения комплексного клинического и экспериментального исследования целесообразности широкого применения этих препаратов при лечении злокачественных опухолей различных локализаций и гистологического типа.

4. Рекомендуется провести специальное исследование влияния пентоксифиллина на развитие злокачественных опухолей с учетом полученных данных об ингибирующей роли этого препарата на частоту возникновения и рост лимфосаркомы Плисса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трашков А.П. Исследование зависимости перевиваемости крысиной лимфосаркомы Плисса от прививаемой дозы / А.П. Трашков, B.C. Федоров // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. H.A. Гавришевой, проф. В.И. Николаева-СПб.: 2007. - С. 126 - 128.

2. Трашков А.П. Исследование зависимости перевиваемости лимфосаркомы Плисса от массы тела (возраста) и пола крысы /B.C. Федоров, А.П. Трашков // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. H.A. Гавришевой, проф. В.И. Николаева-СПб.: 2007. - С. 129- 130.

3. Трашков А.П. Изменение показателя прививаемости лимфосаркомы Плисса в зависимости от дозы трансплантируемого опухолевого материала / А.П. Трашков, B.C. Федоров, М.А. Реутин // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. Т.Д. Власова, проф. В.И. Николаева - СПб.: СПбГМУ, 2008. - С. 98 - 99.

4. Трашков А.П. Сравнительный анализ действия среднемолекулярных гепаринов и ангиопротекторов на развитие лимфосаркомы (лимфомы) Плисса / А.П. Трашков // Всероссийская научно-практическая конференция «Посттромботическая болезнь». Тезисы докладов. - СПб.: СПбГУ, 2009. - С. 104-106.

5. Трашков А.П. Перспективы использования лимфосаркомы Плисса в изучении проблемы взаимоотношений беременности и злокачественных новообразований / М.А. Реутин, А.П. Трашков // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. Т.Д. Власова, проф. В.И. Николаева -СПб.: СПбГМУ, 2009. - С. 94 - 95.

6. Трашков А.П. Развитие лимфосаркомы (лимфомы) Плисса при введении нефракционированных гепаринов / А.П. Трашков, М.А. Реутин // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. Т.Д. Власова, проф. В.И. Николаева - СПб.: СПбГМУ, 2009. - С. 112 -113.

7. Трашков А.П. Анемический синдром при развитии лимфосаркомы Плисса / А.П. Трашков, М.А. Реутин, Д.В. Струков // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. Т.Д. Власова, проф. В.И. Николаева - СПб.: СПбГМУ, 2009. - С. 113 - 114.

8. Трашков А.П. Особенности развития лимфосаркомы Плисса у иммунизированных крыс при коррекции системы гемостаза среднемолекулярным гепарином / А.Г. Васильев, Н.В. Хайцев, А.П. Трашков, М.А. Реутин // Клиническая патофизиология. - 2009. - Вып. 1 -2. - С. 62 - 67.

9. Трашков А.П. Влияние пола животного и количества трансплантируемых опухолевых клеток на развитие Плисса / А.Г. Васильев, Н.В. Хайцев, А.П. Трашков, М.А. Реутин // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 11. Медицина. - 2009. - Вып. 2. - С. 135 - 142.

Отпечатано в ООО «АСпринт». Заказ № 235 Тираж 100 экз. Объем 1,25 пл.