Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние ингибитора ангиотензин-превращающего фермента - периндоприла на сердечно-сосудистую систему крыс с хронической сердечной недостаточностью

. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ

на правах рукописи

ЗАХАРОВА Наталья Владиславовна

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА АНГИОТЕНЗПН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА - ПЕРИНДОПРИЛА НА

СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТУЮ СИСТЕМУ КРЫС С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

14.00.25- фармакология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной фармакологии (рук,-д.м.н., проф. О.С. Медведев) НИИЭК (директор - академик. РАМН В.Н. Смирнов) Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗМП РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор О.С.Медведев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г. Г. Чичканов

доктор биологических наук O.A. Гамазков

Ведущее учереждение — Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится "_"_ 1996г. в_час. на заседании

специализированного ученого совета Д 001.25.01 при Институте фармакологии РАМН по адресу: г.Москва, 125315, ул.Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части Института фармакологии РАМН.

Автореферат разослан "_"_ 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Е.А.Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Хроническая сердечная недостаточность является одним из основных видов патологии, определяющей заболеваемость и смертность в мире. В патогенезе сердечной недостаточности важную роль играет ренин-ангиотензин-альдостероновая система. Один из важнейших элементов этой системы - ангиотензин-превращаюший фермент (АПФ), принимающий участие в регуляции сосудистого тонуса. Экспериментальные и клинические исследования последних десятилетий с очевидностью показали влияние нейрогормональных механизмов на развитие хронической сердечной недостаточности (Packer, 1993; Brooks, Osbom, 1995). Однако начальная стадия развития сердечной недостаточности протекает без видимых изменений в сердечно-сосудистом гомеостазе, в то время как нейрогормональная активация уже имеется (Hodsman et al., 1988; Francis, 1990). Тем не менее в литературе нет однозначного мнения о том, какая из состашмющих нейрогуморальной системы определяет патогенез сердечной недостаточности. Поэтому очень важно охарактеризовать статус сердечно-сосудистой и ренин-ангиотензиновой систем в начальной (компенсированной) стадии развития сердечной недостаточности.

В исследовании новых кардиотонических и вазодилатирующих препаратов, удовлетворяющих требованиям клиницистов, важная роль принадлежит выбору адекватных экспериментальных моделей сердечной недостаточности. Недостатком ранее разработанных моделей являлось отсутствие дозированной эмболизации коронарных сосудов у мелких животных, неизбирательность ишемического воздействия, что приводило к чрезмерной эмболизации сосудов других органов и усложняло интерпретацию получаемых результатов.

В настоящее время препараты класса ингибиторов АПФ являются препаратами выбора при лечении больных с сердечной недостаточностью. Периндоприт один из последних препаратов этого класса. Периндоприл угнетает образование ангиотензина II с большей эффективностью и в меньшей дозе, чем каптоприл. Открытие органных и тканевых ренин-ангиотензиновых систем (РАС) привело к необходимости выяснения их вклада в регуляторные механизмы поддержания системного артериального давления и патогенеза сердечной недостаточности. Установлено, что периндоприл предотвращает сердечную гипертрофию, однако неизвестно, является ли положительное действие периндоприла лишь результатом снижения пред- и постнагрузки или он оказывает непосредственное влияние на сердце, модулируя симпатическую регуляцию сердечно-сосудистой системы. Известно, что изменение

артериального давления не всегда коррелирует с активностью плазменного АПФ, и может быть связано с активностью тканевых систем, поэтому важно определить активность АПФ не только в плазме, но и в различных регионах. Так как при сердечной недостаточности активность симпато-адреналовой системы повышается, что приводит к изменению функционального состояния артериальных и венозных сосудов. Методическая сложность исследования тонуса вен на бодрствующих животных создает трудности в адекватной оценке состояния этих сосудов при патологии. Поэтому остается актуальным исследование состояния тонуса вен, как для более детатьного понимания механизмов развития сердечно-сосудистых патологий, так и их фармакотерапии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось изучение состояния сердечно-сосудистой и ренин-ангиотензиновой систем у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью на ранннх стадиях развития данной патологии и оценка влияния хронического введения периндоприла на статус этих систем.

В соответствии с основной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Дать гемодинамическую характеристику модели сердечной недостаточности в компенсаторной стадии.

2. Оценить состояние венозной системы при данной патологии.

3. Дать морфологическую характеристику эмболизированного миокарда.

4. Определить активность АПФ в плазме крови, в тканях, в сердечно-легочном регионе.

5. Провести фармакологическую коррекцию данной патологии ингибитором АПФ — периндоприлом. Для этого через 21 день терапии периндоприлом исследовать:

а) морфологию тканей миокарда,

б) системную и региональную гемодинамику,

в) состояние венозной системы,

г) Определить активность циркулирующего, тканевого и регионального АПФ в исследуемой модели.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на модели сердечной недостаточности, вызванной дозированной эмболизацией коронарных сосудов, проведен системный анализ состояния сердечно-сосудистой системы и оценена активность ренин-ангиотензиновой системы в хроническом эксперименте на бодрствующих животных. Впервые осуществлено морфологическое исследование ткани миокарда в динамике развития сердечной недостаточности, начиная с острой ишемии до выраженного кардиосклероза. Выявлена прямая корреляционная зависимость

клиренса ангиотензина I от степени повреждения миокарда. Впервые получены данные о тонусе емкостных сосудов у эмболизированных животных. В результате исследований было показано, что эмболизация коронарных сосудов приводит к повышению тонуса вено зных сосудов и снижению сердечного выброса. Хроническое введение ингибитора АПФ - периндоприла вызывало выраженный сосудорасширяющий эффект артерий и вен, улучшало гемодинамические показатели эмболизированных животных, а именно: увеличиваю сердечный выброс, снижапо артериальное давление, увеличиваю коронарный кровоток в сердце, почках, желудке, тонком кишечнике. Периндоприл нормализовыват измененный у эмболизированных животных клиренс ангиотензина I. Морфологические исследования продемонстрировали кардиопротекторное действие периндоприла.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Полученные в экспериментальных исследованиях данные представляют теоретический интерес, поскольку расширяют и углубляют представление о состоянии сердечно-сосудистой системы и роли ренин-ангиотензиновой системы в компенсаторной стадии сердечной недостаточности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены на ежегодных научных конференциях Пятигорского фармацевтического института (1993, 1995); на конференции молодых физиологов и биохимиков России в Санкт-Петербурге, 1995, Sattelite of 2nd Asian-Pacific Symposium on ACE Inhibitors of the Renin-Angiotensin System. Beijjing, April 25-28, 1995, на 1-ом Съезде Российского общества фармакологов в Волгограде, 1995.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование хронической сердечной недостаточности. Для моделирования сердечной недостаточности использовали предложенную ранее (Gorodetskaya et al., 1990) методику эмболизации коронарных сосудов 15 мкм радиоактивными микросферами (Со-57, Gd- 153, Sc-46, Sr-85; NEN, США). Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Wistar массой 330-370 г. Под наркозом (нембутал, 40 мг/кг, внутрибрюшинно) имплантировали полиэтиленовый катетер (РЕ 10, РЕ 50; Clay Adams, США) в полость левого желудочка через наружную ветвь правой сонной артерии, что обеспечивало сохранность общего ствола сонной артерии и позволяло использовать ее в дальнейшем для катетеризации левого желудочка. Микросферы вводили в левый желудочек в первые 3 секунды во время 10-секундного пережатия восходящей аорты в количестве 400000-500000 (за 3 раза) с 10-минутным перерывом (3-ая, 2-ая, 3-ая окклюзии), 4-ое пережатие было контрольным.

Окклюзию дуги аорты осуществили с помощью Г-образного крючка, который вводился в грудную полость путем прокола в третьем межреберье справа без вскрытия грудной клетки. Сердечный катетер через тройник соединялся с электроманометром и системой для ввода микросфер. После эмболизации катетер и крючек вынимали, ветвь перевязывали, операционную рану обрабатывали и зашивали. Контролем служили ложно-оперированные крысы, которым проводили подобные процедуры, но во время пережатия восходящей аорты вместо микросфер вводили такой же объем физиологического раствора. Через 21 день после эмболизации или ложной операции животных повторно наркотизировали и имплантировали артериачьный катетер (РЕ-10, РЕ- 50; Clay Adams, США) в брюшную аорту через правую бедренную артерию для регистрации артериального давления (АД) и сердечный катетер в левый желудочек сердца через правую сонную артерию. На следующие сутки бодрствующих животных брали в опыт. Выбор срока был обусловлен морфологическими данными, указывающими на развитие сердечной недостаточности к концу 3-ей недели после инфаркта миокарда (Fishbein et al., 1978), что подтверждается и характерными гемодинамическими изменениями (Pfeffer et al., 1979; Drexler et al., 1989).

Исследование параметров системной и региональной гемодинамики проводили методом меченых радиоактивными изотопами микросфер. Данный метод был выбран как наиболее точный и физиологичный для регистрации кровотока и сосудистого сопротивления (Медведев и др., 1986). Однократно вводилось около 100000 микросфер. За 5 секунд до введения микросфер начинали забирать кровь из брюшной аорты. По окончании эксперимента животных забивали передозировкой нембутала; органы и ткани, в которых определяли кровоток, взвешивали и помещали в пробирки. Измерения количества микросфер в крови и образцах органов производили на гамма-счетчике "CompuGamma 1282"("LKB-Wallac"), Финляндия. Определяли сердечный выброс (СВ), общее периферическое сопротивление сосудов (ОПСС), ударный обьем (УО), кровоток и сосудистое сопротивление в различных органах и тканях животных.

У бодрствующих крыс измеряли (АД), систолическое давление в левом желудочке (СД), конечно-диастодическое давление в левом желудочке (КДДЛЖ), скорость повышения давления (+dp/dt) и скорость понижения давления (-dp/dt) в левом желудочке, частоту сердечных сокращений (ЧСС). Оцифровку и запись параметров в цифровом виде проводили на компьюторе IBM PC/AT с использованием системы многоканальной обработки физиологических сигналов в реальном времени "Bioshell".

Для определен™ параметров системной и региональной гемодинамики были выделены 4 группы животных:

1 группа - ложно-оперированные животные, получавшие физиологический раствор.

2 группа - эмболизированные животные, получавшие физиологический раствор.

3 группа - ложно-оперированные животные, получавшие перорально ежедневно периндоприл в дозе 2 мг/кг в течение 21 дня.

4 группа - эмболизированные животные, получавшие перорально ежедневно першщоприл в дозе 2 мг/кг в течение 21 дня.

На 21 день животные были наркотизированы и катетеризированы, как описывалось выше. Животные брались в опыт через 24 часа после операции в бодрствующем состоянии. Исследование емкостной функции вен проводили методом определение среднего давления наполнения (СДН).

Среднее циркуляторное давление наполнения определяли по методике Yamamoto et al.,1980. Крысам в полость правого предсердия через яремную вену имплантировали полиэтиленовый катетер с латексным баллончиком на конце. Для измерения центрального венозного давления (ЦВД) силиконовый катетер вживляли через бедренную вену в нижнюю полую вену. Для измерения АД полиэтиленовый катетер имплантировали в брюшную аорту. Регистрацию АД и ЦВД осуществляли с помощью электроманометра Statham 23ID США, сигналы подавали и записывали на самописце Grass 7D, США. СДН рассчитывали по формуле:

СДН = ПВД + (КАД - ПВД)/60, где ПВД - плато венозного давления, КАД - конечное артериальное давление, 1/60 - коэффициент, учитывающий соотношение растяжимости артериальных и венозных сосудов.

Животные были разделены на 4 группы, каждая группа соответствовала тем группам, которые использовались для изучения гемодинамики. На 21 день животные были наркотизированы и прооперированы в соответствии с методикой. Измерение СДН производили на следующий день на бодрствующих животных.

Исследования определения активности АПФ проводились совместно с д.м.н. С.М. Даниловым. Активность АПФ в образцах плазмы и тканей определяли флуориметрически модифицированным методом Friedland & Silverstain (1976) и Piquilloid, Reinharz, Roth (1970). Этот метод основан на определении образования дипептида His-Leu из субстрата Phe-His-Leu. Интенсивность флюоресценции определяли при длине волны возбуждения 363 нм, длине волны испускания 500 нм. За 1 единицу активности АПФ принимали величину 1 мкмоль/л His-Leu, образующегося в минуту. Пробы

отбирались после эвтаназии животных, участвующих в эксперименте по изучению гемодинамики. Определение активности фермента производилось одновременно во всех пробах.

Оценка активности ангиотензин-лревращающего фермента in vivo. Активность фермента оценивали по интенсивности превращения А] в AII, выраженной величиной и соотношением равновесных концентраций 1251-А1 и Ш1-А11 (AI/AII) в крови крыс при инфузии 1251-А1. Синтетический пептид иодировали с помощью хлорамина Т и выделяли меченый продукт методом колоночной жидкостной хроматографии. Радиоактивность элюата определяли на гамма-счетчике "CompuGamma 1282" (LKB-WALLAC), Финляндия. Чистоту моноиодированного пептида контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Область равновесных концентраций меченых ангиотензинов I и II в крови при инфузии Ш1-А1 определяли в эксперименте по трем временным точкам. В течение 20 минут инфузии вводимая доза AI (50 нг/мин) не вызывала гемодинамических изменений у крыс.

Отбор крови в объеме 1 мл проводили непосредственно в экстракционную среду (2 мл), предложенную для экстракции пептидов из биоматериала. Количественный анализ 1251-А1 и 125I-AII методом (ВЭЖХ) проводили в градиентном режиме с УФ детектированием на колонке Lichrosorb RP, 125x4 мм, с диаметром частиц 5 мкм.

Эксперименты проводили на 3 группах крыс через 21 день после эмболизации или ложной операции.

1 группа - ложно-оперированные животные, получавшие физ. раствор

2 группа - эмболизированные животные, получавшие физ. раствор.

3 группа - эмболизированные животные, получавшие периндоприл.

Гистологическое исследование сердец крыс после эмболизации

коронарных артерий проводилось совместно с лабораторией экспериментальной патоморфологии Медицинской Академии под руководством профессора А.Б. Шехтера.

После вскрытия животных сердца фиксировались в нейтральном (забуференном) 10% формалине, заливались в парафин. Микротомные срезы толщиной 5-7 мк изготавливали в продольной плоскости через желудочки и предсердия, окрашивали гематоксилин-эозином, пикрофуксином по ван Гизону, с помощью PAS - реакции на гликоген. Сроки исследования -1,3,7, 21 сутки после эмболизации, изучались также сердца интактных животных.

На 21 сутки после эмболизации проведено сравнительное изучение двух групп животных 1 - эмболизированные, получавшие физ. раствор, 2 -эмболизированные, получавшие перорально периндоприл в дозе 2 мг/кг/сутки.

Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась на компьютере типа IBM PC XT с использованием пакета статистиских программ SOLO (США) и Supercalc 4 (США). Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью t-критерия Стьюдента и множественного дисперсионного анализа сравнения. При значимом уровне величины F группы обрабатывались методом Бонферрони с использованием пакета статистических программ SOLO (США). Для сравнения внутри каждой группы относительно исходного состояния был использован тест Wilcoxon, для межгрупповых сравнений использовали тест Mann-Whitney. Различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05. Данные в тексте представлены как M±ni (среднее + станданая ошибка среднего).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Из ранее опубликованных данных (Smiseth, Mios, 1982) известно, что сократительная способность ЛЖ снижается пропорционально количеству микросфер, попавших в коронарные сосуды. Наиболее резкие изменения при этом происходят с показателями максимального давления, развиваемого левым желудочком во время окклюзии аорты (Ртал) и максимальной скорости нарастания давления (dp/dtmax). Поэтому эффективность эмболизации определяли по этим показателям. Данные представлены в таблице 1. Эмболизация коронарных сосудов приводила к значительному снижению Ршах, вместе с тем сократительная способность миокарда (dp/dtmaí) падала вдвое. Изменение этих показателей служило основным тестом, определяющим качество эмболизации животных, так как четырехкратное 10-секундное пережатие восходящей аорты у контрольных животных не вызывало достоверных изменении функции левого желудочка. Результаты наших исследований показали, что эмболизация коронарных сосудов у крыс через 21 день приводила к достоверному снижению СВ на 12%, снижению коронарного кровотока в правом желудочке сердца на 26% , к увеличению периферического сосудистого сопротиатение в правом желудочке сердца на 36%, к повышению среднего давления наполнения на 12%. Остальные гемодинамические показатели достоверно не различались (таб. 2).

Таблица 1. Максимальное систолическое давление в левом желудочке

(Р шах) и максимальная скорость нарастания давления (+йр/(Мтах) во время окклюзии восходящей аорты у ложно-оперированных и эмболизированных крыс.

Параметры ложно-оперированные эмболизированные

п = И п = 11

окклюзия окклюзия

1-ая 4-ая 1-ая 4-ая

Ртах (мм рт. ст.) 248 + 3 250 ±3 251 + 3 195±3*$

+dp/dt max (мм рт. ст/сек) 13833 + 327 13583 + 280 14000±580 7417+802*$

Примечание: данные представлены, как М±м,

* - Р< 0.001 по сравнению с ложно-оперированными животными $ - Р< 0.001 по сравнению с 1-ой окклюзией сосудов.

Все эти изменения гемодинамики являются признаками сердечной недостаточности (Pfeffer et al., 1985). Аналогичные изменения насосной функции сердца описаны через 48 часов после перевязки коронарной артерии у крыс при ишемизации около 20% массы левого желудочка (Bech et al.,1986; Shoemaker et al., 1990). Патоморфологическое исследование сердец крыс в различные сроки после эмболизации коронарных артерий микросферами свидетельствует о развитии множественного некротического повреждения миокарда вследствие эмболических нарушений микроциркуляции, что впоследствии приводит к мелкоочаговому кардиосклерозу. Степень поражения миокарда варьирует в зависимости от количества попадающих в сосуды сердца микросфер. В правом желудочке, как правило, развиваются более выраженные изменения, что соответствует большей концентрации микросфер, попавших в правый желудочек во время эмболизации (Э.А. Аллабергенова, 1991).

Через сутки после эмболизации в миокарде появлялись мелкие фокусы некроза кардиомиоцитов с перифокальной или диффузной инфильтрацией этих очагов нейтрофилами. Отмечачись также изменения микроциркуляции. Дистрофические изменения сосудов в виде стаза и диапедеза эритроцитов, повышения проницаемости их стенок, лейкопедеза, отеке стромы миокарда изменения кардиомиоцитов определялись как в околоинфарктных зонах, так и в более удаленных участках. На 21 сутки после инфаркта очаги некрозаполностью резорбировались и замещались соединительнотканными рубцами. Часть их состояла из плотной фиброзной ткани, другие из рыхлой ткани. Иногда площадь рубцовых изменений наблюдалась достаточно

обширной (по-видимому, следствие слияния очагов инфаркта), что приводило к истончению и аневризме стенки желудочка.

Таблица 2. Показатели гемодинамики и среднего циркуляторного давления наполнения у ложно-оперированных и эмболизированных крыс._

Параметры ложно- эмболизированные

оперированные п= 11

11=11

АД (мм рт. ст.) 102+2 102+4

ЧСС (уд/ мин) 399±11 374±14

СИ (мл/мин/100 г) 40±1.3 37.2±0.9*

ОПСС (мм рт.ст./мин/ЮОг) 2.55+0.09 2.76+0.14

кровоток в стенке правого

желудочка сердца 5.0Ю.41 3.68±0.31

(мл/мин/г)

сосудистое сопротивление

в правой коронарной 22+1.9 30+2.7

артерии

(мм рт.ст./мл/мин/г)

КДДЛЖ (мм рт. ст.) 11+1.4 12.1 + 1.7

+дар/дхтп (мм рт. ст./сек) 11982+443 11034+732

-с1рЛигак (мм рт.ст./сек) 8336±487 7864±530

СДН (мм рт. ст.) 7.6±0.2 8.4±0.2*

Примечание: данные представлены, как М+м,

*-р<0.05 по сравнению с ложно-оперированными.

Обозначения: АД - среднее артериальное давление; ЧСС - частота сердечных сокращений; ОПСС - общее периферическое сосудистое сопротивление; СИ - сердечный индекс; КДДЛЖ - конечно-диастолическое давление в левом желудочке; СДН - среднее давление наполнения.

К 21 суткам после начала опыта оставался мелкоочаговый кардиосклероз и дистрофия кардиомиоцитов. Рубцы миокарда состояли из плотной фиброзной ткани, еще более богатой коллагеновыми волокнами, чем раньше. У ложно-оперированных животных под действием периндоприла наблюдалось снижение АД, контрактильности миокарда. Поскольку в то же время происходило снижение КДД левого желудочка, а ОПСС не изменялось, мы можем предполагать, что эти изменения происходили за счет уменьшения венозного возврата.

•«¡рли -арш опсс кддлж

* - р < 0.05 по сравнению с соответствующим контролем.

# - р< 0.05 по сравнению с ложно-оперированными, получавшими периндоприл.

Рисунок 1. Изменение параметров системной гемодинамики у ложно-оперированных (незакрашенные столбики) и эмболизированных крыс (закрашенные столбики) после хронического введения периндоприла в % к соответствующему контролю.

У эмболизированных животных периндоприл вызывал сопостовимое с контрольными животными снижение АД, но достоверно снижал сосудистое сопротивление, КДДЛЖ, на 20% увеличивал СВ (рис 1). Распределение сердечного выброса после хронического введения препарата показало, что действие периндоприла зависит не только от сосудистых зон организма, по-разному реагирующих на препарат, но и от патологического состояния самого

организма. Кровоток возрастал в почках на 43%, правом и левом желудочках сердца (на 75% и 23% соответственно), тонком кишечнике на 56%, в желудке на 17% только в группе эмболизированных животных, получавших периндоприл. Менее чувствительными к препарату оказались кожа, скелетные мышцы, печень, надпочечники.

I I -лохаю-оперюованные НШ -эмболижрованные

Гш

* #

I ¿а

У и.

У чн

• 9

I

ч а ^ с в

X 5 < < 5

о 3 Я " 5 х г X = *

* — р<0.05 по сравнению с соответствующим контролем.

# — р <0.05 по сравнению с ложно —оперированными животными, получавшими периндоприл.

Рисунок 2. Изменения регионального кровотока в % к соответствующему контролю после хронического введения периндоприла. Незакрашенные столбики - ложно-оперированные животные, закрашенные -эмболизированные.

Кровоток в мозге имел тенденцию к увеличению. У ложно-оперированных животных кровоток возрастат только в почках, и снижался в мозге на 23%, в правом желудочке сердца на 23%, в левом желудочке сердца на 29%.

Такая различная реакция на препарат у различных групп животных свидетельствует о том, что у контрольных животных ренин-ангиотензиновая система не активирована, тогда как в случае исследуемой патологии она активируется и оказывает прессорное воздействие для поддержания сердечнососудистой системы в компенсированном состоянии в условиях сниженного сердечного выброса. Исследование тонуса венозных сосудов различных групп животных подтвердило наличие измененного состояния активности РАС эмболизированных животных Периндоприлат в дозе 0.5 мг/кг достоверно снижал АД и повышенное эмболизацией СДН только у эмболизированных животных и не влиял на эти параметры у ложно-оперированных животных (рис 3). При хроническом введении периндоприл снижал СДН у крыс с сердечной недостаточностью на 28%, а у ложно-оперированных только на 13% (таб. 3). Это свидетельствует о том, что периндоприл вызывает дилатацию не только артериальных, но и венозных сосудов, облегчает работу сердца (Olivan et al., 1982), что согласуется с имеющимися в литературе клиническими результатами (Flapan et al., 1992) и экспериментальными исследованиями (Tabrizchi et al., 1992). Как следует из представленных данных, в создаваемой модели выраженные гемодинамические изменения претерпевает прежде всего сердечно-легочный регион, а именно - снижение сердечного выброса, снижение коронарного кровотока в сердце, тенденция снижения кровотока в легких. Недостаток сердечно-легочного кровообращения приводит к изменению кардиоваскулярного гомеостаза, что проявляется в повышении тонуса венозных сосудов.

Таблица 3. Изменение сердечно-сосудистых показателей у ложно-оперированных и эмболизированных крыс после хронического введения периндоприла.

Показатели ложно-оперированные эмболизированные

п = 12 и = 12

физ. р-р. периндоприл физ. р-р. периндоприл

АД (мм рт.ст.) 108+4 81+3* 105 + 2 82 + 3# *

ЧСС (уд в мин) 358 ±11 371±9 344+9 375 + 8

СДН (мм рт. ст.) 6.93±0.16 6.05 ±0.24* 8.23± 0.17* 6.00±0.24#

Примечание: данные представлены, как М±м, * - р< 0.05 по сравнению с ложно-оперированными, получавшими физиологический раствор. # - р< 0.05 по сравнению с эмболизированными, получавшими физиологический раствор.

Инфаркт миокарда сопровождается изменением гуморального статуса систем организма. В связи с этим интерес представляют данные, полученные нами при изучении у раатичных групп животных активности АПФ в органах и плазме (таб. 4). Мы продемонстрировали, что эмболизация достоверно снижала активность АПФ в правом желудочке сердца на 60%, в левом желудочке сердца на 24% (но не достоверно), в легких на 32% и повышала активность плазменного АПФ на 46% по сравнению с ложно-оперированными животными.

120

периндоприлат

Рисунок 3. Эффект периндоприлата на АД, ЧСС, СДН у ложно-оперированных (незакрашенные столбики) и эмболизированных (закрашенные столбики).

* - р<0.05 по сравнению с ложно-оперированными.

# - р<0.05 по сравнению с исходными значениями

Снижение активности АПФ в желудочках сердца объясняется наличием диффузного склеротического и дистрофического повреждения всего миокарда,

причем прослеживается зависимость между степенью повреждения миокарда (что подтверждено морфологическим исследованием) и падением активности АПФ сердца. Наши исследования согласуются с литературными данными (Huang et at., 1994) на крысах через три месяца после инфаркта миокарда. У таких животных бьио обнаружено снижение активности АПФ в легких, увеличение активности АПФ в плазме, которое было пропорционально тяжести сердечной недостаточности. Определение уровня мРНК АПФ легких показало, что снижение активности АПФ в легких происходит за счет угнетения синтеза фермента, но не за счет уменьшения его аффинности.

Таблица 4. Активность АПФ в плазме и различных тканях органов крыс с сердечной недостаточностью и ложно-оперированных крыс после лечения периндоприлом._

Активность АПФ (мЕ/мг протеина) п = 10

легкие почки п.сердце л.сердце плазма

ЛФ 40.8 + 3.02 0.77+0.08 0.27 + 0.04 0.13+0.013 1.75+0.25

ЭФ 28.1+0.43* 0.56+0.07 0.11+0.02* 0.10±0.015 2.57 + 0.51*

ЛП 39.5 + 2.62 0.42+0.07* 0.08 ±0.01*# 0.09±0.019* 0.96+0.28*

ЭП 34.2±2.82 0.35±0.04*# 0.12+0.03* 0.06±0.010*# 0.75±0.22*#

Примечание: данные представлена, как М+м, ЛФ - ложно-оперированные, получавшие физ.раствор ЭФ - эмболизированные, получавшие физ.раствор ЛП - ложно-оперированные, получавшие периндоприл ЭП - эмболизированные, получавшие периндоприл * - р< 0.05 по сравнению с ложно-оперированными, получавшими физиологический раствор. # - р< 0.05 по сравнению с эмболизированными, получавшими физиологический раствор.

Парадоксальное увеличение активности плазменного АПФ при снижении легочного АПФ при сердечной недостаточности может быть объяснено несколькими механизмами. Во-первых, снижение функционирования эндотелия при сердечной недостаточности может изменять процесс солюбшшзации АПФ на мембране, выражающийся в увеличении выхода АПФ (Wei et al., 1991). Хотя легкие являются наиболее активным местом синтеза АПФ, тем не менее АПФ синтезируется всеми эндотелиальными клетками других органов (Reams et al., 1993) и этот процесс может быть изменен при сердечной недостаточности. Во-вторых, неэндотелиальные источники АПФ, такие как мононуклеарные клетки воспаления и фибробласты могут также увеличивать активность плазменного АПФ (Friedland et al., 1978; Costerousse et

al., 1993). Кроме того, это может происходить за счет снижения скорости распада АПФ вследствие ухудшения деятельности печени при сердечной недостаточности, что было описано для многих других белков (Arnal et al., 1991).

Хроническое введение периндоприла вызывало подавление активности АПФ в плазме на 46% у ложно-оперированных и на 190% у эмболизированных животных. Периндоприл подавлял активность АПФ в почках в сопоставимых величинах у ложно-оперированных (46%) и эмболизированных (37%) животных. Между тем увеличение кровотока в почках у эмболизированных животных было выше в 2 раза, чем у ложно-оперированных. В левом желудочке сердца активность АПФ у ложно-оперированных животных была подавлена на 31%, у эмболизированных на 40%. Вместе с тем коронарный кровоток у ложно-оперированных снижался на 30%, а у эмболизированных животных возрастал на 23%. Эта разнонаправленная реакция подтверждает различное состояние РАС в двух группах животных, указывая на активацию системы у эмболизированных животных.

Концентрация AI в плазме зависит как от скорости его образования, так и от скорости его выведения из плазмы (конверсия в АН и другие фрагменты, выведение почками и т. д.). В итоге плазменные концентрации эндогенного пептида не отражают интенсивности процесса его потребления в тканях. Поэтому животным проводилась инфузия меченого радиоактивным иодом ангиотензина I до достижения равновесной концентрации пептида в плазме. Равновесные концентрации меченого AI позволяют определить его клиренс.

Интенсивность метаболизма экзогенного AI в выбранной дозе отражает таковую для эндогенного пептида, так как не вызывает гемодннамических изменений.

По сравнению с ложно-оперированными, у эмболизированных животных концентрации AI в четыре раза ниже, что не связано с переходом в АН, так как концентрации АН также снижены (таб. 5). В условиях постоянной скорости инфузии AI этот факт может быть объяснен, с одной стороны, тем что у больных животных большая доля AI элиминируется по другим метаболическим путям, а с другой стороны - возможностью более интенсивного захвата AI тканями легких.. Следовательно, при патологии большая, чем в контроле доля инфузируемого AI подвергается деградации иными, чем АПФ ферментами. Хроническое введение ингибитора привело к нормализации соотношения AI и All, то есть как бы восстановило до уровня ложно-оперированных животных .

Повышенные концентрации образующегося All у леченых животных можно отнести либо за счет усиленного его образования (несмотря на повсеместное ингибирование активности АПФ), либо за счет замедленной элиминации.

Таблица 5 . Равновесные концентрации AI и All (тыс. расп/мин/г крови), величина AJ/AII и клиренс AI (мл/мин) у крыс различных экспериментальных групп после хронического введения периндоприлом.__

Группа AI АН AI/AII CI AI

ложно-оперированные, п—6 4.135+0.78 3.670+0.706 1.236+0.11 314.4

эмболиз.физ.р-р, п = 7 0.879+0.15* 2.037+0.33* 0.507+0.08* 1479

эмболизир. + 3.76±0.48# 2.708+0.33 1.464+0.12# 345.7

периндоприл, п = 5

Примечание: Данные представлены, как М+м.

Величину клиренса (CL AI) рассчитывали по формуле:

скорость инфузии (срм/мин) / равновесная концентрация (срм/мл)

по средним групповым значениям.

* - р<0.05 относительно ложно-оперированных.

# - р<0.05 относительно эмболизированных.

Другим объяснением значительных концентраций АН в крови при хроническом приеме периндоприла, является возможность превращения AI в АН, катализируемого не АПФ и, следовательно, не зависимого от присутствия ИАПФ (Campbell et al., 1994). Известно, что А1 может служить субстратом не только для АПФ, но и для целого ряда других энзимов, в том числе химаз (Urata et al., 1990), эндопептидаз, сериновых протеаз и других ферментов (Okunishi et al., 1984; Campbell et al., 1993).

По-видимому, соотношение "классического" АПФ-опосредованного и "неклассического" путей образования АН различно для разных тканей и может быть органоспецифичным. Такой подход согласуется с фактом, что степень прироста концентраций AI и падение концентраций АН в ответ на введение ИАПФ в каждом органе отлична от других и не параллельна динамике пептидов в крови (Unger et al., 1986; Campbell et al., 1994).

"Смещенность" метаболизма AI подтверждается и результатами болюсного введения каптоприла (таб. 6). Через 5 мин после введения каптоприла (0.5 иг/кг), вследствие ингибирования АПФ сосудистого русла, на 63% падает концентрация АН у ложно-оперированных и на 64% у

эмболизированных животных. Одновременно концентрации AI в контрольной группе прирастают на 34%, и не изменяются у эмболизированных животных.

Таблица 6. Равновесные концентрации AI и А-II (распад/мин/г крови) и величина AI/AII в крови ложно-оперированных и эмболизированных крыс до и после болюсного введения каптоприла в дозе 1 мг/кг

ложно-оперированные п =7 эмболизированные п = 7

исходные значения 5 мин каптоприл исходные значения 5 мин каптоприл

AI 4135+780 5563 + 740# 879+160* 891 + 160*#

All 3670 + 700 1369+80# 2037+330* 706 + 150*#

AI/AII 1.236 + 110 5.108 ±920# 0.507 + 80* 1.366+ 120*#

Примечание: данные представлены, как М + м, * - р< 0.05 по сравнению с ложно-оперированными

# - р< 0.05 по сравнению с исходным значением

Нами была установлена достоверная корреляция между AI и АН у ложно-оперированных крыс. У эмболизированных животных эта зависимость отсутствовала. У эмболизированных животных, получавших периндоприл, наблюдалась высокая степень корреляции концентраций AI и АН, вместе с тем и отношение AI/AII нормализовывалось (рис. 4). Если в контрольной группе это отношение составило 1.24, то у эмболизированных 0.5, а у эмболированных, получавших периндоприл 1.46. Преобладание равновесных концентраций AI над АН в группе леченых животных по сравнению с их обратным соотношением у больных свидетельствует о сниженной региональной элиминации AI.

На основании полученных данных нами была обнаружена достоверная корреляция между концентрациями AI в артериальной крови и количеством рубцов на 1 срез. Однако, еще большая корреляция наблюдалась между отношением AI/AII и количеством рубцов на 1 срез, (рис 5). Следует отметить, что коэффициент корреляции между концентрациями АН и степенью поражения миокарда в эмболизированной группе был равен 0.41, что является недостоверным. Тем не менее высокая корреляция наблюдалась между отношением AI/AII и количеством рубцов. Таким образом, отноношение AI/AII является более информативным показателем, чем сами концентрации ангиотензинов. Как было показано в работе (Campbell et al., 1994) отношение концентраций AI и АН для плазмы и тканей является более чувствительным

индикатором изменения активности АПФ, чем непосредственное определение активности фермента.

8000,'Ы г =0.84

(р0.05)

бооа

4000

200а

Контроль

AI

1000 2000 3000 4000 5000 6000

All

8000 п 6000 4000 2000-

Эмболизация

All

1000 2000 3000 4000 5000 6000

AI

8000

6000 4000 2000

Эмболизация+периндоприл

All

1000 2000 3000 4000 5000 6000

Рисунок 4. Зависимость концентраций ангиотензина II (All) от ангиотензина I (AI) в артериальной крови при инфузии меченого AI в различных группах животных.

Гистологический сравнительный анализ эмболизированных леченых и нелеченых животных свидетельствует о том, что количество рубцов, их площадь и развитие выраженного кардиосклероза при лечении уменьшается (таб.7). Дистрофические изменения кардиомиоцитов на 21 сутки в миокарде в группе леченых животных имеют меньшую выраженность, а содержание

гликогена в клетках достоверно выше, чем в нелеченой группе. Все это объясняется улучшением метаболизма миокарда при лечении периндоприлом.

AI

0'

г = 0.77 (р<0.05)

О 5 10 15 20 25 30

AI/All количество рубцов

2.0 п ,

на 1 срез

б] "

г = 0.81 (р<0.05)

10 15 20 25 30 количество рубцов на 1 срез

1.5

Рисунок 5. А. Зависимость равновесной концентрации (распад/мин/г крови) ангиотензина I от степени повреждения миокарда. Б. Зависимость отношений AI/A1I от степени повреждения миокарда.

Таким образом, эмболизация коронарных сосудов микросферами приводит к множественному нарушению микроциркуляции с последующей некротизацией тканей и последующему формированию рубцов, состоящих из плотной фиброзной ткани. Оставшиеся миоциты в значительной части дистрофичны наряду с наличием гипертрофированных форм. Необратимость эмболизации, кроме того, имеет следствием некоторую недостаточность кровоснабжения миокарда (ишемию), несмотря на формирование артерио-венозных анастомозов. Перечисленные повреждения сердечной мышцы формируют миокардиальную недостаточность, что выражается в достоверном падении сердечного

выброса относительно группы ложно-оперированных животных. При этом в сердечно-легочном регионе усиливается элиминация AI и падает количество образуемого All (из-за падения активности АПФ в легюгх, сердце). Однако, вследствие компенсаторных механизмов, напрашгенных на поддержание неизменного уровня АД и органных кровотоков (прежде всего почечного), по-видимому, активируются тканевые ренин-ангиотензиновые системы, за счет которых нормализуется АД и величина кровотоков в органах.

Таблица 7. Морфологическая оценка патологических изменений у эмболизированных крыс после хронического введения периндоприла.

Морфологические критерии Эмболизированные + Эмболизированные +

физ. раствор п = 7 периндоприл п = 5

Количество рубцов на 1 17 ±2.82 6.6±0.81 *

срез

Очаговый кардиосклероз 2.57 + 0.30 1.6±0.24 *

Дистрофия 1.57±0.2 1.0±0.2 *

кардиомиоцитов

Гипертрофия 1.71+0.18 1.20±0.2

кардиомиоцитов

Содержание гликогена 1.43+0.3 2.40 + 0.24*

Примечание: данные представлены, как М ± м, использована балльная оценка результатов.

* - р<0.05 по сравнению с эмболизированными животными, получавшими физ.раствор.

О повышении активности РАС свидетельствует и повышенный тонус венозных сосудов.

Периндоприл усиливает процессы регенерации в поврежденном миокарде, уменьшая дистрофические изменения поврежденных кардиомиоцитов и гипертрофию неповрежденных миоцитов, повышая содержание гликогена, то есть улучшает метаболические процессы в миокарде. В результате кардиопротекторного действия периндоприла возрастает коронарный кровоток и увеличивается сниженный эмболизацией сердечный выброс. Периндоприл расслабляет артериальные и венозные сосуды, увеличивает кровоток и снижает сосудистое сопротивление в ряде органов.

Развитие гипотензивного эффекта у ложно-оперированных и эмболизированных животных связано в первую очередь с ингибированием циркулирующей ренин-ангиотензиновой системы. Периндоприл при хроническом введении оказывал нормализующее влияние на активность РАС, восстанавливая соотношения ангиотензина I и II в артериальной крови и клиренсе AI в сердечно-легочном регионе у эмболизированных животных до величин, характерных для ложно-оперированных животных. Ингибирование АПФ в тканях приводило к увеличению кровотока в органах в результате дилатации сосудов. Снижение пред- и постнагрузки обеспечивало щадящий режим работы сердца. Как кратковременное, так и длительное введение ингибитора позволяет выявить активацию тканевых ренин-ангиотензиновых систем у эмболизированных животных.

ВЫВОДЫ.

1. Избирательная эмболизация коронарных сосудов приводила через 21 день к возникновению сердечной недостаточности, что подтверждается морфологическими признаками (очаговый кардиосклероз, дистрофические изменения кардиомиоцитов, снижение содержания гликогена), гемодинамическими (снижение сердечного выброса, снижение коронарного кровотока, повышение тонуса венозных сосудов), и биохимическими признаками ( сниженные концентрации AI и All, достоверное отличие AI/AII от контрольных животных).

2. У эмболизированных крыс с хронической сердечной недостаточностью происходила активация ренин-ангиотензиновой системы, проявляющаяся в повышении активности плазменного АПФ и клиренса AI. Равновесные концентрации AI находились в обратной корреляционной зависимости от степени повреждения миокарда.

3. Длительное введение периндоприла приводило к снижению пред- и постнагрузки, увеличению сердечного выброса, коронарного кровотока, кровотока в почках, тонком кишечнике у эмболизированных крыс с ХСН.

4. Периндоприл оказывал кардиопротекторное действие, уменьшая выраженность склерот!гческих и дистрофических изменений в миокарде и увеличивая содержание гликогена у эмболизированных крыс с ХСН.

5. Периндоприл модулировал активность ренин-ангиотензиновой системы, подаатяя активность тканевых АПФ и нормализуя клиренс AI у эмболизированных крыс с ХСН. Длительное введение препарата восстанавливало прямую корреляционную зависимость между концентрациями AI и АН и соотношение их концентраций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.С.Ф. Дугин, Н.В. Захарова, О.С. Медведев. Парадоксальные эффекты некоторых антагонистов кальция на симпатические окончания в сердце: Фармакологические доказательства наличия непрямого симпатомиметического действия. Тезисы докладов YI Всесоюзного Симпозиума "Центральная регуляция кровообращения". Ростов-на Дону. 1991, С. 44-45.

2. С.Ф. Дугин, Н.В. Захарова, О.С. Медведев. Гемодинамические механизмы гипотензивного действия кобальта у наркотизированных крыс. Кардиология, 1991, том 31, С. 80-82.

3. Г.Ф. Султанов, Э.А. Аллабергенова, Н.В. Захарова. Систолическая и диастолическая функции сердца при гиперемии организма. Тезисы докладов II Республиканского съезда физиологов Туркменистана. Ашхабад, 1992.

4. Н.В. Захарова, О.С. Медведев. Влияние ингибитора ангиотензинпревращающего фермента периндоприла на параметры системной и регионарной гемодинамики у крыс с хронической сердечной недостаточностью. Материалы республиканской научной конференции по фармации и фармакологии. Пятигорск, 1993, С. 288.

5. О.С. Медведев, Н.В. Захарова. Длительное введение периндоприла улучшает гемодинамический статус у крыс с сердечной недостаточностью, но не у контрольных животных. Эксперим. и клинич. фармакология, 1994, N 6, С. 26-29.

6. Н.В. Захарова, Е.И. Каленикова, Т.В. Кузнецова, Е.А. Городецкая. Методика оценки активности ангиотензин-превращающего фермента у бодрствующих крыс. Материалы 50 региональной конфер енции по фармации, фармакологии и подготовке кадров. Пятигорск, 1995, С. 147.

7. Н.В. Захарова, С.М. Данилов. Изменение тканевой и плазменной активности ангиотензин-превращающего фермента у крыс с сердечной недостаточностью после лечения периндоприлом. Материалы конференции молодых физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург, 1995,С. 79.

8. Medvedev О., Gorodetskaya Е., Zacharova N. Systemic and haemodynamic effects of perindopril in experimental cardiac failure. Sattelite of 2nd Asian-

Pacific Symposium on ACE Inhibi tors of the Renin-Angiotensin System. Beijjing, April 25-2S, 1995, 3-4.

9. E.A. Городецкая, H.B. Захарова, Е.И. Каленикова, T.B. Кузнецова, О.С. Медведев. Влияние ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента на сердечно-сосудистую систему крыс с сердечной недостаточностью. Тезисы 1-го Съезда Российского общества фармакологов 9-13 октября 1995, Волгоград, С. 119.

10. Н.В.Захарова, О.С. Медведев. Влияние периндоприла на тонус вен у крыс с сердечной недостаточностью. II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов 10- 15 апреля 1995 г., Москва. С. 268.

11. Е.И. Каленикова, Н.В. Захарова, Е.А. Городецкая, О.С. Медведев. Влияние периндоприла на активность ренинангиотензиновой системы и процессы постинфарктной регенерации у крыс. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов 16-20 апреля 1996 г., Москва. С. 25.

пгш Г.тпс 3.6S2 т.ICG - SS г. Москва, НоБЗ-Zaсланная, д.6