Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Влияние инактивации патогенов в концентратах тромбоцитов на функцию тромбоцитов

На правах рукописи

Накастоев Ислам Мухарбекович

ВЛИЯНИЕ ИНАКТИВАЦИИ ПАТОГЕНОВ В КОНЦЕНТРАТАХ ТРОМБОЦИТОВ НА ФУНКЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 НОЯ 2013

005537565

Москва 2013

005537565

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический Научный Центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Городецкий Владимир Матвеевич, член-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Точенов Александр Владимирович, заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ, научно-клиническое отделение гематологической хирургии, старший научный сотрудник

Трахтман Павел Евгеньевич, доктор медицинских наук, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» МЗ РФ, отделение трансфузиологии, заготовки и процессинга стволовых клеток, заведующий отделения

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «27» ноября 2013г. в 12 часов на заседании диссертационного совета 208.135.01. в ФГБУ «Гематологический Научный Центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

2013г.

Зыбунова Е.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюгальность темы исследования.

Актуальность проблемы инфекционной безопасности реципиентов при трансфузиях компонентов крови не снижается, несмотря на развитие службы крови. Увеличение количества переливаний и совершенствование методов детекции трансмиссивных инфекций еще более повышает требования к обеспечению безопасности трансфузионной терапии.

Точных популяционных данных по количеству трансфузий концентратов тромбоцитов (КТ) нет, поскольку отсутствует единый международный регистр. Однако, учитывая отчеты региональных служб крови и косвенные данные, можно сделать вывод о существенном увеличении потребности в количестве и качестве КТ.

По данным регистра ЕВМТ (Européen Group for Blood and Marrow Transplantation), количество ежегодно выполняемых трансплантаций в европейских странах с 1990 года по 2010 год увеличилось с 4200 до 30 000. При этом трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток составили 41%, из которых 53% от неродственного донора. Такой рост трансплантационной активности сопровождается увеличением потребности в переливании КТ. Так, в Великобритании количество трансфузий тромбоцитов возросло с 4,0 доз на 1000 населения в 2005 году до 4,5 на 1000 населения в 2010 году. Ожидаемый прирост потребности в переливаниях тромбоцитов составляет до 5% в год. В США, Финляндии, Ирландии потребность в трансфузиях КТ еще выше - порядка 6 доз на 1000 населения.

По данным Cobain T.J. и соавт., проанализировавших эпидемиологические данные по трансфузиям компонентов крови в США, Великобритании, Австралии и Дании, количество используемых доз концентратов тромбоцитов в этих странах колеблется от 2 до 6 на 1000 населения.

В России имеются проблемы с регистрацией количества трансфузий компонентов крови, так как помимо медицинских организаций системы Министерства здравоохранения имеются службы крови в таких ведомствах, как Министерство обороны, Министерство по чрезвычайным ситуациям, Министерство внутренних дел, учреждения Российской академии медицинских наук и т.д. По данным Е. Б. Жибурта, заготовка тромбоцитов в России в 10-20 раз ниже, чем в

странах Западной Европы, и не превышает 0,2-0,6 доз KT тромбоцитов на 1000 населения.

Таким образом, в мире наблюдается постоянный рост применения KT. По мере дальнейшего внедрения в широкую практику высокотехнологичных методов лечения, в том числе трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, протоколов высокодозной химиотерапии потребность в KT будет продолжать увеличиваться.

Учитывая рост частоты трансфузий тромбоцитов, риск инфицирования реципиента при переливании компонентов крови, особенно при наличии большого числа доноров, является весьма существенным и не может не приниматься во внимание. В среднем риск вирусного заражения при увеличении количества доноров от 1 до 8 возрастает от 3,6 до 36 на 1000 пациентов. Несмотря на систему строгой селекции доноров тромбоцитов, скрининг гемотрансмиссивных инфекций, внедренных в 1980-х годах после серии случаев заражения ВИЧ, летом и весной 2002 г. в США была зарегистрирована трансфузионно-обусловленная эпидемия лихорадки Западного Нила. В настоящее время не разработаны методы скрининга для 68 различных инфекционных агентов, которые могут передаваться при переливании компонентов крови. Среди них важнейшее эпидемиологическое значение имеют такие патогены, как прионы, вызывающие болезнь Creutzfeldt-Jakob, вирус лихорадки Денге и Babesia sp. В России по-прежнему актуальна проблема заражения парентеральными вирусными гепатитами [Гармаева Т. Ц. и соавт., 2006].

Риск бактериальной контаминации компонентов крови существенно ниже - 0,9 на 1000 трансфузий, но при этом значимость данного вида заражения играет не менее важную роль. Бактериальное обсеменение концентратов тромбоцитов происходит, как правило, в момент донации. В дальнейшем, при хранении в течение 5 дней в температурном диапазоне 20-24° С количество микоорганизмов может многократно увеличиваться. В США риск развития бактериемии/сепсиса, связанного с трансфузией аферезных тромбоцитов от одного донора в 2010 году составлял 1/60000 трансфузий. Вероятность контаминации тромбоцитов, полученных из цельной крови от нескольких доноров статистически значимо (в 5,6 раза) выше в сравнении с аферезными тромбоцитами [Vamvakas, Е.С., 2009]. Объяснение этому факту очень простое - чем выше частота венепункций, тем больше вероятность контаминации

компонентов крови микроорганизмами, находящимися. на коже. При получении аферезного КТ проводится лишь одна венепункция, при получении тромбоцитов из цельной крови - от 4 до 6-7 венепункций. Селекция доноров, обработка места венепункции 70% спиртом в сочетании с 2% раствором хлоргекседина, микробиологическое тестирование образцов крови снижают риск бактериальной контаминации на 50%. Тем не менее, риск тяжелых осложнений, связанных с бактериальным обсеменением тромбоконцентратов, в том числе с летальным исходом, сохраняется. По данным Eder и соавт. на 1004000 протестированных концентратов тромбоцитов приходилось 20 септических реакций от 17 донаций, при этом в трех случаях - со смертельным исходом. Схожие данные по частоте бактериальной контаминации и развитию тяжелых септических реакций приводят и другие авторы [Ramírez-Arcos и соавт., 2011, deKorte и соавт., 2006, Schmidt и соавт.].

Таким образом, организационные мероприятия (формирование пула кадровых доноров, проведение строгой селекции доноров), качественное микробиологическое тестирование компонентов крови, обеспечение принципа «один донор - один реципиент» являются недостаточными для обеспечения инфекционной безопасности трансфузий. Рост количества трансфузий тромбоцитов, расширение спектра тяжелых гемотрансмиссивных инфекций, учащение тяжелых осложнений, связанных с бактериальной контаминацией КТ диктует необходимость внедрения методов патогенинактивации (ПИ).

Наиболее широко используются фотодинамические методы ПИ компонентов крови. Принципиальный подход, используемый во всех фотодинамических методах ПИ является единым: компонент крови обрабатывается веществом, которое при облучении светом с определенной длиной волны способно вызывать повреждение нуклеиновых кислот или клеточных мембран. Однако, высокая интенсивность ультрафиолетового облучения тромбоцитов может оказывать влияние на их функциональную активность. Van Marwijk и соавт. наблюдали после облучения тромбоцитов ультрафиолетовым светом в В-Диапазоне активацию агрегации тромбоцитов. Другая группа исследователей обнаружила уменьшение прироста уровня тромбоцитов после воздействия ультрафиолетового облучения в В-диапазоне [Grijzenhout М.А. и соавт., 1993].

Псоралены являются наиболее перспективными компонентами для патогеинактивации компонентов крови, в особенности тромбоцитов. Они способны связываться с нуклеиновыми кислотами и под влиянием ультрафиолетового излучения оказывают эффект, аналогичный алкилирующим соединениям, эффективно ингибируя все основные функции ДНК и РНК - репликацию, транскрипцию, трансляцию и репарацию. Исследования показали, что этот метод ПИ позволяет эффективно нейтрализовать большинство известных болезнетворных микроорганизмов, включая оболочечные и безоболочечные вирусы, бактерии, простейшие.

Амотосален является новым классом аминопсораленов. В настоящее время он является основным представителем данного класса веществ, применяемых для ПИ, т.к. лишен основных недостатков своих предшественников. Способность Амотосалена нарушать структуру нуклеиновых кислот приводит не только к инактивации ДНК или РНК содержащих микроорганизмов, но и к подавлению репликации нуклеиновых кислот в клетках крови. Практически важным фактом является способность фотодинамических методов вызывать подавление пролиферативной активности лимфоцитов, что позволяет предотвращать трансфузионную реакцию трансплантант против хозяина и отказаться от дополнительного рентгеновского или у-облучения КТ.

Как известно, тромбоциты представляют собой фрагменты цитоплазмы и цитолеммы мегакариоцитов, лишенные ядра, а, следовательно, и ДНК и содержащие только транспортные, митохондриальные и матричные РНК. Если не принимать во внимание некоторый незначительный цитолитический эффект, связанный преимущественно с ультрафиолетовым облучением, амотосален вызывает достаточно специфическое ингибирование основных функций нуклеиновых кислот.

Однако первые результаты применения in vivo амотосален-обработанных тромбоцитов были неоднозначны — не вполне согласовывались с данными экспериментов на животных и лабораторных испытаний. У здоровых добровольцев прирост тромбоцитов и их выживаемость были ниже в сравнении с результатами трансфузии тромбоцитов, не подвергнутых манипуляциям [Snyder Е. и соавт., 2004].

Эффекты амотосалена могут реализовываться через влияние на цитоплазматические или митохондриальные нуклеиновые кислоты и ненасыщенные жирные кислоты билипидного слоя плазмолеммы. Функции тромбоцитов многообразны, они включают не только участие в гемостазе, поддержании структуры сосудистого эндотелия, но выполняют защитную, антигенпрезентирующую и транспортную функции. Предсказать и оценить изменение функциональных свойств тромбоцитов во всем их многообразии после воздействия амотосалена невозможно. Однако, трансфузии КТ проводятся в основном для достижения одной единственной цели - купирования или профилактики тромбоцитопенических кровотечений. В данном контексте конечной точкой исследования будет достижение клинической гемостатической эффективности трансфузии концентрата тромбоцитов, а суррогатными точками - морфологические или функциональные характеристики тромбоцитов in vitro, наиболее тесно коррелирующие с их гемостатическими свойствами.

Цель исследования - изучить влияние фотодинамического метода ПИ в КТ с использованием амотосалена на функциональные свойства тромбоцитов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ количественных и морфометрических характеристик тромбоцитов в концентрате в зависимости от ПИ

2. Определить степень экспрессии маркеров активации тромбоцитов до и после ПИ

3. Исследовать влияние ПИ на агрегацию тромбоцитов после активации АДФ, ристоцитином и коллагеном

4. Оценить влияние ПИ на клиническую эффективность переливаний КТ

Научная новчзна

Получены новые данные о влиянии ПИ в КТ с применением амотосалена на функциональный статус тромбоцитов.

Впервые проведено исследование агрегации тромбоцитов с тремя индукторами для оценки влияния ПИ в КТ на функцию тромбоцитов.

s

Научно-практическая ценность работы

Данные, полученные в результате исследования, могут быть использованы в клинике при планировании заместительной терапии и службой крови для адекватного обеспечения клинических отделений концентратами тромбоцитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. ПИ фотодинамическим методом с использованием амотосалена приводит к уменьшению количества тромбоцитов в концентрате.

2. ПИ существенно снижает уровень спонтанной активации тромбоцитов (в том числе экспозиции фосфатидилсерина (ФС), Р-селектина и чувствительности АДФ-рецепторов), происходящей во время хранения концентратов.

3. Гемостатический эффект трансфузии ПИ КТ у реципиентов сопоставим с трансфузиями КТ, не подвергнутых инактивации.

4. После трансфузии КТ, подвергнутых ПИ, посттрансфузионный прирост числа тромбоцитов статистически значимо ниже по сравнению с переливанием необработанных КТ.

5. Использование ПИ не приводит к существенному сокращению межтрансфузионного интервала и необходимости увеличения количества трансфузий КТ.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ "Проблемы донорства, производства и контроля качества компонентов и препаратов крови" 26.12.2012г.

Материалы работы доложены на симпозиумах и конференциях: Всероссийская научно практическая конференция: «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», 6-7 октября, 2010г., Киров.

23rd Regional Congress of the International Society of Blood Transfusion, 2-5 июня, 2013 г., Амстердам, Голландия.

VII Международный симпозиум, посвященный памяти Раисы Максимовны Горбачевой: «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых», 19-21 сентября, 2013 г., Астана, Республика Казахстан.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 92 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 12 рисунков и 14 таблиц. Список цитируемой литературы включает 118 источников, 8 из них - отечественных авторов и 110- зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Получение КТ и проведение инактивации патогенов.

КТ получали из крови доноров с помощью сепаратора клеток крови MCS+ («Hemonetics», США) в соответствие с инструкциями изготовителя. MCS+ использует принцип прерывистого потока через центрифужную разделительную камеру, в которой происходит разделение крови на компоненты под действием центробежной силы, В течение 1-2 часов после тромбоцитафереза КТ хранился при постоянном помешивании. Затем проводили ПИ с использованием системы INTERCEPT ("Cerus Corporation", США). Данная система получила одобрение Европейского Союза по безопасности продукции для тромбоцитов в 2002 г., для плазмы - в 2006 г., зарегистрирована в РФ в 2004 г. В России данный метод применяется лишь в нескольких крупных станциях переливания крови и федеральных учреждениях МЗ РФ.

Характеристика реципиентов.

Исследовано 29 пациентов (13 женщин, 16 мужчин), медиана возраста 38 лет (20-66), находившихся на лечении в ФГБУ ГНЦ МЗ РФ, со следующими гематологическими заболеваниями: острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) (п = 13), острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) (п = 6), апластическая анемия (АА) (п = 6),

острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ) (п = 2), миелодиспластический синдром (МДС) (п = 1), миелоидная саркома (п = 1) (табл. 1).

Критерием включения в исследование была глубокая тромбоцитопения (<20 х 109/л), требующая трансфузии КТ с целью профилактики или купирования геморрагического синдрома.

В исследование не включались пациенты, имевшие факторы, могущие повлиять на посттрансфузионный прирост тромбоцитов: фебрильная температура тела, терапия амфотерицином В, выявленная резистентность к трансфузиям КТ (скорректированный прирост тромбоцитов <5 после двух последовательных переливаний КТ), спленомегалия (размер селезенки >12 см), или пациенты, которым выполнена спленэктомия.

Таблица 1. Распределение реципиентов по диагнозу и полу

Диагноз Мужчины Женщины Всего

16 13 29

ОМЛ 6 7 13

ОЛЛ 4 2 6

АА 2 4 6

ОММЛ 1 1 2

МДС 1 1

Миелоидная 1 0 1

саркома

Каждый реципиент получил 2 трансфузии КТ - одна трансфузия ПИ КТ и одна контрольная трансфузия КТ, не подвергнутого ПИ. Таким образом, всего произведено 58 трансфузий КТ, которые составили 2 группы: 1-я группа - 29 трансфузий ПИ КТ, 2-я группа - 29 трансфузий КТ, не подвергнутых ПИ.

Получение и хранение образцов КТ.

Каждый КТ анализировался трижды. Пробы №1 и №2 брали из КТ до ПИ в объеме 5,0±1,0 мл с соблюдением асептических условий. Пробу №1 подвергали исследованию непосредственно после получения, проба №2 — хранили в смесителе с

инкубатором до окончания процедуры ПИ (20-24 часа) и только затем исследовали одновременно с пробой №3, которую забирали из контейнера с КТ после окончания ПИ и адсорбции остаточного амотосалена в том же объеме 5,0±1,0 мл, что и пробы №1 и №2 и также с соблюдением асептических условий. Определение тромбоцитарных параметров.

Данная часть работы выполнена совместно с сотрудниками лаборатории гемоцитологии (зав. лаб., проф. Погорелов В. М.).

Тромбоцитарные параметры в исследуемых образцах КТ анализировались на гематологическом анализаторе «SYSMEX ХЕ-2100» (Cobe, Japan). Для приготовления исследуемой пробы использовали следующий методический подход: пробы из КТ разводили раствором NaCl 0,9% в соотношении 1:1 в пробирках из ареактивного пластика («Vacutaner», Becton Dickinson, USA), содержащих напыление антикоагулянта К3ЭДТА. Разведение пробы исследуемого КТ требовалось для того, чтобы концентрация тромбоцитов в пробе не превышала допустимый порог оценки предела измерения тромбоцитов прибором. В противном случае могут быть получены заниженные показатели.

Для достижения равномерного распределения тромбоцитов по всему объему исследуемой пробы в течение 1-2 минут подвергали перемешиванию на автоматическом устройстве «ООО Медлакор, УПК-01». Затем на гематологическом анализаторе Sysmex-XE-2100 выполняли анализ пробы в автоматическом режиме в течение 60 секунд.

В результате исследования с помощью анализатора Sysmex-XE-2100 были получены следующие тромбоцитарные параметры:

• PLT х 103/мкл - число тромбоцитов (усредненный показатель, рассчитанный по результатам кондуктометрического и оптического метода подсчёта),

• IPF - фракция незрелых тромбоцитов, % ;

• MPV - средний объем тромбоцитов, фл. (фемтолитр - 10~15 л);

• PDW - ширина распределения тромбоцитов (по объему);

• P-LCR(%) - количество крупных тромбоцитов - превышающих по объему 12 фл;

• РСТ (%) - тромбокрит (доля тромбоцитов в общем объеме).

Определение экспозиции фосфатидилсерина (ФС) и Р-селектина на

мембранах тромбоцитов.

Данная часть работы выполнена совестно с сотрудниками лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лаб., д.ф-м.н. Пантелеев М. А.)

КТ с концентрацией тромбоцитов ~1 х 109 клеток/мл разводили в 10 раз базовым тромбоцитарным буфером (БТБ): 20 мМ HEPES рН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0,4 мМ NaH2P04, 5 мМ глюкозу и 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин).

Для прокрашивания по ФС и Р-селектину и активации использовали аликвоты тромбоцитов по 5 мкл. К этим аликвотам добавляли равный объем (по 5 мкл) БТБ с добавленными 5 мМ СаС12 и 4% фикоэретрин (РЕ)-аннексином V (для прокрашивания ФС), либо 4% PE-CD62P (для прокрашивания Р-селектина). Таким образом, конечная концентрация тромбоцитов в смеси составляла ~0,5><108 клеток/мл, СаС12 - 2,5 мМ, красителя - 2%.

Для активации тромбоцитов в пробы с добавленным красителем и кальцием вносили аналог коллагена CRP (collagen related peptide) до конечной концентрации 25 мкг/мл (0,5 мкл раствора 0,5 мг/мл на пробу объемом 10 мкл) и перемешивали. Активацию проводили в течение 15 минут, после чего пробы разбавляли в 20 раз БТБ с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре по характерному светорассеянию и флуоресценции фикоэретрина.

При анализе полученных результатов при помощи специализированного программного обеспечения, по характерному светорассеянию определяли границы популяции тромбоцитов. Далее только для выделенной зоны тромбоцитов анализировали флуоресценцию добавленных маркеров. За 100 % принимали число всех событий, в популяции тромбоцитов. Процент ФС-положительных определяли как отношение выявленного количества клеток, окрашенных аннексином V, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов. Процент Р-селектин-положительных определяли как отношение выявленного количества клеток, окрашенных CD62P, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов.

Исследование агрегации тромбоцитов.

Данная часть работы выполнена совместно с сотрудниками лаборатории клинической коагулологии (зав. лаб., проф. Васильев С. А.)

Исследовали агрегацию тромбоцитов с тремя агонистами - АДФ, коллагеном и ристоцитином. Низкие концентрации АДФ (менее 2,5 мкмоль/л) вызывают первичную или обратимую агрегацию. Исследвание проводили турбидометрическим методом на агрегометре 230LA НПФ БИОЛА (Россия).

Методика: полученный образец КТ разводили ауто-плазмой, которую получали во время тромбоцитафереза, до концентрации тромбоцитов в пределах 200-400 х 109/л. Для исследования агрегации тромбоцитов с АДФ применяли обезвоженную натриевую соль АДФ ("Sigma", Россия). Готовили раствор АДФ в концентрации 105 мкМ - 5.00 мг разводили на 100 мл физиологического раствора. Отливали аликвоты по 0.2-0.4 мл и замораживали. В день использования в пробирку наливали 0.9 мл физиологического раствора. Размораживали одну аликвоту, и 0.1 мл ее содержимого добавляли в пробирку. В образцы обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) объемом 0.3 мл добавляли по 15 мкл раствора АДФ из пробирки и маточного разведения, для получения конечной концентрации 0.5 мкМ и 5 мкМ соответственно.

Раствор коллагена концентрацией 1 мг/л служил исходным реактивом. Перед применением его разводили в прилагаемом буферном растворе для получения концентрации 10 и 40 мкг/мл. После окончательного разведения 1:10 в солевом фосфатном буфере концентрация составляла 1 и 4 мкг/мл.

При исследовании агрегации тромбоцитов с ристоцитином использовался ристоцитина сульфат (American Biochemical and Pharmaceutical Corporation). Каждый флакон содержит 100 мг ристоцетина. Для получения раствора концентрацией 12,5 мг/мл содержимое флакона растворяли в 8 мл 0,9% раствора хлорида натрия.

Обработка результатов: после калибровки прибор автоматически вычисляет проценты светопропускания, причем начальное светопропускание обогащенной тромбоцитами плазмы принимается за 0%, а светопропускание бедной тромбоцитами плазмы - за 100%.

Подсчет количества тромбоцитов у реципиента.

Данная часть работы выполнена совместно с сотрудниками экспресс лаборатории отдела анестезиологии реанимации и интенсивной терапии (зав. лаб., к.м.н. Кречетова А. В.).

В рамках исследования было произведено 58 трансфузий 29 пациентам. Каждому пациенту было произведено 2 трансфузии - 1 трансфузия ПИ КТ и 1 трансфузия КТ не подвергнутого ПИ. В работе были использованы общепринятые показания к переливанию тромбоцитов, которые были разделены на профилактические и лечебные, и определялись лечащим врачом.

Лабораторным признаком, характеризующим эффективность трансфузии КТ, считали увеличение количества циркулирующих тромбоцитов в крови реципиента через 1 час и через 24 часа после трансфузии.

Материалом исследования служила капиллярная кровь. Кровь набиралась из пальца в объеме 200 мкл в пробирки Microvette 200 с встроенной капиллярной системой "end-to-end". Пробирки содержали стандартное количество распыленного антикоагулянта - калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (К2 ЭДТА).

Количественный подсчет тромбоцитов, проводили на гематологическом анализаторе ADVIA 60.

Исходное число тромбоцитов в русле крови реципиента определяли за 20-60 минут до трансфузии. Первичной конечной точкой было определение абсолютного прироста тромбоцитов через 1 час (30-120 минут) после трансфузии (АПТ-1), далее абсолютный прирост определялся через 18-24 часа после трансфузии (АПТ-24). Всего проведено 174 измерения.

Оценка геморрагического синдрома.

Клиническим критерием эффективности трансфузии КТ считали прекращение спонтанной кровоточивости и отсутствие новых геморрагий на коже и видимых слизистых.

Геморрагический синдром оценивался по критериям кровотечений Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на основании осмотра и опроса пациента за 1 час до трансфузии, через 1 и 24 часа после трансфузии.

Статистическая обработка результатов.

Статистическая обработка данных выполнена совестно с лабораторией биостатистики (зав. лаб., к.т.н. Куликов С. М.)

Различие групп тромбоцитов (подвергнутых и не подвергнутых ПИ) оценивали (при применённой в данной работе двухвыборочной схеме испытания) с помощью непараметрического линейного бинарного критерия. Для проверки нулевой гипотезы об отсутствии статистически значимого сдвига выборочных распределений использовались: парный критерий Вилкоксона. Пороговый уровень значимости р, соответствующий нулевой гипотезе отсутствия различия, выбран, как обычно, равным 0,05. Данные с распределением близким к нормальному представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (5Э).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние патогенинактивации на количество тромбоцитов в концентрате.

Средняя концентрация тромбоцитов в образце исходного КТ (1-я группа) составила 1138.0 х 109/л. Средняя концентрация тромбоцитов в образцах 2-й и 3-й групп составила 1008.3 и 946.7 х 109/л соответственно (табл. 2). Следовательно, концентрация тромбоцитов в КТ, не подвергнутых ПИ, была выше, чем в КТ после ПИ. Обе эти концентрации оказались меньше исходного среднего значения.

Таблица 2. Среднее количество тромбоцитов в исследуемых группах

№ группы образцов Количество образцов Средняя концентрация (х109/л) Стандартная ошибка 95%-ый доверительный интервал

1 18 1138.0* 63.0 1264.2-1011.8

2 21 1008.3* 58.4 1125.2-891.4

3 21 946.7* 58.4 1063.5-829.8

Примечание: *р<0,05 между любыми двумя измерениями.

Таким образом, при исследовании количества тромбоцитов выявлено достоверно значимое снижение их числа в группе КТ, подвергнутой ПИ, по

сравнению с КТ, хранившимися в течение 20-24 часов с соблюдением аналогичных условий хранения, но не подвергнутых ПИ (р=0.034) (рис. 1).

Рисунок 1. Частотное распределение концентрации тромбоцитов в группе образцов необработанных (А) и прошедших процедуру ПИ (Б)

12

11---_--Б

3 l'-И

III

800 1200 1400 1600 Концентрация тромбоцитов (*109/л)

Снижение количества тромбоцитов в результате ПИ в КТ позволяет прогнозировать более низкий посттрансфузионный прирост после трансфузии ПИ КТ. Однако маловероятно, что столь незначительное снижение может сказаться на клинической эффективности трансфузий.

Помимо количества тромбоцитов, исследовали такие параметры, как содержание незрелых тромбоцитов, средний объем и ширина распределения тромбоцитов по объему, количество тромбоцитов, превышающих по объему 12 фл.

Незрелые тромбоциты являются показателем активности тромбоцитопоэза, по уровню дифференцировки они аналогичны ретикулоцитам в красном ростке кроветворения. Появляясь в кровотоке в ответ на кровопотерю, незрелые тромбоциты гемостатически более активны и инициируют образование тромба [Thattaliyath и соавт., 2005]. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами. Объем фракции незрелых тромбоцитов на анализаторе "Sysmex ХЕ-2100" определяется по специальной программе «IPF Master». Параметр выражается как % от общего количества тромбоцитов.

Индекс P-LCR отражает содержание крупных, превышающих по объему 12 фл., тромбоцитов и выражается как % от общего числа тромбоцитов. Известно, что разные

800 1200 1400 1600

Концентрация тромбоцитов (*109/л)

по размерам тромбоциты обладают и различной агрегационной и адгезивной активностью. Более крупные тромбоциты активнее участвуют в процессах тромбообразования. Кроме того, изменение индекса Р-ЬСЯ может отражать наличие агрегатов тромбоцитов.

Содержание незрелых тромбоцитов в 1-й группе образцов в среднем составило 1,5%. В образцах 2-й и 3-й групп этот показатель составил 1,65 и 1,45 % соответственно. Среднее значение индекса Р-ЬСЯ в 1-й группе 16%, во второй группе (после хранения образца в течение суток) 13,7% и 12,9% после проведения ПИ.

Таким образом, выявлено отсутствие статистически значимого влияния ПИ на содержание незрелых и крупных тромбоцитов в КТ (табл. 3).

Таблица 3 Уровень незрелых (1РБ) и крупных тромбоцитов (Р-ЬСЯ)

Показатель 1 -я группа («=18) 2-я группа («=21) 3-я группа (« = 21)

Р-ЬСЯ, % (М±БО) 16,0 ±6,6 13,7 ±5,9 12,9 ±6,3

1РИ, % (\feSD) 1,5±1,15 1,65±1,11 1,45±1,15

Ширина распределения тромбоцитов по объему (РО\У) отражает степень анизоцитоза. Увеличение этого показателя может свидетельствовать о наличии агрегатов тромбоцитов и/или фрагментов тромбоцитов. Исходно (в 1-й группе образцов) этот показатель составил в среднем 9,13%. В результате хранения образца КТ в течение суток отмечено некоторое снижение этого индекса в среднем до 8,18%. ПИ не оказала статистически значимого влияния на индекс РО\У (р=0.11) (табл. 4).

Следующим анализируемым показателем на анализаторе "Бувтех ХЕ-2100" был средний объем тромбоцитов (МРУ). В норме этот показатель варьирует от 7,4 до 10,4 фл. В образах КТ 1-й группы этот показатель составил в среднем 8,69 фл. Во 2-й и 3-й группах МРУ в определялся в среднем на уровне 8,33 и 8,19 фл. соответственно. ПИ не привела к статистически значимым изменениям данного параметра (табл. 4).

Таблица 4. Средние значения распределения тромбоцитов по объему (РБХУ) и среднего объема тромбоцитов (МРУ)

1 -я группа (п =18) 2-я группа (п = 21) 3-я группа (п = 21)

РО\У % (М±БО) 9,13±1,77 8,18±1,39 8,16±1,66

МРУ фл. (М±8Э) 8,79±0,94 8,33±0,84 8,19±0,94

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено влияние ПИ на общее количество тромбоцитов и отсутствие селективного влияния обработки на определенную фракцию тромбоцитов.

Определение экспозиции ФС и Р-селектина

Мы рассматривали экспозицию ФС в качестве маркера активации тромбоцитов и формирования прокоагулянтной мембраны.

В нормальном состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свертывания: отрицательно заряженные фосфолипиды, в том числе ФС, сосредоточены на внутреннем слое мембраны. Активация тромбоцитов приводит к перемещению ФС на внешний слой мембраны и формированию прокоагулянтной поверхности. Активация тромбоцитов имеет несколько степеней, и экспозиция прокоагулянтной поверхности является одной из высших. Только сильные активаторы (тромбин и коллаген) способны вызвать такой ответ. Более слабые активаторы не способны самостоятельно вызвать появление ФС.

Исходный (в первой группе) уровень экспозиции ФС в фоне (без направленной активации) составил 4,08%. Средний уровень экспозиции ФС тромбоцитов в фоне составил 8,1% во второй группе и 4,1% в третьей группе (табл. 5).

Таким образом, в результате хранения КТ в течение 20-24 часов отмечается повышение уровня экспозиции ФС на мембранах исследуемых тромбоцитов, в то время как процедура инактивации патогенов в КТ не привела к изменению этого показателя.

После направленной активации тромбоцитов уровень экспозиции ФС повысился в среднем до 29,5% в первой и до 30,1% во второй группах. В группе

образов КТ, подвергнутых ПИ, экспозиция ФС после активации повысилась в среднем до 15,4% (табл. 5).

Разница значений второй и третьей групп с исходными значениями экспозиции ФС демонстрирует изменения, обусловленные непосредственно ПИ и вследствие хранения. Для упрощения анализа полученных данных мы сравнили частотное распределение этих изменений во второй и третьей группах как для активированных тромбоцитов (рис. ЗА, ЗБ), так и для неактивированных (рис. 2А, 2Б). Получены следующие результаты: изменение процента тромбоцитов, экспрессирующих ФС, составило для неактивированных тромбоцитов в среднем около 4,0% (95%ДИ 4,9-3,2) в группе КТ, не подвергнутых ПИ, и 0,1% (95%ДИ (-0,8)- 0,9) в группе КТ после ПИ (рис. 2А, 2Б). Для тромбоцитов после их направленной активации (аналогом коллагена): 0,6% (95%ДИ (-2,5)-3,8) в группе без ПИ и -14,1% (95%ДИ (-17,1)-(-11,0)) в группе с ПИ (рис. ЗА, ЗБ). Обнаруженный сдвиг средних значений экспозиции ФС в группе тромбоцитов, подвергнутых ПИ в сторону уменьшения является статистически значимым (р<0,05), что справедливо как для неактивированных, так и для активированных тромбоцитов. В первом случае разница изменений между группой КТ не подвергнутых обработке, и КТ после ПИ составляет примерно 4%, во втором - около 14%.

Повышение экспозиции ФС без направленной активации тромбоцитов может свидетельствовать о спонтанной активации тромбоцитов в результате хранения. В свою очередь более низкая экспозиция этого маркера после направленной активации тромбоцитов может говорить о снижении их функциональной активности.

Таблица 5. Экспозиция ФС на тромбоцитах

Показатель 1 группа (п-46) 2 группа (п-46) 3 группа (п-46)

Экспозиция ФС,%

4,08 ± 1,41 9,5 ± 5,56 4,14 ±2,12

(\liSD)

Экспозиция ФС после активации, % (\tfcSD) 29,49 ± 10,28 30,09 ± 12 15,43 ± 9,58

Рисунок 2. Частотное распределение изменений (от исходного) экспозиции фосфатидилсерина неактивированных тромбоцитов в группах без ПИ (А) и после ПИ (Б).

40% л

-6-4-2 0 2 4 6 810

40% го

-6-4-2 0 2 4 6 810

2А 2Б

Рисунок 3. Частотное распределение изменений (от исходного) экспозиции фосфатидилсерина активированных тромбоцитов в группах без ПИ (А) и после ПИ (Б)

ЗА ЗБ

Далее были проанализированы данные, полученные при исследовании экспозиции Р-селектина на поверхности тромбоцитов. Исходный уровень Р-селектина составил 10,06%. После хранения необработанного образца КТ отмечено статистически значимое повышение уровня экспозиции Р-селектина до 22,27% (р<0,001), что может свидетельствовать о некоторой спонтанной активации тромбоцитов и начала высвобождения а-гранул. Однако в 3-й группе образцов уровень Р-селектина оставался сопоставимым с исходным уровнем (13,27%). После направленной активации во всех исследованных образцах отмечен высокий уровень экспозиции этого маркера активации, что говорит о сохранной активационной способности тромбоцитов (табл. 6).

Повышение экспозиции Р-селектина при хранении также свидетельствует о спонтанной активации тромбоцитов при хранении.

Таблица 6. Экспозиция Р-селектина на тромбоцитах

Показатель 1 группа (п=46) 2 группа (п=46) 3 группа (п=46)

Экспозиция Р-селектина, % (\iiSD) 10,06 ±4,32 22,27 ± 12,31 13,27 ±6,77

Экспозиция Р-селектина после активации, % (М±5Б) 79,72 ± 8,75 77,36 ±9,6 78,2 ± 15,2

Исследование агрегации тромбоцитов с различными агонистами

Исследовано по 12 образцов КТ в каждой из образованных групп. Все образцы также были разделены на 3 группы: 1 - нативный КТ, 2 - КТ хранившийся течение 20-24 часов, 3 - КТ после ПИ. Отличительной особенностью этой части работы является разведение образцов КТ аутологичной плазмой доноров, полученной во время тромбоцитафереза.

Исходный уровень агрегации тромбоцитов с АДФ в среднем составил 66%. В результате хранения тромбоцитов в течение суток (20-24 часа) уровень агрегации снизился в среднем до 20%. В группе КТ, подвергнутого ПИ, агрегация тромбоцитов составила в среднем 42% (табл. 7, рис. 4). Таким образом, ПИ не оказывает отрицательного влияния на агрегационную способность тромбоцитов. Более того, в группе ПИ КТ уровень агрегации статистически значимо выше, чем в группе КТ, не подвергнутых ПИ (р<0.02).

Исследование агрегации тромбоцитов с коллагеном и ристомицином продемонстрировало отсутствие статистически значимых изменений как в результате хранения, так и после проведения ПИ (р>0.05).

Таблица 7. Агрегация тромбоцитов с тремя агонистами

Агонист 1 -я группа (п = 12) 2-я группа (п = 12) 3-я группа (п = 12)

АДФ, % (М±8Б) 66 ± 16 20 ± 12 42 ±26

Коллаген, % (\liSD) 68 ± 18 80 ±20 72 ± 17

Ристомицин, % (М±БО) 90 ± 13 95 ± 12 93 ± И

Рисунок 4. Агрегация тромбоцитов с АДФ (%)

70 60 50 40 30 20 10 0

66%

42%

р<0.02

20%

1 группа

2 группа

3 группа

Снижение агрегации тромбоцитов при хранении можно объяснить тем, что во время хранения КТ, вследствие высокой концентрации клеток происходит некоторая спонтанная активация тромбоцитов под воздействием эндогенного АДФ, выделяемого тромбоцитами, что в свою очередь, приводит к снижению чувствительности рецепторов к АДФ на тромбоцитах. ПИ приводит к подавлению спонтанной активации тромбоцитов, о чем свидетельствует более низкий уровень экспозиции Р-селектина и ФС на тромбоцитах, в результате тромбоциты сохраняют чувствительность рецепторов к АДФ.

Клиническая эффективность трансфузий КТ подвергнутых ПИ

Среднее число тромбоцитов у реципиентов до трансфузии в группе, получивших ПИ КТ и в контрольной группе получивших необработанные КТ, составило 15,3 х 109/л и 14,7 х 109/л соответственно. Терапевтическая доза КТ определялась перед каждой трансфузией из расчета 0,5-0,7 х 10й тромбоцитов на каждые 10 кг веса реципиента и в среднем составила 3,7 х 10й в группе ПИ КТ и 3,9 х 10й в контрольной группе. Через час после трансфузии число тромбоцитов у реципиентов в среднем составило 40,0 х 109/л в группе ПИ КТ и 48,0 х 109/л в контрольной группе. Таким образом, выявлен достоверно более низкий абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) через час после трансфузии в группе ПИ КТ (25 х 109/л против 33 х 109/л) (р<0,001) (табл.8). Аналогичные данные были получены в исследовании БРЯГМТ, в котором на большой репрезентативной выборке показано, что в сравнении с контрольной группой, после трансфузии ПИ КТ прирост тромбоцитов через 1 час существенно ниже (21,4 х 109/л против 34,1 х 109/л).

Исследование числа тромбоцитов через 24 часа (18-24) после трансфузии показало, что средний уровень тромбоцитов через сутки после переливания составил 30,6 х 109/л в группе ПИ КТ и 36,3 х 109/л в контрольной группе. В обеих группах число тромбоцитов через сутки после трансфузии превышало исходное значение, что свидетельствовало об удовлетворительной эффективности заместительной терапии. Однако в группе ПИ КТ показатель АПТ-24 зафиксирован более низким, чем в контрольной группе (15,3 х 109/л против 21.6 х 109/л) (р<0,001) (табл.8)

Таблица 8. Абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) и время до следующей трансфузии после переливания ПИ или контрольных КТ

Регистрируемые данные Трансфузии ПИ КТ (п = 29) Контрольные трансфузии (п = 29)

АПТ-через 1 час(х Ю'/л) (\tfcSD) 25,17 ±7,53 33,24 ±7,49

АПТ - через 24часа (х Ю'/л) (\teSD) 15,27 ±8,25 21,59 ±6,26

Время до следующей трансфузии (дней) 3,31 3,45

Известно, что посттрансфузионный прирост зависит не только от количества переливаемых тромбоцитов, но и от массы тела реципиента. В связи с этим основным критерием посттрансфузионного прироста в нашей работе был скорректированный прирост тромбоцитов (СПТ).

СПТ определяли по формуле: СПТ = АПТ х площадь поверхности тела (м2) / количество перелитых тромбоцитов (х 10й). Скорректированный прирост тромбоцитов так же оказался меньшим после трансфузии ПИ тромбоцитов (табл. 9).

Таблица 9. СПТ после переливания ПИ или контрольных КТ

Регистрируемые данные Трансфузии ПИ КТ (п = 29) Контрольные трансфузии (п = 29)

СПТ - через 1 час (х 10у/л) (\iiSD) 11,61 ±3,14 15,01 ±3,48

СПТ - через 24часа (х Ю'/л) (М±8Э) 7,06 ±3,98 9,76 ± 2,90

С целью сравнительного анализа мы оценили распределение СПТ у реципиентов после трансфузии ПИ и контрольного КТ (рис. 5).

Рисунок 5. Распределение СПТ у реципиентов после трансфузии ПИ КТ через 1 час (А) и 24 часа (Б) и контрольного КТ через 1 час (В) и 24 часа (Г)

-40% го

40% га

-20% о

10 15 20 25

-40% ¡5

"20% Ц

10 15 20 25

-40% га

Примечания: по оси абсцисс - СПТ (х109/л); по оси ординат - частота (поинтервальная) регистрации количества тромбоцитов (%).

Рассмотрим связь СПТ с фактором ПИ тромбоцитов. Сравнение распределений СПТ для случая ПИ КТ и КТ не подвергнутого обработке через 1 час после трансфузии тромбоцитов показывает, что уровень СПТ при трансфузии ПИ КТ статистически значимо ниже, чем при трансфузии необработанного КТ: 11,6 (95% ДИ: 10,4 - 12,8) и 15,0 (95% ДИ: 13,7 - 16,3) соответственно (р<0,001) (рис. 5: А, Б). То же самое справедливо для второй временной точки (через 24 часа после трансфузии): 7,1 (95% ДИ: 5,5 - 8,6) и 9,8 (95% ДИ: 8,7 - 10,9) соответственно (р<0,001) (рис. 5: В, Г).

Таким образом, уровень прироста тромбоцитов в русле крови реципиента (как в первой, так и во второй временных точках) 1) зависит от наличия фактора ПИ, 2) уменьшается при наличии этого фактора, 3) это уменьшение оценочно составляет 23% - 28% (по сравнению с приростом после трансфузии КТ, не подвергнутых ПИ).

По данным различных авторов, удовлетворительным считается значение СПТ-1 выше 7,5-10 х 109/л, СПТ-24 не менее 4,5-7 х 109/л. Таким образом, при использовании ПИ КТ значение СПТ сохранялось в допустимых пределах.

Анализ длительности интервала между трансфузиями в обеих группах показал, что средний интервал между трансфузиями КТ составил 3,3 в группе ПИ КТ и 3,5 дней в контрольной группе (р=0.3). Таким образом, более низкий прирост тромбоцитов после трансфузии ПИ КТ не сопровождался достоверным укорочением интервала между трансфузиями.

Большинство трансфузий в обеих группах проводились с профилактической целью и не сопровождались геморрагическими осложнениями (43 из 58).

В группе ПИ КТ у 7 из 29 реципиентов имелись геморрагические проявления в виде кожно-геморрагического синдрома на момент трансфузии. Все геморрагические осложнения были отнесены к 1-й степени по классификации ВОЗ. Геморрагический синдром был полностью купирован после трансфузии. Также было обеспечено эффективное предупреждение геморрагических осложнений у остальных реципиентов.

В контрольной группе у 8 реципиентов из 29 имелись кожно-геморрагические проявления, отнесенные к 1-й степени по классификации ВОЗ. Как и в случае

трансфузии ПИ КТ, в контрольной группе было отмечено купирование геморрагического синдрома и эффективная профилактика геморрагических осложнений.

Таким образом, использование патогенинактивированных концентратов тромбоцитов не оказывает значительного отрицательного влияния на клиническую эффективность трансфузий.

ВЫВОДЫ

1. Патогенинактивация концентратов тромбоцитов фотодинамическим методом с применением амотосалена сопровождается статистически значимым снижением количества тромбоцитов при отсутствии избирательного влияния патогенинактивации на фракции незрелых или крупных тромбоцитов.

2. При хранении концентрата тромбоцитов в первые 24 часа происходит повышение экспозиции фосфатидилсерина. Несмотря на то, что концентрат тромбоцитов, подвергнутый патогенинактивации так же хранился в течение суток, экспозиция фосфатидилсерина сохранялась на исходном уровне. Исследование экспозиции Р-селектина на тромбоцитах так же продемонстрировало рост этого маркера в результате хранения, в то время как в группе патогенинактивированных концентратов тромбоцитов уровень экспозиции Р-селектина сопоставим с исходным.

3. При исследовании экспозиции фосфатидилсерина после активации аналогом коллагена (CRP) в группе патогенинактивированных концентратов тромбоцитов выявлено снижение активационного ответа тромбоцитов. Исследование экспозиции Р-селектина в ответ на активацию коллагеном в этой же группе показало сохранение адекватной активационной способности тромбоцитов.

4. Исследование агрегации тромбоцитов продемонстрировало лучшие результаты агрегации с АДФ тромбоцитов подвергнутых патогенинактивации в сравнении с необработанными тромбоцитами при прочих равных условиях. Агрегация с коллагеном и ристомицином сохраняется на сопоставимом с исходным уровне, как при хранении, так и после патогенинактивации.

5. Анализ посттрансфузионного прироста у реципиентов показал более низкий прирост тромбоцитов после трансфузии концентратов тромбоцитов подвергнутых патогенинактивации и в сравнении с контрольной трансфузией тромбоцитов хранившихся в течение 20-24 часов с соблюдением аналогичных условий хранения. Более низкий посттрансфузионный прирост не приводил к увеличению частоты трансфузий концентратов тромбоцитов.

6. Клиническое использование концентратов тромбоцитов, подвергнутых фотодинамическому методу патогенинактивации с использованием амотосалена,

показало отсутствие значимого отрицательного влияния этого метода патогенинактивации на получение гемостатического эффекта или на предотвращение тромбоцитопенических осложнений.

Список опубликованных печатных работ по теме диссертации:

1. Накастоев И.М., Грачев А.Е., Гемджян Э.Г., Пантелеев М.А., Захарова Н.В., Ватагина Е.А., Кастрикина И.С., Погорелов В.М., Рыжко В.В. Изменения функциональных характеристик тромбоцитов при проведении инактивации патогенов в концентратах тромбоцитов. Гематология и трансфузиология. М., 2012 - Т.57 - №5. С 31-36.

2. Накастоев И. М., Грачев А. Е., Гемджян Э. Г., Цыба Н. Н., Журавлев В. В., Кречетова А. В., Кастрикина И. С., Ватагина Е. А., Рыжко В. В., Городецкий В. М. Клиническая эффективность переливаний патогенинактивированных концентратов тромбоцитов. Терапевтический архив. 2013 - Т.85 - №8. С.77-80

3. Islam М. Nakastoev, Eduard G. Gemdjian, Mikhail Zh. Alexanyan, Vladimir M. Gorodetsky. Clinical Efficacy of platelets concentrates during transfusion treated with the INTERCEPT Blood System. 23rd Regional Congress of the ISBT, Amsterdam. Abstr. code: P-197.

4. Islam M. Nakastoev, Eduard G. Gemdjian, Zakharova N. V., Vatagina E. A., Alexanyan M. Zh., Vladimir M. Gorodetsky. The functional properties of platelets treated with the INTERCEPT blood system for pathogen inactivation. 23rd Regional Congress of the ISBT, Amsterdam. Abstr. code: P-205.

5. Vatagina EA, Nakastoev IM, Aleksanyan MJ, Gorodetsky VM. Effect of INTERCEPT blood system technology on the quality of platelet concetrates -experience from moscovv haematology research center. 23rd Regional Congress of the ISBT, Amsterdam. Abstr. code: P-206.

6. Накастоев И. M., Гемджян Э. Г., Городецкий В. М. Влияние патогенинактивации на клиническую эффективность трансфузий концентратов тромбоцитов. Вестник МЦ УДП РК. Сер. Медицина 2013. Специальный выпуск (50). С.102-103

Подписано в печать: 23.10.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 994 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru