Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Сравнительная оценка методов заготовки, обработки и клинического применения концентратов тромбоцитов

На правах рукописи

КАРПОВА Оксана Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ЗАГОТОВКИ, ОБРАБОТКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ

ТРОМБОЦИТОВ.

14.01.21-гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005559737 3 МА? 2115

Москва 2015

005559737

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович доктор медицинских наук Трахтман Павел Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Голенков Анатолий Константинович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Н.Ф.Влади мирского.

Жибурт Евгении Борисович-доктор медицинских наук, профессор, заслуженный рационализатор РФ, проректор по научно-организационной работе Института усовершенствования врачей Национального медико-хирургического центра имени Н.И. Пирогова.

Ведущая организация:

Федеральное Государственное бюджетное учреждение Гематологический Научный Центр Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: РФ Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, д.4

диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117198, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России и на сайте www.niidg.ru

Автореферат разослан«¡4 2015 г.

Защита состоится

2015 г. в 12 часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов Вениамин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Сегодня трансфузии аллогенных КТ (концентрат тромбоцитов) имеют важное значение для детей с онкогематологическими заболеваниями для профилактики или купирования геморрагического синдрома, развившегося вследствие тромбоцитопении или тромбоцитопатии при различных заболеваниях кроветворной системы или миелотоксического воздействия цитостатиков и/или лучевой терапии (А.Г. Румянцев, В.А. Аграненко 2002). Интенсивность и агрессивность современных протоколов химиотерапии, широкое внедрение технологий трансплантации гемопоэтических стволовых клеток делают донорский концентрат тромбоцитов самым востребованным компонентом крови.

Необходимо оптимизировать и совершенствовать технологии заготовки, обработки компонентов крови для обеспечения максимально качественной гемотрансфузионной поддержки (Филатов Ф. П. и др. 2001; Донское С. И. и др. 2001).

Актуальными проблемами безопасности трансфузий на сегодня являются:

1. Количество тестируемых патогенов ограничено только вирусами гепатитов В и С,

ВИЧ.

2. Риск бактериальной контаминации концентратов тромбоцитов.

3. «Слабые места» скрининг-тестирования: период «серонегативного окна» и ограниченность чувствительности тест-систем.

4. Отсутствие скрининговых тест-систем для новых патогенов.

5. Риск развития негемолитических (фебрильных) трансфузионных реакций, связанных с аллогенными донорскими лейкоцитами и белками плазмы.

На сегодняшний день указанные проблемы не решены окончательно, поэтому необходимо использовать максимально все возможности для сведения посттрансфузионных рисков к минимуму.

Для решения этих задач существует стандартный комплекс мероприятий: совершенствование методов отбора доноров, технологий двухэтапного лабораторного скрининга (серологический скрининг + тестирование нуклеиновых кислот (NAT), способов заготовки компонентов крови (приоритет аферезным технологиям с применением лейкорсдукции), бактериальное тестирование, архивация донорских образцов, выполнение программы по карантинизации плазмы. Но, серологические методы и тестирование нуклеиновых кислот (NAT) снижают, но не исключают вероятность передачи стандартных тестируемых патогенов (Hogman C.F. 1976).

Также возрастает риск передачи патогенов, на наличие которых не проводится скрининг донорской крови. В 2009 году Комитет по заболеваниям, передаваемым при переливании крови

Американской ассоциации банков крови определил 68 новых патогенов с подтвержденным или потенциальным риском передачи при переливании компонентов крови (Stramer S. et.al. 2009). В качестве приоритетных для тестирования были определены следующие патогены: вирус лихорадки Денге и Babesia spp, вирус Чикунгуньи, Leishmania spp, Plasmodia spp, Trypanosomacruzi, парвовирус B19, аденовирус человека 5 типа,вирус гриппа H1N1.

Распространение новых патогенов связано с естественной миграцией вирусов из тропических стран в страны с умеренным климатом. Это связано и с увеличением путешественников по всему миру, и с климатическими переменами (Sharm S.P. 2010; Rezza G. et al. 2007; Zheng K.et al. 2010; Rasongles P.et al. 2009).

Еще больший риск трансфузионной передачи патогенов возникает в результате потенциальной бактериальной контаминации концентрата тромбоцитов, что связано с погрешностями заготовки (погрешность обработки локтевого сгиба, ошибки при венепункции, повторная венепункция, отсутствие отвода первой порции крови в контейнер-спутник) (Corash L. et al. 2011) и с комнатной температурой хранения KT (Corash L. 2000).

Скрининг KT на наличие бактерий не дает 100% гарантию безопасности гемотрансфузий (BCleinman S. et al. 2012). Доказано, что частота передачи бактериальной инфекции даже после проведения скрининга составляет 1 на 1500 KT (Murphy W.G. et al. 2008). Учитывая, что средний взрослый пациент с онокгематологическим заболеванием получает 6 KT за один цикл химиотерапии, то риск передачи бактериальной инфекции при гемотрансфузиях возрастает до 1:250.

Актуальной проблемой остается не только инфекционная, но и иммунологическая безопасность гемотрансфузионной терапии (Абдулкадыров K.M. и др.; Глазанова Т.В. и др. 2011). Неинфекционные (иммунологические) трансфузионные осложнения связаны с присутствием в компонентах крови жизнеспособных аллогенных лейкоцитов, не смотря на внедрение фильтрации донорской крови. К ним относятся: лихорадочные негемолитические реакции, острое поражение легких связанное с переливанием (ТРАЛИ), аллоиммунизация к лейкоцитарным антигенам, формирование рефрактерности к трансфузиям KT, болезнь «трансплантат против хозяина» (Pelszynski М.М. et al. 1994; Seftel M.D. et al. 2004; Rebulla P. 2005; Geiger T.L. et al. 2007; Hendrickson J.E. et al. 2009).

Поэтому на сегодняшний день очень актуален поиск оптимальных способов заготовки и методов обработки компонентов крови, чтобы максимально минимизировать риск посттрансфузионных реакций. Особенно важен этот вопрос в отношении больных с иммунодепрессией (Morel P.C. 1999; Мс Cullough J. 2007).

Заготовку аферезных концентратов тромбоцитов (АКТ) с пониженным содержанием плазмы можно рассматривать как один из способов заготовки компонентов крови с целью

уменьшения частоты трансфузионных реакций, связанных с биологически активным! компонентами плазмы (deWildt-Eggen J. et al. 2000; Azuma H. et al. 2009; Fontana S.et al. 2011; Marschner S. et al. 2011).

В последнее десятилетие на фоне роста числа заместительных трансфузий все больший интерес представляет заготовка КТ с применением добавочных растворов (ДР) с целью снижения вероятности развития негемолитических посттрансфузионных реакций. Кроме того, использование добавочных растворов при заготовке КТ способствует сохранению функциональной активности тромбоцитов при длительных сроках хранения (Murphy M.F. et al. 1991; Seghatchian J. et al. 2001; Procházková R. et al. 2007; Tynngard N. et al. 2012).

Для максимального уменьшения инфекционных рисков целесообразно внедрение различных технологий инактивации патогенов (ИП) и донорских лейкоцитов (с применением ультрафиолета (УФ) в сочетании с фотосенсибилизатором) в клеточных компонентах крови (синонимы: инактивация патогенов, вирусинактивация). Современные технологии ИП позволяют в короткие сроки получать КТ, свободными от патогенов (вирусов, бактерий, простейших), тем самым обезопасив реципиента от возможных трансфузионных осложнений. В отличие от бактериальной детекции, эффективные технологии ИП могут значительно снизить риск пролиферации минимального уровня бактерий при хранении (Ruane Р.Н., et al. 2004; Goodrich R.P. et al. 2006; Cardo L.J. et al. 2007; Rentas F.et al. 2007; Goodrich R.P. et al. 2009).

Основной принцип различных технологий инакгивациии патогенов и аллогенных лейкоцитов заключается в воздействии на нуклеиновые кислоты. Идеальные технологии ИП должны обеспечивать не только максимальное снижение патогенной нагрузки на компонент крови и инактивацию аллогенных лейкоцитов, но и обеспечивать максимальную сохранность клеток и белков крови.

Сама процедура заготовки, процессинга и хранения тромбоцитов, а также способы обработки КТ приводят к выраженным изменениям их морфологических и функциональных характеристик, что в свою очередь ведет к снижению терапевтической эффективности трансфузионной терапии (Holme S. 1998; Seghatchian J. 2006). Необходимо всесторонне оценить не только морфо-функциональные характеристики клеток, но и клиническую эффективность концентратов тромбоцитов, заготовленных и обработанных разными методами.

Цель исследования - оценить на разных сроках хранения качество концентратов тромбоцитов (in vitro и in vivo), заготовленных и обработанных разными способами и их клиническую эффективность для оптимизации гемотрансфузионной терапии в педиатрии.

Задачи исследования:

1. Оценить морфологические и метаболические характеристики концентратов тромбоцитов на разных сроках хранения, заготовленных разными способами.

2. Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения, заготовленных разными способами.

3. Оценить морфологические характеристики концентратов тромбоцитов на разных сроках хранения, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.

4. Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.

5. Изучить эффективность Rg-облучения для инактивации остаточных лимфоцитов в концентрате тромбоцитов и необходимость Rg- облучения в технологической цепи обработки концентратов тромбоцитов.

6. Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний концентратов тромбоцитов, заготовленных разными способами.

7. Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний концентратов тромбоцитов, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.

Научная новизна:

В отличие от существующих стандартных методов заготовки АКТ был впервые применен автоматический метод получения АКТ на аппарате Trima Accel с пониженным содержанием плазмы с применением добавочного раствора SSP+. Новая методика афереза КТ позволяет эффективно использовать компоненты крови в педиатрической практике с целью снижения вероятности развитая негемолитических постгрансфузионных осложнений у пациентов (за счет уменьшения биоактивных компонентов плазмы) на фоне роста числа заместительных трансфузий.

Впервые в России проведен сравнительный анализ морфофункциональных и биохимических параметров клеток в КГ, заготовленных на платформе Trima Accel по методике с применением добавочного раствора. Показатели качества клеток in vitro указывают на оптимальное качество тромбоцитов в течение всего периода хранения, независимо от способа заготовки АКТ. По морфофункциональным и биохимическим параметрам КТ, заготовленные в ДР, характеризуются менее интенсивными процессами гликолиза; по антигенной структуре отличаются более низким уровнем спонтанной и индуцированной экспрессии маркеров активации и апоптоза. Доказана необходимость внедрения новой методики процессинга АКТ в

ДР в педиатрической практике с целью решения задачи максимального сохранения жизнеспособности тромбоцитов в процессе заготовки и хранения.

Впервые была проведена сравнительная оценка изменений морфологических и акгивационных параметров тромбоцитов (заготовленных разными способами) при обработке АКТ по технологии инактивации патогенов с применением УФ (ультрафиолетовое облучение) +РФ (рибофлавин) и Rg-облучением в дозе 25 Гр. Следствием воздействия на тромбоциты УФ+РФ является изменение морфофункциональных показателей тромбоцитов к концу срока хранения и увеличение активации тромбоцитов с запуском процессов апоптоза в течение хранения. При этом Rg-облучение не оказывает отрицательного влияния на тромбоциты, что подтверждается данными исследования in vitro.

Впервые в педиатрической практике было изучено клиническое применение АКТ, заготовленных разными способами и обработанных УФ+РФ, и проведен сравнительный анализ данных. Доказано, что клиническая эффективность КГ, заготовленных в плазме и КТ в ДР равнозначна по таким показателям, как АПТ и СПТ, но при оценке количества неэффективных трансфузий и постгрансфузионных осложнений, более эффективными оказались КТ, заготовленные в ДР. Выявлена корреляция между результатами in vitro и in vivo и доказано уменьшение клинической эффективности КТ, обработанных ИП с применением УФ+РФ.

Научно-практическая значимость работы:

Полученные результаты позволяют считать заготовку концентратов тромбоцитов с добавочным раствором приоритетным способом заготовки концентратов тромбоцитов в педиатрической практике. Данные по сравнению клинической эффективности разных концентратов тромбоцитов, позволяют выработать правильную стратегию по заготовке и обработке компонентов крови, для оптимизации гемостатической терапии для пациентов с онокгематологическими заболеваниями.

Результаты работы были доложены на: II конгрессе гематологов России, 17-19 апреля 2014г. Москва, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 24-25 июня 2014г, г. Санкт-Петербург, Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы и перспективы развития службы крови Республики Казахстан», 10-11 сентября 2014 г., г. Алма-Ата, Казахстан., 2ndEupl an conferenceEuropeanplateletNetwork,, 24-26 September 2014, Le bischenberg, France, Х1УСъезде федерации анестезиологов и реаниматологов, Казань, 20-22 сентябрь 2014 Международной конференции «Гемостаз, проблемы и достижения», 10-13 октября, Ереван, Армения. Научно-практической конференции «Производственная и клиническая

эффективность концентратов тромбоцитов плазмы, инаетивированных амотосаленом и ультрафиолетовым облучением», Санкт-Петербург 11-12.11.2014г. Международной конференции Bleedingdisorders, Berlin, Germany October 30-November 1 2014

Апробация работы состоялась 10.10.2014г на совместном заседании отделов трансплантации гемопоэтическх стволовых клеток и молекулярной и экспериментальной медицины в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России.

По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей (4- в журналах ВАК) и 8 тезисов, 2 из которых в иностранных изданиях

Структура и объем диссертации:

Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 25 рисунками. Представлены ссылки на 176 литературных источника (16 отечественных, 160 зарубежных).

Содержание работы

Работа выполнена в отделении трансфузиологии, заготовки и процессинга гемопоэтических стволовых клеток (зав. - д.м.н. П.Е.Трахтман), отдела трансплантации стволовых клеток (зав. - д.м.н. М.А. Масчан) и лабораториях физиологии и патологии гемостаза (зав. - д.б.н., проф. Е.В.Ройтман), клеточного гемостаза и тромбоза (зав. - д.ф-м.н., проф. МА.Пантелеев), физиологии и патологии стволовых клеток (зав. - д.б.н. Е.Ю.Осипова) отдела молекулярной и экспериментальной медицины (зав. - к.б.н., С.СЛарин) ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России (директор - академик РАН, д.м.н., проф. А.Г.Румянцев), часть эксперементальных исследований была выполнена на базе RI лаборатория LF, больница Род-Айленда, г. Провиденс, США при финансовой поддержке Caridian ВСТ Biotechnologies (руководитель лаборатории Лорен Д. Фаст, доктор наук, адъюнкт-профессор медицины).

Материалы и методы исследования

Получение АКТ:

КГ были получены стандартизировано от здоровых доноров методом афереза на сепараторе для автоматизированного сбора крови и ее компонентов Trima Accel (Caridian ВСТ, США).

Заготовка концентратов тромбоцитов была проведена двумя способами: классический -в 100% плазме и с плазмозамещающим раствором SSP+ (Макофарма, Франция). ДР добавляли

сразу (с помощью коннектора) по окончанию процедуры афереза в расчете на такой конечный объем КТ, чтобы выполнялось условие не менее 40 мл общего объема на 0,бх10п клеток. При этом соотношение донорской плазмы и ДР составляло 1:3 (30% донорской плазмы и 70% ДР). Общая характеристика КТ:

КТ, заготовленные в плазме (п=28): ср. объем КТ 444±102 мл; средняя концентрация тромбоцитов составила (6,6±1,5)х10".

КТ, заготовленные с ДР (п=29): ср. объем КТ до добавления ДР составил 131±25,8; после добавления- 437±86мл; средняя концентрация тромбоцитов составила (6,5±1,3)х 1011.

Средняя концентрация тромбоцитов при заготовке в обеих группах КТ составила 6,85 - 10й, средний объем КТ - 458,46 мл.

Все заготовленные КТ были автоматически лейкоредуцированы (с помощью камеры лейкоредукции ЬЛБ) с обязательным последующим лабораторным контролем на проточном цитометре). Все КТ, участвовавшие в исследовании, содержали лейкоциты менее 1 х ю6.

При исследовании образцов КТ, обработанных разными методами, разделение исходного КТ проводилось по следующей схеме (табл.1).

Таблица 1

Схема разделения АКТ, заготовленных разными способами, для последующей обработки разными методами

КТ-Плазма КТ-ДР

0бъем-570 мл Объем 610 мл

Количество тромбоцитов 8,5*10" Количество тромбоцитов 8,5 х 10 "

КТ-К KT-Rg КТ-М КТ-К KT-Rg КТ-М

105 мл 80 мл 360 мл 105 мл 80 мл 450 мл

1,55,10" 1,1x10й 5,4х10" 1,55хю" l,lxl0U и 6,3x10

КТ-К - не подвергалась никакой обработке, контрольная группа.

KT-Rg - подвергалась рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.

КТ-М - подвергалась обработке по инактивации патогенов.

Вирусинакгивация КТ проводилась с помощью технологии PRT-система Mirasol (Candían), основанная на сочетанием использовании рибофлавина и УФ-В-250-350 нм. Вирусинакгивация КТ проводилась строго согласно инструкции производителя, соблюдая требования по технологии сбора КТ, по срокам обработки, объему КТ и концентрации тромбоцитов (перед добавлением рибофлавина).

Rg-облучение КТ проводили в день заготовки не позднее двух часов после заготовки на рентгеновском аппарате «АРДОК -1» (Россия).

КТ хранились в интегрированных полимерных контейнерах производства компании Terumo ВСТ, соответствующих требованиям спецификации, в течении 5-и дней со дня заготовки при температуре +20-24 °С в термостате при постоянном помешивании.

КТ обеих групп были разделены на две равные части (общее количество тромбоцитов на один гемоконтейнер не должно превышать 5,1 хЮ11 - по условиям от производителя).

Огбор проб (по 3 мл) КТ проводили в стерильных условиях через 2 часа после афереза (1час- фаза покоя, КТ находился вне шейкера, комнатная температура хранения (для спонтанной дезагрегации) и 1 час в термостате при температуре +20-24°С при постоянном перемешивании)- на 0-й день, 1-й, 3-й и 5-й дни хранения.

Для оценки функциональной активности CD3+ (обработанных и необработанных) клеток определяли митогенный ответ методом серийных разведений (МСР) путем выделения МКПК (в градиенте Ficoll-Hypague), получения СШ-обедненной фракции методом негативной иммунномагнитной селекции (Miltenyi Biotec, Калифорния) с последующим гамма-облучением в дозе 30 Гр; выделения CD3+ положительной фракции методом позитивной иммунномагнитной селекции с последующим приготовлением серийных разведений для необработанных клеток: разведения 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 и 0,625 клеток/на объем лунки), и для клеток, подвергнутых гамма-облучению или ИП разведения: - 1x105, 3,3х10\ 1,1x104, 3700, 1200, 410, 140 и 46 клеток/на объем лунки).

Используемая среда содержала: 16% эмбриональная телячья сыворотка (FCS Atlanta Biologicals, Атланта, штат Джорджия), 8 мг/мл ФГА-М (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), 50 ед/мл рекомбинантный IL-2 человека (Zeptometrix, Буффало, штат Нью-Йорк), 10% стимулятор роста Т-клеток (TCGF,Zeptometrix).

В лунки 96-луночного планшета вносили фидерные клетки (1х105 клеток на объем лунки), а затем добавляли обработанные и необработанные (контрольные) Т-клетки. Опыты с каждым разведением были воспроизведены в 12 лунках; поставлен контрольный эксперимент при отсутствии Т-клеток в системе.

На 3-й, 7-й, 14-й дни в каждую лунку вводили 25 мл питательной среды, содержащей 45% FCS, 45% TCGF, 500 U/мл рекомбинантного человеческого1Ь-2, 80мг/мл РНА-М. Для предотвращения испарения все планшеты накрывались специальной водонепроницаемой и С02 проницаемой пленкой и инкубировались при температуре 37 °С. На 21-й день проводилась микроскопическая оценка розеткообразования. Положительным результатом оценки пролиферации клеток в каждой лунке считалось наличие хотя бы одной розетки под микроскопом.

Для оценки клинической эффективности трансфузий в исследование были включены трансфузии КТ, заготовленных и обработанных разными способами, пациентам с

тромбоцитопенией менее 20х109л. Оценивали трансфузии КТ пациентам с геморрагическим синдромом по шкале ВОЗ менее 2 баллов (петехии, синяки на коже, подслизистые гематомы, гематурия, мелена, кровохарканье, маточное кровотечение (более двух прокладок в сутки), носовое кровотечение (продолжительностью более часа), но не требующее трансфузий эритроцитов, и у которых отсутствовали состояния, связанные с повышенным потреблением тромбоцитов (инфекция, лихорадка, спленомегалия, ДВС и др). Проанализировали клинико-лабораторные показатели эффективности трансфузий: абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) и скорректированный прирост тромбоцитов (СПТ) через 24 часа после трансфузии, продолжительность межтрансфузионных интервалов, а также эффективность трансфузий и количество посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных в 100% плазме, с добавочным раствором не-/обработанных по технологии патогенной редукции. Неэффективными трансфузиями считались те переливания КГ, когда АПТ был равен или ниже ноля, отсутствовал гемостатический эффект и пациенту требовалась повторная трансфузия КТ для купирования геморрагического синдрома.

Всего было проанализировано 814 трансфузий КТ, из них: КТ-Плазма - 387 ед.; КТ-ДР-257 ед.; КТ-Плазма, обработанные ИП - 70 ед.; КТ-ДР, обработанные ИП -100 ед.

Подсчет количества тромбоцитов в исследуемых образцах проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex КХ-21 путем разведения образца буферным раствором в соотношении 1: 10 после предварительного перемешивания образца на программируемом ротаторе-миксере BioSan MuItiBioRS-24 (BioSan, Латвия).

Подсчет количества остаточных лейкоцитов в концентрате тромбоцитов проводили на проточном цитометре FACSCantoIIc применением наборов Kit Tru Count Fluorospheres фирмы «Becton Dickinson» (определение антител против панлейкоцитарного маркера CD45).

Для оценки состава и кислотно-щелочного состояния КТ использовался прибор РОС-анализатор iSTAT (Abbot Laboratories Inc., США; Сервис Инструмент Плюс, Россия - картриджи СНЕМ8+ и CG4+.)

Методика исследования КТ методом проточной цитометрии:

Образцы КТ разбавляли в 40 раз буфером А (150 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0,4 мМ NaH2POj, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,5 % бычий сывороточный альбумин, рН 7,4) с добавлением 5 мМ СаСЬ. В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р-сслсктина, фосфатидилсерина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии на Accuri Сб (BD Biosciences, USA) с помощью флуоресцентно меченых антител PE-CD62P (Bioscience, USA), FITC-PAC-1 (BD Biosciences, USA) и Alexa 647-annexinV (Biolegend, USA).

Для активации тромбоцитов (при исследовании маркеров активации в каждой из групп при разделении КТ на три равные части: контрольная группа - КТ, группа, облученная Rg-KT-

Rg; группа, обработанная по системе ИП-КТ-М) в пробы вносили аналог коллагена CRP (collagen related peptide) до конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию проводили в течение 15 минут, после чего в пробы добавляли флуоресцентно меченные антитела и инкубировали еще 5 мин. Затем пробы разбавляли в 20 раз буфером А с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре по характерному светорассеянию и флуоресценции связавшихся на поверхности тромбоцитов антител.

Анализ полученных результатов проводили при помощи специализированного программного обеспечения CFlowPlus. Границы популяции тромбоцитов определяли по характерному светорассеянию. Далее только для выделенной зоны тромбоцитов анализировали флуоресценцию связавшихся на их поверхности антител. За 100 % принимали число всех событий в популяции тромбоцитов. Процент фосфатидилсерин-положительных определяли как отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных аннексином V, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов. Процент Р-селектин- положительных определяли как отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных CD62P, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов.

Статистический анализ проводили с помощью программного пакета Origin 8.0 (OriginLabCorp., USA). Значения показателей в группах представлены средними значениями (М ± SD). Для оценки различий между значениям показателей в группах применяли тест Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р< 0,05.

Вычисление частоты событий (ответ на стимуляцию-розеткообразование) в исследовании методом серийных разведений рассчитывали по анализу си-квадратов на основании распределения Пуассона. Для распределения Пуассона можно утверждать, что 37% ячеек в среднем отрицательны, если один конкретный лейкоцит попадал в каждую лунку в самом начале. Уменьшение логарифма Т-клеток может быть рассчитано следующим образом (^контрольIfo6pаботта), ГДеГютроп, - ЭТО ЧаСТОТНОСТЬ Т-КЛвТОК в контрольных клетках, a fобработка - это частотность Т-клеток в ИП - обработанных или гамма-облученных клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ:

По морфологическим параметрам тромбоцитов можно проанализировать их биологическую полноценность - структурную целостность и функциональную активность. Адекватный гемостатический эффект при клиническом использовании концентратов тромбоцитов зависит от оценки параметров биологической полноценности клеток. (ЮЛ. Шевченко, Е.Б. Жибурт, 2008).

Мы исследовали такие морфологические параметры в КТ-Плазма и КТ-ДР (без обработки, подвергнутые Rg-облучению и обработанные ИП), как среднее количество, индекс

содержания больших тромбоцитов 12 фл (platelet large cell ratio - P-LCR), средний объем (mean platelet volume- MPV) и ширина распределения по объему (platelets distribution width-PDW). Измерение указанных параметров проводили сразу после заготовки (ТКО), на 1-й день (ТК1), на 3-й (ТКЗ) и пятый дни (ТК5) хранения.

Важным фактором поддержания качества хранящихся тромбоцитов является постоянная концентрация тромбоцитов. Среднее содержание тромбоцитов во всех группах KT на протяжении всего периода хранения не менялась и достоверных отличий между группами не выявлено. В образцах KT, обработанных ИП. количество клеток было примерно в 1,2 раза меньше по сравнению с КТ-К, что соответствует разведению при добавлении раствора рибофлавина в количестве 35 мл. Это соотношение сохраняется в течение всего срока хранения как для образцов заготовленных в плазме, так и в ДР(рис. 1).

--КГ-КДР

- KT-Rg ДР КТ-МДР

КГ-К Плазма

А

3

t in, хранения

KT-Rg Плазма КТ-М Плазма

Рисунок 1. Среднее количество тромбоцитов в группах КТ, заготовленных и обработанных разными способами.

Показатель Р-ЬСК отражает содержание больших тромбоцитов, которые характеризуются высокой активностью в процессах тромбообразования. По этому показателю в обеих группах (по заготовке) также не выявлено значимых изменений в течение 5-и дней хранения (рис 2).

О 1 3

День хранения

■ КТ-К Плазма

■ KT-Rg Плазма КТ-М Плазма

— D- КТ-КДР -О- KT-Rg ДР КТ-МДР

Рисунок 2. Изменения индекса Р-ЬСЯ в группах КТ, заготовленных и обработанных разными способами, в течение срока хранения.

Величина определяет степень анизоцитоза, указывает на наличие агрегатов

тромбоцитов или их фрагментов. К пятому дню хранения этот показатель достоверно снижался в группе КТс ДР (р=0,02) (рис.3).

16,0

14,0

^ 12,0 £

е 10,0 8,0 6,0

1

Г ~ ~ * " -

0 13 5

День хранения

■ КТ-К Плазма

■ К'Т-Б^ Плазма КТ-М Плаз ма

-О- КТ-КДР -О- КТ^ДР КТ-МДР

Рисунок 3. Величина PDW в группах КТ, заготовленных и обработанных разными способами, в течение срока хранения.

По среднему объему тромбоцитов (МРУ) внутри обеих групп, заготовленных разными способами, достоверных отличий не выявлено (рис.4).

••.....—1- ■

ь ■ - ^ :=

а "1 ~ " "3

День хранения

КТ-К Плазма КТ-йё Плазма КГ-М Плазма

--КТ-КДР

— — КТ-БёДР КТ-МДР

Рисунок 4. Величина МРУ в группах КТ, заготовленных и обработанных разными способами, в течение срока хранения.

Статистически значимых различий по МРУ, Р-ЬСИ и РБ\¥между группами КТ-Плазма и КТ в ДР не выявлено в течение всего периода хранения. Группы образцов КТ-К и КТ-!^ между собой также не отличаются по параметрам РЬТ, PDW, МРУ и Р-ЬСИ в течение всего срока хранения. Это справедливо, как для образцов, заготовленных в плазме, так и в ДР.

По морфологическим параметрам МРУ, Р-ЬСЯ и РЭШотмечается достоверное увеличение всех величин к пятому дню хранения в группах КТ-Плазма и КТ в ДР,

обработанных по технологии ИП, но они не выходят за рамки референсных значений, (рис. 1,2,3,4).

Можно сделать вывод, что в процессе заготовки КТ обоими способами и после обработки КТ методом И^-облучения, а также в процессе их хранения морфологических изменений не выявлено, а это важно для сохранения посттрансфузионной выживаемости тромбоцитов.

После обработки КТ по технологии ИП отмечается повышение параметров клеток МРУ, Р-ЬСИ. и РЭи'. К концу хранения происходит увеличение- разбухание клеток (ЕгиЫ в. с! а1. 2008), что объясняется и воздействием УФ-лучей спектра В и С (Ц .1. е( а1. 2005).

При исследовании биохимических показателей (рН, концентрация лактата и глюкозы) можно сделать заключение, что условия хранения в КТ, заготовленных в плазме и в КТ с ДР обеспечивают стабильность метаболических процессов в течение первых 5 суток.

При заготовке КТ с добавочным раствором уровень глюкозы и содержание лактата несопоставимы с такими же параметрами в КТ-Плазма (согласно разведению). При сравнении скорости метаболических процессов в обоих КТ отмечается снижение метаболизма в КТ с ДР, что проявляется уменьшением скорости потребления глюкозы и образования лактата в динамике по сравнению с КТ-Плазма (рис.5, 6).

у - -0,69x5^,17

2 3 4

Дни хранения

♦ КТ-Плазма ИКТ-ДР

Рисунок 5. Сравнение потребления глюкозы в КТ-Плазма и КГ-ДР.

20

у = 1,46х+ 1,72 Я' - 0,99

2 3 4

Дни хранения

♦ КТ-Плазма ИКТ-ДР

Рисунок 6. Сравнение образования лактата в КТ-Плазма и КТ-ДР.

Данные, полученные нами по изучению биохимических параметров, согласовываются с данными Picker et al. и Macher et al: значения pH для всех KT находились значительно выше минимальных значений, установленных нормативными стандартами (6,4) - по стандартам Европы (Руководство по приготовлению, использованию и обеспечению качества компонентов крови. 16-е издание 2010г), в России- 6,4-7,4 (Постановление Правительства РФ № 29 сгг 26.01.2010).

Также на качество «жизни» тромбоцитов влияет не только способ их заготовки и условия хранения (длительность хранения), но и тип контейнера и среда хранения (плазма или ювешивающий раствор) (Tynngrd N. 2009). Ключевым фактором поддержания окислительного фосфорилирования для надлежащего синтеза АТФ, является достаточное количество кислорода. Данный процесс варьирует в зависимости от того, из какого материала изготовлен контейнер для хранения крови (Duraont L.J. et al. 2003; DeWildt-Eggen J. et al. 1998).

Наши результаты определения концентрации образовавшегося лакгата и поглощенной глюкозы в конце периода хранения, сходные с данными Picker et al. и Macher et al., которые подтверждают качество заготовки KT на платформе Trima Acell и говорят о достаточной газопроницаемости контейнеров для тромбоцитов, используемых в технологии Trima Acell. Высокая газопроницаемость контейнеров для хранения KT позволяет поддерживать аэробный метаболический гликолиз, что обеспечивает сохранность морфо-функционалъных свойств тромбоцитов.

Маркеры активации тромбоцитов являются важными показателями in vitro качества тромбоцитов (их жизнеспособности и функциональной активности). Функциональное состояние переливаемых тромбоцитов имеет первоочередное значение для купирования геморрагического синдрома (остановки кровотечения) (Жибурт Е.Б. и др. 2009). На посттрансфузионную активность тромбоцитов оказывает влияние любое воздействие на клетку и в процессе заготовки, и в процессе хранения KT, и в процессе обработки клеток, что приводит не только к изменению биохимических параметров среды, окружающую тромбоциты, но и приводит к выраженным изменениям самих тромбоцитов. Это приводит к активации тромбоцитов, стимуляции реакции высвобождения содержимого гранул тромбоцитов. Поэтому исследование in vitro маркера активации в KT может прогнозировать его посттрасфузионные свойства in vivo. Доказана обратная корреляция экспрессии Р-селектина с величиной посттрансфузионного восстановления тромбоцитов через 15-60 минут после трансфузии и величиной СПТ через 1 час после переливания (Rinder Н.М. et al. 1991).

Важным прогностическим признаком функциональной активности и жизнеспособности тромбоцитов после трансфузии является определение связывания аннексинУ с фосфатидил-серином (Cookson P.et al. 2010).

Другие исследователи (Murphy S. 2004) считают, что ни один из маркеров активации тромбоцитов не оказался эффективным предиктором восстановления или выживаемости тромбоцитов после переливания. Таким образом, этот вопрос остается открытым на сегодняшний день.

Следующим этапом нашего исследования было изучение и сравнение спонтанной экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина в зависимости от способа заготовки АКТ.

Сразу после заготовки в обеих группах KT наблюдался одинаково низкий уровень экспрессии Р-селектина в КТ-Плазма 0,2-5,7 % и в КТ-ДР - 0,3-5,1%., статистически достоверное повышение активации тромбоцитов в KT, заготовленных в плазме в 1-3-дни хранения; значимое повышение активации клеток на 5-й день хранения по сравнению с днем после заготовки в KT, заготовленных в плазме- 1,5±1,4 против 6,7±3,7; в КТ-ДР -2,1±1,6 против 6,8±4,2. Достоверных отличий между показателями экспрессии Р-селекгина на 5-й день между обеими группами KT не выявлено (р=0,62).

Также сразу после заготовки (табл.2) в обеих группах KT отмечается низкий уровень фосфатидилсерина (0,3-3,4 %). На 1-й и 3-й дни хранения экспрессия фосфатидилсерина в KT, заготовленных с использованием ДР, оказалась достоверно ниже, чем в KT, заготовленных в плазме:0,7±0,2 и 1,1±0,3 против 1,0±0,3 и 1,8±0,9 (р<0,05). На 5-й день экспрессия фосфатидилсерина достоверно ниже в группе КТ-ДР (2,6±1,0), чем в группе КТ-Плазма (3,1±1,3) (р<0,05).

В нашем лабораторном исследовании показано, что использование ДР при заготовке АКТ значительно сокращает гликолю (меньшее потребление глюкозы и снижение образования лактата), что обеспечивает более низкую степень экспрессии маркеров активации и апоптоза. Эти же данные подтверждает (Diedrich В. et al. 2008). Но, Andreu G. в своем исследовании показал, что на основании определения скорректированного прироста тромбоцитов и постгрансфушонного выхода тромбоцитов преимуществ какой-либо технологии не было выявлено - исследовали в течение 2-х лет трансфузии 4287 доз KT. Также было доказано, что использование ДР снижает частоту посттрансфузионных аллергических реакций, особенно при переливании АКТ (Andreu G. et al. 2007).

Таким образом, можно сделать выводы, что низкая экспрессия обоих исследуемых маркеров независимо от способа заготовки говорит о качестве процессинга заготовки АКТ.

В процессе хранения клетки меньше активируются при заготовке KT в добавочном растворе, чем в плазме, и уровень экспрессии маркера апоптоза также ниже, чем в КТ-Плазма. (табл.2).

Следующим этапом исследования был анализ экспрессии маркеров активации и апоптоза на поверхности тромбоцитов в зависимости от способа обработки: 1^-об лучения в дозе 25 Гр или по технологии редукции патогенов с применением УФ+РФ.

Сразу после заготовки в группах КТ-Плазма и КТ-ДР в образцах КТ-К и КТ-1^ наблюдался одинаково низкий уровень экспрессии Р-селектина (0,4-9,8%); в образцах КТ, обработанных ИП, уровень экспрессии Р-селекгина был несколько выше (2,4-10,6%). Для КТ-Плазма, обработанных ИП- 3,1±3,1 против - 5,9±3,3 (не обработанных ИП). Для КТ-ДР, обработанных ИП- 1,5±1,4 против 6,7±1,9 (не обработанных ИП) (рис.6).

Таблица 2

Экспрессия маркеров тромбоцитов в зависимости от метода заготовки и сроков хранения КТ

Количество тромбоцитов (в%), экспрессирую щих маркер Длительность хранения КТ, дни

0 1 3 5 6 7

СБ62Р КТ-Плазма 1,5±1,4 2,8±1,9 53±3,0 6,7±3,7 6,8±3,7 11,6±7,2

КТ-ДР 2,1±1,6 1,9^1,9 2,7±1,6 6,8±4,2 8,2±3,8 12,5±4,9

Р 0,24 0,01 0,0004 0,62 0,23 0,43

Аппехш V КТ-Плазма 1,1±0,8 1,0±0,3 1,8±0,9 3,1±1,3 4,8±2,9 8,2±6,1

КТ-ДР 0,8±0,2 0,7±0,2 1,1±0,3 2,6±1,0 5,0±3,1 10,6±6,3

Р 0,23 0,003 0,0001 0.06 0,85 0,17

ТК0-ТК5: КТ-Плазма (п=28), КТ-ДР (п=29), ТК6-ПС7: КТ-Плазма (п=15), КТ-ДР (п=20).

На 1-й и 3-й дни хранения экспрессия Р-селекгина в группах КТ-К и КТ-Я& заготовленных в ДР, достоверно ниже, чем в КТ-К и КТ-!^ заготовленных в плазме. Экспрессия Р-селекгина в КТ-М, заготовленные в плазме, выше, чем КТ-К: 17,6±8,5 против 5,5±2,8 (1-е сутки) и 20,6±7,0 против 6,1±3,3 (3-й сутки). Экспрессия Р-селекгина в КТ-М, заготовленные в ДР выше, чем в КТ-К: 11.5±3.1 против 2,0±1,0 (1-е сутки) и 15,4±3,1 против 3,2±1,8 (3-сутки). При этом, экспрессия Р-селекгина достоверно выше в группе КТ-М, заготовленных в плазме по сравнению с КТ-М, заготовленных в ДР.

На 5-й день хранения экспрессия Р-селектина в КТ-М, заготовленных в плазме и с ДР, выше, чем в КТ-: 36,2±15,4 против 6,5±2,8 (для КТ-Плазма) и 24,5±6,3 против 4,8±1,7 (для КТ-ДР).

Спонтанная экспрессия Р-селектина практически не меняется во всех группах КТ в течение хранения, за исключением групп КТ, обработанных ИП (достоверные отличия по

сравнению с КТ-К). Обработка ИП приводит к увеличению активации тромбоцитов, что приводит к снижению их функциональной активности и проявляется в снижении клинической эффективности (о чем будет сказано дальше).

Рисунок 6. Спонтанная экспрессия Р-селектина (С062Р) в зависимости от способа обработки и сроков хранения КТ.

Экспрессия фосфатидилсерина во всех группах в течение срока хранения сохранялась на низком уровне, за исключением групп КТ, обработанных ИП. При этом отмечаются достоверные различия между контрольными группами и группами КТ, обработанных ИП в течение всего срока хранения. Уровень экспрессии фосфатидилсерина в КТ-ДР, подвергнутых ИП, значительно выше по сравнению с КТ-Плазма, подвергнутых ИП. Это может быть связано с истощением запасов глюкозы или недостаточной буферной емкостью среды в КТ, заготовленных с ДР (Ди1ту К.е! а1.2008).

1 3

День хранения

■ КТ-К Плазма "■"^^КТ-!^ Плазма КТ-М Плазма —О- КТ-КДР КТ-ИвДР КТ-МДР

Рисунок 7. Оценка апоптоза (экспрессия фосфатидилсерина ) в зависимости от способа заготовки и сроков хранения КТ.

Таким образом, обработка КТ (заготовленных обоими способами) ИП приводит к активации тромбоцитов и к запуску в них апоптоза. Эти процессы нарастают к пятым суткам хранения. Метод обработки клеток И^-облучением не приводит к увеличению экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина в течение всего периода наблюдения.

Раньше технология гамма - или облучения в дозе 25 Гр компонентов крови с применением лейкоредукции были единственной альтернативой для инактивации аллогенных лейкоцитов с целью профилактики постгрансфузионной РТПХ у пациента. На сегодняшний день с этой целью компоненты крови подвергают обработке ИП. Поэтому интересно сравнить два способа инактивации лейкоцитов.

Для этого провели сравнение способности к пролиферации трех категорий лейкоцитов: не прошедших обработку (рис.8), обработанных в системе ИП (рис.9),обработанных гамма-облучением (рис.10).

Анализ предельного разведения проводили для количественной оценки эффективности воздействия любого способа обработки на способность Т-клеток к пролиферации. Для этого различное количество необработанных и обработанных СОЗ+клеток добавляли в лунки, где содержались аллогенные С0-3 обедненные облученные питающие клетки и факторы стимуляции (1Ь-2, митоген, ФГА) и проводилась количественная оценка наличия клонов на 21-й день.

Провели два эксперимента, графические результаты которых обозначены двумя линиями (см. рис. 8,9,10). Воздействие ИП и воздействие облучения в дозе 25 Гр имели одинаковую эффективность при предотвращению пролиферации лимфоцитои, что подтверждает логарифмическое уменьшение числа жизнеспособных Т-клеток на 4,9 и 4,3 порядка соответственно.

Содержание СОЗ+ клеток/лунку

Рисунок 8. Оценка митогенной активности необработанных СОЗ+клеток (в % содержание «негативных» лунок).

120%

е

я IS 100%

¡1 » 80%

а

s 60%

в

= 40%

1 20%

3 0%

et

\ •

V_

10 100 1000 10 000 100 000 Содержание CD3+ клеток/лунку

Рисунок 9. Оценка митогенной активности обработанных ИП СЭЗ+клеток (в % содержание «негативных» лунок).

120%

и 100%

■ 1 80% S S

2 2 60% = S?

| I. 40%

Ч 20%

0%

10

100 1 000 10 000 100 000 СодержаныеСБЗ+ клеток/лунку

Рисунок 9. Оценка митогенной активности обработанных гамма-облучением в дозе 25 Гр СОЗ+клеток (в % содержание «негативных» лунок).

Для оценки клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных и обработанных разными способами, проводился мониторинг пациентов, оценивались клинико-лабораторные показатели эффективности трансфузий в каждой группе исследуемых КТ: абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) через 24 часа после переливания, скорректированный прирост тромбоцитов (СПТ) через 24 часа после переливания, продолжительность межтрансфузионных интервалов, количество неэффективных трансфузий, количество посттрансфузионных реакций.

Проанализировано 4 группы трансфузий: КТ-Плазма (N=387), КТ-ДР(Ы=257), КТ-Плазма, обработанные ИП (N=70), КТ-ДР, обработанные ИП (N=100).

1 группа (КТ-плазма):387 трансфузий,132ж., 255м., медиана возраста11лет (4мес. -21 г) со следующими заболеваниями: острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - 223, острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) -164.

2 группа (КТ-ДР): 257 трансфузий, 77 ж., 180 м., медиана возраста 10 лет (4 мес. -21 г) со следующими заболеваниями: ОЛЛ - 152, ОМЛ - 105.

3 группа (КТ-Плазма, обработанные ИП): 70 трансфузий, 32 ж., 38 м., медиана возраста 15 лет (2,4-18 лет) со следующими заболеваниями: ОЛЛ - 30, ОМЛ- 40.

4 группа (КТ-ДР, обработанные ИП): 100 трансфузий, 38ж, 62м, медиана возраста 12 лет (4мес -21 г) со следующими заболеваниями: ОЛЛ - 56, ОМЛ - 44.

Среднее содержание тромбоцитов у реципиентов до трансфузии составило (14,2±6,9)х109/л, (13,5±6,5)х 109/л,(14,6±7,0)х ю'/л и(13,8±6,3)хЮ'/л в 1, 2, 3 и 4 группах соответственно. Терапевтическая доза КТ определялась перед каждой трансфузией из расчета 0,55-0,6хЮп тромбоцитов на каждые 10 кг веса реципиента и в среднем составила (2,3±1,1)х10м, (2,3±1,3)х10", (2,7±1,1)хЮ11, (2,3±1,0)хЮ11в 1, 2, 3 и 4 группах соответственно.

Исследование числа тромбоцитов через 24 часа после трансфузии показало, что средний уровень тромбоцитов через сутки после переливания составил (40,3±17,8)хЮ9/л в 1 группе,(33,1±13,5)хЮ'/л во2 группе, (27,4±12,0)х10'/л в 3 группе и (27,2±12,6)х10'/л в 4 группе. Во всех группах число тромбоцитов через сутки после трансфузии превышало исходное значение, что свидетельствовало об удовлетворительной эффективности заместительной терапии.

Трансфузию КТ можно считать успешной, если минимальные значения СПТ через 24 часа были больше 4,5 (Schiffer С.А. et al. 2001). И если так оценивать все трансфузии КТ в нашем исследовании, то можно сказать, что переливания всех исследуемых групп КТ можно считать успешными. Но,учитывая достоверность выявленных отличий между группами КТ по АПТ, СПТ и длительностью межтрансфузионного интервала, то необходимо более детально сравнить полученные данные.

Таблица 3

Данные по приростам КТ, заготовленных разными методами и обработанных ИП

п Абсолютный 9 прирост; 10 Скорректированный 9 прирост, 10 Межгрансфузионный интервал, дни

КТ-Плазма 387 26,1±17,3(22)* 12,7± 7,5(11,4)* 2,1±1,5(2,0)*

КТ-Плазма-М 70 12,8*9,4(12)* 6,8±5,0(6,9)* 1,7±0,9(1,0)*

КТ-ДР 257 19,6±12,0(18,0)* 9,4± 5,7 (8,3)* 2,1± 1,3(2,0)*

КТ-ДР-M 100 13,3±10,7(13,0)* 6,4±5,1(6,1)* 1,4±0,8(1,0)*

Примечание: *р<0,05 (отличия между группами)

Выявлены различия(р<0,05) между уровнями абсолютного (АПТ=26,1х1о' и АПТ=19,6х1о') и скорректированного (СПТ=12,7х109и СПТ=9,4х109) прироста между группами КТ-Плазма и КТ-ДР, но, величина межтрансфузионного интервала для трансфузий этих групп КТ была одинаковой -2,1дней (р<0,05). Это свидетельствует о сохранении функциональной

активности тромбоцитов в ДР, что также подтверждается более низким уровнем экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина по сравнению с тромбоцитами, заготовленными классическим способом (табл.3).

КТ, обработанные ИП (как в плазме, так и в ДР) характеризуются более низкими

9 __9

(р<0,05) уровнями абсолютного (АПТ=12,8х10 и АПТ=13,Зх10) и скорректированного

9 ..........9

(СПТ=6,8х10 и СПТ=6,4х10 ) прироста. СПТ при переливании КТ-Плазма, обработанные ИП, в 2 раза ниже, чем при переливании КТ-Плазма, не обработанные ИП. СПТ при переливании КТ-ДР, обработанные ИП, в 2 раза ниже, чем при переливании КТ-ДР, не подвергнутые ИП. Более низкая эффективность КТ при обработке ИП подтверждается и в снижении уровня межтрансфузионных интервалов для КТ-Плазма и КТ с ДР, обработанных ИП (1,7 день и 1,4день соответственно), (р<0,05) и приводит к более частым трансфузиям (табл. 3). Более частые трансфузии у детей с онкогематсшогическими заболеваниями приводят к повышенному риску формирования аллоиуммунизации и инфекционных осложнений.

Эти различия связаны с тем, что после заготовки и до проведения переливания пациенту у тромбоцитов, обработанных по технологии ИП, выявлены более высокие уровни спонтанной и индуцированной активации тромбоцитов, что снижает их функциональную активность.

Таблица 4

Данные по приростам КТ, заготовленных с ДР и обработанных ИП, (парные трансфузии)

и перелитые одному пациенту

КТ-ДР ЮГ-ДР-М Р

АПТ через 24 ч, хю'/л 18,1±12,0(15,0) 12,^10,0(12,5) 0,09

СПТ через 24 ч, хю'/л 9,1±5,5 (8,1) 6,4±4,2 (6,3) 0,09

Мы провели исследование, когда одному и тому же пациенту проводили две трансфузии (одна за другой) - парные трансфузии: одна трансфузия - КТ-ДР (без обработки ИП), другая-КТ-ДР, обработанная ИП. Были оценены 68 трансфузий (34 пары) по вышеуказанным критериям (табл.4). Выявлена тенденция к снижению АПТ и СПТ после переливаний в группе КТ, подвергнутых обработке ИП (табл. 3 и 4).

Но, качество трансфузии КТ необходимо оценивать и по критерию эффективности/неэффективности переливания на основании мониторинга динамики геморрагического синдрома у пациента (до и после переливания) и по наличию или отсутствию постгрансфузионных осложнений.

Таблица 5

Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в КТ-Плазма и КТ-ДР

КТ-ДР КТ-Плазма

N Доля, % N Доля, %

Всего трансфузий 257 387

Неэффективных И 4,28%* 36 9,3%*

Осложнений 7 2,72%* 24 6,2%*

*р<0,05 (отличия между группами)

В нашем исследовании все осложнения при переливании КТ относились к группе фибрильных негемолитических осложнений.

Переливания КТ в ДР сопровождаются значительно меньшим количеством как постранфузионных осложнений (р<0,05), так и меньшим количеством неэффективных трансфузий (р<0,05) (табл.5). Известно, что частота аллергических реакций при применении КТ во взвешивающих растворах уменьшается за счет удаления плазмы. (Herve Р.Франция)- показал в масштабном французском исследовании, что использование PAS снижает частоту побочных аллергических поспрансузионных реакций.

Таблица 6

Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в КТ-Плазма и КТ-ДР,

обработанных ИП

КТ-ДР-М КТ-Плазма -М

N Доля, % N Доля, %

Всего трансфузий 100 70

Неэффективных 13 13,0% 10 14,29%

Осложнений 1 1,0% 3 4,29%

Количество неэффективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений не отличаются в обеих исследуемых группах КТ, обработанных ИП (табл. б).

Таблица 7

Сравнение клинической эффективности трансфузий КГ, заготовленных в КТ-ДР и КТ-ДР, обработанных ИП

КТ-ДР КТ-ДР-М

N Доля, % N Доля, %

Всего трансфузий 257 100

Неэффективных 11 4,28%» 13 13,0% *

Осложнений 7 2,72% 1 1,0%*

*р<0,05 (отличия между группами)

Количество неэффективных трансфузий увеличивается в группе с КТ, заготовленных в ДР и обработанных ИП (р<0,05). Достоверных различий по осложнениям нет (табл.7).

Таблица 8

Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в плазме и обработанных УФ+РФ

КТ-Плазма КТ-Плазма-М

N Доля, % N Доля, %

Всего трансфузий 387 70

Неэффективных 36 9,3%* 10 14,29%*

Осложнений 24 6,2% 3 4,29%

*р<0,05 (отличия между группами)

Количество неэффективных осложнений в КТ-Плазма, обработанных по технологии ИП, достоверно выше, чем в группе КТ, заготовленных в плазме и не обработанных ИП. По количеству осложнений эти две группы КТ не отличаются.

Результаты клинической эффективности, полученные в нашем исследовании, согласованы с зарубежны™ данными.

В рамках исследования (Slichter S.J. et al. 2009) по оценке безопасности и эффективности обработанных с помощью системы Mirasol PRT тромбоцитов, не было выявлено преимуществ одного метода по сравнению с другим. Автор утверждает, что для соответствия критериям отсутствия преимуществ одного метода по сравнению с другим абсолютное различие между

двумя группами по величине CCI должно быть менее 2940. С учетом этого между переливаниями КТ в группе обработанных УФ+РФ, и контрольной группой не было различий в среднем числе дней между трансфузиями, в среднем числе трансфузий концентрата тромбоцитов на одного пациента, а также в дозе перелитых тромбоцитов и по количеству посттрансфузионных осложнений.

Slichter S.J., и Jackman Я.Р.провели клиническое испытание (MIRACLE) по клинической оценке переливаний КТ, обработанных УФ+РФ. Пациенты, получавшие тромбоциты, обработанные ИП, вначале показывали более низкий средний показатель прироста тромбоцитов (CI) за периоды 1 ч и 24 ч по сравнению с контрольной (необработанные) группой КТ. В ходе последующих трансфузий показатель прироста КТ-М не снижался. В противоположность этому величины показателей прироста тромбоцитов в контрольной группе неуклонно понижались по мере увеличения количества трансфузий. Одна из возможных причин такого результата при переливании тромбоцитов в динамике заключается в развитии аллоиммунизации пациента, в клиническом исследовании TRAP этот эффект сопровождался высокими уровнями антител HLA (Slichter S.J. et al. 2005; Jackman R.P. et al. 2009). Для пациентов, получающих аллогенный концентрат тромбоцитов, повышается вероятность выработки более высокого уровня антител в организме реципиента, что приведет к выведению тромбоцитов из кровотока .В настоящее время проводятся клинические исследования, направленные на изучение наличия корреляции между показателями прироста тромбоцитов и выработкой аллоантител при переливании КТ, обработанных ИП.

Заключение:

Мы проанализировали морфологические и функциональные характеристики КТ, заготовленные методом афереза с использованием добавочного раствора. Полученные результаты показали, что использование добавочного раствора по сравнению с плазмой снижает спонтанную активацию тромбоцитов и способствует сохранению функциональной активности и жизнеспособности клеток при хранении КТ. Морфологические признаки тромбоцитов при обоих способах заготовки КТ были неизменными, а интенсивность процессов метаболизма в КТ с ДР была ниже, чем в КТ, заготовленных в плазме. В целом, можно сделать заключение, что условия хранения КТ с ДР обеспечивают стабильность метаболически процессов в течение всего периода хранения КТ.

Морфологических изменений не выявлено при обработке КТ, заготовленных обоими способам и подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.

Метод обработки клеток Rg-облучением не приводит к увеличению экспрессии Р селектина и фосфатидилсерина в течение всего периода хранения

При исследовании антигенной структуры тромбоцитов были выявлены более низкие уровни экспрессиии маркеров Р-селекгина (связывание с СЕ)62Р) и фосфатидилсерина (связывание аннексинУ) в КТ, заготовленных с ДР и не наблюдалось значимых изменений по экспрессии указанных маркеров в течение всего периода хранения обоих групп КТ при их обработке рентгеновским облучением.

Данные выводы были подтверждены результатами клинического исследования по переливаниям КТ, заготовленных разными способами. Не смотря на то, что по таким параметрам оценки клинической эффективности, как АПТ и СПТ, группа КТ с ДР показала более низкие значения, чем КТ в плазме, но величина межтрансфузионного интервала была одинаковой в обеих группах КТ. По количеству неээфективных трансфузий и посттрнасфушонных осложнений (фибрильные негемолитические реакции) КТ с ДР показали явное превосходство по отношению к КТ в плазме.

Нами было доказано, что обработка КТ по технологии ИП с применением УФ+РФ, влияет на морфофункциональные характеристики тромбоцитов, что проявляется в увеличении морфологических параметров клеток к пятому дню хранения. Обработка КТ по технологии ИП приводит к активации тромбоцитов и запуску в них апоптоза в течение хранения. И эти процессы нарастают к пятым суткам.

Выявленные изменения тромбоцитов при обработке ИП находят свое отражение при последующем анализе клинического применения КТ, заготовленных двумя способами и обработанных УФ+РФ. Переливания КТ, подвергнутые ИП, характеризуются более низкими значениями АПТ и СПТ по сравнению с необработанными КТ, более коротким межтрансфузионным интервалом и большим количеством неэффективных трансфузий.

Нами была доказана равнозначность обоих методов обработки КГ с целью профилактики РТПХ у пациентов: ¡^-облучение, как и ИП, эффективно снижает способность аллогенных лимфоцитов к пролиферации. Поэтому необходимо наряду с новым способом инактивации лимфоцитов (ИП) активно применять и стандартный метод облучения клеток в дозе 25 Гр, учитывая его меньшую степень воздействия на клетки.

Доказав и подтвердив лучшую сохранность тромбоцитов при заготовке КТ с помощью автоматизированного афереза с использованием добавочного раствора, данный метод заготовки АКТ в педиатрической практике можно считать приоритетным. Данный способ заготовки КТ решает проблему уменьшения трансфузионной нагрузки на пациента и проблему снижения вероятности развития посттрансфузионных реакций.

Данная работа имеет большое практическое значение для клинических трансфузиологов и гематологов. Наши выводы и рекомендации помогут врачам выбрать правильную тактику трансфузионной терапии пациентам.

Выводы:

1. Концентраты тромбоцитов, заготовленные с добавочным раствором, характеризуясь менее интенсивными процессами гликолиза, не имеют достоверных отличий по морфологическим и биохимическим параметрам (MPV, PDf, P LCR, pH, р02, PCO2).

2. Концентраты тромбоцитов, заготовленные в добавочном растворе, характеризуются более низким уровнем спонтанной экспрессии Р-селекгина и фосфатидилсерина (р<0,05), чем в концентратах тромбоцитов в 100% плазме, что приводит к сохранению функциональной активности клеток и клинической эффективности концентратов тромбоцитов.

3. Инактивация патогенов в концентратах тромбоцитов приводит к увеличени морфологических параметров клеток (MPV, PDF, P_LCR), р<0,05, что сопровождаете изменениями их функциональной активности (увеличению агрегационно-адгезионно!" способности клеток при хранении). Rg-облучение не приводит к изменения,«, морфологических параметров клеток.

4. Уровни экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина при спонтанной активацш достоверно выше в группах концентратов тромбоцитов, обработаннь ультрафиолетовым облучением с добавлением рибофлавина (р<0,05), чт подтверждается снижением клинической эффективности переливаний концентрато тромбоцитов, подвергнутых обработке по технологии инактивации патогенов. Rg облучение не влияет на уровень экспрессии маркеров активации и апоптоза..

5. Rg-облучение и технология патогенной редукции являются эффективным способом да предотвращения пролиферации аллогенных лимфоцитов (профилактика РТПХ), о чен свидетельствует доказанное логарифмическое уменьшение их количества на 4,3 и 4, соответственно.

6. Переливания концентратов тромбоцитов с добавочным раствором сопровождаютс меньшим количеством посгранфузионных осложнений, и меньшим количество* неэффективных трансфузий, что доказывает их большую клиническую эффективност по сравнению с концентратами тромбоцитов, заготовленных в плазме.

7. Количество неэффективных трансфузий достоверно выше в группе концентрато тромбоцитов, заготовленных в плазме и с добавочным раствором и обработанных п технологии с применением ультрафиолетового облучения с рибофлавином, чт приводит не только к снижению абсолютного и скорректированного прироста, но i уменьшению межтрансфузионного интервала и, как следствие, увеличению количеств трансфузий на одного пациента. Необходимо рассмотреть возможность использовани альтернативной технологии

Практические рекомендации:

1. При стандартной заготовке аферезных концентратов тромбоцитов могут быть использованы оба способа заготовки- классический- в 100% плазме и с добавочным раствором- в минимальном соотношении 1:3 (30% плазмы и 70% добавочного раствора).

2. Метод заготовки аферезных концентратов тромбоцитов с добавочным раствором можно широко использовать в педиатрической практике и считать приоритетным способом заготовки концентратов тромбоцитов, так как такой метод заготовки демонстрирует лучшую сохранность тромбоцитов и решает проблему снижения вероятности развития посттрансфузионных реакций у пациентов.

3. Способ заготовки концентратов тромбоцитов с добавочным раствором можно считать приоритетным по отношению к донорам с точки зрения плазмосберегающей технологии заготовки концентратов тромбоцитов.

4. При использовании технологии инактивации патогенов с применением ультрафиолетового облучения и рибофлавина можно рекомендовать использовать метод заготовки концентратов тромбоцитов в 100% плазме.

5. С учетом более низкой клинической эффективности концентратов тромбоцитов после обработки по технологии инактивации патогенов с применением ультрафиолетового облучения с рибофлавином рекомендуется рассмотреть возможность использования альтернативной технологии инактивации патогенных биологических агентов в концентратах тромбоцитов.

6. При выборе тактики темотрансфузионной терапии при переливании концентратов тромбоцитов после инактивации патогенов с применением ультрафилетового излучения с рибофлавином, необходимо учитывать, что срок хранения влияет на развитие акгивационно-апоптических процессов в тромбоцитах и приводит к ухудшению их функциональной активности, а, следовательно, и к снижению клинической эффективности. Рекомендуется использование концентратов тромбоцитов, обработанных по технологии с применением ультрафиолета и рибофлавина, в кратчайшие сроки после заготовки и обработки.

Список опубликованных работ:

1. Игнатова А.А, Карпова О.В., Трахтман П.Е., Пантелеев М.А. Оценка качества аферезного концентрата тромбоцитов, заготовленного с использованием добавочного раствора 88Р+. материалы II конгресса гематологов России, 17-19 апреля 2014г. Москва // гематология и трансфузиология. 2014. т.59, №1, с.9б

2. Карпова О.В., Ройтман Е.В., Колесникова И.М., Трахтман П.Е., Румянцев С.А. «Изменения функциональных показателей тромбоцитов при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных разными методами». Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 24-25 июня 2014г, г. Санкт-Петербург.

3. Карпова О.В. Изменение функциональных показателей тромбоцитов при хранении концентратов тромбоцитов, заготовленных разными методам. Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы и перспективы развития службы крови Республики Казахстан», 10-11 сентября 2014 г., г. Алмата, Казахстан.

4. Eugene V. Roitman, Irina M. Kolesnikova, Oksana V Karpova, Pavel E. Trakhtman, Sergey A. Roumiantsev. Changes in clot properties due to platelet concentrate storage (in vitro study) // abstr. о 2ndeuplan conference, 24-26 September, Le bischenberg, France. EuropeanplateletNetwork, 2014.vol. 126-p 110

5. Колесникова И.М., Ройтман E.B., Карпова O.B.,Трахтман П.Е., Румянцев С.А.«Факторы влияющие на изменения гемостатических свойств тромбоконцентратов при хранении»Д1\ съезд федерации анестезиологов и реаниматологов, Казань, 20-22 сентябрь 2014 С.156-157

6. Колесникова И.М., Ройтман Е.В., Карпова О.В. Гемостатические свойства тромбоцитных концентратов при хранении// Гемостаз, проблемы и достижения, 10-13 октября, Ереван, Армения. Научно-практический журнал «Кровь», 2014. №2, с 80.

7. Карпова О.В. «Сравнительная характеристика концентратов тромбоцитов, заготовленных обработанных разными методами». Научно-практическая конференция «Производственная i клиническая эффективность концентратов тромбоцитов плазмы, инактивированнь амотосаленом и ультрафиолетовым облучением», Санкт-Петербург 11-12.11.2014г.

8. Eugene Roitman, Irina Kolesnikova, Oksana Karpova, Sergey Roumiantsev Subsequent clo properties depend on the storage time of platelet concentrates // Cith abstract submission Bleedingdisorders.cith2014-abs-1056Berlin Germany October 30-November 1 2014

9. Пантелеев M.A., Артеменко E.O., Демина И. А., Захарова Н.В., Игнатова A.A., Карпов О.В.,Котова Я.Н., Липец E.H. и др. Субпопуляции тромбоцитов крови и механизмы » взаимодействия с белками системы свертывания. Гематология и трансфузиологня. 2014.. Т.59 №S1. С.23.

9. Карпова О.В., Ройтман Е.В, Игнатова A.A., Мадзаев С.Р., Румянцев С.А, Плясунова С.А, Трахтман П.Е. Оценка качества тромбоцитного концентрата, заготовленного методом афереза с использованием добавочного раствора SSP+ Журнг «Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.» 2014. Т. 13. №2 . С.20-24.

10. Карпова О.В., Ройтман Е.В, Колесникова И.М, Трахтман П.Е, Андрианова М.Ю, Исаег

A.M., Румянцев C.A. Метаболические изменения при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных разными методами. - Журнал «Трансфузиология» 2014 -№3(15>С. 30-32.

11. Ройтман Е.В., Колесникова И.М., Карпова О.В., Трахгман П.Е., Румянцев С.А., Андрианова М.Ю., Бондар Е.В.. Изменения гемостатических свойств сгустка при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных различными методами.- Журнал «Гематология и трансфузиология». 2014. Т.59. №З.С. 30-34.

12.Карпова О.В., Образцов И.В., Трахгман П.Е., Игнатова A.A., Пантелеев М. А., Румянцев С.А.. Сравнение морфофункциональных свойств тромбоцитов в зависимости от различных способов процессинга. Журнал «Онкогематология». 2014. №4. С.37-45.

13. Мартемьянов В.Ф., Зборовская И.А., Мозговая Е.Э., Стажаров М.Ю., Бедина С.А., Мякишев М.В., Абрамов Н.В., Карпова О.В., Ермолаева H.A. Клинико-патогенетическое значение исследования активности ферментов п>ринового метаболизма и антиоксидантной системы в лизатахэритроцитов больных системной склеродермией. Журнал «Фундаментальные исследования». 2013. .№9-6. С.1053-1056.

Список сокращений KT- концентрат тромбоцитов

АКТ-концентрат тромбоцитов, заготовленный аферезным способом

ТРАЛИ - острое поражение леглх, связанное с переянванлем хомпонентсв хровл

ДР - добавочный раствор

ТИП - технология инактивации патогенов

ДТВ - доза тромбоцитов дня взрослого

ТЛП - тромбоциты из лейкоцитарной пленки

ТОТП - тромбоциты из обогащенной тромбоцитами плазмы

ТОД - тромбоциты от одного донора

ЛРС - дейкоредущноиная система

АПТ - абсолютный прирост тромбоцитов

СПТ - скорректированный прирост тромбоцитов

PAS - раствор дня хранения тромбоцитов

TA-TrimaAccel

AM - Amicus

MC-MOS

ПТ - РТПХ - посттрансфузнанная реакцих «трансплантат прошв хозяина»

ФНГТР — фебрильные негемошггические трансфузионные реакции

PRT-PahogenReductionTechnology

MCP - метод серийных разв деннй

РФ - рибофлавин

УФ - ультрафиолет

К U lull - KT с пониженным содержанием плазмы.

МКПК - ыонолуклеары периферической крови

SSFH- - platelet storage solution—раствор дня хранения тромбоцитов

КАРПОВА Оксана Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ЗАГОТОВКИ, ОБРАБОТКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ

ТРОМБОЦИТОВ.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 13.02.15 Заказ № 3946 Тираж 100 экз. Типография «ОПБ-Принт» ИНН 7715893757 107078, г.Москва, Мясницкий пр-д д. 2/1 (495) 777 33 14 www.opb-print.ru