Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Влияние гиперразветвленных полимеров на антиоксидантную активность водных извлечений и меланинов чаги

ИВАНОВА ГУЗЕЛЬ АДГАМОВНА

ВЛИЯНИЕ ГИ.ПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ И МЕЛАНИНОВ ЧАГИ

14,04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 МАР 2011

Казань-2011

4840838

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный технолог ический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Сысоева Мария Александровна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Егорова Светлана Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « _1_8 » марта 2011 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета при ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, Зал заседании Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета (www.kstu.ru) Автореферат разослан « Г5_ » февраля 2011 г.

доктор химических наук, профессор Медянцева Эльвина Павловна

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из сырьевых ресурсов для производства лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) является гриб 1попоиш оЬНсцшх (Гг.) РП. - чага. Современной фармацевтической промышленностью выпускается ряд лекарственных препаратов на основе гриба чага, которые используются для профилактики и лечения онкологических заболеваний, болезней желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы и др., возникающих вследствие воздействия на организм свободных радикалов. Вредное влияние на организм свободных радикалов можно уменьшить за счет систематического употребления некоторых лекарственных растительных препаратов и БАД, обладающих антиоксидантной активностью (АОА). Вследствие этого необходимость в создании новых БАД с высокими антиокеидантными свойствами возрастает.

Многие известные препараты на основе чаги производятся путем получения водных извлечений или меланина из гриба. Установлено, что АОА водных извлечений и меланинов чаги возможно повысить при введении в экстракцию комплексонов, изменении рН экстрагента, обработке водных извлечений из чаги органическими растворителями, т. е. при воздействии различных химических веществ на дисперсионную среду коллоидной системы водного извлечения из чага. При этом увеличение АОА и извлечений, и меланина происходит, в среднем, в 2 раза. Фармацевтические исследования последних лет показали эффективность использования гиперразветвленных полимеров (ГРП) с целью улучшения свойств лекарственных препаратов. При использовании ГРП в процессе получения водного извлечения и меланина чаги можно ожидать значительного повышения их АОА. Поэтому поиск новых, простых в реализации способов значительного повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги является актуальным.

Цель работы; повышение АОА водных извлечений и меланинов чаги при использовании ГРП.

Задачи, требующие решения для достижения поставленной цели:

- разработка способов повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги с применением ГРП двух поколений - Войог» 1130 и 1140 в экстракции сырья и при обработке водных извлечений чаги;

- сравнение воздействий ГРП двух поколений, отличающихся количеством концевых функциональных групп, на физико-химические характеристики водных извлечений и меланинов чаги;

определение связи структурной организации меланина чаги, полученного с применением ГРП, с проявлением им АОА;

- установление влияния гидрофобной компоненты, удаляемой из водного извлечения чаги петроленным эфиром, на изменение АОА и структурной организации меланина чаги, полученного с применением ГРП;

- определение влияния антиоксидантных свойств меланинов чаги на проявление ими гепатопротекториой активности.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность применения водных растворов Г РП ВоИогп ИЗО и 1140 в экстракции сырья и обработке водных извлечений из чаги для увеличения антиоксидантных свойств извлечений и меланинов чаги.

Установлено, что введение ГРП ВоНогп Н30 и Н40 в водное извлечение чаги приводит к -изменению структурной организации частиц меланина и его АОА.

Определено, что удаление гидрофобной компоненты из меланина чаги, полученного с применением ГРП, приводит к изменению его физико-химических свойств и снижению АОА, в отличие от меланина водного извлечения чаги.

Впервые показано, что высокая АОА меланина, полученного с применением ГРП, способствует проявлению им высоких гепатопротекторных свойств.

Практическая значимость работы. Впервые показана возможность увеличения АОА меланина чаги в 1,5 раза при использовании ГРП Вокогп Н30 и Н40 в экстракции сырья.

Впервые разработан способ введения растворов ГРП Вокогп НЗО и Н40 в водные извлечения чаги, позволивший повысить АОА извлечений и меланинов в 2-4 раза.

Получен меланин чаги с применением ГРП Вокогп Н40, который обладает высокими АОА и гепатопротекторными свойствами (патент 2392953).

Апробация работы. Результаты работы ежегодно докладывались и обсуждались на отчетных научно-технических конференциях КГТУ в 20082010 гг. и Всероссийских конференциях «Пищевые технологии» (Казань, 2008-2010 гг.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Итоговая научная конференция КНЦ РАН (Казань, 2009). Первый кластер конференций СЬетЛУайеСИет «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» (Санкт-Петербург, 2010 г.), IV Международная конференция «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010 г.), VI

Всероссийская научно-техническая конференция «Интенсификация тепло- и массообменных процессов в химической технологии» (Казань, 2010 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 2 статьях в изданиях, рекомендованных ВАК, 6 публикациях но материалам конференций, 2 патентах на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

- способы и полученные результаты по применению ГРП Boltorn двух поколений в экстракции сырья и при введении в водные извлечения из чаги;

- результаты исследований структурной организации полученных меланинов, обладающих высокой АОА;

- результаты по структурной организации и АОА меланинов чаги, полученных с применением ГРП, после удаления из них гидрофобной компоненты;

экспериментальные данные по проявлению меланинами чаги гепатопротекторных свойств.

Структура п объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав (литературный обзор, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка использованной литературы из 185 источников, в том числе 58 иностранных. Работа изложена на 135 страницах, содержит 42 рисунка, 25 таблиц.

Автор выражает благодарность руководителю научной работы Сысоевой М. А. за помощь в выборе объектов и методов исследования, обсуждении и интерпретации полученных результатов, а также коллективам химико-биологического корпуса, лаборатории ВОС ИОФХ им. А. Е. Арбузова КНЦ РАН, доц. Знятдиновой Г. К. за помощь в проведении экспериментальной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен литературный обзор. Охарактеризованы объекты исследования. Рассмотрены способы повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги. Проанализированы свойства ГРП Boitom Ю0 и Н40 н их использование в фармации. В заключение обоснована возможность использования ГРП с целью повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги.

Во второй главе приведена экспериментальная часть работы. Представлены физико-химические свойства сырья чаги, использованного для получения водных извлечений: 1-ОАО «Красногорсклексредства», партия G60706; 2-ОАО «Красногорсклексредства», партия АВВ40707. В

работе применены ГРП серим Boltorn НЗО и Н40 производства компании Perstorp Speciality Chemicals AB, Швеция. Приведены способы введения ГРП при проведении экстракции чаги и в водное извлечение из чаги. Описаны стандартные методики исследования водных извлечении и меланинов чаги.

АОА определена кулонометрически. Фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС) частиц меланина произведена при помощи коррелометра «ФотоКорр-М». Регистрация электронных спектров поглощения растворов меланина проведена на спектрофотометре UNICO UV/VIS 2800, ИК-снектров меланина - на спектрофотометре IRPrestigc -21. Исследование электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) осуществлено на спектрометре EMX-plus Bruker X-band. Микроснимки меланина получены на сканирующем зондов«м микроскопе MultiMode V фирмы Veeco с применением метода прерывисто-контактной атомно-силовой микроскопии (АСМ). Рентгенфлуоресцентный анализ (РФА) выполнен на спектрометре Shimatzu EDX-800-HS 2. Тонкослойная хроматография липидов проведена по стандартным методикам на пластинах «Sorbfil».

Оценка острой токсичности и гепатопротекторной активности проведена в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» на половозрелых белых беспородных мышах и крысах обоего пола. Биохимические исследования сыворотки крови подопытных животных осуществлены по общепринятым методам с использованием стандартных наборов ЗАО «ДИАКОН-ДС» (Пущино) на полуавтоматическом биохимическом анализаторе RAL Clima МС-15.

Третья глава посвящена обсуждению полученных результатов.

Ранее показано, что введение в экстракцию сырья чаги таких комплексонов, как ОДЭФ (в концентрации 0,146*10' мкмоль/л) и Трнлон Б (в концентрации 0,810*103 мкмоль/л), способствует повышению АОА меланинов чаги до 3 раз. Поскольку ГРП обладают большим количеством функциональных групп на периферии, то, следовательно, они более реакцноноспособны, чем комплексоны.

Повышение АОА извлечений и меланинов чаги при введении в экстракцию сырья ГРП Boltorn ИЗО и 1140 . Экстракция чаги проведена ремацерацией (повторным настаиванием при 70° С в течение 10 часов). Концентрацию ГРП в экстрагенте варьировали от 0,286*103 мкмоль/л до 0,286* 1 (Гмкмоль/л для НЗО и от 0,196*103 мкмоль/л до 0,196*10"7

мкмоль/л для 1140. Оценка полученных результатов проводилась по содержанию меланина н АОА извлечении и меланинов (табл. 1). Использование ГРП в концентрациях, оптимальных в случае применения комилексонов, приводит к снижению экстракции меланина и его АОА. Наиболее высокая АОА достигнута при использовании низких концентраций ГРП, что подтверждает высказывание о возможно большем влиянии ГРП на коллоидную систему водного извлечения чаги, чем комплексоны.

Таблица 1 - АОА меланинов, полученных при экстракции сырья чаги

растворами ГРП

Концентрация полимера, мкмоль/л Сырье ] Сырье 2

Выход меланина. % ЛОЛ меланина, кКл/100 г Выход меланина, % ЛОЛ меланина, кКл/100 г

Вокогп ИЗО

0 15,42 31,00+1,00 13,47 37,00+1.00

0,286*103 9.84 26,00±2,00 10.98 25,00+1.60

0,286*10' 16,63 37.00^1.00 13,44 34,00±2.00

0,286*10"° 16,24 49,00±3,00 13,29 19,00+1.70

Вокогп 1140

0 15,42 31,00±1,00 13,47 37,(Н)И.()0

0,196*102 15,98 26,00±1,50 13,26 44,00±0,90

0,!96*10"° 15,23 28,00±2,00 13,72 32,00±2,00

При введении в экстракцию ГРП, происходит изменение дисперсионной среды коллоидных систем извлечений чаги. В свою очередь это приводит к изменению их дисперсных фаз, о чем свидетельствуют данные таблицы 2. Изменения и размеров частиц меланина, и их содержания, а также соотношения крупных и мелких частиц в извлечениях, полученных с применением ГРП, может свидетельствовать об их иной организации по сравнению с частицами меланина водных извлечений из чаги. То есть, введение в экстрагент ВоИогп ИЗО и 1140 изменяет дисперсионную среду коллоидной системы водного извлечения чаги, инициируя процессы агрегации и дезагрегации частиц меланина. Изменение компоновки частиц меланина способствует формированию новых центров, отвечающих за АОА, либо

существующие центры становятся более доступными, а, следовательно, и более активными.

Таблица 2 - Размер частиц меланина

Сырье Экстрагент Радиус частиц, им Содержание частиц, %

Сырье 1 вода 29 32

190 58

вода+НЗО 33 50

(конц. 0,286* 10"6мкмоль/л) 185 42

Сырье 2 вода 108 68

1 32

вода+Н40 98 87

(конц, 0,196* 10'мкмоль/л) 1 13

Влияние ГРП при введении его в экстрагент является достаточно сложным для интерпретации изменения коллоидной системы водного извлечения из чаги в процессе экстракции. Скорее всего, ассоциаты ГРП взаимодействуют с низкомолекуляриыми соединениями, в первую очередь экстрагируемыми из сырья и затрудняют экстракцию меланина, что подтверждает снижение выхода меланина при использовании высоких концентраций ГРП (табл. 1).

В целом, АОА извлечений и меланинов чаги повышается при использовании ГРП в экстракции сырья. Однако подбор концентрации ГРП в экстрагенте и проведение ремацерации достаточно длительные и трудоемкие процессы, что снижает эффективность применения ВоИогп ИЗО и 1140 в экстракции.

Повышение АОА водных извлечений и меланинов чаги при введении ГРП л водные извлечения из чаги.

Поскольку интерпретация процессов, происходящих при экстракции сырья чаги растворами ГРП, сложна, было осуществлено введение ГРП в водные извлечения из чаги, полученные ремацерацией. При этом происходит воздействие ГРП на уже сформированную коллоидную систему. При подборе условий проведения эксперимента определено, что с повышением температуры обработки от 20° С до 70° С АОА извлечений и меланинов снижается, что может быть связано с интенсификацией процессов агрегация и дезагрегации частиц меланина, их перекомпоновки. Поэтому, оптимальными условиями выбраны: температура

обработки водного извлечения растворами ГРП 20±5°С, время обработайте. Увеличение продолжительности обработки от 0,5 до 24 ч не влияет на изменения АОА.

При введении Bol torn дву х поколений в водные извлечения из чаги происходит значительное увеличение АОА, как самих водных извлечений, так и меланинов чаги, выделенных из них (табл. 3).

Таблица 3 - АОА обработанных водных извлечений чаги и меланинов из них

Сырье Boltorn Н30 Boltom Н40

Концентрация, мкмоль/л ЛОЛ водных извлечении. Кл/мп АОА меланинов, кКл/100 г Концентрация, мкмоль/л АО Л водных извлечении, Кл/мл АОА меланинов, кКл/1 ООг

Сырье 1 0 0,286*102 0.286*10'6 7,50±0,03 12,39±0,03 12,78±0,05 31 ±1,00 62±1.00 64±3,50 0 19,6 0,196*10"' 7.50±0,03 19.20-0.06 18,93±0,04 31±1,00 72+2,00 121 ±4,00

Сырье 2 0 0.286*102 0,286*10"6 2,17±0,07 5,92+0,07 5,74±0,05 37±1,00 64±1,50 67±3,30 0 19,6 0,196* НУ1 2,17±0,07 6,21±0,08 6,09±0,08 37±1,00 116+5,00 93±2.00

После введения в водные извлечения из чаги ГРП 3 поколения АОА извлечений и меланинов, выделенных из них, возрастает в 2 раза, а 4 поколения - в 4. Более значительное повышение АОА извлечений и меланинов чаги при использовании ГРП Н40 по сравнению с Н30, может быть связано с наличием большего числа гидроксильеых групп в его молекуле и, соответственно, большей реакционоспособностыо. То есть воздействие Н30 несколько отличается от воздействия Н40, поскольку размер молекул Н30 составляет 2 нм, а Н40-2.5 им. В водной среде молекулы ВоИогп образуют ассоциаты. Эти ассоцнаты могут сильно отличаться по размерам в зависимости от рН среды и ее компонентного состава. Для определения размеров ассоциатов Вокош в дисперсионной среде водного извлечения из чаги на основе литературных данных создана модель дисперсионной среды (полисахарид - 3,60 %, общая зола - 2,90 %, щавелевая кислота - 1,22 %, уксусная кислота - 0,33 %, муравьиная кислота - 0,23 %). В модель дисперсионной среды были введены растворы ГРП в условиях, подобранных для введения в водные извлечения чаги. С помощью ФКС определены размеры ассоциатов ГРП (табл. 4).

Полученные данные свидетельствуют о взаимодействии ассоциатов ГРП с дисперсионной средой, в результате которого происходит уменьшение их размера, что может повышать их реакционную способность при взаимодействии с компонентами дисперсионной среды.

Таблица 4 - Размер ассоциатов ГРП в воде и модели дисперсионной среды

Среда Радиус ассоциатов Boltorn ИЗО конц. 0,286*10"6 мкмоль/я. нм Радиус ассоциатов Boltorn TI40 конц. 19,6 мкмоль/л, нм

Вода рН=5.6 72±3,34 111.35+2,25

Модель рН=4.8 32±2,21 40,54±1,06

Влияние ГРП на дисперсионную среду должно привести к перекомпоновке дисперсной фазы за счет процессов агрегации и дезагрегации частиц, что наблюдается по изменению их размеров (табл. 5).

Таблица 5 - Распределение крупных частиц меланина водных извлечений чаги и водных извлечений чаги, обработанных ГРП_

Концентрация полимера, мкмоль/л Сырье 1 Сырье 2

R частиц, нм Содержание частиц, % R частиц, им Содержание частиц. %

Boltorn ИЗО

0 190 58 108 68

0,286*102 126 83 127 71

0.286*10"'' 74 54 150 72

Boltorn Н40

0 190 58 108 68

19,6 96 72 156 72

0,196*10"' 80 67 196 73

На снимках, полученных с помощью АСМ (рис. 1), отчетливо видны изменения не только размера, но и формы частиц меланина, происходящие после введения ГРП в водные извлечения.

Данные, полученные с помощью ФКС, хорошо согласуются с данными АСМ. Таким образом, отличие размеров и формы частиц меланинов связано с изменением их компоновки, что отражается на изменении их АОА под воздействием ГРП.

. rTlf 1-5 2Г'-Г \ .................2 3 4 Spm

0.5 a) 1 2 6)

Рисунок 1 - АСМ-изображения частиц меланина: а - водного извлечения чаги (диаметр частиц 400 нм): б - водного извлечения после введения Boltorn Н40 концентрацией 19,6 мкмоль/л (диаметр частиц 120 нм. встречаются 500 нм)

Для подтверждения перекомпоновки частиц меланинов и связанные с ней повышения АОА (табл. 3). проведено исследование меланинов с помощью ЭПР-спектроскопии. В спектре меланина, выделенного из водного извлечения чаги (Сырье 2), наряду с характерным для меланинов чаги сигналом с §=2,0035 (рис. 2 а). обнаружен сигнал с £=2,1400 при Т=300 К (рис. 2 б).

9=4,2736

3S00 3600

Н, Ое

3000 3500 4000 Н. Ое

0 500 1000 1500 2000 2500

Н. Ое

а)

б)

в)

Рисунок 2 - ЭПР-спектр меланина водного извлечения из чаги (АОА=37 кКл/ЮОг)

Парамагнитный центр с §-фактором 2,0035 в меланине чаш обеспечивается органической компонентой, а сигнал §=2,1400 относят к проявлению парамагнитных свойств комплексов органических соединений с

11

металлами. Согласно данным РФА в меланине из водных извлечений чаги присутствуют металлы, обладающие парамагнитными свойствами, такие, как Мп-0,293%, Zn-0,277%, Fe-0,.154%, Cu-0,083%, которые могут участвовать в образовании этих комплексов. Кроме того, в спектре этого меланина наблюдается сигнал с g=4,2736 (рис. 2 в). По форме линии этот парамагнитный центр может быть представлен комплексом органического соединения с ионами железа.

ЭПР-спектры меланинов, выделенных из водных извлечений обработанных ГРП, отличаются от ЭПР-спектров меланинов водного извлечения чаги. В спектре меланина, выделенного из водного извлечения чаги после его обработки Boltorn ИЗО, при 300 К, интенсивность сигнала с g=2,0035 увеличивается в 1,6 раз (рис. 3 а). Сигнал с g=2,14 в спектре этого меланина отсутствует. При снижении температуры снятия спектра от 300 К до 100 К значительно усиливается интенсивность сигнала с g=4,2736 (рис. 3 а). Увеличение интенсивности этих двух сигналов обеспечивают повышение АОА меланина в 2 раза.

В ЭПР-спектре меланина, выделенного из водного извлечения чаги после введения Boltorn Н40, также отсутствует сигнал с g=2,I400. Спектр сигнала с g=4,2736 остается неизменным (рис. 2 в). Возрастание АОА меланина в четыре раза обеспечивается увеличением интенсивности сигнала с g=2,0035, примерно, в 3,5 раза (рис. 3 б).

3500 3600 Н, Ое

Мм

А

^ к • зоок, i/W* 200К

/ 100K

V /

Лм*/'

MP=2 mW | /А mod=2Gs if it of scan=10

M 1000 1500 2000 25G( H, Oe

a)

3500 3800 H, Oe

6)

Рисунок 3 - ЭПР-спектры меланинов: a) - после введения ИЗО (АОА=67 кКл/100 г); б) - после введения Н40 (АОА=116 кКл/100 г)

Спектральные характеристики сравниваемых объектов исследования подтверждают, что с изменением компоновки частиц меланина, изменяется их АОА.

Повышение АОА меланинов чаги путем удаления гидрофобной компоненты из меланина. Для повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги были получены коллоидные системы, из дисперсной фазы которых удалена часть гидрофобной компоненты. Ранее было показано, что удаление гидрофобной компоненты из меланина петролейным эфиром способствует повышению АОА меланина в 3 раза. Поскольку коллоидная система водного извлечения из чаги не содержит эмульсионной фазы, то петролейным эфиром из нее удаляется гидрофобная компонента, ассоциированная в меланине. Этот факт подтверждает и то, что частицы меланина значительно уменьшаются в размерах (табл. 6).

Таблица б - Физико-химические свойства водных извлечений из чаги после их обработки петролейным эфиром

Партия сырья Количество сухих веществ, удаляемых "н.э., %** Размер частиц И меланинов с водных извлечении чаги, им АОА меланинов, кКл/100 г меланина

до обработки п. э. после обработки п. э. до обработки п. э. после обработки п. э.

1 1,14 190 65 31,00±1.00 32,00±1.70

2 3.34 108 2 37.00±1.00 46,00±1,50

3* 21,30 160 67 27.50±0.7 63,00±4,00

"-литературные данные, **-от массы сухог о вещества водною извлечения чаги

Экстракция петролейным эфиром водных извлечений из трех партий сырья показало, что количество удаляемой гидрофобной компоненты из меланина для разных партий сырья различно (табл. 6). Чем больше гидрофобной компоненты удается извлечь, тем существеннее повышение АОА меланина. При последовательной обработке водных извлечений ПРИ и, затем, петролейным эфиром доступность гидрофобной компоненты меланинов остается прежней, как и в меланинах водного извлечения чаги (табл. 7).

Анализ петролейных экстрактов показал, что состав веществ, извлекаемых из водных излечений чага и водных извлечений, обработанных ГРП, одинаков. Однако такой способ обработки приводит к снижению АОА

меланинов. Этот эффект также объясняется изменением дисперсионной среды извлечения чаги - сначала при введении ГРП, а, затем, при экстракции петролейным эфиром. В свою очередь, изменения дисперсионной среды приводят к переформированию дисперсной фазы, изменению размеров ее частиц, что сопровождается изменением АОА меланинов, в данном случае, ее снижением.

С помощью ФКС и АСМ показано, что последовательная обработка водных извлечений ГРП и петролейным эфиром приводит к изменению формы и размера частиц меланина (табл. 7, рис. 4).

Таблица 7 - Физико-химические свойства водных извлечений из чаги после

их последовательной обработки ГРП и петролейным эфиром

Пар- Количество Размер частиц R,- АОА меланинов.

Вводи- тия сухих меланинов чаги в

мым сырья веществ, извлечениях. кКл/100 г меланина

ГРП удаляемых обработанных ГРП, ям

петролейным до после до после

эфиром, %** обработки обработки обработки п. обработки

0. э. п. э. э. п.

Boltorn 1 1, 02 74 81 64,00±3,50 36,00±1,4

ИЗО 2 2, 73 121 1,1 67,00+1,70 40,00±2,1

Boltorn 1 0. 97 96 84 72.00+2.00 41,00±2,2

Н40 1* 0, 57 80 146 121,00±4,0 44,00±2,2

2 2, 81 156 7 116,00± 1,2 56,00±1,4

2** 2.48 196 3.7 93.00+2.00 65,00±1,4

*, ** - отличаются концентрацией вводимого ГРП

Исследование гепатопротекторной активности меланинов чаги. Проведено исследование гепатопротекторной активности меланинов чаги в

Рисунок 4 - АСМ-изображение меланина, полученного после введения в водное извлечение из чаги Вокот Н40 концентрацией 19,6 мкмоль/л и последующего удаления гидрофобной компоненты

опыте острого ССЬ4-гепатита. Четыреххлористый углерод вводили подкожно в 50%-ном растворе на оливковом масло в течение 4-х дне и в дозе 2 мл/кг. Сравнение проведено с препаратом Карсил. Меланины чаги и препарат Карсил вводили животным (крысам) перорально в дозе 100 мг/кг.

Четыреххлористый углерод является наиболее известным гепатотоксином, применяемым для моделирования заболеваний печени. Введение его в организм сопровождается развитием тяжелого поражения печени с проявлением синдромов цитолиза, холестаза и печеиочно-клеточной недостаточности. Лечебно-профилактическое применение меланинов чаги и препарата Карсил в дозах 100 мг/кг массы животного на фоне острого ССЦ-гепатнта в разной степени влияло на восстановление биохимических показателей основных патологических синдромов поражения печени СС14 (табл. 8).

Таблица 8 - Биохимические показатели сыворотки крови подопытных крыс (Х±Ах; п=10)

Группы В сыворотке кропи

живот-

ных ЩФ*. Е/л АсЛТ*, Е/л АлЛТ*, Е/л Белок, г/л Билирубин общин, мкмоль/л Холестерин, ммоль/л Мочевина, моль/л

Интакт- 92,00±2 59,36± 39,36± 67,30± 3,74±0,17 4.874-0,16 4,28±0.13

ш,il- 8.1 5,47 2.25 5,02

ea, 458,00+ 138,64+ 68,54± 42.94± 14,22+0,14 10,50±0,8 7,35.1.0,14

35.41 16,40 6,79 3.43 6

Мелапи 187,00.1- 79,00.1, 55.461: 50,73±: 8.72±0,?2 6.7810,93 5,63:10,19

и + СС1, 15,16 6,18 2.7S 2.45

.440" 167.00± 65,46± 48.45± 55,10± 6,94±0,19 6,12±0,24 5,394.0.02

+ (XI, 22.65 7,54 3.33 4,01

Карсил + СС14 196.00+ 18.74 93.18:1: 9,17 61,47:1: 8.33 51.37± 4,36 9,41 ±0.23 7,66:10,31 6.3710,17

*М40-меланпн чаги, выделенный из водного извлечения, обработанного ГРП 1140; ЩФ-щелочная фосфатам; АсАТ-аспартатамниотрансфераза; АлАТ-аланииамниотрансфераза: п-количество животных в группе

При интоксикации четыреххлористым углеродом изменяется активность индикаторных ферментов, отражающих нарушение проницаемости клеточных мембран, о чем и свидетельствует повышение активности ACT, АЛТ и ЩФ в сыворотке крови. По биохимическим

показателям сыворотки крови животных, принимавших меланин, М40 и Карснл, можно судить о значительном снижении интенсивности процессов липоперокеидации, следовательно, и о разрушении мембран гепатоцитов, что подтверждено микрофотографиями срезов печени подопытных животных. Использование в качестве гепатопротектора меланинов чаш более эффективно, чем препарата Карсил. При этом меланин чаги, выделенный из водного извлечения чаги, обработанного ГРП Н40, обладает более высокими свойствами гепатопротектора по сравнению с меланином водного извлечения чаги. Следовательно, более высокая АОА меланина способствует интенсификации его гепатопротекторных свойств.

Определена острая токсичность меланина, выделенного из водного извлечения чаги, обработанного ГРП Н40 (мыши, per os). LD50 этого меланина составляет 7063 мг/кг, что относит его к классу нетоксичных веществ.

Низкая токсичность меланина и его высокие антиоксидантные и гепатопротекторные свойства позволяют рекомендовать разработку лекарственных средств на его основе.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что введение ГРП в экстрагент при проведении экстракции сырья чаги приводит к повышению АОА извлечений и меланинов чаги в 1,5 раза, а при введении в водные извлечения из чаги, АОА извлечений и меланинов, выделенных из них, повышается, в 3-4 раза.

2. Показано, что размер ассоциатов ГРП при введении его в среду, близкую по составу дисперсионной среде водного извлечения чаш, уменьшается по сравнению с их размером в воде: у Boltorn ИЗО - с 72 до 32 им, у Н40 - с Ш до 40 нм, что может свидетельствовать об изменениях, происходящих в дисперсионной среде, которые приводят к повышению АОА извлечений и меланинов чаги.

3. С помощью ФКС, АСМ и ЭПР подтверждено, что введение растворов ГРП в водное извлечение чаги способствует изменению компоновки частиц меланина и влияет на изменение его АОА.

4. В водных извлечениях чаги, обработанных ГРП, после удаления из них гидрофоб ной компоненты петролсйным эфиром, происходит изменение размеров и формы частиц меланина, что приводит к снижению их АОА в отличие от меланинов водных извлечений чаги. При этом количество и состав веществ гидрофобной компоненты, извлекаемых петроленным эфиром, не изменяется.

5. Получен меланин, выделенный из водного извлечения чаги после введения Вокогп Н40, который нетоксичен (и)<„=7063 мг/кг) и кроме высокой АО А (116 кКл/100 г меланина), обладает высокой гепатопротекторпой активностью, превосходяще!! препарат Карспл.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, для размещения материалов кандидатских диссертации:

1. Сысоева, М. А. Повышение антиокендантной активности водных извлечений и меланинов чагн. I. Обработка водных извлечений чаги водными растворами гиперразветвленных полимеров / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, В. С. Гамаюрова, Г. К. Зиятдннова, Г. К. Будников. Л. Я. Захарова, М. А. Воронин // Химия растительного сырья. - 2010. - №2. - С. 105-10В.

2. Сглсоева, М. А. Влияние гидрофобной компоненты меланинов чаги на их структуру и антиоксидантную активность / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, Л. Я. Захарова // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - №9. - С. 595-601.

Патенты:

3. Патент 2366439 Российская Федерация МГЖ" А 61 К 36/06 . Способ получения осажденного препарата из березового гриба чага / Сысоева М. А., Гамаюрова В. С.. Иванова Г. А., Кутырев Г. А.: заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет». - 2008123969/15, заявл. 06.06.2008; опубл.

10.09.2009, Бюл. №25. - 4 с.

4. Патент 2392953 Российская Федерация МПК51 А 61 К 36\06, А 61 Р 39/06. Способ получения осажденного препарата чаги / Сысоева М. А., Гамаюрова В. С., Иванова Г. А., Зиятдинова Г. К., Будников Г. К.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет». - 2009100422/15; заявл. 11.01.2009; опубл.

27.06.2010, Бюл. №18.-3 с.

Тезисы по материалам конференций:

5. Сысоева, М. А. Использование водных растворов высокомолекулярных соединений для повышения антиоксидантной активности иолифенолоксикарбонового комплекса чаги / М. А. Сысоева, Г.

A. Иванова, В. С. Гамаюрова // IX Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань: Изд-во «Отечество», 2008. - С. 195.

6. Сысоева, М. А. Изучение липидного состава водных извлечений чаги / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, Е. А. Ларионова, В. С. Гамаюрова // IX Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань: Изд-во «Отечество», 2008. - С. 188.

7. Сысоева, М. А. Обработка водного извлечения чаги водными растворами пшерразветвленных полимеров / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова,

B. С. Гамаюрова // X Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань: Изд-во «Отечество», 2009. - С. 274.

8. Сысоева, М. А. Исследование коллоидных систем извлечении чаги на содержание в них гидрофобной компоненты / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, Е. А. Ларионова, В. С. Гамаюрова // X Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань: Изд-во «Отечество», 2009. - С. 289.

9. Сысоева, М. А.. Безопасность использования пшерразветвленных полимеров при получении галеновых препаратов на основе березового гриба Inonotus obliquus / M. А. Сысоева, Г. А. Иванова, В. В. Зобов // I конференция ChemWasteChem «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ»: тез. докл. - С.-Петербург, 2010, С. 248.

10. Сысоева М. А. Исследование меланинов чаги с применением ЭПР-спектроскошш / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, В. С. Минкин // VI Всероссийская научно-технической конференция «Интенсификация тепло- и массообменных процессов в химической технологии»: тез. докл. - Казань, 2010, С. 78.

Соискатель

Г. А. Иванова