Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Высокоактивные антиоксиданты на основе гриба Inonotus obliquus

СЫСОЕВА МАРШ! АЛЕКСАНДРОВНА

На правах рукописи

ВЫСОКОАКТИВНЫЕ АНТИОКСИДАНТЫ НА ОСНОВЕ ГРИБА

¡попоне оЬидиив

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Казань-2009

003465042

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный технологический университет»

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор Гамаюрова Валентина Семёновна

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Гарабаджиу Александр Васильевич

Защита состоится 3 апреля 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 в Казанском государственном технологическом университете по адресу: г.Казань, ул.К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан 3 марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Захаров В.М.

доктор химических наук,

профессор Мельникова Нина Борисовна

доктор химических наук, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

Ведущая организация: ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время одним из наиболее перспективных и актуальных направлений исследований является изучение природных объектов, имеющих применение в медицине и способных обеспечить биологическую безопасность организма человека. Существует большая потребность в адаптогенах, иммуномодуляторах, антиоксидантах и антитоксикантах на основе сырья природного происхождения. В отличие от синтезированных лекарственных средств, такие препараты и биологически активные добавки обладают комплексным действием и редко приводят к осложнениям после применения.

Перспективным объектом для разработки на его основе лекарственных препаратов, биологически активных и пищевых добавок, косме-цевтических средств различной направленности действия является гриб 1попой18 оЬ^ииэ (Р'г.) РИ. (чага). Водное извлечение чаги представляет собой гидрофильную полидисперсную коллоидную систему. Её дисперсной фазой и основным действующим компонентом водных извлечений чаги, обеспечивающих их терапевтическую активность, считаются хромогены или полифенолы, называемые полифенолоксикарбо-новым комплексом (ПФК). В последнее время ПФК чаги отнесён, к меланинам. Согласно современным воззрениям, меланины представляют собой глобулы, состоящие из аморфных микрочастиц, которые организованы из агрегатов и субагрегатов различной формы и размеров. Такая структура этой биомолекулы определяет биохимические и биологические свойства меланинов. ПФК/меланин является сложно организованными природным объектом с не выясненной структурой. В его состав входят полимерные (полифенолы, белки, полисахариды) и низкомолекулярные (простые фенолы, фенолкарбоновые кислоты, высшие жирные кислоты) соединения и неорганическая компонента,

С давних времён водные извлечения этого гриба и лекарственные препараты на их основе находят широкое применение в народной и афицинальной медицине для профилактики и терапии желудочно-кишечных, а также онкологических заболеваний. Поскольку онкологические заболевания, лучевая болезнь, атеросклероз и ряд других относятся к патологиям, вызванным воздействием свободных радикалов, то разработка более эффективных антиоксидантов на основе водных извлечений чаги для профилактики и лечения этих заболеваний является перспективной задачей.

В настоящее время в мировом сообществе интерес к этому сырью и препаратам на его основе очень велик. Это связано с тем, что препараты

на основе чаги проявляют широкий спектр биологической активности. Установлено, что они обладают высокими антитоксическими, радиопротекторными, генопротекторными, адаптогенными, иммуномодули-рующими, антивирусными, антиоксидантными свойствами, регулируют активность ферментов крови, а также деятельность сердечной, нервной и дыхательной систем живого организма.

Традиционно используемые формы препаратов на основе чаги, такие как: бефунгин, водный экстракт чаги, - имеют ряд недостатков: препараты производятся с высоким содержанием зольных элементов; стандартизация препаратов осуществляется только по содержанию в них ПФК; отсутствует количественная и качественная характеристика биологически активных соединений входящих в их состав, а также ряд других недостатков.

Согласно литературным данным, культивирование чаги с привлечением биотехнологических приёмов не приводит к формированию ПФК, аналогичного природному. Возобновление сырья в природных условиях является достаточно длительным процессом. Поэтому поиск повышения эффективности препаратов на основе водных извлечений чаги очень перспективен.

Традиционные подходы к исследованию водного извлечения чаги не позволяют определить структуру золя и его дисперсной фазы - ПФК, а также состав биологически активных веществ, обеспечивающих терапевтический эффект от применения водных извлечений. Эту задачу можно решить, только расширив представления о коллоидной системе водного извлечения чаги и структуре её дисперсной фазы -ПФКУмеланина. Поэтому разработка новых методов изучения структурной организации золя водного извлечения чаги позволит определить физиологически активные компоненты золя, создать на его основе высокодисперсные коллоидные системы, что представляет значительный научный и практический интерес.

Работа, проведена в соответствии с: Пр- 843 от 21.05.06 «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники в РФ», по направлениям «Живые системы» и «Индустрия наносистем и нанома-териалов», с созданием критической технологии по теме «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизненеобеспечения и защиты человека и животных»; в рамках научного направления по номенклатуре специальностей научных работников «Технология биологически активных веществ» (код 051818), по научному направлению - Пр-245-0 от 02.12.05 по КГТУ «Биологически активные вещества различной этиоло-

гии для производства функциональных БАД к пище, лекарственных средств и кормовых добавок».

Цель работы. Разработать теоретические основы и методологические подходы получения экстрактов, высокодисперсных коллоидных систем и ПФК/меланинов из чаги, обладающих высокой антиоксидант-ной активностью для создания на их основе новых высокоэффективных лекарственных и космецевтических препаратов различной .направленности действия.

Достижение поставленной цели требует решения следующих задач:

• Изучить состав и образование дисперсной фазы (ПФК) золя водного извлечения чаги, используя химические, физические и биотехнологические методы, и на основании полученных результатов обосновать структурную организацию мицелл ПФК/меланина чаги.

• Представить теоретическое обоснование процесса реструктурирования сложного гидрофильного золя водного извлечения чаги при применении химических, физических воздействий, а также ферментативного гидролиза.

•Определить связь антиоксидантной активности и состава биологически активных веществ различных классов соединений, находящихся в золе в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой состоянии, с размерами частиц дисперсной фазы и их структурой.

• Изучить состав веществ фильтрата, получаемого после выделения ПФК из водного извлечения чаги.

• Разработать способы получения высокодисперсных коллоидных систем на основе водного извлечения чаги, способных обеспечить биологическую безопасность организма человека. . , •

: • Разработать комплексный подход к извлечению из сырья ПФК/меланина и других биологически активных соединений, заключающийся в получении нескольких высокоэффективных препаратов на основе водного извлечения чаги, а также спиртовых экстрактов из шрота, остающегося после получения водных извлечений. ;

Методы исследований. Дтя изучения компонентов золя водного извлечения чаги и полученных на его основе объектов исследования использован широкий спектр современных методов, который соответствует современному состоянию науки и действующей нормати'вно-тёх-нической документации. Применены современные методы исследования - различные виды хроматографии, электрофорез, потенцйометрия, ИК-спектроскопия, ЭПР, ЯМР релаксации, РСА, электронная спектроскопия, кондуктометрия, фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС), методы химического и физико-химического анализа, а также стандарт-

ные методики определения физико-химических характеристик получаемых извлечений, экстрактов и выделяемых соединений.

Результаты измерений и исследований обрабатывались с применением методов математической статистики с использованием пакета программ БТАТКПСА 6.0.

Научная новизна работы. Разработан комплексный подход к исследованию водного извлечения чаги как сложно организованной коллоидной системы.

С помощью химических, физических и биотехнологических методов получены и исследованы коллоидные системы водного извлечения чаги, отличающиеся от природных составом, физико-химическими свойствами и антиоксидантной активностью.

Полученные высокодисперсные коллоидные системы и ПФК/меланин отличаются от коллоидной системы водного извлечения чаги более высокой антиоксидантной активностью.

Установлены закономерности связи антиоксидантных свойств ПФК/меланина с его структурой и размером частиц.

Впервые установлено, что фильтрат, полученный после выделения ПФК с помощью хлористоводородной кислоты, является высокодисперсной коллоидной системой, что позволяет получить ПФК с антиоксидантной активностью в четыре раза выше, чем ранее выделенный ПФК.

Показано, что в золе водного извлечения чаги и фильтрате (после удаления из него ПФК), в свободном и слабосвязанном состоянии с их дисперсными фазами находятся биологически активные соединения белковой, углеводной, липидной и фенольной природы, отличающиеся по составу и количеству.

Впервые установлено, что разделение хромогенов водного извлечения чаги для получения отрицательно и положительно заряженных фракций, подвижных в электрическом поле, происходит при применении электрофореза.

Впервые доказано, что на основе сырья чаги можно получить ряд высокоэффективных антиоксидантов и экстрактов с максимальным извлечением биологически активных веществ и ПФК из сырья.

Теоретическая значимость работы. На основании полученных данных и современных теоретических воззрений скорректированы и развиты научные представления о структурной организации высокодисперсной природной коллоидной системы. Разработаны и обоснованы методологические основы по реструктурированию коллоидной

системы водного извлечения чаги для изменения её дисперсной фазы и увеличения антиоксидантных свойств ПФК.

Практическая ценность работы. Получены физико-химические характеристики водных извлечений чаги, ПФК/меланина, позволяющие выявить особенности их структурной организации.

Разработаны способы экстракции чаги с применением комплексонов и гидроокиси натрия, которые позволяют получить ПфК, превышающие по антиоксидантной активности ПФК, полученных по традиционным технологиям.

Показана возможность стандартизации лекарственных препаратов на основе чаги по антиоксидантной ёмкости извлечений из чаги и ПФК-

Определён качественный состав и количество белка, углеводов, ли-пидов и фенольных соединений, находящихся в золе водного извлечения чаги и фильтрате (после удаления из него ПФК) в свободном и слабосвязанном с дисперсными фазами состоянии, способных обеспечить их терапевтическую эффективность.

Разработаны способы обработки водного извлечения чаги органическими растворителями, позволившие получить высокодисперсные коллоидные системы и ПФК/меланин с антиоксидантными свойствами, превышающими указанные свойства у водных извлечений чаги и ПФК.

Разработаны способы комплексной переработки сырья с получением высокоактивных антиоксидантов и повышенным выходом биологически активных веществ и ПФК/меланина.

Реализация результатов. Полученные результаты могут быть реализованы на предприятиях фармацевтической, пищевой и косметической промышленности, что позволит значительно расширить ассортимент высокоэффективных препаратов для медицины, продуктов функционального назначения, космецевтических средств и обеспечит биологическую безопасность населения.

На защиту выносятся:

- результаты исследования сырья, водных извлечений чаги и ПФК.с применением различных методов;

- разработка способов экстракции чаги, в том числе с применением гидроокиси натрия, комплексонов, ферментов класса гидролаз, а также способы экстракции шрота, остающегося после проведения экстракции чаги водой;

- экспериментальные данные исследований протеолиза водного извлечения чаги in vitro ферментами желудочно-кишечного тракта;

разработка способов и полученные результаты по обработке золя водного извлечения чаги органическими растворителями;

- экспериментальные данные по выделению ПФК с применением хлористоводородной кислоты и спиртового раствора щелочи;

- закономерности изменения антиоксидантных свойств, а также количественного и качественного состава биологически активных веществ различных классов соединений, находящихся в золе водного извлечения чаги или фильтрате (после удаления ПФК) в свободном или слабосвязанном с их дисперсной фазой состоянии, в зависимости от способа получения золя или его обработки органическими растворителями;

- результаты разделения хромогенов водного извлечения чаги с применением зонального электрофореза;

- теоретические представления о структурной организации золя водного извлечения и его дисперсной фазы.

Личный вклад аптора состоит в постановке цели и задач исследований, выборе объектов и методов исследований, непосредственном участии в проведении основных экспериментов, систематизации и интерпретации полученных результатов, формулировании научных положений и выводов. Вклад автора является решающим во всех разделах работы.

Автор выражает благодарность профессорам B.C. Гамаюровой, ф.Г. Халитову, Г.К. Будникову, доценту КГУ Г.К Зиятдиновой и другим соавторам за помощь в выполнении работы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались и обсуждались на: II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань 2002 г.); 7-ой и 8- ой Путинских школах - конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ-НАУКА XX Г (Пущи по 2003 г. и 2004 г); XVII и на XVIII Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Казань 2003 г., Москва 2007 г.); Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» ( Алматы 2003 г.); III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов 2004 г.); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов 2004 г.); II и III Всероссийских конференциях «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул 2005 и 2007 г.г.); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006 г.); конференциях молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань 2002 - 2008 г.г.). Основные результаты работы изложены в 17 статьях, в том числе в 15 рекомендованных ВАК, 46 публикациях по материалам конференций, 4 патентах на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, библиографического списка и приложения. В тексте приведены ссылки на 369 литературных источника. Работа изложена на 293 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков, 53 таблицы.

Содержание работы В первой главе представлен литературный обзор. Рассмотрены особенности биологического вида гриба [попоШэ оЬПцииБ (Рг.) РН (чаги). Приведён спектр физиологической активности препаратов на основе чаги. Сделан обзор и анализ существующих и перспективных методов получения водных извлечений чаги, способов исследования этой коллоидной системы и её дисперсной фазы - ПФК. Показана глубина исследования биологически активных веществ в чаге, водном извлечении чаги и в ПФК.

Во второй главе представлена характеристика сырья чаги (партии [-XV, закупленные в аптечной сети), используемого для получения водных извлечений. Описаны методы и методики получения и исследования водных извлечений чаги и объектов, выделенных в результате применения химических, физических и биотехнологических способов воздействия на коллоидную систему водного извлечения чаги.

Третья глава посвящена выбору способов получения водных извлечений чаги; исследованию физико-химических и антиоксидант-ных свойств водных извлечений и ПФК.

Показано, что при смене способа экстракции в ряду - ремацерация (РЕМ), реперколяция (РЕП), экстракция с механическим перемешиванием среды (МП) - снижается сухой остаток, содержание углеводов и выход ПФК (11,80 —> 9,8—► 6,8 % соответственно). В водном извлечении, полученном (РЕМ), наблюдается наименьшая зольность (24,1 %), что повышает его биологическую значимость. Максимальное значение антиоксидантной активности (АОА) имеет водное извлечение, полученное при механическом перемешивании (МП — 39,68; РЕМ - 28,08; РЕП - 24,22 в кКл/на ЮОгПФК), что, вероятно, обусловлено содержанием в нём низкомолекулярных соединений (фенолов, флаваноидов и др.), не связанных с ПФК. Согласно полученным с помощью ЯМР-ре-лаксации результатам, каждый из применённых способов экстракции, приводит к формированию индивидуальной коллоидной системы с соответствующими значениями параметров релаксации. По эффективности процесса набухания полимерной компоненты (по объему и энергетическим затратам), по параметру однородности и молекулярной подвижности дисперсной фазы, исследуемые коллоидные системы можно

расположить в следующий ряд: МП< РЕП « РЕМ. Водное извлечение, полученное РЕМ, характеризуется относительной гидрофильностью и, одновременно, максимально плотной и/или однородной упаковкой индивидуальных полимерных цепей в ПФК.

Для подтверждения различия структурной организации ПФК разработан простой способ щелочного гидролиза, позволяющий разрушить его наиболее полно и при этом проанализировать ход гидролиза. Общее содержание углеводов в гидролизате ПФК, выделенного из извлечения полученного РЕМ, максимально и составляет - 21,62% (РЕП-16,38% и МП-10,05%). Эти данные, в том числе и ИК спектры анализируемых ПФК, подтверждают различие их макромолекулярной структуры.

Согласно полученным результатам, оптимальным способом проведения экстракции чаги является ремацерация, при которой водное извлечение чаги имеет высокое содержание углеводов и ПФК, низкую зольность и высокую антиоксидантную активность. Это извлечение также имеет наилучшую оценку среди исследованных коллоидных систем по параметру однородности и молекулярной подвижности дисперсной фазы.

С помощью метода ЯМР релаксации проведен анализ сырья, водных извлечений, полученных РЕМ, и ПФК. Показано, что исследованное сырьё по молекулярной подвижности имеет двухкомпонентную структуру. Обе компоненты соответствуют жесткоцепным полимерным формам. В сырье более жесткая компонента составляет около двух третей (в среднем 66%) от общего количества протонсодержащего вещества, а менее жесткая компонента с более развитым молекулярным движением - приблизительно одну треть общего объема (в среднем 34 %). В ПФК заметно возрастает средняя доля полимеров с менее упорядоченной протонсодержащей структурой. На основании полученных результатов трудно приписать короткую и длинную компоненты к конкретному типу структурных фрагментов полимера в сырье и ПФК, поскольку эти полимеры по-разному организованы в сырье, водной вытяжке и(ПФК.

ИК спектры ПФК, выделенных из водных извлечений, полученных РЕМ из разных партий сырья, отличаются соотношением входящих в их состав карбоксильных групп по сравнению со связанным карбоксилом. Это подтверждается содержанием зольных элементов в соответствующем водном извлечении, способствующих формированию золя и влияющих на состав и компоновку структуры ПФК.

Определена АО А водных извлечений чаги, полученных РЕМ из пятнадцати партий сырья (от 10,74 до 39,98 кКл/ЮОг ПФК), и ПФК (рт 19,27 до 37,24 кКл/ЮОг ПФК). В целом, увеличение содержания ПФК

в водном извлечении приводит к снижению его АОА. АОА ПФК в водном растворе имеет тенденцию к увеличению по сравнению с АОА соответствующего водного извлечения. Это связано с иной стабилизацией ПФК и изменением его пространственной структуры в воде по сравнению с золем водного извлечения чаги. Отличия, обнаруженные в спектральных характеристиках ПФК, не влияют на проявление АОА.

Определён размер мицелл ПФК водных извлечений, имеющих близкое содержание сухих остатков, зольности и отличающихся по содержанию ПФК (10,05 и 13,20%).

-Ж—

Содержание частиц % 120----

@ 6«

Содержание ПФК (по оси абсцисс): 1 - 0,0017 мг/мл; 2- 0,0068 мг/мл; 3 — 0,11 мг/мл; 4 - 0,43 мг/мл; 5 - 7,00 мг/мл

Содержание ПФК (по оси абсцисс); 1 - 0,0028 мг/мл; 2 - 0,0053 мг/мл; 3 - 0,03 мг/мл; 4-1,08 мг/мл; 5 - 8,7 мг/мл

Рисунок 1 Эффективный радиус (нм) частиц дисперсных фаз коллоидных систем водных извлечений чаги из сырья партий Х1(А) и XII (Б)

Критические концентрации мицеллообразования (ККМ) в анализируемых коллоидных системах определены по изменению электропроводности в анализируемых образцах в зависимости от содержания в них ПФК. Отличие значений ККМ в коллоидных системах водных извлечений, полученных из разных партий сырья чаги, свидетельствует об их различной организации. В водных извлечениях (рис. 1 А и Б) при концентрации ПФК до и после ККМ происходит изменение размеров частиц дисперсной фазы и их содержания в образце. Коллоидная система с меньшим размером мицелл ПФК (рис.1 А) имеет большее значение АОА (29.37 кКл/ЮОг ПФК) по сравнению с другой коллоидной системой (рис.1 Б - 10.74 кКл/ЮОг ПФК). Аналогичная закономерность наблюдается для ПФК (рис.1 А, АОА=32.00 кКл/ЮОг ПФК, а рис.1 Б,

АОА= 27,5±0,7 кКл/ЮОг ПФК). Частицы с радиусом около ЗОнм, 15нм и более мелкие отнесены нами к субмицеллам.

Полученные результаты могут быть использованы для характеристики поступающего на переработку сырья и его стандартизации, а также являются базовыми для перехода к решению задач по повышению АОА извлечений и ПФК на основе водного извлечения чаги.

В четвёртой главе изложены способы изменения дисперсионной среды золя в процессе экстракции с использованием растворов ком-плексонов, гидроокиси натрия, а также ферментных препаратов.

Разработаны два способа проведения экстракции чаги: (1) предварительное замачивание сырья в растворе комплексона или гидроокиси натрия, (2) применение раствора комплексона в качестве экстрагента. Использованы комплексоны - гидроксиэтилендифосфоновая кислота (ОДЭФ) и натриевая соль этилендиамин-ЫДЧ.М'ДЧ'-тетрауксусной кислоты (трилон Б). Экстракция проводилась методами РЕМ и РЕП. Варьируя время замачивания от 30 минут до тринадцати часов и концентрацию комплексонов от 0.5x10° до 0.5 г/л, оценивали извлечения по содержанию в них ПФК. Определены оптимальные условия: время замачивания сырья в растворах комплексонов составило один час, концентрация комплексонов 0.3 г/л.

Таблица 1

Физико-химические показатели водных извлечений чаги, полученных по способам (1) и (2) с применением комплексонов

Содержание в водной вытяжке

Условия Комплек- Сухой Золь- Выход Концентра-

экстракции сом остаток ность ПФК ция углеводов

г г % %

Контроль* 1.54 0.79 8.9 2.00

РЕПП) Тоилон Б 1.42 0.37 12.6 2.00

РЕПГП ОЛФК 1.22 0.27 12.4 0.75

Контроль** _ 1.74 0.41 13.00 2.33

РЕМт Тоилон Б 1.77 0.38 13.60 2.17

РЕМ СП ОДЭФ 1.85 0.39 13.20 1.55

Контооль** _ 1.78 0.46 12.90 2.40

РЕМ (2) Трилон Б 1.97 0.55 16.30 3.04

РЕМ (2) ОДЭФ 1.61 0.44 14.80 2.38

Примечание: * - проведение РЕП водой с предварительным замачиванием сырья в воде; ** - проведение РЕМ водой с предварительным замачиванием сырья в воде

При проведении экстракции РЕП и РЕМ с применением способа (1) природа используемого комплексона мало влияет на изменения анализируемых компонентов золя (табл. 1). В целом, применение комплексо-нов по способу (1) приводит к изменению дисперсионной среды: увеличивается содержание дисперсной фазы (ПФК) в золях по сравнению с контролем, снижается зольность полученных извлечений. Более ярко проявляются особенности действия комплексонов при использовании способа (2). Применение трилона Б увеличивает выход ПФК на 26%, а ОДФК только на 15% по сравнению с контролем. ОДФК как комплексен, способный образовывать прочные комплексы с щелочноземельными металлами в кислой среде (рН водной вытяжки около 5), несколько дестабилизирует золь водной вытяжки. Это приводит к снижению содержания сухого остатка при сохранении показателей зольности и количества углеводов на уровне с контролем.

При применении трилона Б происходит увеличение всех анализируемых параметров водной вытяжки. Известно, что комплексообразование при рН 5 трилоном Б затруднено, так как наиболее прочные комплексы им образуются при рН среды 8-9 с двухвалентными ионами. Высокая зольность водной вытяжки может быть обусловлена либо связыванием трилона Б с сырьем и облегчением выхода из него зольных элементов, либо связыванием их в водной вытяжке в комплексные соединения, что облегчает их диффузию по градиенту концентраций. ИК спектры ПФК, полученных по способам (1) и (2), отличаются от ИК спектра ПФК, выделенного из водного извлечения, преобладанием в них свободных карбоксильных группы над участвующими в соле и/или комплексооб-разовании. Это может быть объяснено связыванием зольных элементов комплексонами в дисперсионной среде золя.

Применение комплексонов по способу (2) приводит к увеличению АОА ПФК, полученных с применением трилона Б, почти в полтора раза (28.80 кКл/ЮОг ПФК), а с применением ОДЭФ(62,ОЭ кКл/ЮОг ПФК) - более чем в три раза выше контроля (19,72 кКл/ЮОг ПФК). С помощью метода ЯМР релаксации показано, что при использовании ОДЭФ в экстракции формируется ПФК, имеющий значительно большие размеры и высокие энергетические характеристики рабочей поверхности. Такой структурной организацией этого ПФК объясняется максимальное значение его антиоксидантной емкости.

Водные извлечения, полученные по способу (1) с использованием гидроокиси натрия из сырья разных партий, по выходу ПФК незначительно отличаются от контроля (табл. 2). Вне зависимости от сырья взятого на экстракцию, АОА ПФК, выделенных из извлечений, по-

лученных по способу (1), в 1,4-2 раза выше (табл.2), чем у ПФК, выделенного из контрольного извлечения.

С точки зрения практического применения важно, что растворимость в воде высушенных ПФК, полученных экстракцией с применением комплексонов и гидроокиси натрия, выше, чем ПФК полученных РЕМ, и тем более, чем РЕП.

Таблица 2

Физико-химические показатели водных извлечений чаги, полученных по способу (1), с использованием гидроокиси натрия__

Партия сырья Реагент Содержание в водной вытяжке АЕ водных вытяжек, кКл/ЮОг ПФК I АЕ водных растворов ПФК, 1 кКл/ЮОг ПФК

Сухой остаток, г 1 Зольность, г Выход ПФК, % Концентрация углеводов % _ _

IV контроль * 1.52 0.65 9.75 1.84 29.40 38.66

ЫаОП 1.43 0.54 9.25 1.96 29.16 52.37

VIII контроль * 1.60 I 0.44 11.39 1.86 28.35 27.22

ЫаОН _М2 0.55 8.67 2.16 29.90 51.53

IX контроль * 0.97 ~ 0.58 9.25 2.30~ 29.61 37.24

N3011 1.48 0.81 9.25 2.08 29.21 52.05

Примечание: * -проведение РЕМ »одой

Для изменения дисперсионной среды золя при получении извлечений чаги, на основании содержания в них в качестве субстратов целлюлозы - 2.09% и гемицеллюлоз - 12.50%, выбраны микробиологические ферментные препараты: «Целлюкласт», обладающий выраженной цел-люлазной активностью (400 ед/г), и «Шеарзим», обладающий выраженной пентозаназной активностью (500 ед/г). При применении ферментных препаратов в интервале концентраций 0.01-0.1%, найдена их оптимальная концентрация (0.01%), позволяющая увеличить выход экстрактивных веществ по сравнению с контролем. Использование ферментных препаратов позволяет увеличить выход ПФК : на 24.3% («Шеарзим»), на 23,3% («Целлюкласт»); увеличить содержание углеводов: на 32.7% («Целлюкласт»), на 25.5% («Шеарзим»); увеличить зольность: на 35% («Шеарзим»), на 18.1% («Целлюкласт») по сравнению с контролем. Применение в экстракции чаги указанных ферментных препаратов приводит к существенному снижению АОА как получаемых извлечений («Шеарзим» - 18.63 кКл/100 г ПФК и «Целлюкласт» - 17.62 кКл/100 г ПФК, контроль - 29,37 кКл/100 г ПФК), так и выделенных из

них ПФК (25.00 кКл/100 г ПФК и 25.00 кКл/100 г ПФК, контроль -32.00кКл/100 г ПФК).

Исследование размеров дисперсных фаз (рис. 2 А и Б) показало, что в этих извлечениях мицеллы имеют больший размер, чем в водном извлечении (рис. 1 А), и во всех исследованных концентрациях ПФК дисперсная фаза содержит мицеллы и субмицеллы.

Содержание частиц % 120 ■

oU 0

@!2

О

Содержание ПФК

Содержание частиц. %

0 0

Содержание ГН>К

А Б

По оси абсцисс, содержание ПФК : По оси абсцисс, содержание ПФК : 1 -0,0043 мг/мл; 2-0,0175 м г/мл; 1- 0,0162 мг/мл; 2 - 0,1300 мг/мл; 3-0,14 мг/мл; 3 - 0,55 мг/мл; 4 - 8,85 мг/мл

4 - 0,55 мг/мл; 5 - 8,92 мг/мл Рисунок 2 - Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы коллоидных систем извлечений чаги (сырьё XI), полученных с применением ферментных препаратов: А - Целлюкласт; Б - Шеарзим

Выделяемые продукты гидролиза целлюлозы, гемицеллюлоз и полисахаридов чаги, а также высокая зольность в получаемых извлечениях приводят к увеличению размеров дисперсной фазы золя и снижению АО А.

Для определения изменений, происходящих в коллоидной системе водного извлечения чаги под действием ферментов желудочно-кишечного тракта, разработана методика проведения эксперимента in vitro. При последовательном гидролизе водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта - в условиях, близких к физиологическим, - в гидролизате происходит убывание белка (в 5,4 раза по сравнению с его содержанием в водном извлечении) и накопление аминокислот (в 2,4 раза выше, чем в водном извлечении). Мицеллы в гидролизате с концентрацией ПФК 6,52 мг/мл имеют радиус 178нм, превышающий радиус частиц дисперсной фазы водного извлечения чаги (158нм). Это

связано с преобладанием процессов ассоциации, чему может способствовать высокое содержание аминокислот, накапливающихся в процессе гидролиза. При более низких концентрациях ПФК (0,2 мг/мл, 0,013 мг/мл) повышается устойчивость частиц дисперсной фазы с радиусом около 50 нм. На основе смоделированного нами процесса, происходящего в желудочно-кишечном тракте человека с водным извлечением чаги, показано, что формируемый в гидролизате ПФК относится к на-норазмерным частицам, что обеспечивает высокую терапевтическую эффективность водных извлечений чаги.

Использование комплексонов и гидроокиси натрия при экстракции чаги позволяет получить, ПФК с высокими АОА свойствами, что является перспективным для разработки эффективных антиоксидантов на основе чаги.

Пятая глава посвящена обработке водного извлечения чаги органическими растворителями.

При обработке коллоидного раствора водного извлечения чаги этилацетатом, хлороформом, хлороформ-этанольной смесью образуются три слоя: водный - коллоидные системы (1); эмульсионный - коллоидные системы (2) и слой органического растворителя - экстракт. Коллоидные системы (3) - получены на основе коллоидных систем (2) путём отгонки из них органических растворителей. Обработка водного извлечения чаги петролейным эфиром приводит к образованию коллоидной системы (1) и экстракта.

Состав липидов и фенольных веществ экстрактов и коллоидных систем (2). полученных на основе водного извлечения чаги

Максимальной экстрагирующей способностью обладает петролей-ный эфир, которым можно извлечь 21,3% веществ от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание экстрактивных веществ в полученных экстрактах составляет: в хлороформном - 1,51%, в хлороформ-этанольном - 8,34%, в этилацетном - 1,67%. Качественный состав нейтральных и полярных липидов в них определён с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Впервые показано присутствие в водном извлечении чаги большого спектра нейтральных липидов - moho-, ди- и триацилглицеридов, высших жирных кислот и алифатических спиртов, стеринов и их эфиров, углеводородов. Впервые обнаружены биологически активные липиды: ненасыщенные жирные кислоты, витамины Е и К, кофермент Q. Очень высоко содержание стеринов - до 0,14% (от сухих веществ водного извлечения чаги). Содержание высших жирных кислот в свободном или слабосвязанном состоянии составляет 0,15% от су-

хого остатка водного извлечения чаги, из них 0,004% мононенасыщенных жирных кислот. С помощью ГЖХ определен их качественный состав. Обнаружено 12 высших жирных кислот, среди которых преобладают лауриновая и тридекановая кислоты. Впервые обнаружены мононенасыщенные пальмитиновая, олеиновая и эйкозеновая кислоты, содержание которых составляет 30% от суммы обнаруженных кислот, а также полиненасыщенные жирные кислоты - линолевая и линоленовая. Применённый подход впервые позволил определить в водном извлечении чаги полярные липиды (0,02%): фосфатидилглицерин, фосфатидилэтанола-мин, фосфатидилсерин, лизолецитин и цереброзиды. Состав полярных липидов и жирных кислот отличается в экстрактах полученных из разных партий сырья, что связано с метаболизмом чаги. Показаны незначительные отличия в составе нейтральных липидов и существенные отличия в составе полярных липидов.

С помощью ТСХ было показано, что в коллоидной системе (2), полученной при обработке водного извлечения чаги этилацетатом, липиды находятся в связанном с дисперсной фазой (ПФК) состоянии. Для изучения их состава был применён щелочной гидролиз исследуемого объекта. Состав нейтральных липидов коллоидных систем (2) аналогичен соответствующему составу липидов этилацетатных экстрактов. Полярные липиды при проведении гидролиза разрушаются. С помощью ГЖХ в исследуемых объектах (два вида сырья) идентифицированы ми-ристиновая (С|4:0), пальмитиновая (С^о), олеиновая (С18:|) и линолевая (С¡8:2) кислоты. В коллоидной системе (2) (сырьё XI) обнаружены также каприловая (С8:0), каприновая (Сюю), лауриновая (С|2:о), линоленовая (Си з) и эйкозеновая (С2о;0> а в коллоидной системе (2) (сырьё XII) тридекановая (Сил), пентадекановая (С15.о), гептадекановая (Сп.о) и стеариновая (С18.0) кислоты.

Для определения состава фенольных и терпеновых соединений водного извлечения чаги использован этилацетатный экстракт, который последовательно обрабатывали №НС03 и ШОН, а затем органическими растворителями. Применённая схема разделения позволяет извлечь до 97,3% содержащихся в этом экстракте веществ от его сухого остатка. Половина проэкстрагированных веществ представлена фенол-карбоновыми кислотами и сопутствующими им соединениями. Количество фенолкарбоновых кислот составляет 1,82%, а простых фенолов 0,96% от сухих веществ водного извлечения чаги. Разделение содержащихся в экстрактах веществ проведено с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии. Определены фенолкарбоновые кислоты -ванилиновая, сиреневая, п- и м- оксибензойные, п-кумаровая, у- и Р- ре-

зорциловые, З-метокси-4-оксикоричная, 3-оксиантраниловая, ксантуре-новая, протокатеховая и галловая, простые фенолы - пирокатехин и резорцин. Флавоноиды представлены мирицетином, робинетином, гипе-рином, нортангеретином, кверцетином, диоксифлавонолом, рамнетином, кемпферолом, апигенином, морином и нарингенином. В остатке этилацетатного экстракта с помощью ТСХ обнаружены вещества, относящиеся к классу циклопентаноидных монотерпенов - иридоидам, а также азулены. Эти соединения, обладающие выраженной биологической активностью, определены и в петролейных экстрактах, полученных при обработке водного извлечения чаги.

Коллоидные системы, полученные на основе водного извлечения чаги

Формирование образующихся при обработке водного извлечения чаги коллоидных систем сопровождается неравномерным распределением веществ между коллоидными системами (1) и (2) в случае использования всех органических растворителей. Большая часть сухих веществ водного извлечения чаги переходит в коллоидные системы (2).

При использовании хлороформа и хлороформ-этанольной смеси большее количество зольных элементов остаётся в коллоидных системах (1). При применении этилацетата водный слой имеет наименьшую зольность по сравнению со всеми объектами исследования, что перспективно использовать для разработки на его основе препаратов, предназначенных для профилактики и лечения предраковых заболеваний. В коллоидных системах (1) и (3), полученных при применении хлороформа и хлороформ-этанольной смеси, устойчивость дисперсных фаз (ПФК) по отношению к хлористоводородной кислоте имеют коллоидные системы (3), а при использовании этилацетата - коллоидная система (1). Кроме того, ККМ золей (1) и (3) лежат в разных диапазонах концентраций ПФК и существенно различаются между собой и отличаются от коллоидной системы водного извлечения чаги, что свидетельствует о различной организации исследуемых объектов.

Эффективный радиус мицелл в системах, сформировавшихся при обработке водного извлечения чаги хлороформом, этилацетатом и пет-ролейным эфиром, меньше чем при обработке хлороформ-этанольной смесью (рис. 3 А и Б). Размер мицелл в полученных коллоидных системах зависит не только от количества и природы удаляемых органическими растворителями из водного извлечения чаги компонентов, но и от дисперсионной среды, в которой происходит их формирование. Размер мицелл во всех коллоидных системах (1) и (3) не выходит из диапазона высокодисперсных частиц.

Все ПФК, выделенные с помощью хлористоводородной кислоты, имеют близкие ИК спектральные характеристики. От них отличаются спектры ПФК, выделенные этанолом из коллоидной системы (2). В этих ПФК количество карбоксилат-ионов превалирует над количеством свободных карбоксильных групп, что связано с большим количеством зольных элементов в коллоидных системах (2), а также со специфичностью действия этанола как осаждающего агента.

Содержание ПФК Содержание ПФК

По оси абсцисс, содержание ПФК:

1 - 0,37мг/мл - обработка смесью

хлороформ-этанол;

2 - 0,03 мг/мл - контроль;

3 - 0,06 мг/мл - обработка хлороформом;

4 - 0.04 мг/мл -обработка этилацетатом;

5 - 0,05 мг/мл - обработка петролейным эфиром

По оси абсцисс, содержание ПФК:

1-1,08 мг/мл - контроль;

2 - 1,99 мг/мл - обработка

этилацетатом;

3 - 1,38 мг/мл - обработка

смесью хлороформ-этанол

Рисунок 3 Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы А -коллоидных систем (1) и Б - коллоидных систем (3) после обработки водного извлечения чаги органическими растворителями в сравнении с частицами дисперсной фазы водного извлечения чаги (контроль)

Антиоксидантные свойства полученных коллоидных систем (1) и (3) возрастают по сравнению с коллоидной системой водного извлечения чаги. Максимальное увеличение АОА в пять-шесть раз по сравнению с водным извлечением чаги (10,74 кКл/ЮОгПФК) наблюдается для коллоидных систем (1) и (3), полученных с применением хлороформа (67,54и 56,42кКл/1 ООгПФК соответственно).

Выделенные из коллоидных систем (1) ПФК обладают АОА, в 1,5-2 раза превышающей АОА ПФК, полученного из водного извлечения чаги. Максимальное увеличение антиоксидантной активности наблюдается для ПФК, выделенного из коллоидной системы (1), полученной с применением петролейного эфира (64,0 кКл/ЮОгПФК). Увеличение

АОА ПФК связано с качественным составом удаляемых из водного извлечения соединений. Происходит иная компоновка мицеллы с образованием дополнительных центров, способных проявлять антиоксидант-ную активность.

Для объяснения существенной разницы в проявлении антиокси-дантных свойств ПФК, полученных с применением этилацетата: коллоидная система (2) (ПФК2) - 18,2 кКл/100гПФК, коллоидная система (1) (ПФК1) - 46,0 кКл/ЮОгПФК, и ПФК водного извлечения - 27,5 кКл/ЮОгПФК, - исследованы их парамагнитные характеристики. Идентичным для всех ЭПР спектров ПФК является наличие сигнала с g=2.00, отвечающего за органическую компоненту этих объектов, сигнала с в=2.10, который, характеризует парамагнитные свойства как органической, так и неорганической компоненты объектов. В ЭПР спектрах ПФК2 (при 143К) и ПФК1(при 290К) появляются сигналы с g факторами, равным» 3.90 и 3.85, характеризующие парамагнитные свойства ионов железа. Отличие g факторов и форма линий данных сигналов в спектре свидетельствует о том, что в ПФК1 ионы Ре3+ имеют большее координационное число, чем в ПФК2, то есть ионы Ре3+ в них имеют различное окружение. Во всех исследуемых образцах после озоления с помощью бумажной хроматографии показано присутствие ионов Ре3+. Несмотря на возрастание парамагнитных свойств органической компоненты сигнала с g=2.00 в ПФК—» ПФК1—> ПФК2 (1-М.1-Ч.4), высокое значение АОА ПФК1 связано с появлением только в его спектре дополнительного ПМЦ ^=3.85), с более равномерным, возможно, радиальным распределением ПМЦ и, соответственно, с максимально плотной упаковкой компонентов в ПФК/меланине. Исследуемые ПФК/меланины различаются по подвижности входящих в них компонентов: ПФК1—>ПФК—>ПФК2. В этой последовательности убывают их антиоксидантные свойства. Проявлению высоких антиок-сидантных свойств ПФК1 также способствует его меньший размер (ЯЭфф = 80 нм) по сравнению с ПФК (Я3фф = 148 нм). Согласно данным РСА, все исследуемые образцы (ПФК, ПФК1, ПФК2 и ПФКЗ) имеют аморфную структуру. В двух из них - ПФК и ПФК1 - обнаружен хлорид калия, находящийся в ассоциатах в кристаллическом виде.

Обработка водного извлечения чаги органическими растворителями позволила определить липиды и фенольные соединения, находящиеся в свободном и слабосвязанном с его дисперсной фазой состоянии. Многие из них относятся к биологически активным, что позволяет объяснить терапевтическую эффективность водных извлечений чаги. Применённый подход позволил получить несколько коллоидных систем на

основе водного извлечения чаги, различающихся составом и антиокси-дантной активностью, что перспективно для разработки на их основе БАД и лекарственных препаратов.

В шестой главе изложены результаты исследований по разделению хромогенов водного извлечения чаги с помощью электрофореза на бумажном носителе и в тонком слое сорбента.

Электрофорез водного извлечения чаги на бумажном носителе

В каждой буферной системе разделение водного извлечения чаги проводили в следующих режимах: фиксировали силу тока 5, 10, 15 или 20 мА, меняя напряжение от 100 до 400 В с шагом в 50 В.

Использование муравьиного буфера с рН среды, близкой к седиментации ПФК (рН 2,4), приводит к низкой подвижности хромогенов на электрофоретограмме. В УФ-свете отделившиеся подвижные хромогены флуоресцируют, приобретая зеленоватую окраску. Обработка электрофоретограмм парами аммиака усиливает цвет подвижного фронта. Следовательно, продвигающиеся по электрофоретограмме соединения относятся к классу фенолов, которые могут быть сложно организованы.

Проведен электрофорез фильтрата (после удаления ПФК из водного извлечения чаги осаждением хлористоводородной кислотой). В режиме 5мА и 350В движение хромогенов не наблюдается. Электрофорез фильтрата при режиме 20мА и 400В обеспечивает движение частиц золя фильтрата: в большей степени к аноду и в меньшей - к катоду. В подвижных фракциях фильтрата кроме хромогенов подтверждено присутствие аминокислот и соединений, обладающих восстанавливающими свойствами (при проявлении электрофоретограмм нингидрином и раствором азотнокислого серебра).

Проведение электрофореза в среде муравьиного буфера, эффективно использовать для изучения веществ, находящихся в свободном и слабосвязанном состоянии с их дисперсными фазами состоянии.

При использовании ацетатного буфера (рН 5,6) сохраняется нативный рН среды водного извлечения. При всех применённых режимах элек-трофоретического разделения хромогенов водного извлечения чаги на стартовой линии остаётся больше хромогенов. Оптимальный режим (ток 5мА напряжение 350В) позволяет выделить две фракции хромогенов, подвижных в сторону катода. Этому может способствовать высокое содержание зольных элементов в водном извлечении чаги (25 до 50%). Повышение силы тока до 15 мА (напряжение 400В) позволяет получить как фракции несущие положительный заряд, так и подвижные полианионные фракции.

Рисунок 4 - Электрофорез водного извлечения чаги при 20 мА (боратный буфер): денситоно-граммы при 150 и 200В

Электрофорез водного извлечения чаги в ацетатном буфере позволил обнаружить как отрицательно, так и положительно заряженные фракции, подвижные в электрическом поле.

Электрофорез водного извлечения чаги в боратном буфере даёт яркие зоны на электрофоретограммах. На них преобладают хромогены, движущиеся в сторону анода. Как показано на денситограммах (рис. 4), оптимально подобранные режимы проведения электрофореза позволяют разделить хромогены

водного извлечения чаги на две фракции, подвижные в сторону анода, и одну - в сторону катода. Впервые показано, что в отличие от гуминовых кислот, хромогены водного извлечения чаги в боратном буфере подвижны как в сторону анода, так и в сторону катода.

Электрофорез водного извлечения чаги в слое сорбента на пластинке БПиГо! при использовании боратного буфера.

На пластинах силикагеля (в режимах: сила тока 5, 10, 15 и 20мА и напряжении 250 В) хромогены водного извлечения чаги перемещаются к катоду и разделяются на пять зон (рис. 5). Большая сорбционная ёмкость силикагеля способствует образованию положительно заряженных частиц, что позволяет проанализировать вещества, подвижные в электрическом поле.

Зона I

Рисунок 5 Зоны электрофо-ретограммы, полученной при проведении электрофореза в режиме ЮмА, 250В, в течение 60 минут.

Электронные спектры эльюатов, полученных с каждой из зон электро-форетограммы, схожи со спектром ПФК водного извлечения чаги. Следовательно, во всех зонах присутствуют вторичные мицеллы, образующиеся из мицелл золя водного извлечения чаги на стартовой линии.

Анализ эльюатов каждой зоны с помощью ТСХ показал присутствие в них полярных липидов. Кроме ранее обнаруженных в водном извлечении чаги цереброзидов было показано наличие в них кардиолипинов. Эльюаты силикагеля 95% этанолом проанализированы с помощью ТСХ. В них, со второй по пятую зону включительно, обнаружены п-ок-сибензойная, сиреневая, ванилиновая и вератровая кислоты. Для проведения идентификации соединений во фракциях, подвижных под действием электрического тока, более эффективно применять в качестве носителя пластины сорбента.

Электрофорез эффективно применять для разделения коллоидной системы водного извлечения чаги, как в аналитических целях, так и для разработки лекарственных препаратов при обнаружении электрофоре-тических зон, проявляющих высокую биологическую активность.

В седьмой главе показана возможность комплексной переработки чаги.

Практическое применение имеет осаждение ПФК хлористоводородной кислотой. Именно с его количественным содержанием в водном извлечении чаги связывают терапевтическую эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе водных извлечений чаги. После отделения ПФКк1 (13,58% от сухого веса чаги) фильтрат имеет коричнево-желтую окраску. Диаметр мицелл в нём составляет 188 нм. Добавление к фильтрату в отдельности хлористоводородной кислоты, этанола или водного раствора гидроокиси калия не приводит к осаждению ПФК. Применение спиртового раствора щёлочи позволяет осадить ПФКЩ2 (4,79%). Осаждение водного извлечения сначала спиртовым раствором щёлочи приводит к получению ПФКЩ1 (17,24%). В результате осаждения дисперсной фазы фильтрата хлористоводородной кислотой получено 2,01% Г1ФКк2. Выделенные ПФК отличаются по АО А: ПФКк1 -27,5 кКл/100 г, ПФКЩ2 - 108,0 кКл/100 г; ПФКЩ1 -17,0 кКл/100 г, ПФКк2 - 6,8 кКл/100 г. Различие их структурной организации показано с помощью ИК и электронных спектров, а также по содержанию белка, углеводов и веществ фенольной природы, ассимилируемых ПФК при осаждении.

Для определения состава липидов и веществ фенольной природы, находящихся в фильтрате в свободном или слабосвязанном с его дисперсной фазой состоянии, проведена последовательная исчерпывающая экстракция фильтрата органическими растворителями (петро-лейный эфир, смесь хлороформ-этанол (2:1), диэтиловый эфир, этил-ацетат и бутанол). В них перешло 69,2% веществ от сухого остатка фильтрата. Максимальное количество экстрактивных веществ обнару-

жено в бутанольном экстракте (20,39%), содержащем вещества, относящиеся к полигликозидным формам фенольных соединений. Этим объясняется высокая АО А ПФКЩ2. Исследование экстрактов с помощью ТСХ позволило выявить в них липнды: моно- и триглицериды, стерины и их эфиры, галактозилглицериды, лизофосфатидилэтаноламин и фос-фатидилсерин. Содержание стермнов и их эфиров составляет 0,29% от сухих веществ фильтрата, В фильтрате содержится 0,1% гликолипидов и 0,19% липидов., содержащих аминогруппу, 0,09% из которых приходится на фосфодипиды. С помощью ГЖХ определён состав высших жирных кислот: тридекановая (Сад), миристиновая (Сн о), миристолеи-новая (Cj4:i), пентадекановая (С^о), пальмитиновая (Ci6o), гептадекано-вая (Сп.о), олеиновая (Ci£;;i). Количество простых фенолов составляет 0,18% от сухих веществ водного извлечения чаги. Показано содержание в фильтрате вератровой, ванилиновой, сиреневой, п-оксибензойной, п-кумаровой, p-резорциловой, м-оксибензойной, протокатсховой и галловой кислот. С помощью бумажной хроматографии определены флаво-ноиды: нарингенин, апигенин, мирицетин, гиперин, госсипетин, кемп-ферол, 3-метокси-4,5-диоксифлавапон-7-0-неогесперидозид, робинетин и наренгик.

Разработаны способы извлечения биологически активных веществ и ПФК из шрота - отхода, полученного после проведения водной экстракции чаги. В качестве экстрагснта использован этиловый спирт с концентрацией 30%, 50% и 70%. Спиртовые экстракты из шрота получены по двум способам. По первому способу шрот проэкстрагирован РЕМ. По второму способу процесс проведён при кипячении шрота. Первый способ позволяет получить спиртовый экстракт (50% спирт) с самой низкой зольностью и высоким содержанием ПФК - до 6%, что в 3,5 - 6 раз выше, чем по второму способу. Использование второго способа (70% спирт) позволяет получить экстракт, содержащий в 3-5 раз больше углеводов ив 1,5 - 2,5 раза больше фенольных соединений, чем в экстракте, полученном по первому способу. 70% спиртом из шрота можно извлечь в 6,6 раз больше фенольных соединений и в 1,1 раз больше углеводов по сравнению с их содержанием в настойках чаги, выпускаемых промышленностью на основе сырья чаги.

Такая переработка сырья позволяет извлечь из сырья в 6-7 раз больше ПФК по сравнению с его содержанием в промышленно полученных настойках чаги, производимых из сырья чаги без проведения предварительной экстракции чаги водой. Идентичность ПФК, выделенных из спиртовых экстрактов и полученных из водных извлечений чаги, показаны с помощью ИК и электронной спектроскопии. Их АОА

находится на уровне с этими показателями настоек, выпускаемых фармацевтической промышленностью.

Разработана комплексная переработка сырья чаги, заключающаяся в получении ряда продуктов на основе водного извлечения и шрота. Из водного извлечения можно получить два ПФК, обладающих высокими АОА, либо использовать фильтрат (после выделения ПФК) в качестве самостоятельного объекта для разработки БАД и лекарственных препаратов. Экстракция шрота позволяет получить спиртовые экстракты чаги с высоким содержанием углеводов, фенольных соединений и ПФК.

В восьмой главе проведено обобщение полученных результатов, сформированы теоретические представления о структуре золя водного извлечения чаги и раскрыты практические аспекты применения объектов, полученных при его модификации.

На основании сопоставления структуры наноразмерных биологических объектов с мицеллами ПФК/меланина показано, что при компоновке глобулы его структурной единицей являются частицы с диаметром 8-20 нм (и более мелкие). Это позволяет объяснить лабильность дисперсной фазы (изменение четвертичной структуры ПФК/меланина) как коллоидной системы водного извлечения чаги, так и золей формируемых на её основе при химическом, физическом и биотехнологическом воздействии. Использование химического воздействия на коллоидную систему водного извлечения чаги при обработке его этилацетатом приводит к изменению вторичной структуры дисперсных фаз коллоидных систем (1) и (2) - ПФК1 и ПФК2 - по отношению к ПФК водного извлечения чаги, что показано с помощью ЭПР и РСА.

Приведены схемы по комплексной переработке сырья чаги, в которых использованы разработанные перспективные методы повышения АОА извлечений и ПФК, получаемых на основе чаги. Показана возможность использования их в практических целях.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что водные извлечения чаги относятся к высокодисперсным коллоидным системам. Диаметр частиц дисперсной фазы составляет: для крупных мицелл - 120-320нм (с колебаниями от 100 до 400нм), для мелких, субмицелл - бОнм (и более мелкие).

2. Показано, что коллоидная система водного извлечения чаги имеет легко перестраивающуюся дисперсную фазу (ПФК/меланин): при разбавлении водного извлечения, смене способа его получения, обработке

25

его с помощью органических растворителей или проведении электрофореза.

3. Установлено, что изменение антиоксидантной активности как коллоидной системы водного извлечения чаги, так и её дисперсной фазы (ПФК) связано: с содержанием в водном извлечении ПФК, размером мицелл ПФК/меланина (при изменении четвертичной структуры), природой соединений, входящих в его состав, а также количеством и природой ПМЦ в ПФК/меланине (при изменении вторичной структуры).

4. Показано, что изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги при применении в экстракции комплексонов ОДФК, трилона Б, а также гидроокиси натрия позволяет повысить антиоксидантную активность получаемых ПФК в 3, 1,5 и 1,4 раза по сравнению с антиоксидантной активностью ПФК, выделенного из водного извлечения чаги.

5. Применение в экстракции чаги микробиологических ферментных препаратов, содержащих гидролазы некрахмалистых полисахаридов, изменяет дисперсионную среду образуемых золей, способствуя формированию более крупных мицелл ПФК (Я,фф около 100-125нм) и большего количества субмицелл по сравнению с водным извлечением чаги(Я3фф около 60 - ЮОнм). ПФК, выделенные из этих коллоидных систем, обладают низкой антиоксидантной активностью (18,63 и 17,62 кКл/100 г ПФК) в сравнении с ПФК, полученным из водного извлечения чаги (29,61 кКл/100 г ПФК).

6. Применение разработанной методики для изучения протеолиза в коллоидной системе водного извлечения чаги (in vitro) показало, что под действием ферментов желудочно-кишечного тракта происходит деградация белка. Это приводит к формированию наноразмерных мицелл ПФК(ЯЭфф=50 нм) и мелких субмицелл (8нм), что обеспечивает высокую терапевтическую эффективность водных извлечений чаги.

7. Установлено, что коллоидные системы с наноразмерными мицеллами ПФК (Яэфф = 58 нм - 96 нм), полученные на основе водного извлечения чаги после его обработки органическими растворителями (петролейный эфир и этилацетат) имеют более высокую антиоксидантную активность по сравнению с водным извлечением чаги (в два - пять раз), а также более низкую токсичность. Антиоксидантная активность ПФК, выделенных из этих коллоидных систем, в среднем в два раза превышает эту характеристику для ПФК водного извлечения чаги.

8.Установлено, что фильтрат (после осаждения ПФК хлористоводородной кислотой) является высокодисперсной коллоидной системой, дисперсную фазу которой можно выделить с помощью спиртового раствора щёлочи, а полученный из него ПФК имеет антиоксидантную ак-

тивность в четыре раза выше, чем ПФК, выделенный из водного извлечения с помощью хлористоводородной кислоты.

9. Определён состав веществ, находящихся в золе водного извлечения чаги и фильтрате в свободном и слабосвязанном с дисперсной фазой золя состоянии. Показано присутствие биологически активных липи-дов (стерины и их эфиры, моно- и полиненасыщенные высшие жирные кислоты, витамины К и Е, кофермент Q, глико- и фосфолипиды), терпенов (азулены и иридоиды), и фенольных соединений (фенолкарбоновые кислоты, фенолы и флавоноиды). Состав этих веществ в водном извлечении чаги и фильтрате различен.

10. Разработаны способы получения спиртовых экстрактов из шрота, обеспечивающие дополнительный выход ПФК (6%), а также углеводов и фенольных соединений. Антиоксидантная активность экстрактов не уступает этой характеристике спиртовых экстрактов из чаги, выпускаемых фармацевтической промышленностью.

11. Разработан комплексный подход к переработке сырья чаги с получением нескольких продуктов, обладающих высокой антиоксидантной активностью.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. 1. Изменение изучаемой системы при введении комплексонов/ М.А.Сысоева, О. Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г. Халитов // Башкирский химический журнал. 2004. - т, 11. -2. -С. 62-65.

2. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г. Халитов, П.П. Суханов// Вестник Казанского технологического университета. - 2003. - 2. - С. 172-176.

3. Сысоева, М.А. Исследование золя вводных извлечений чаги III. Влияние состава сырья на выход экстрактивных веществ водных извлечений чаги/ М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова, Г.К: Будников // Химия растительного сырья. - 2004. - 4. - С. 15-21.

4. Сысоева, М.А. Исследование золя вводных извлечений чаги IV. Антиоксидантная активность, Влияние способа извлечения и применение комплексонов, гидроокиси натрия. / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Химия растительного сырья. - 2005. - 1. - С.41-47.

5. Сысоева, М.А. Структурная организация и свойства полифенолов чаги / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова,Т.К. Будников И Вестник Казанского технологического университета. - 2005. - I. - С. 244-250.

6. Сысоева, М.А. Использование гидролаз некрахмалистых полисахаридов. I Антиоксидантная активность полученных извлечений / М.А. Сысоева, В.Р. Ха-бибрахманова, В. С. Гамаюрова, Д. В. Муллина, О.Ю. Кузнецова, Г. К. Зиятди-нова, Г. К. Будников // Бутлеровские сообщения. - 2005. - т. 7. - 4. - С, 33- 35.

7. Сысоева, М.А. Исследование липидного состава водных извлечений чаги. I. Липиды извлекаемые этидацетатом / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, О. Ю. Кузнецова, В. С. Гамаюрова // Новые лекарственные средства: Успехи и перспективы. - Уфа: Гилем, 2005-С. 133-135.

8. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги V. Электрофорез в кислых средах. Использование муравьиного буфера / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В. С. Гамаюрова, Г.И. Халиуллина, A.C. Опарина И Вестник Казанского технологического университета. - 2006. - 4. - С. 143-147.

9. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги VI. Электрофорез п кислых средах. Использование ацетатного буфера / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Г.И. Халиуллина, О.Ю. Кузнецова // Вестник Казанского технологического университета. - 2006.-4.-С. 153-156.

10. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги VII. Электрофорез в щелочной срсдс. Использование боратного буфера / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, 13. С. Гамаюрова, Г.И. Халиуллина // Вестник Казанского технологического университета. - 2006. - 4. - С. 164-168.

11. Сысоева, М.А. Разделение водных извлечений чаги с использованием этил-ацетата I. Антиоксидантная активность / М.А. Сысоева, В. Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Химия растительного сырья. -2007.- 4.-С.101-104.

12. Сысоева, М.А. Разделение водных извлечений чаги с использованием этил-ацетата. II. Парамагнитные свойства хромогенов чаги / М.А. Сысоева, В. Р. Хабибрахманова, B.C. Минкин, B.C. Гамаюрова, В.Е. Петрашень // Химия растительного сырья. - 2007. - 4. - С. 105-109.

13. Сысоева, М.А. Исследование золя вводных извлечений чаги. IX. Определение размеров частиц дисперсной фазы золя извлечений из чаги / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, J1.A. Кудрявцева // Химия растительного сырья. - 2008 - 2. - С.75 - 80.

14. Сысоева, М.А. Разделение водных извлечений чаги с использованием этил-ацетата. Ш. Состав липидов, отделяемых из водного извлечения чаги этилацетатом. / М.А. Сысоева, В. Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Э.Ф. Зайнетди-нова//Химия растительного сырья. - 2008. - 1. - С.111 - Г14.

15. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. X. Протеолиз водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта / М.А. Сысоева, Е.В. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Л.А. Кудрявцева// Химия растительного сырья. - 2008 - 2. - С.81 - 86.

16. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. XI. Липиды водного извлечения чаги/ М.А. Сысоева, В.Р.Хабибрахманова, В.С.Гамаюрова, А.Х. Тазеева //Химия растительного сырья. - 2008 - 3.-С.119-122.

17.Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги-VIII Размеры частиц дисперсных фаз, образующихся при экстракции водных извлечений чаги ор-

ганическими растворителями / М.А. Сысоева, В. Р, Хабибрахманова, B.C. Га-маюрова, Л.А. Кудрявцева // Химия растительного сырья. - 2008 - 4 . - С. 129 -132.

18. Пат (19)RU(11) 2 23)786 (П) С1 . Способ определения углеводного состава по-лифенольного комплекса чаги / Сысоева М.А., Кузнецова О. Ю., Гамаюрова B.C.: заявитель и патентообладатель КГТУ. - № 2231786; заявл. № 2002132770, 27.11.2002; опубл. 27.06.2004 Бюл. №18.

19. Патент (I9)RU(,,) 2 336 085 (,3) С2. Способ получения полифенолов из чаги / Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Гамаюрова B.C., Юмаева Л.Р.: заявитель и патентообладатель КГТУ. - №2336085; заявл.2006134108/15, 13.09.2006 ; опубл. 20.10.2008 Бюл.№29.

20. Патент (I9)RU(1I) 2 336 888 |,3) С1. Способ получения спиртового экстракта чаги / Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Юмаева J1.P., Гамаюрова B.C.: заявитель и патентообладатель КГТУ. - №2336888; заявл.2007115936/15, 20.04.2007 ; опубл. 27.10.2008 Бюл.№30.

21. Патент (i9)RU<n) 2 339 390 (13)С1. Способ получения водных извлечений и полифенолов чаги, обладающих антиоксидантной активностью/ Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Гамаюрова B.C., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К.: заявитель и патентообладатель КГТУ. - №2339390; заявл.2007109396/15, 06.03.2007 ; опубл. 27.11.2008 Бюл.№33.

22. Сысоева М.А, Углеводы растительного сырья - чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии», Казань, 2002, С.63.

23. Сысоева М.А. Способы получения водных вытяжек чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова// II Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ», Казань, 2002, С. 131.

24. Сысоева М.А. Получение водных вытяжек чаги с применением комплексо-нов/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI: 7-ая Путинская школа - конференция молодых ученых, Пущино, 2003, С.И1-112.

25. Сысоева М.А. Коллоидная система водных вытяжек чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии», Казань, 2003, С.90-9]. -

26. Сысоева М.А. Роль зольных элементов в формировании коллоидных растворов водных вытяжек Inonotus obliquus/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г.Халитов// XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, секция «Биомолекулярная химия и биотехнология», Казань, 2003, С.257.

27. Сысоева М.А. Исследование физико-химических свойств полифенолов чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г.Халитов, П.П.Суханов// XVI] Менделеевский съезд по обшей и прикладной химии, секция «Биомолекулярная химия и биотехнология», Казань, 2003, С.303.

28. Сысоева М.А. Биологические и биохимические аспекты изучения трутового гриба чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI: 8-ая Путинская школа - конференция молодых ученых, Пущино, 2004, С.267.

29. Сысоева М.А. Анализ растительного сырья - чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г.Халитов, Г.К.Будников, Г.К. Зиятдинова// Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии», Казань, 2004, часть 11, С.3-5.

30. Сысоева М.А. Антиоксидантная активность водных извлечений и полифенолов чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Г.К.Будников, Г.К. Зиятдинова // III Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004, С.149-151.

31. Сысоева М.А. Ферментативный гидролиз чаги/ М.А.Сысоева, B.C. Гамаюрова, М.А.Бурмасова// III Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ», Саратов, 2004, С.229-231.

32. Сысоева М.А. Сравнительный анализ содержания углеводной компоненты водных извлечений трутового гриба Inonotus obliquus/ М.А. Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // III Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2004, С.41.

33. Сысоева М.А. Использование слабых растворов гидроокиси натрия при экстрагировании чаги/ М.А.Сысоева, О.(О.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г.Халитов, Г.К.Будников, Г.К. Зиятдинова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии», Казань, 2005, С.102-103.

34. Сысоспа М.А. Очистка полных извлечений чаги от пигментных веществ с целью идентификации флапонондоп/ В.Р.Хабибрахманова, Муллина Д.П., Ю.А. Скрылева, B.C. Гамаюрова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии», Казань, 2005, С.104-105.

35. Сысоева М.А Гипотетическая схема строения полифенолоксикарбонового комплекса чаги/ М.Л.Сысоспа, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Ф.Г.Халитов, П.П.Суханов, Г.К.Будников, Г.К. Зиятдинова, // II Всероссийская конференция «Новые достижения и химии н химической технологии растительного сырья», Барнаул, 2005,книга И, С.461-465.

36. Сысоева М.А. Фотон-корреляционная спектроскопия водных извлечений чаги/ М.А.Сысоева, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Л.З.Ризванова, Кудрявцева Л.А. // IV Всероссийская научная конференция «Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар, 2006, С.205.

37. Сысоева М.А. Электрофоретическое разделение компонентов водных извлечений чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // IV Всероссийская научная конференция «Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар, 2006, С.399.

38. Сысоева М.А. Применение электрофореза для исследования водной вытяжки чаги/М.А.Сысоева, Г.И.Халиуллина, О.Ю.Кузнецова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.113-115.

39. Сысоева М.А. Применение фотон-корреляционной спектроскопии в исследовании водной вытяжки чаги / М.А.Сысоева, Л.З.Ризванова, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Л.А.Кудрявцева// Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006,,С.115-116.

40. Сысоева М.А. Нейтральные липиды извлекаемые из водной вытяжки этил-

ацетатом / М.А.Сысоева, Э.Ф.Зайнетдинова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаю-рова// Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.116-117.

41. Сысоева М.А. Терпеновые соединения водных извлечений чаги/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.117-118.

42. Сысоева М.А. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги/ М.А.Сысоева, Л.Р.Юмаева, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.118-119.

43. Сысоева М.А. Выделение флавоноидов из водного извлечения чаги с помощью колоночной хроматографии/ М.А.Сысоева, Ю.Г.Скрылёва,

B.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006,

C.119-120.

44. Сысоева М.А. Исследование биологически активных компонентов водных извлечений чаги с помощью горизонтального электрофореза / М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова // Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.121-122.

45. Сысоева М.А. Электрофоретическая подвижность хромогенов водного извлечения чаги/ М.А.Сысоева, В.Р.Хабибрахманова, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, А.С.Опарина // III Всероссийская конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул, 2007, кн.2, С.210-214.

46. Сысоева М.А. Протеолиз белков водных извлечений Inonotus obliquus/ М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Е.В. Сысоева // III Всероссийская конференция,«Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул, 2007, кн.2, С.214-215.,

47. Сысоева М.А. Определение веществ флавоноидной природы в водных извлечениях чаги/ М.А.Сысоева, А.В.Порфирьева, М.А.Бурмасова, О.Ю.Кузнецова,

B.C. Гамаюрова//УН1 Всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2007, С. 188'.

48. Сысоева М.А. Отнесение фенольных соединений, полученных при гидролизе хромогенов водного извлечения чаги/М.А.Сысоева, Г.И.Зарйпова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // VIH Всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2007,

C. 190.

49. Сысоева М.А. Анализ углеводов водной вытяжки чаги/ М.А.Сысоева, Н.К.Шаехова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // VIII Всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2007, С.191-192.

50. Сысоева М.А. Нейтральные липиды водной вытяжки чаги/ М.А.Сысоева, Н.А.Маякова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // VIII Всероссийская кон-

ференция молодых учёных с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2007, С. 199.

51. Сысоева М.А. Изучение терпенового состава водных извлечений чаги/ М.А.Сысоева, Г.И.Кыямова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // VIII Всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Пищевые технологий», Казань, 2007, С.200.

52. Сысоева М.А. Разработка биологически активных добавок на основе полифенолов Inonotus obliquus/ М.А.Сысоева, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 2007, т.4, С.590.

53. Сысоева М.А. Определение размеров дисперсной фазы золя водного извлечения Inonotus obliquus / М.А.Сысоева, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, Л.А.Кудрявцева // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 2007, т.4, С.591.

54. Сысоева М.А. Оптимизация процесса экстракции трота чаги/М.А.Сысоева, Л.Р.Юмаева, B.C. Гамаюрова// 1ХМеждународная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С. 166-167.

55. Сысоева М.А. Изучение липидного состава водных извлечений чаги/М.А.Сысоева, Е.Л.Ларионова, Г.Л.Иванова, B.C. Гамаюрова// IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С. 188.

56. Сысоева М.А. Состав липндов водного извлечения чаги/М.А.Сысоева, Н.В.Куракина, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова//1Х Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008.-С. 193.

57. Сысоева М.Л. Изучение биологически активных соединений полифенолок-сикарбонового комплекса чаги/М.А.Сысоева, С.А.Никитина, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова// IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С. 199-200.

58. Сысоева М.А. Изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги/ М.А.Сысоева, А.В.Григорьева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова, Г.К.Будников, Г.К. Зиятдинова// IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С.201.

59. Сысоева М.А. Особенности формирования полифенолоксикарбонового комплекса препарата «Бефунгин» / М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, B.C. Гамаюрова// IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С.202.

60. Сысоева М;А. Сравнение состава биологически активных соединений дисперсионной среды водных извлечений чаги из различного сырья/М.А.Сысоева, Л.А.Ефремова, В.Р.Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова// IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2008, С.203-204.

Заказ 2.0 Тираж 100 эгал.

Офсетная лаборатория Казанского государственного технологического университета

420015, Казань, К. Маркса,68

Актуальность работы. В настоящее время одним из наиболее перспективных и актуальных направлений исследований является- изучение природных объектов, имеющих применение в медицине и способных обеспечить биологическую безопасность организма человека. Существует большая потребность в адаптогенах, иммуномодуляторах, антиоксидантах и антитоксикантах на основе сырья, природного происхождения. В отличие от синтезированных лекарственных средств, такие препараты и биологически активные добавки обладают комплексным действием и редко приводят к осложнениям после применения.

Перспективным объектом для разработки на его основе лекарственных препаратов, биологически активных и пищевых добавок, космецевтических средств различной направленности действия* является гриб Inonotus obliquus (Fr.) Pil. (чага). Водное извлечение чаги представляет собой гидрофильную полидисперсную коллоидную систему. Её дисперсной фазой и основным действующим компонентом водных извлечений чаги, обеспечивающих их терапевтическую активность, считаются хромогены или полифенолы, называемые полифенолоксикарбоновым комплексом (ПФК). В последнее время ПФК чаги отнесён к меланинам. Согласно современным воззрениям, меланины представляют собой глобулы, состоящие из аморфных микрочастиц, которые организованы из агрегатов и субагрегатов различной формы и размеров. Такая структура этой биомолекулы определяет биохимические и биологические свойства меланинов. ПФК/меланин является сложно организованными природным объектом с не выясненной структурой. В его состав входят полимерные (полифенолы, белки, полисахариды) и низкомолекулярные (простые фенолы, фенолкарбоновые кислоты, высшие жирные кислоты) соединения и неорганическая компонента.

С давних времён водные извлечения этого гриба и лекарственные препараты на их основе находят широкое применение в народной и афицинальной медицине для профилактики и терапии желудочно-кишечных, а также онкологических заболеваний. Поскольку онкологические заболевания, лучевая болезнь, атеросклероз и ряд других относятся к патологиям, вызванным воздействием свободных радикалов, то разработка более эффективных антиоксидантов на основе водных извлечений чаги для профилактики и лечения этих заболеваний является перспективной задачей.

В настоящее время в мировом сообществе интерес к этому сырью и препаратам на его основе очень велик. Это связано с тем, что препараты на основе чаги проявляют широкий спектр биологической активности. Установлено, что они обладают высокими антитоксическими, радиопротекторными, генопротекторными, адаптогенными, иммуномодули-рующими, антивирусными, антиоксидантными свойствами, регулируют активность ферментов крови, а также деятельность сердечной, нервной и дыхательной систем живого организма.

Традиционно используемые формы препаратов на основе чаги, такие как: бефунгин, водный экстракт чаги, - имеют ряд недостатков: препараты производятся с высоким содержанием зольных элементов; стандартизация препаратов осуществляется только по содержанию в них ПФК; отсутствует количественная и качественная характеристика биологически активных соединений входящих в их состав, а также ряд других недостатков.

Согласно литературным данным, культивирование чаги с привлечением биотехнологических приёмов не приводит к формированию ПФК, аналогичного природному. Возобновление сырья в природных условиях является достаточно длительным процессом. Поэтому поиск повышения эффективности препаратов на основе водных извлечений чаги очень перспективен.

Традиционные подходы к исследованию водного извлечения чаги не позволяют определить структуру золя и его дисперсной фазы — ПФК, а также состав биологически активных веществ, обеспечивающих терапевтический эффект от применения водных извлечений. Эту задачу можно решить, только расширив представления о коллоидной системе водного извлечения чаги и структуре её дисперсной фазы - ПФК/меланина. Поэтому разработка новых методов изучения структурной организации золя водного извлечения чаги позволит определить физиологически активные компоненты- золя, создать на его основе высокодисперсные, коллоидные системы, что представляет значительный,научный и практический интерес.

Работа проведена в соответствии с: Пр- 843 от 21.05.06 «Приоритетные направления развития- науки, технологий и техники в РФ»,. по направлениям' «Живые системы» и «Индустрия наносистем: и наноматериалов»; с: созданием: критической- технологии по теме «Биомедицинские и ветеринарные: технологии жизнеобеспечения и защиты; человека; и животных»; в рамках научного направления? по номенклатуре специальностей научных работников «Технология биологически активных, веществ» (код 051818), по научному направлению - Пр-245-0 от 02.12.05 по КГТУ «Биологически активные вещества различной этиологии для; производства функциональных БАД,к пище, лекарственных средств и кормовых добавок».

Цель- работы. Разработать теоретические: основы и методологические подходы; получения экстрактов, высокодисперсных коллоидных: систем; и ИФК/меланинов; из чаги, обладающих высокой антиоксидантнойf активностью > для- создания на их основе новых- высокоэффективных лекарственных: и: космецевтических препаратов различной направленности действия.

Достижение поставленной цели требует решения следующих задач:: •Изучить состав* и образование дисперсной фазы (Г1ФК) золя водного извлечения чаги, используя химические, физические и биотехнологические методы, и на основании полученных результатов- обосновать структурную организацию мицелл ПФК/меланина чаги.

•Представить теоретическое обоснование процесса реструктурирования сложного гидрофильного золя: водного извлечения- чаги: при- применении: химических, физических воздействий, а также, ферментативного гидролиза;.

•Определить связь антиоксидантной- активности и; состава1 биологически активных веществ различных классов соединений, находящихся1 в золе в свои бодном или слабосвязанном с дисперсной фазой состоянии, с размерами частиц дисперсной фазы и их структурой.

•Изучить состав веществ фильтрата, получаемого после выделения ПФК из водного извлечения чаги.

•Разработать способы получения высокодисперсных коллоидных систем на основе водного извлечения чаги, способных обеспечить биологическую безопасность организма человека.

•Разработать комплексный подход к извлечению из сырья ПФК/меланина и других биологически активных соединений, заключающийся в получении нескольких высокоэффективных препаратов на основе водного извлечения чаги, а также спиртовых экстрактов из шрота, остающегося после получения водных извлечений.

Методы исследований. Для изучения компонентов золя водного извлечения чаги и полученных на его основе объектов исследования использован широкий спектр современных методов, который соответствует современному состоянию науки, и действующей нормативно-технической документации. Применены современные методы исследования - различные виды, хроматографии, электрофорез, потенциометрия, ИК-спектроскопия, ЭПР, ЯМР релаксации, РСА, электронная спектроскопия, кондуктометрия, фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС), методы химического и физико-химического анализа, а также стандартные методики определения физико-химических характеристик получаемых извлечений, экстрактов и выделяемых соединений.

Результаты измерений и исследований обрабатывались с применением методов математической' статистики с использованием пакета программ STATISTICA 6.0.

Научная новизна работы. Разработан комплексный подход к исследованию водного извлечения'чаги как сложно организованной коллоидной системы.

С помощью химических, физических и биотехнологических методов получены и исследованы коллоидные системы водного извлечения чаги, отличающиеся от природных составом, физико-химическими свойствами и антиоксидантной активностью.

Полученные высокодисперсные коллоидные системы и ПФК/меланин отличаются от коллоидной системы водного извлечения чаги более высокой антиоксидантной активностью.

Установлены закономерности связи антиоксидантных свойств ПФК/меланина с его структурой и размером частиц.

Впервые установлено, что фильтрат, полученный после выделения ПФК с помощью хлористоводородной кислоты, является высокодисперсной коллоидной системой, что позволяет получить ПФК с антиоксидантной активностью в четыре раза выше, чем ранее выделенный ПФК.

Показано, что в золе водного извлечения чаги и фильтрате (после удаления из него ПФК), в свободном и слабосвязанном состоянии с их дисперсными фазами находятся биологически активные соединения белковой,' углеводной, липидной и фенольной природы, отличающиеся по составу и количеству.

Впервые установлено, что разделение хромогенов водного извлечения чаги для получения отрицательно и положительно заряженных фракций, подвижных в электрическом поле, происходит при применении электрофореза.

Впервые доказано, что на основе сырья чаги можно получить ряд высокоэффективных антиоксидантов и экстрактов с максимальным извлечением биологически активных веществ и ПФК из сырья.

Теоретическая значимость работы. На основании полученных данных и современных теоретических воззрений скорректированы и развиты научные представления о структурной организации высокодисперсной природной коллоидной системы. Разработаны и обоснованы методологические основы по реструктурированию коллоидной системы водного извлечения чаги для изменения её дисперсной фазы и увеличения антиоксидантных свойств ПФК.

Практическая ценность работы. Получены физико-химические характеристики водных извлечений чаги, ПФК/меланина, позволяющие выявить особенности их структурной организации.

Разработаны способы экстракции чаги с применением комплексонов и гидроокиси натрия, которые позволяют получить ПФК, превышающие по антиоксидантной активности ПФК, полученные по традиционным технологиям.

Показана возможность стандартизации лекарственных препаратов на основе чаги по антиоксидантной ёмкости извлечений из чаги и ПФК.

Определён качественный состав и количество белка, углеводов, липидов и фенольных соединений, находящихся в золе водного извлечения чаги и фильтрате (после удаления из него ПФК) в свободном и слабосвязанном с дисперсными фазами состоянии, способных обеспечить их терапевтическую эффективность.

Разработаны способы обработки водного извлечения чаги органическими растворителями, позволившие получить высокодисперсные коллоидные системы и ПФК/меланин с антиоксидантными свойствами, превышающими указанные свойства у водных извлечений чаги и ПФК.

Разработаны способы комплексной переработки сырья с получением высокоактивных антиоксидантов и повышенным выходом биологически активных веществ и ПФК/меланина.

Реализация результатов. Полученные результаты могут быть реализованы на предприятиях фармацевтической, пищевой и косметической промышленности, что позволит значительно расширить ассортимент высокоэффективных препаратов для медицины, продуктов функционального назначения, космецевтических средств, и обеспечит биологическую безопасность населения.

На защиту выносятся: результаты исследования сырья, водных извлечений- чаги и ПФК с применением различных методов;

- разработка способов экстракции чаги, в том числе с применением гидроокиси натрия, комплексонов, ферментов класса гидролаз, а также способы экстракции шрота, остающегося после проведения экстракции чаги водой;

- экспериментальные данные исследований протеолиза водного извлечения чаги in vitro ферментами желудочно-кишечного тракта; разработка способов и полученные результаты по обработке золя водного извлечения чаги органическими растворителями;

- экспериментальные данные по выделению ПФК с применением хлористоводородной кислоты и спиртового раствора щелочи;

- закономерности изменения антиоксидантных свойств, а также количественного и качественного состава биологически активных веществ различных классов соединений, находящихся в золе водного извлечения чаги или фильтрате (после удаления ПФК) в свободном или слабосвязанном с их дисперсной фазой состоянии, в зависимости от способа получения золя или его обработки органическими растворителями;

- результаты разделения хромогенов водного извлечения чаги с применением зонального электрофореза;

- теоретические представления о структурной организации золя водного извлечения и его дисперсной фазы.

Личный вклад автора состоит в постановке цели и задач исследований, выборе объектов и методов исследований, непосредственном участии в проведении основных экспериментов, систематизации и интерпретации полученных результатов, формулировании научных положений и выводов. Вклад автора является решающим во всех разделах работы.

Автор выражает благодарность профессорам B.C. Гамаюровой, Ф.Г. Ха-литову, Г.К. Будникову, доценту КГУ Г.К Зиятдиновой и другим соавторам за помощь в выполнении работы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались и обсуждались на: II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань 2002 г.); 7-ой и 8- ой Пущинских школах -конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI (Пущино 2003 г. и 2004 г); XVII и на XVIII Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Казань 2003 г., Москва 2007 г.); Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» ( Алматы 2003 г.); III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов 2004 г.); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов 2004 г.); II и III Всероссийских конференциях «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул 2005 и 2007 г.г.); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006 г.); конференциях молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань 2002 - 2008 г.г.). Основные результаты работы изложены в 17 статьях, в том числе в 15 рекомендованных ВАК, 46 публикациях по материалам конференций, 4 патентах на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, библиографического списка и приложения. В тексте приведены ссылки на 369 литературных источника. Работа изложена на 293 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков, 53 таблицы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что водные извлечения чаги относятся к высокодисперсным коллоидным системам. Диаметр частиц дисперсной фазы составляет: для крупных мицелл - 120-320нм (с колебаниями от 100 до 400нм), для мелких, субмицелл - бОнм (и более мелкие).

2. Показано, что коллоидная система водного извлечения чаги имеет легко перестраивающуюся дисперсную фазу (ПФК/меланин): при разбавлении водного извлечения, смене способа его получения, обработке его с помощью органических растворителей или проведении электрофореза.

3. Установлено, что изменение антиоксидантной активности как коллоидной системы водного извлечения чаги, так и её дисперсной фазы (ПФК) связано: с содержанием в водном извлечении ПФК, размером мицелл ПФК/меланина (при изменении четвертичной структуры), природой соединений, входящих в его состав, а также количеством и природой ПМЦ в ПФК/меланине (при изменении вторичной структуры).

4. Показано, что изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги при применении в экстракции комплексонов ОДФК, трилона Б, а также гидроокиси натрия позволяет повысить антиоксидантную активность получаемых ПФК в 3, 1,5 и 1,4 раза по сравнению с антиоксидантной активностью ПФК, выделенного из водного извлечения чаги.

5. Применение в экстракции чаги микробиологических ферментных препаратов, содержащих гидролазы некрахмалистых полисахаридов, изменяет дисперсионную среду образуемых золей, способствуя формированию более крупных мицелл ПФК (R-эфф около 100-125нм) и большего количества субмицелл по сравнению с водным извлечением чаги(ЯЭфф около 60 - ЮОнм). ПФК, выделенные из этих коллоидных систем, обладают низкой антиоксидантной активностью (18,63 и 17,62 кКл/100 г ПФК) в сравнении с ПФК, полученным из водного извлечения чаги (29,61 кКл/100 г ПФК).

6. Применение разработанной методики для изучения протеолиза в коллоидной системе водного извлечения чаги (in vitro) показало, что под действием ферментов желудочно-кишечного тракта происходит деградация белка. Это приводит к формированию наноразмерных мицелл ПФК(ЯЭфф=50 нм) и мелких субмицелл (8нм), что обеспечивает высокую терапевтическую эффективность водных извлечений чаги.

7. Установлено, что коллоидные системы с наноразмерными мицеллами ПФК (11Эфф = 58 нм - 96 нм), полученные на основе водного извлечения чаги после его обработки органическими растворителями (петролейный эфир и этилацетат) имеют более высокую аитиоксидантную активность по сравнению с водным извлечением чаги (в два - пять раз), а также более низкую токсичность. Антиоксидантная активность ПФК, выделенных из этих коллоидных систем, в среднем в два раза превышает эту характеристику для ПФК водного извлечения чаги.

8.Установлено, что фильтрат (после осаждения ПФК хлористоводородной кислотой) является высокодисперсной коллоидной системой, дисперсную фазу которой можно выделить с помощью спиртового раствора щёлочи, а полученный из него ПФК имеет аитиоксидантную активность в четыре раза выше, чем ПФК, выделенный из водного извлечения с помощью хлористоводородной кислоты.

9. Определён состав веществ, находящихся в золе водного извлечения чаги и фильтрате в свободном и- слабосвязанном с дисперсной фазой золя состоянии. Показано присутствие биологически активных липидов (стерины и их эфиры, моно- и полиненасыщенные высшие жирные кислоты, витамины К и Е, кофермент Q, глико- и фосфолипиды), терпенов (азулены и иридоиды), и фенольных соединений (фенолкарбоновые кислоты, фенолы и флавоноиды). Состав этих веществ в водном извлечении чаги и фильтрате различен.

10. Разработаны способы получения спиртовых экстрактов: из шрота, обеспечивающие дополнительный выход ПФК (6%), а также углеводов и фенольных соединений. Антиоксидантная активность экстрактов не уступает этой характеристике спиртовых экстрактов из чаги, выпускаемых фармацевтической промышленностью.

11. Разработан комплексный подход к переработке сырья чаги с получением нескольких продуктов, обладающих высокой антиоксидантной активностью.