Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Некоторые морфофункциональные изменения в иммунной системе при противоопухолевых эффектах комплексных электромагнитных воздействий в эксперименте

На правах рукописи

БАРТЕНЕВА Татьяна Альбертовна

НЕКОТОРЫЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ИММУННОЙ СИСТЕМЕ ПРИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЭФФЕКТАХ КОМПЛЕКСНЫХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАР 2011

Ростов-на-Дону, 2011

4840670

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РФ (директор института - профессор О.И. Кит)

доктор биологических наук, Г.В. Жукова

доктор медицинских наук, профессор Е.Ю. Златник

кандидат биологических наук, доцент И.С. Хусаинова

Саратовский государственный медицинский университет

_2011 г. в _часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.083.01 при Федеральном Государственном Учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Автореферат разослан « »_2011 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится « »

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор

Л.Ю. Голотина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. В последнее время в клинической онкологии все более широкое применение получают такие методы низкоинтенсивной электромагнитотерапии, как инфранизкочастотная магнитотерапия, КВЧ-терапия и СКЭНАР-терапия (Шихлярова А.И. и соавт., 2003, 2010; Карева Н.П., Поспелова Т.И., Позднякова C.B., 2008; АнкинаТ.И., 2009). Они используются для снижения токсического и повышения противоопухолевого эффектов химио- и радиотерапии, профилактики послеоперационных осложнений, уменьшения риска развития рецидивов и метастазов. Ранее было показано, что одним из важных механизмов лечебного действия слабых электромагнитных излучений является развитие антистрессорных адаптационных реакций организма, в первую очередь, реакций спокойной и повышенной активации (Гарка-ви Л.Х., 1968-2006; Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А., 1979, 1990; Плетнев С.Д., 2000). В связи с этим была разработана новая лечебная технология - активационная терапия, предусматривающая такие режимы осуществления слабых электромагнитных воздействий, которые увеличивают их эффективность и способствуют повышению неспецифической противоопухолевой резистентности организма (Гаркави Л.Х., 2ООО, 2006; Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., 1990; Шихлярова А.И., 2001).

К числу принципов активационной терапии относится использование низкоинтенсивных комплексных воздействий как более эффективных по сравнению с действием отдельных факторов (моновоздействий), поскольку они способны активизировать большее число регуляторных структур (Гаркави Л.Х., 2000, 2006). Между тем в настоящее время в медицине комплексные воздействия используются значительно реже, чем соответствующие моновоздействия, поскольку их эффекты не достаточно изучены. Ранее в эксперименте была показана способность комплексных воздействий вызывать торможение роста опухолей и даже их полную регрессию, подтвержденную результатами гистологического анализа и данными длительного наблюдения за животными с регрессировавшими опухолями, а также были выявлены некоторые механизмы, определяющие эффективность таких воздействий (Жукова Г.В., 2006). В то же время

3

результаты проведенного при этом гистологического анализа изменений в иммунной системе и ткани опухолей нуждались в дополнении и количественной оценке. Количественное изучение структурно-функциональных изменений в иммунной системе и ткани опухоли при эффективных комплексных электромагнитных воздействиях явилось необходимым этапом в выяснении механизмов их влияния на неспецифическую противоопухолевую резистентность организма, а также важной частью экспериментального обоснования новых методов электромагнитотерапии для целей клинической онкологии.

Цель работы. Выявить связь количественных показателей морфофунк-ционального состояния центрального и периферических звеньев иммунной системы с выраженностью противоопухолевого эффекта комплексных низкоинтенсивных электромагнитных воздействий, осуществляемых по алгоритмам активационной терапии.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Изучить морфофункциональные изменения в тимусе, селезенке и лимфатических узлах, а также в ткани и периферической зоне перевивных опухолей экспериментальных животных под влиянием крайне высокочастотного электромагнитного излучения (ЭМИ КВЧ) и сочетанного действия ЭМИ КВЧ и инфранизкочастотного магнитного поля (ИНЧ МП).

2. Изучить морфофункциональные изменения в исследуемых органах иммунной системы, а также в ткани и периферической зоне перевивных опухолей экспериментальных животных под влиянием СКЭНАР-терапии и комбинированного электромагнитного воздействия, включающего ЭМИ КВЧ и СКЭНАР-терапию.

3. Изучить изменения функционального состояния лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных при исследованных воздействиях.

4. Выявить изменения морфофункционального состояния органов иммунной системы, функционального состояния лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарной инфильтрации ткани опухоли, характерные для эффективных комплексных электромагнитных воздействия.

4

Научная новизна работы

В диссертационной работе автором впервые

• проведен количественный анализ изменений в центральном и периферических звеньях иммунной системы экспериментальных животных-опухо-леносителей при действии комплексных факторов электромагнитной природы, применявшихся в соответствии с алгоритами активационной терапии.

• выявлены количественные различия в показателях структурно-функционального состояния центрального и периферических звеньев иммунной системы, связанные с различной противоопухолевой эффективностью комплексных электромагнитных воздействий и соответствующих моновоздействий.

• получены количественные морфофункциональные характеристики противоопухолевого эффекта низкоинтенсивных комплексных электромагнитных воздействий, применявшихся в соответствии с алгоритмами активационной терапии.

Практическая значимость исследования

Полученные данные могут служить основанием для разработки эффективных методов электромагнитотерапии с использованием низкоинтенсивных комплексных воздействий в клинической онкологии в качестве сопровождающего, восстановительного и паллиативного лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Противоопухолевая эффективность комплексных электромагнитных воздействий, осуществляемых по алгоритмам активационной терапии, связана с определяемой количественно активизацией лимфопролиферативных процессов и межклеточных взаимодействий в органах иммунной системы, сопровождающихся перестройкой активности лейкоцитов периферической крови и усилением инфильтрации ткани опухоли клетками иммунной системы.

2. Различные эффективные комплексные электромагнитные воздействия при сходстве структурно-функциональных изменений в органах иммунной системы могут иметь различия в перестройках функциональной активности нейтрофилов крови.

Апробация результатов диссертации. Апробация диссертации состоялась 18 ноября 2010 г. на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах, получен патент на изобретение РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы. Список использованной литературы включает 217 источника (161 - отечественных и 56 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 18 таблицами и 36 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика экспериментального материала и методов исследования

Исследования проводились на 170-и белых беспородных крысах-самцах (200-250 г) с перевивными опухолями саркомой 45 (119 животных) и лимфо-саркомой Плисса (51 животное). Воздействия начинали при достижении опухолями размеров, при которых их спонтанная регрессия маловероятна (Коноплев В.П., 1960; Плисс Г.Б., 1961). Методика экспериментов соответствовала международным регламентациям экспериментов на животных (Копаладзе P.A., 2003).

В ходе экспериментов использовали низкоинтенсивное ЭМИ КВЧ с частотной модуляцией и СКЭНАР-терапию, а также два вида комплексных электромагнитных воздействий. При сочетанном электромагнитном воздействии одновременно применяли модулированное ЭМИ КВЧ и ИНЧ МП. При комбинированном электромагнитном воздействии последовательно проводили сеанс СКЭНАР-терапии и воздействие модулированным ЭМИ КВЧ. Воздействие ЭМИ КВЧ (аппарат КВЧ-терапии «Явь-1» и модулятор на базе генератора сигналов специальной формы Г6-37) имело следующие параметры - плотность потока мощности 10 мВт/см2/с, частота излучения 42,1-42,3 ГГц, для частотной модуляции ЭМИ КВЧ в полосе 200 МГц применяли последовательность сигна-

6

лов низких биоэффективных частот - 1,7, 3,4, 7,8, 15,6 Гц. Воздействие ЭМИ КВЧ осуществляли на затылочную область головы крысы. В случае соче-танного электромагнитного воздействия поличастотно модулированное ЭМИ КВЧ применяли одновременно со слабым ИНЧ МП малой индукции (1 мТл). При комбинированном электромагнитном воздействии сначала проводили сеанс СКЭНАР-терапии (аппарат «СКЭНАР-97.1»), а затем - воздействие ЭМИ КВЧ. Данные комплексные воздействия осуществлялись в соответствии с ранее разработанными алгоритмами (Жукова Г.В., 2006).

По окончании экспериментов животные были забиты путем эфирной перенаркотизации. Для фиксации материала использовали 10% раствор нейтрального формалина и фиксатор Карнуа. Для оценки общей микрокартины изучавшихся органов срезы толщиной 3-5 мкм окрашивались гематоксилин-эозином. Выявление нуклеопротеидов осуществлялось по методу Браше в модификации A.A. Симаковой (1960). Морфометрия ткани опухоли и ее периферической зоны осуществлялась с помощью автоматизированного измерительного комплекса «САГА» на базе ПК. В ткани опухоли (ув. 1000) определяли плотность клеточной популяции, подсчитывали клетки с фигурами митоза и дистрофически измененные клетки, а также выявляли состав инфильтрации, количество лимфоцитов и плазмоцитов в каждом 10-м поле зрения на 1000 клеток. В периферической зоне опухоли подсчитывали количество макрофагов, лимфоцитов, плазмоцитов, тканевых базофилов в каждом 5-м поле зрения с определением среднего количества.

Морфометрию тимуса и селезенки осуществляли по методу Г.Г. Автан-дилова (1990). В тимусе определяли ширину коркового вещества, стромально-паренхиматозный коэффициент. Содержание тканевых базофилов (Nt/6), а также число их контактов с тимоцитами определяли в 20-и случайных полях зрения для каждого наблюдения с вычислением среднего значения. В качестве показателя дегранулирования тканевых базофилов использовали коэффициент дегрануляции (КдегрТБ), который вычисляли в соответствии с известным методом (Онопченко Н.В., Кучерявый Г.Н., Срывкина Н.Л., 1991):

КдегрТБ = число максимально дегранулированных клеток / число максимально гранулированных клеток х 100%. В селезенке определяли число фолликулов с герминативными центрами (на 30 фолликулов). В герминативных центрах оценивали среднюю митотическую активность лимфоидных элементов, подсчитывая фигуры митоза в 50 полях зрения. Среднее число комплексов-ассоциатов макрофагов с лимфоцитами в красной пульпе селезенки определяли в 30 полях зрения. Величину периартериальных муфт, тимус-зависимых зон органа измеряли, используя винтовой окуляр-микрометр (Автандилов Г.Г., 2002). В лимфатических узлах определяли процентное содержание фолликулов с герминативными центрами, в которых подсчитывали клетки с фигурами митоза в 30 полях зрения. Кроме того, в синусах мозгового вещества лимфоузлов определяли число комплексов-ассоциатов макрофагов и лимфоцитов в 30 полях зрения.

Лейкоцитарная формула крови использовалась в качестве сигнального показателя характера и напряженности общих неспецифических адаптационных реакций (Гаркави Л.Х., 1968; Гаркави Л.Х., Квакина Е Б., 1990).

В крови экспериментальных животных изучали функциональное состояние нейтрофилов и моноцитов по показателям фагоцитарной активности, а также интенсивность кислородозависимых реакций «дыхательного взрыва», которую оценивали в нейтрофилах и моноцитах крови крыс с помощью спонтанного и стимулированного (зимозаном или латексом) теста восстановления нитросинего тетразолия до диформазана (НСТ-теста) с вычислением коэффициента НСТстим./НСТспонт. (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983). Кроме того, в мазках периферической крови оценивали функциональное состояние лимфоцитов, определяя активность митохондриальных гидролитических ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) - участвующих в важнейших энергетических процессах клеточного метаболизма (Зарецкая Ю.М, 1983).

При обработке полученных данных использовали параметрические и непараметрические критерии - I-критерий (Стыодента) и 7-критерий (знаков), а также анализировали вариабельность изучавшихся показателей.

8

Результаты исследования

Результаты исследования свидетельствовали о принципиальном сходстве характера структурно-функциональных изменений в ткани опухоли и разных звеньях иммунной системы под влиянием исследованных воздействий у животных с различными перевивными опухолями — лимфосаркомой Плисса и саркомой 45. Так, ЭМИ КВЧ не вызывало достоверного изменения размеров ни лим-фосаркомы Плисса, ни саркомы 45 к концу эксперимента, тогда как сочетанное воздействие (ЭМИ КВЧ+ИНЧ МП) оказывало выраженный эффект в отношении обеих исследованных опухолей, вплоть до регрессии этих опухолей в 2(М-0% случаев (рис. 1). При этом у животных как с саркомой 45, так и с лимфосаркомой Плисса, было отмечено и более значительное антистрессорное влияние сочетанного электромагнитного воздействия.

35%

20%

□ случаи регрессии

III случаи торможения роста

ЕЭ случаи роста

60%

45%

40%

Саркома 45 (А)

Лимфосаркома Плисса (Б)

Рис. 1. Показатели противоопухолевой эффективности сочетанного электромагнитного воздействия у животных с саркомой 45 (А) и лимфосаркомой Плисса (Б)

Регрессия обеих исследованных опухолей имела место, как правило, в случаях развития стойкой адаптационной реакции повышенной активации, не наблюдавшейся при действии только ЭМИ КВЧ. Она сопровождалась выраженными признаками активизации лимфопролиферативных процессов и межклеточных взаимодействий в органах иммунной системы. Гистологически регрессия опухолей проявлялась в виде замещения ткани опухоли соединительной тканью и выраженных дегенеративно-дистрофических изменений немногочисленных опухолевых клеток (рис. 2).

Рис. 2. Регрессия лимфосаркомы Плисса под влиянием сочетанного электромагнитного воздействия. Замещение ткани опухоли соединительной тканью. Обилие макрофагальных, лимфоидных и плазматических клеток. Браше. Ув. х 400

При использовании лимфосаркомы Плисса количественная характеристика инфильтрирующих опухоль иммунных клеток была затруднена вследствие лим-фоидного происхождения самой опухоли. Кроме того, противоопухолевый эффект исследованных воздействий у крыс с лимфосаркомой Плисса заключался исключительно в регрессии опухоли (рис. 1Б, рис. 2), полной или практически полной (когда, наряду с соединительной тканью, отмечались небольшие участки дегенеративно измененных клеток опухоли). Отсутствие градаций противоопухолевого эффекта также затрудняло сравнительную оценку влияния комплексных воздействий и соответствующих моновоздействий на неспецифическую противоопухолевую резистентность организма животных с лимфосаркомой Плисса. Эти причины обусловили выбор саркомы 45 в качестве основной экспериментальной модели для наиболее полного количественного изучения изменений одновременно в разных звеньях иммунной системы при противоопухолевых эффектах комплексных электромагнитных воздействий.

Микрокартина саркомы 45 при действии ЭМИ КВЧ свидетельствовала о развитии дегенеративно-дистрофических изменений в части клеток и тенденции к снижению их плотности, что приводило, как было отмечено выше, лишь к нестойкому торможению роста опухоли (табл. 1). При сочетанном электромагнитном воздействии в 65% случаев на фоне стойкой антистрессорной АР

10

повышенной активации наблюдался выраженный противоопухолевый эффект, заключавшийся либо в торможении роста опухоли на 73% (у 45% животных), либо в регрессии опухоли на 75% (в 20% случаев) (рис. 1 А). Такие крысы составляли подгруппу 1. У животных подгруппы 2 вес и размеры опухоли не отличались от контрольных значений. При выраженном торможении роста саркомы 45 под влиянием сочетанного воздействия в ткани опухоли отмечали снижение плотности клеточной популяции, митотической активности и увеличение числа клеток с дистрофическими изменениями (соответственно, в 2, 1,7 и 1,4 раза) по сравнению с показателями при использовании только ЭМИ КВЧ (табл. 1).

Таблица 1

Показатели морфофункционалышго состояния ткани саркомы 45 белых крыс при действии ЭМИ КВЧ и выраженном торможении роста опухоли под влиянием сочетанного электромагнитного воздействия (ЭМИ КВЧ + ИНЧ МП)

ЭМИ КВЧ+ИНЧ МП

Показатель Контроль п=16 ЭМИ КВЧ п=20 торможение роста опухоли, п=9 п/гр. 2, п=7

Вес опухоли, г 16,5±1,5 13,6±1,0 4,5±1,2 »оТ 14,5±1,1

Число клеток в 1 поле зрения 53,6±5,0 39,9±5,6 Т. 18,4±2,1 *пТ 39,0±3,0 •

к ч о Митотическая активность(%о) 47,2±4,2 21,6-1-4,2 • 12,3±1,4*пТ 19,7±1,1 •

о ►д к н Клетки с дистрофическими изменениями (%о) 9,9±1,3 80,8±7,0 • 118,2±11,4 *аГ 96,8±10,8 •

Кол-во лимфоцитов (%,) 34,5±2,6 80,8±10,5 • 130,9±13,2 «п 110,6±18,5 •

Примечание. Отличия от контрольных значений - • - р<0,05—0,001; Т. - р<0,1; от группы ЭМИ КВЧ: □ - р<0,05; от п/гр 2 ЭМИ КВЧ+МП: Т - р<0,05. Площадь поля зрения -6787 мкм2

При этом наблюдалось усиление лимфоцитарной инфильтрации ткани опухоли в 1,6 раз, а также увеличение лейкоцитарной инфильтрации периферической зоны опухоли по сравнению с наблюдавшимся при действии только ЭМИ КВЧ - число плазматических клеток увеличивалось в 1,4 раза, количество тканевых базофилов - в 2,3 раза, а также отмечалась тенденция к увеличению

11

лимфоцитов по сравнению с этими показателями при моновоздействии ЭМИ КВЧ (табл. 1 и 2). Таким образом, изменения количественного состава инфильтрировавших опухоль клеток иммунной системы соответствовали выраженности противоопухолевого эффекта сочетанного электромагнитного воздействия.

Таблица 2

Содержание клеток иммунной системы в периферической зоне саркомы 45 белых крыс при действии ЭМИ КВЧ и выраженном торможении роста опухоли под влиянием сочетанного электромагнитного воздействия (ЭМИ КВЧ + ИНЧ МП)

ЭМИ КВЧ + ИНЧМП

Число иммунных клеток в поле зрения Контроль п=16 ЭМИ КВЧ п=20 торможение роста опухоли, п/гр. 1, п=9 п/гр. 2, п=7

Макрофаги 0 4,5±0,9* 5,9±0,9 • 5,0±1,0 •

Лимфоциты 3,2±0,3 23,5±1,1* 26,9±1,3*Т„Т 21,9±1,2 •

Плазмоциты 0 4,6±0,6» 6,5±0,2 5,1±0,3 •

Тканевые базофилы 0,16*0,06 0,21±0,04 0,49±0,06 0,22±0,04

Примечание. Различия по отношению: к контролю • - р<0,05-0,001; от группы ЭМИ КВЧ: □ - р<0,05, Т„ - р<0,1; от п/гр. 2 ЭМИ КВЧ+ИНЧМП: Т - р<0,05. Площадь поля зрения - 6787 мкм2

Противоопухолевый эффект и более значительная активизация эффек-торных элементов иммунной системы в зоне опухоли под влиянием сочетанного электромагнитного воздействия, очевидно, были обусловлены процессами в центральном и периферических звеньях иммунной системы при развитии анти-стрессорной АР повышенной активации. Так, в случае сочетанного воздействия признаки лимфопролиферативной активности в тимусе были выражены в большей степени, чем при действии только ЭМИ КВЧ (табл. 3). Отмечалось снижение стромально-паренхиматозного коэффициента в 1,4 раза и тенденция к увеличению относительной площади коркового вещества долек тимуса, увеличение числа контактов тимоцитов с тканевыми базофилами в 1,7 раза при повышении функциональной активности тканевых базофилов, о чем свидетельствовало усиление их дегрануляции в 1,3 раза, по сравнении с отмеченным при моновоздействии ЭМИ КВЧ (табл. 3, рис. ЗА).

12

Таблица 3

Характер преобладавших в течение эксперимента адаптационных реакций (АР) и показатели морфофункционального состояния тимуса белых крыс с саркомой 45 при действии ЭМИ КВЧ и сочетанном электромагнитном воздействии (ЭМИ КВЧ + ИНЧ МП)

Показатель Контроль п—16 ' ЭМИ КВЧ п=20 ЭМИ КВЧ + ИНЧ МП

п/гр 1, п= 13 п/гр. 2, п=7

Преобладавшие АР Стр, САн, анизоцитоз САн ПА Трн, Стр

Весовой коэффициент 0,51±0,05 0,55±0,11 0,72+0,08 • 0,60+0,07

КВ 58,0±1,2 61,0±2,8 68,9±1,5 • Т„т 63,7±1,0 •

С/П х 100 6,7+0,3 5,2+0,6 • 3,7±0,3 • 5,7±0,4 •

Ит/б 3,79+0,39 4,58+0,43 4,96+0,58 4,43+0,48

К дегр. ТБ (%) 157+22 259+14 • 321+21 *п 283±23,5 •

Контакты ТБ с тимоцитами 1,41 ±0,23 1,92+0,09 Т. 3,35+0,24 *пТ 2,36+0,43

Примечание. Отличие от значений: в контрольной группе • - р<0,05-0,001, ТпТ -р<0,1; в группе ЭМИ КВЧ □ - р<0,05; в подгруппе 2 группы ЭМИ КВЧ+МП ▼ - р<0,05

Обозначения: КВ - относительная площадь коркового вещества долек тимуса; С/П - стромально-паренхиматозный коэффициент; №/б - количество тканевых базофилов в поле зрения; К дегр. ТБ (%) - коэффициент дегрануляции тканевых базофилов; САн, Трн - напряженные антистрессорные АР, соответственно, спокойной активации и тренировки.

В селезенке оба воздействия приводили к увеличению числа и размеров фолликулов, в том числе, фолликулов с герминативными центрами и митотиче-ски делящимися лимфобластами (в 1,7 раза, р<0,05) (рис. ЗБ).

Рис. 3. Органы иммунной системы белых крыс при регресси саркомы 45 под влиянием сочетанного электромагнитного воздействия. А. Тимус. Дегрануляция тканевых базофилов, их контакт с тимоцитами. Б. Селезенка. Розеткоподобные комплексы-ассоциаты макрофагов и лимфоцитов в красной пульпе. Браше. Ув. х 1000

Значительно, почти в 4 раза (р<0,01) увеличивались и размеры тимус-зависимых зон (периартериальных муфт) по сравнению с животными контрольной группы. При этом отличие между воздействиями было отмечено только по показателям активности межклеточных взаимодействий в селезенке - при сочетанием воздействии в 1,2 раза (р<0,05) увеличилось число розеткоподобных комплексов-ассоциатов спленоцитов и макрофагов в красной пульпе по сравнению с этим показателем при моновоздействи ЭМИ КВЧ. Кроме того, о заметной активизации лимфоцитов, входивших в указанные комплексы-ассоциаты, свидетельствовало интенсивное окрашивание их ядер, отражавшее усиление синтеза ДНК (рис. ЗБ).

В лимфатических узлах оба воздействия способствовали существенному повышению лимфопролиферативной активности. В 1,7-1,8 раза (р<0,05) увеличилось содержание фолликулов с герминативными центрами и более чем в 2 раза усилилась митотическая активность спленоцитов (р<0,05). Об активизации межклеточных взаимодействий свидетельствовало увеличение в 1,6-1,7 раза (р<0,05) числа комплексов макрофагов и лимфоцитов в синусах мозгового вещества лимфоузлов по сравнению с контролем. Достоверных различий между воздействиями на уровне исследованных показателей в данном органе выявлено не было.

Изменения функционального состояния лейкоцитов крови при эффективности сочетанного воздействия выражались в повышении показателей фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов в 1,2-2,1 раза (р<0,05, рис.4), а также в увеличении показателей интенсивности кислород-зависимых реакций моноцитов (в 1,7-1,9 раз, р<0,05) по сравнению с соответствующими показателями при действии только ЭМИ КВЧ. Эти процессы сопровождались значительным увеличением вариабельности поглощательной способности (фагоцитарного числа) и интенсивности спонтанных кислородозависимых реакций моноцитов (соответственно, в 2,8 и в Зраза), что могло отражать развитие функциональной гетерогенности моноцитов, усложнение и оптимизацию их функционирования при сочетанном воздействии.

Рис. 4. Сравнение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов (нф) и

моноцитов (мон) крови крыс с саркомой 45 при действии ЭМИ КВЧ и эффективном сочетанном электромагнитном воздействии. ФА - фагоцитарная активность (%), ФЧ - фагоцитарное число (количество поглощенных тест-объектов)

Все отмеченные изменения в иммунной системе и ткани опухоли могли быть интерпретированы следующим образом: сочетанное электромагнитное воздействие, в отличие от моновоздействия ЭМИ КВЧ, позволило обеспечить эффективные регуляторные влияния на различные структуры иммунной системы, что привело к выраженному повреждению опухолевой ткани, опосредованному эффекторными элементами иммунной системы.

Другое исследованное моновоздействие - СКЭНАР-терапия - было более I эффективным, чем ЭМИ КВЧ. Так, если при ЭМИ КВЧ наблюдалось только нестойкое торможение роста опухоли, то в случаях применения СКЭНАР-терапии отмечали выраженный противоопухолевый эффект в 55% случаев (подгруппа 1) в виде полной или практически полной регрессии опухоли (20% случаев) или торможения ее роста на 57% у остальных животных (35% случаев) (рис. 5). Комбинированное электромагнитное воздействие, включавшее СКЭНАР -терапию и ЭМИ КВЧ (СКЭНАР + ЭМИ КВЧ), было более эффективным, чем только СКЭНАР-терапия. При комбинированном воздействии выраженный эффект был получен у всех животных - в 36% случаев наблюдалась полная или практически полная регрессия опухоли, а у остальных животных (64% случаев) - торможение роста опухоли на 71% (рис. 5).

15

20%

□ случаи регрессии

□ случаи торможения роста

0 случаи роста

35%

36%

СКЭНАР

64%

СКЭНАР+ЭМИ КВЧ

Рис. 5. Показатели противоопухолевой эффективности действия СКЭНАР-терапии и комбинированного электромагнитного воздействия у крыс с саркомой 45

Более выраженное, чем при СКЭНАР-терапии, торможение роста опухоли под влиянием комбинированного воздействия (71% против 57%) сопровождалось и более интенсивной, чем при СКЭНАР-терапии, лейкоцитарной инфильтрацией опухоли (табл. 4, рис. 6А). Так, в ткани опухоли при этом количество лимфоцитов возросло в 1,5 раза, а количество плазмоцитов - в 1,7 раз по сравнению с соответствующими показателями при СКЭНАР-терапии (табл. 4).

Таблица 4

Лейкоцитарная инфильтрация саркомы 45 при торможении роста опухоли под влиянием СКЭНАР-терапии и комбинированного электромагнитного воздействия

Показатель Контроль п=15 СКЭНАР п=7 СКЭНАР+ЭМИ КВЧ п=18

Вес опухоли (г) 11,1+1,4 4,8±0,6» 3,2±0,4»п

Ткань опухоли (%о) Лимфоциты 34,94+5,69 94,51+9,18 • 143,06+22,72»п

Плазмоциты 0,63±0,60 3,96+1,02 « 6,86+1,27 »п

Периферическая зона опухоли (количество клеток в поле зрения) Лимфоциты 3,11±0,3 21,71+2,57» 21,38+1,32»

Плазмоциты 0 5,06+0,82» 11,34+2,88»п

Макрофаги 0 3,53+0,0,38» 4,41+0,81»

Тканевые базофилы 0,13+0,06 0,41+0,06» 0,56+0,07» Тп

Примечание. Различия по отношению: к контролю • - р<0,05-0,001; к подгруппе 1 СКЭНАР □ -р<0,05-0,001, Т0. р<0,1. Площадь поля зрения-6787,12 мкм2

В периферической зоне опухоли при комбинированном воздействии число плазмоцитов в 2,2 раза было выше, чем при моновоздействии СКЭНАР-терапии,

16

а также была отмечена тенденция к увеличению количества тканевых базофилов (табл. 4, рис. 6Б). Эти результаты позволяли говорить об усилении местных иммунных реакций при комбинированном электромагнитном воздействии.

А Б

Рис. 6. Саркома 45. Комбинированное воздействие СКЭНАР+КВЧ. А. Обширные участки некроза при частичной регрессии опухоли. Ув.х 400. Б. Инфильтрация иммунными клетками Ув.х 1000. Браше

Аналогично отмеченному при сочетанном электромагнитном воздействии, комбинированное электромагнитное воздействие оказывало более выраженное активизирующее влияние на лимфопролиферативные процессы в тимусе, чем СКЭНАР-терапия (табл. 5).

Таблица 5

Показатели морфофункционального состояния тимуса крыс-олухоленосителей при эффективной СКЭНАР-терапии и комбинированном электромагнитном воздействии

Показатель Контроль, п=15 СКЭНАР п/гр. 1, п—11 СКЭНАР+КВЧ, п=28

Характер преоблад. АР Стресс, напр .АР СА, ПА СА, ПА

Весовой коэффициент 0,75±0,07 1,29±0,11 • 1,26+0,21 •

КВ 48,3+1,0 64,5+1,4» 70,9+1,5

С/Пх 100 4,7±0,6 1,8±0,1 • 1,4+0,1

Шб 3,89+0,41 4,53+0,61 5,01 ±0,43 Т.

КдегрТБ (%) 133,75+24,5 318,6+64,8 • 308,4+55,6 •

Контакты с тимоцитами 1,37±0,28 2,16+0,31 Т. 3,64+0,28

Примечание. Различия по отношению: к контролю • - р<0,05-0,001; к группе СКЭНАР □ - р<0,05-0,001, Т. - р<0,1: КВ - относительная площадь коркового вещества долек тимуса; С/П - стромально-паренхиматозный коэффициент, №/б - количество тканевых базофилов в поле зрения, КдегрТБ (%) - коэффициент дегрануляции тканевых базофилов, напр. АР - напряженные антистрессорные адаптационные реакции

Наблюдалось снижение стромально-паренхиматозного коэффициента на 22% и достоверное увеличение относительной площади коркового вещества долек тимуса по сравнению с этими показателями при СКЭНАР-терапии.

В селезенке, в группе с комбинированным воздействием, в 1,3 раза увеличивалось число фигур митоза в герминативных центрах фолликулов (р<0,05), тенденция к увеличению этого же показателя по сравнению со значением при моновоздействии СКЭНАР-терапии (р<0,1) была отмечена и в лимфатических узлах. Таким образом, микрокартина органов иммунной системы крыс с выраженным противоопухолевым эффектом комбинированного электромагнитного воздействия отличалась наиболее высоким уровнем лимфопролиферативной активности (рис. 7). В совокупности с данными о сходстве сравниваемых воздействий по характеру АР (табл. 5) это могло указывать на развитие антистрес-сорных АР более высоких уровней реактивности, чем при эффективной СКЭНАР-терапии.

А Б

Рис. 7. Выраженные лимфопролиферативные процессы в органах иммунной системы у крыс с регрессией саркомы 45 под влиянием комбинированного электромагнитного воздействия. А. Тимус. Увеличение размеров долек и площади коркового вещесства. Ув.х 100. Б. Селезенка. Высокая митотическая активность в лимфобластах герминативных центров. Ув. хЮОО. Браше

Активизации межклеточных взаимодействий при комбинированном воздействии по сравнению со СКЭНАР-терапией наблюдалась только в тимусе. Было отмечено увеличение в 1,7 раза числа контактов между тимоцитами и тканевыми базофилами (табл. 5), что указывало на изменение состояния этих клеток по сравнению с состоянием тимоцитов и тканевых базофилов у животных при СКЭНАР-терапии.

Таким образом, характер различий между комбинированным электромагнитным воздействием и СКЭНАР-терапией по показателям состояния органов иммунной системы и ткани опухолей был аналогичен отмеченному при сравнении эффектов сочетанного электромагнитного воздействия и ЭМИ КВЧ.

При исследовании показателей функционального состояния лейкоцитов крови также были выявлены различия между эффектами СКЭНАР-терапии и комбинированного электромагнитного воздействия. Оба воздействия препятствовали значительному снижению активности фермента а-глицерофосфат-дегидрогеназы (а-ГФДГ), характерному для роста опухоли, а также способствовали изменению соотношения активности ферментов сукцинат-дегидрогеназы (СДГ) и а-ГФДГ по сравнению с отмеченным в контрольной группе (р<0,05) и приближению его к значениям у интактных животных. В то же время при использовании комбинированного воздействия в лимфоцитах периферической крови наблюдалась иная динамика активности СДГ, чем при СКЭНАР-терапии. Активность СДГ была наиболее высокой среди всех групп крыс-опухоленосителей, не отличавшейся от значений у интактных животных, в случаях торможения роста опухоли (более чем на 25% выше, чем в контрольной группе и при эффективной СКЭНАР-терапии, р<0,05) и наиболее низкой среди всех исследованных групп животных в случаях регрессии саркомы 45 (р<0,05). Мы полагаем, что такое снижение данного показателя могло быть обусловлено эффективной реализацией лимфоцитами своего высокого функционального и энергетического потенциала, необходимой для достижения наиболее значительного эффекта, обеспеченного комбинированным воздействием.

Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов крови позволило выявить различия в состоянии этих клеток не только между комбинированным воздействием и СКЭНАР-терапией, но и между двумя исследованными комплексными воздействиями. Если при эффективности сочетанного воздействия происходило повышение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов по сравнению с их значениями при моновоздействии ЭМИ КВЧ (рис. 4), то при комбинированном воздействии фагоцитарное число при спонтанном фагоцитозе, напротив, было примерно в 1,5 раза (р<0,05) меньше, чем в контрольной

19

группе и при эффективной СКЭНАР-терапии (рис. 8). Ситуация резко изменялась при стимуляция фагоцитоза зимозаном. Происходило снижение поглощающей способности нейтрофилов у крыс контрольной группы и животных, получавших СКЭНАР-терапию, на 18 и 11%, соответственно, и, напротив - повышение этой способности в группе с комбинированным воздействием почти в 1,5 раза, до максимальных значений в сравнивавшихся группах (р<0,05, рис. 8).

140 120 -100 -80 -60 -40 -20 0 --20 -40 --60 -

lK0HTD0nb

ЕСКЭНАР п/га.1

ОСКЭНАР+ЭМИ КВЧ

а

и

1

ФЧ сп.хЮ

ДФЧ%

ДФЧ%то5

Рис. 8. Спонтанная (сп.) и стимулированная поглощающая способность (ФЧ) нейтрофилов крови крыс-опухоленосителей при эффективной СКЭНАР-терапии (СКЭНАР п/гр.1) и комбинированном электромагнитном воздействии (СКЭНАР+ЭМИ КВЧ). Обозначение. ДФЧ% - относительное изменение ФЧ после стимуляции зимозаном в целом по каждой из групп, АФЧ%торм. - относительное изменение ФЧ после стимуляции зимозаном у животных с торможением роста саркомы 45 под влиянием исследованных воздействий

При этом вариабельность показателя при моновоздействии и в контрольной группе животных снизилась примерно в 2 раза, тогда как при комбинированном воздействии, напротив, повысилась более чем в 1,5 раза, приблизившись к 70%. Существенное увеличение поглощающей способности нейтрофилов и вариабельности этого показателя при стимулированном фагоцитозе свидетельствуют о повышении функционального потенциала этих клеток и их функциональной гетерогенности при комбинированном воздействии. Такие различия могли указывать на изменение функционального профиля нейтрофилов при комбинированном воздействии по сравнению с их функционированием при эффективной СКЭНАР-терапии. Дополнительным основанием для такого

20

предположения послужили данные о динамике фагоцитарного числа при стимуляции фагоцитоза при сходном противоопухолевом эффекте сравниваемых воздействий - торможении роста саркомы 45. Изменение данного показателя в результате стимуляции нейтрофилов зимозаном имело ту же направленность, что и при сравнении групп в целом, но было еще более выраженным (не менее чем в 1,9 раз, р<0,05, рис.8).

На рисунках 9 и 10 в обобщенном виде представлены выявленные изменения в разных звеньях иммунной системы, отличавшие комплексные воздействия от соответствующих моновоздействий.

Опухоль

Структура АР

Наличие выраженного противоопухолевого эффекта - выраженное торможение роста (С-45) и регрессия опухолей(С-45, лимфосаркома Плисса)

Улучшение структуры АР -

уменьшение напряженности, повышение уровня реактивности

Иммунная система

Тимус

1. Лимфопролиферативная активность -

увеличение в 1,4 раза

2.Межклеточные взаимодействия:

- увеличение числа контактов «тканевой базофил-тимоцит» в 1,7 раз

- увеличение степени дегрануляции тканевых базофилов в 1,3 раза

Селезенка

Межклеточные взаимодействия: увеличение числа комплексов-ассоциатов «макрофаг-спленоцит» в 1,2 раза

Лейкоциты крови

- увеличение фагоцитарной активности Нф и Мон в 1,2-2,1 раза\

- увеличение интенсивности кисло-родозависимых реакций Мон

в 1,7-1,9 раза;

- увеличение функциональной гетерогенности Мон.

Лейкоциты в опухоли

увеличение числа (в 1,1-2,3 раза)

- лимфоцитов,

- плазмоцитов,

- тканевых базофилов

Рис. 9. Отличие эффектов сочетанного воздействия ЭМИ КВЧ и ИНЧ МП от эффектов ЭМИ КВЧ

Опухоль

Структура АР

Выраженный противоопухолевый эффект —усиление противоопухолевых эффектов СКЭНАР-терапии

Улучшение структуры АР-

уменьшеиие напряженности, повышение уровня реактивности

Иммунная система

Тимус 1. Лимфопролиферативная активность - увеличение в 1,2 раза 2.Межклеточные взаимодействия - увеличение числа контактов «тканевой базофил-тимоцит» в 1,7 раз Лейкоциты крови - Лф: повышение активности СДГ в 1,3 раза при снижении ее при регрессии. - Нф: снижение фагоцитарной активности в 1,5 раз при значительном увеличении фагоцитарного потенциала и функциональной гетерогенности

Селезенка Лимфопролиферативная активность -увеличение в 1,3 раза

Лейкоциты в опухоли

увеличение числа (в 1,6-2,2 раза) - лимфоцитов, - плазмоцитов, - тканевых базофилов

Лимфатический узел Лимфопролиферативная активность -тенденция к увеличению

Рис. 10. Отличие эффектов комбинированного воздействия СКЭНАР-терапии и ЭМИ КВЧ от эффектов СКЭНАР-терапии

Характер этих отличий по показателям морфофункционального состояния органов иммунной системы и лейкоцитарной инфильтрации опухолей был аналогичен у исследованных комплексных воздействий. В то же время при сходстве во влиянии на показатели состояния органов иммунной системы изученные комплексные воздействия отличались друг от друга по их влиянию на состояние нейтрофилов. По нашему мнению, такие различия отражают устойчивость механизмов гомеостаза, проявляющуюся в существовании различных путей достижения изменений, жизненно важных для состояния организма в целом (Николис Г., Пригожин И., 1990).

Полученные результаты позволяют дать ряд количественных характеристик связи противоопухолевых эффектов низкоинтенсивных комплексных электромагнитных воздействий, предъявлявшихся в соответствии с алгоритмами активационной терапии, с изменениями в центральном органе иммунной системы и некоторых ее периферических звеньях. Эти характеристики позволяют получить более полное представление об эффектах комплексных воздействий и соответствующих моновоздействий, указывают на возможные механизмы реализации этих эффектов и позволяют обосновать целесообразность применения комплексных электромагнитных воздействий в противоопухолевом лечении.

ВЫВОДЫ

1. Усиление противоопухолевой эффективности активационной элек-тромагнитотерапии вследствие комплексного применения воздействий (вплоть до регрессии перевивных саркомы 45 и лимфосаркомы Плисса у 20-40% животных) сопровождается морфофункциональными изменениями в центральном и периферических звеньях иммунной системы, свидетельствующими о более значительной активизации иммунных механизмов, чем при эффективности соответствующих моновоздействий.

2. Противоопухолевые эффекты комплексных электромагнитных воздействий сопровождаются более значительной инфильтрацией ткани и периферической зоны перевивных опухолей клетками лейкоцитарного ряда по сравнению с отмеченной при эффективности соответствующих моновоздействий. Это выражалось в повышении содержания лимфоцитов и плазмоцитов в ткани опухолей в 1,5-1,7 раза, а также количества плазмоцитов и тканевых базофилов в периферической зоне опухолей до 2,2-2,3 раз (р<0,05) относительно показателей при моновоздействиях.

3. При эффективности комплексных электромагнитных воздействий повышение лимфопролиферативной активности в тимусе более значительно, чем при эффективности соответствующих моновоздействий. Это выражалось в снижении стромально-паренхиматозного коэффициента в 1,2-1,4 раза (р<0,05) и

23

тенденции к увеличению размеров коркового вещества долек тимуса (р<0,1) относительно показателей при моновоздействиях.

4. При эффективности комбинированного воздействия СКЭНАР-терапии и электромагнитного излучения КВЧ-диапазона повышение лимфо-пролиферативной активности в селезенке более значительно, чем при эффективной СКЭНАР-терапии. Это выражалось в повышении митотической активности в герминативных центрах фолликулов в 1,3 раза, а также в увеличении размеров тимус-зависимых зон (периартериальных муфт) в 1,2 раза (р<0,05) относительно показателей при СКЭНАР-терапии.

5. При эффективности комплексных электромагнитных воздействий признаки межклеточных взаимодействий в тимусе более выражены, чем при эффективности соответствующих моновоздействий. Отмечено увеличение числа контактов тимоцитов и тканевых базофилов в 1,7 раз (р<0,05), а при сочетанием действии электромагнитного излучения КВЧ-диапазона и инфранизко-частотного магнитного поля - также и усиление дегрануляции тканевых базофилов в 1,3 раза (р<0,05), относительно показателей при моновоздействиях.

6. При эффективности сочетанного действия электромагнитного излучения КВЧ-диапазона и инфранизкочастотного магнитного поля признаки межклеточных взаимодействий в селезенке более выражены, чем при действии излучения КВЧ-диапазона. Отмечено увеличение числа комплексов-ассоциатов макрофагов с активированными лимфоцитами в красной пульпе селезенки в 1,2 раза (р<0,05) относительно показателя при действии излучения КВЧ-диапазона.

7. При эффективности комплексных электромагнитных воздействий показатели, характеризующие активность и/или функциональный потенциал лейкоцитов крови выше, чем при эффективности соответствующих моновоздействий (р<0,05-0,01). При этом характер изменений активности нейтрофилов крови зависел от типа комплексного воздействия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бартенева Т.А. Повышение эффективности электромагнитоте-рапии в эксперименте путем сочетания действия излучений крайне высокочастотного и сверхнизкочастотного диапазонов / Г.В. Жукова, JI.X. Гар-кави, А.И. Шихлярова, О.Ф. Евстратова, Т.А. Бартенева // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - М., 2005. - №1-2. - С. 10-16.

2. Бартенева Т.А. Антнстрессорные адаптационные реакции и новые технологии электромагнитотерапии в восстановительном лечении онкологических больных / JI.X. Гаркави, Г.В. Жукова, H.H. Капкина, Н.М. Мащенко, О.Ф. Евстратова, Т.А. Бартенева, C.B. Поушкова // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ 14-16 мая 2008 г. - Ташкент, 2008. - С. 514.

3. Бартенева Т.А. Антнстрессорные реакции и адаптационные возможности организма / JI.X. Гаркави, Г.В. Жукова, О.Ф. Евстратова, Т.А. Бартенева, Н.М. Мащенко // Материалы II Междунар. конф: «Актуальные проблемы биологии, биотехнологии и медицины» 8-10 октября 2008 г. - Ростов н/Д (Россия), 2008.-С. 91-92.

4. Бартенева Т.А. Антнстрессорные механизмы противоопухолевого влияния слабых электромагнитных воздействий / JI.X. Гаркави, Г.В. Жукова, О.Ф. Евстратова, Т.А. Бартенева, Н.М. Мащенко, C.B. Поушкова, М.И. Суханова // Материалы II Съезда физиологов СНГ, 29-31 октября 2008 г. - Кишинев (Молдова), 2008. - С. 258-259.

5. Бартенева Т.А. Изменения в иммунной системе при противоопухолевых эффектах слабых электромагнитных воздействий в эксперименте / Г.В. Жукова, JI.X. Гаркави, Т.А. Бартенева, О.Ф. Евстратова, Е.А. Ники-пелова, C.B. Поушкова, Л.П. Барсукова, Г.Я. Марьяновская // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т.10, JV® 3. - С. 344-349.

6. Barteneva Т.А. Morpho-functional changes in immune system of rats with enchanced antitumor resistance induced by application of electromagnetic factors to the central nervous system / G.V. Zhukova, E.Yu. Zlatnik, O.F. Eustratova, T.A. Barteneva, S.V. Poushkova, E.A. Nikipelova // Материалы II Междунар. симпозиума «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии». - СПб. 2009 (16-19 июня). - С. 78.

7. Бартенева Т.А. Некоторые подходы к разработке и повышению эффективности использования аппаратов для электромагнитотерапии / Г.В. Жукова, Л.Х. Гаркави, О.Ф. Евстратова, Н.М. Мащенко, Т.А. Бартенева, С.А. Дубо-вицкий, В.И. Петросян, C.B. Власкин // Материалы III Междунар. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». - Ростов-на-Дону, ЮФУ, 1-4 октября 2009. - С. 63-64.

8. Бартенева Т.А. Морфологические характеристики противоопухолевого эффекта слабого сочетаниого электромагнитного воздействия в эксперименте / Т.А. Бартенева, Г.В. Жукова, О.Ф. Евстратова, Л.Х. Гаркави И Известия ВУЗ Северо-Кавказский регион. Клиническая и эксперим. онкология. - 2010. Спецвыпуск. - С. 85-88.

9. Бартенева Т.А. Способ лечения злокачественных новообразований в эксперименте / Л.Х. Гаркави, Г.В. Жукова, А.И. Шихлярова, О.Ф. Евстратова, A.B. Кондратов, Ю.В. Костровицкий, Н.К. Пшеничная, C.B. Поуш-кова, Т.А. Куркина, Т.А. Бартененва - Патент на изобретение № 2286811. Бюл. № 31 от 10.11. 2006.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 2092 Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88