Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Состав и свойства тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений Inonotus obliquus

На правах рукописи

мУ/

никитина светлана александровна

состав и свойства тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений ичогютив овыдиив

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

8 АПР 2015

005567019

Казань-2015

005567019

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Сысоева Мария Александровна

Официальные оппоненты: Катаев Владимир Евгеньевич

доктор химических наук, профессор, ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, в.н.с. лаборатории фосфорсодержащих аналогов природных соединений

Зиятдинова Гузель Камилевна

кандидат химических наук, ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», доцент кафедры аналитической химии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пермская государственная

фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится 29 мая 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» и на сайте kstu.ru.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, КНИТУ, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.080.07 и по e-mail: gulia_nn@yahoo.com

Автореферат разослан &исцАГд^ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета --—' Нугуманова Гульнара Наиловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время на основе водных извлечений чаги (1попоШ оЬПдиш) фармацевтические предприятия выпускают препараты, терапевтическая эффективность которых обусловлена наличием хро-могенного комплекса - меланина, обладающего широким спектром биологической активности.

Исследования последних десятилетий показывают, что в биологическую активность, проявляемую экстрактами и лекарственными средствами на основе чаги, значительный вклад вносят тритерпеноидные и стероидные соединения. Содержание их в грибе составляет не более 0,8% от сухих веществ и представлены они ланостеролом, его многочисленными производными, а также эргостеролом. Большинство данных соединений проявляет выраженные противоопухолевые, противовоспалительные, противовирусные и иммуномодулирующие свойства как при испытании индивидуальных соединений, так и суммарных водных и органических экстрактов.

В водном извлечении тритерпеноидные и стероидные соединения находятся в связанном или слабосвязанном с меланином состоянии. Однако до сих пор их состав и содержание в шроте и меланине чаги не исследованы, нет данных о вкладе этих соединений в биологическую активность меланина. Исследование данных соединений в сырье, шроте и меланине является актуальным для создания на их основе новых эффективных лекарственных средств, которые будут обладать высокой активностью и специфичностью действия. Кроме того, перспективно исследование распределения тритерпе-ноидных и стероидных соединений в сырье, меланине и шроте чаги. Полученные данные позволят в дальнейшем разработать методики стандартизации лекарственных средств и биологически активных добавок, разработанных на основе чаги.

Цель работы. Разработать комплексный подход для определения количественного и качественного состава тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений в сырье, меланине и шроте чаги, выявить фракции, обладающие противоопухолевой и антиоксидантной активностью, для разработки на их основе эффективных лекарственных средств.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- разработать способы экстракции сырья, меланина и шрота чаги для максимального извлечения из них тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений;

- провести поэтапное разделение веществ полученных экстрактов для определения их состава;

- определить возможность использования фракций меланина чаги, полученных после экстракции меланина петролейным эфиром;

- выявить наиболее перспективный экстракт, содержащий максимальное количество тритерпеноидных и стероидных соединений, разработать метод анализа в нем тритерпеноидных и стероидных соединений, определить его биологическую активность и на основании полученных результатов разработать нормы качества.

Научная новизна работы. Впервые разработанный комплексный подход к исследованию тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений позволил: увеличить их выход, определить их содержание в сырье, шроте и меланине, а также уточнить их качественный состав.

В шроте впервые идентифицированы инотодиол, траметеноловая кислота, 22,25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол, ланостерол, 3-гидроксиланоста-8,24-диен-21 -аль, ланоста-8-ен-3,22,24-триол, 25-метокси-21,22-цикло-ланоста-8-ен-3,21 -диол, 3,22-дигидроксиланоста-8,23 -диен-25-пероксид, 3-гидроксиланоста-8,24-диен-21,23-лактон, 3,25-дигидрокси-ланоста-8-ен-

20.24-олид, 3-гидрокси-5-холен-24-овая кислота.

В меланине чаги впервые идентифицированы траметеноловая кислота,

22.25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол, 3-гидроксиланоста-8,24-диен-21-аль, ланоста-8-ен-3,24,24-триол, 25-метокси-21,22-циклоланоста-8-ен-3,21 -диол, 3,22-дигидроксиланоста-8,23-диен-25-пероксид, 21,24-циклопенталаноста-3,21,25-триол-8-ен, ланоста-8,24-диен-3,11-диол, 21,22-циклоланоста-8-ен-3,21-диол ацетат, производное ланостерола с м.в. 441, З-гидрокси-5-холен-24-овая кислота, 4-холестен-7-ол, холеста-5,24-диен-3-ол, холестерол, 24-метиленхолестерол (халинастерол), 5-холестан-З-ол; углеводороды: насыщенные - С14Н42, С2оН42, С2зН48- С31Нб4, С34Н70, С35Н72, С37Н76, изопреноид-ные - пристан и фитан, полициклические - холестан, эргостан, кампестан, стигмастан или ситостан, гопан, олеанан.

Впервые проведено разделение меланина чаги с использованием петро-лейного эфира с получением двух фракций, отличающихся друг от друга физико-химическими свойствами.

Практическая ценность работы. Впервые обоснована возможность использования фракций меланина, полученных после его экстракции петро-лейным эфиром, в качестве субстанций для дальнейшей разработки на их основе лекарственных средств с антиоксидантными свойствами.

Разработан способ получения петролейного экстракта из шрота, который содержит до 85% тритерпеноидных и стероидных соединений (Липофит чаги), перспективный для разработки на его основе лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием.

Разработана методика количественного определения тритерпеноидных соединений в сырье чаги и лекарственных средствах на его основе, которая может быть использована для их стандартизации.

Разработаны нормы качества на субстанцию Липофит чаги.

Новизна способов получения меланина и фракций липофильных веществ из чаги подтверждена патентами на изобретения (Пат. №2522952, №2523414 и №2530636), и заявкой на изобретение (№2014126328 от 27.06.2014).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены на кафедре Пищевой биотехнологии ФГБОУ ВПО «КНИТУ» в учебный процесс бакалавров, обучающихся по направлению «Биотехнология» -дисциплина «Физико-химические методы анализа биологически активных веществ», магистров, обучающихся по профилю «Бионанотехнология» -дисциплина «Бионанотехнология в фармации и медицине», и использованы в научных исследованиях при выполнении специалистами и магистрами выпускных квалификационных работ.

На защиту выносятся: положения, сформулированные в разделах научная новизна работы и в выводах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на: Международной конференции молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2008г., 2010г., 2012г., 2014г.), IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010г.), VI Всероссийской научно-технической конференции «Интенсификация тепло-и массообменных процессов в химической технологии» (Казань, 2010г.), I Всероссийском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011г.), III Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011г.), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011г.), II Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых веществ и материалов» (Сыктывкар, 2012г.), V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012г.), Всероссийской конференции «Современные проблемы химической науки и образования» (Чебоксары, 2012г.), XIII Международной научно-технической интернет-конференции «Актуальные проблемы лесного комплекса» (Брянск, 2012г.), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиомате-риалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 2 статьях в изданиях, рекомендованных ВАК для размещения материалов диссертаций, 15 публикациях по материалам конференций, 3 патентах на изобретение.

Личный вклад автора. Весь теоретический и экспериментальный материал, положенный в основу диссертационной работы, получен, обработан и проанализирован автором самостоятельно. Вклад автора заключается также в непосредственном участии в постановке задач, формулировании выводов, написании и оформлении статей.

Часть результатов работы получена в совместных исследованиях, проведенных на оборудовании ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) феде-

ральный университет»: газожидкостная хроматография (ГЖХ) и хромато-масс-спектрометрический (ГХ/МС) анализ углеводородов совместно с зав. лабораторией Носовой Ф.Ф., определение антиоксидантной активности (АОА) образцов в сотрудничестве с к.х.н. Зиятдиновой Г.К., определение противоопухолевой активности в НОЦ Фармацевтики совместно с Штыр-линым Ю.Г. и Иксановой А.Г. В ЦКП ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН проведены ГХ/МС тритерпеноидных и стероидных соединений совместно с к.х.н. Ризвановым И.Х., фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС) совместно с д.х.н. Захаровой Л.Я. В ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздрава России» проведен ВЭЖХ-анализ в сотрудничестве с д.х.н. Мельниковой Н.Б. В ЦКП ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» определен элементный состав меланинов рентгенофлуоресцентным методом (РФА) совместно с д.х.н. Юсуповым Р.А, микроснимки меланина методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) сделаны в сотрудничестве с к.х.н., зав. лабораторией Низамеевым И.Р. В ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» определена общая токсичность образцов в сотрудничестве с д.б.н. Тремасовым М.Я.

Автор выражает благодарность соавторам за консультации и помощь в проведении экспериментов, а также куратору доценту кафедры ПищБТ КНИТУ, к.х.н. Хабибрахмановой В.Р. за помощь в проведении исследовательской работы.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка, приложений. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 34 таблицы и 172 литературных источника.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках г/елевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» по Госконтракту №01201252915 от 28.02.2012; Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по федеральной программе «УМНИК» по Госконтракту №11717р/17263 от 05.04.2013 и по Договору № 3108ГУ2/2014 от 05.08.2014, тема НИОКР «Разработка способа создания биологически активных добавок на основе меланина чаги».

Основное содержание работы

В первой главе представлен обзор литературы. Обобщены данные по качественному составу тритерпеноидных и стероидных соединений чаги и методам их исследования. Рассмотрена фармакологическая активность тритерпеноидных и стероидных соединений чаги. Приведены физико-химические свойства меланина и методы его исследования. Обоснована

актуальность исследования тритерпеноидных и стероидных соединений сырья, меланина и шрота чаги. Показана перспектива разработки на их основе лекарственных средств.

Во второй главе изложена экспериментальная часть работы. Приведены характеристики сырья, водных извлечений, меланинов и шрота, полученных в лабораторных условиях, а также шрота, полученного с предприятия «Татхимфармпрепараты» (г. Казань). Описаны разработанные способы извлечения тритерпеноидных и стероидных соединений из сырья, меланина и шрота чаги, а также разработанные и стандартные методы их анализа.

В работе для идентификации тритерпеноидных и стероидных соединений в качестве стандартов использованы ланостерол (№S446793-1EA Sigma-Aldrich), эргостерол (№117810050 Acros Organics), сквален (№S3626-10ML Sigma-Aldrich). AOA объектов исследования определена кулонометриче-ским методом на потенциометре «П-5827 М». ФКС применена для определения размера частиц меланина и проведена с помощью «PhotoCor Complex» Для ГХ/MC использованы приборы «TurboMass Gold» и «GCMS 2010 Plus». Исследование ВЭЖХ осуществляли на хроматографе «Shimadzu LC-Ю». Качественный элементный состав меланинов проанализирован на СУР-02 «Реном ФВ». ГЖХ углеводородов проводили на хроматографе «Кристалл 2000М». Оценка общей токсичности проведена в соответствии с ГОСТ Р 52337-2005, противоопухолевая активность исследована в проли-феративном МТТ-тесте в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) на клетках MCF-7 (АТСС, США).

Результаты проведенных экспериментов обработаны с помощью программы «Statistica 6.0» (п=3-8, р=0,95).

В третьей главе приведено обсуждение полученных результатов.

Выделение тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений из сырья, меланина и шрота чаги.

Извлечение тритерпеноидных. стероидных и сопутствующих им соединений из сырья и шрота чаги. Экстракцию сырья и шрота проводили петро-лейным эфиром с tKHn=40-60 °С, при этом изменяли продолжительность процесса экстракции, степень измельчения сырья и шрота, соотношение сырья или шрота и экстрагента (табл. 1).

Установлено, что степень измельчения сырья и шрота не оказывает существенного влияния на выход тритерпеноидных и стероидных соединений. Оптимальные результаты были достигнуты при экстракции сырья и шрота в течение 1 ч при соотношениях сырье:экстрагент 1:50 и шрот:экстрагент 1:60. Эти условия позволяют преимущественно экстрагировать тритерпено-идные и стероидные соединения.

Показано, что из сырья и шрота экстрагируется примерно одинаковое количество липофильных веществ. Причем, чем больше липофильных ве-

ществ извлекается из анализируемых объектов, тем ниже в них доля тритер-пеноидных и стероидных соединений. Аналогичная зависимость наблюдается также для других природных объектов [Гальцова Р.Д. Стеринообразо-вание у дрожжевых организмов. М: Наука, 1980, 224 е.]. Максимальное количество тритерпеноидных и стероидных соединений извлекается из шрота и, следовательно, шрот чаги является перспективным источником для получения этих соединений.

Таблица 1

Содержание экстрактивных веществ, тритерпеноидных и стероидных соединений в экстрактах, полученных из сырья и шрота_

Соотношение Время, Содержание, %

объект:экстра Объект экстрактивных тритерпеноидных и

гент веществ* стероидных соединений**

1 сырье 0,47±0,09 13,18±0,36

1:50 шрот 0,31 ±0,03 15,33±0,20

2 сырье - -

шрот 0,38±0,08 15,00±0,20

1:60 1 сырье 0,20±0,05 15,75±0,13

шрот 0,35±0,04 41,60±0,15

1:70 1 сырье 0,36±0,04 14,55±0,16

шрот 0,40±0,02 32,74±0,10

1 сырье - -

1:100 шрот 0,57±0,05 10,50±0,15

2 сырье - -

шрот 1,18±0,05 2,20±0,10

Примечание:* - от массы сырья или шрота; ** - от суммы экстрактивных веществ.

Извлечение тритерпеноидных. стероидных и сопутствующих им соединений из меланина. При экстракции сырья водой липофильные вещества ассоциируются в меланине. Разработан эффективный способ максимального извлечения тритерпеноидных и стероидных соединений из меланина, подтвержденный патентом РФ №2522952. Экстракцию меланина проводили петролейным эфиром, изменяли продолжительность и температуру проведения процесса, влажность используемого меланина. Наилучшие результаты получены при экстракции меланина с влажностью 90±2 % при температуре 37±2 °С в течение 3 ч. В зависимости от партии сырья чаги, взятой на исследование, можно извлечь от 2 до 10 % тритерпеноидных и стероидных соединений.

В результате экстракции меланина петролейным эфиром получают две фракции: фракция 1 - меланин, выпавший в осадок (89 %), фракция 2 -оставшаяся водная фаза. Содержание в них зольных элементов снижается более чем в 2 раза. Наблюдается различие в АОА меланинов, фракций 1 и 2, полученных из разных партий сырья (таблица 2).

Таблица 2

Аитиоксидантиая активность и зольность меланинов чаги и их фракций

Партия сырья Зольность, %* АОА, кКл/100 г

исходный меланин фракция 1 фракция 2 исходный меланин фракция 1 фракция 2

1 - - - 37,0±1,1 26,9±0,9 27,8±2,0

2 2,60±0,10 1,20±0,30 1,02±0Д5 37,0±2,0 39,9±0,7 38,2±0,3

3 1,50±0,10 0,80±0,10 0,89±0,26 44,0±3,0 64,0±2,0 43,6±0,6

4 3,30±0,20 0,80±0,20 1,27±0,39 41,0±2,0 39,0±3,0 26,7±0,7

Примечание:* - от массы меланина.

Показано, что высокая АОА фракции 1 (партия 3) в сравнении с АОА исходного меланина может быть связана с уменьшением размеров крупных частиц меланинов (методы ФКС и АСМ), а также с увеличением в них доли элементов, проявляющих парамагнитные свойства (метод РФ А).

Предлагается использовать фракции 1 и 2, имеющие высокие АОА и низкую зольность, в качестве субстанций для дальнейшей разработки на их основе лекарственных средств, обладающих антиоксидантными свойствами.

Разделение петролейных экстрактов из сырья, шрота и меланина чаги.

Предварительно в петролейных экстрактах из сырья, шрота и меланина с помощью ТСХ показано присутствие тритерпеноидных и стероидных соединений, углеводородов и восков, высших алифатических альдегидов, высших жирных кислот и алифатических спиртов, три-, ди- и моноглице-ридов, ди- и моноалкиловых эфиров глицерина.

Разделение петролейных экстрактов из сырья и шрота с помощью колоночной и тонкослойной хроматографии. Упаренные досуха экстракты перерастворяли в этаноле, разделение проводили методом колоночной хроматографии, а отнесение веществ в пробах с помощью ТСХ. Установлено, что в сырье и шроте преобладают тритерпеноидные и стероидные соединения — соответственно 56 и 73 %. Сопутствующие соединения представлены углеводородами и восками (26,89 % и 3,13 %), высшими жирными кислотами и алифатическими спиртами (1,29 и 0,19 %), ацилглицеридами и эфирами глицерина (7,6 и 9 %), а также моно- и сесквитерпенами (5,54 и 13 %). Разное содержание тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих соединений подтверждает различия в их доступности в объектах исследования. Кроме того, вероятно, сопутствующие соединения из сырья переходят в водное извлечение чаги и участвуют в формировании его дисперсной фазы — меланина, что объясняет их низкое содержание в шроте. С помощью ТСХ в экстракте из шрота показано 14 тритерпеноидных и стероидных соединения, а в экстракте из сырья - 9 соединений, среди которых обнаружены ла-ностерол, инотодиол и траметеноловая кислота.

Разделение петролейного экстракта из меланина с помощью колоночной и тонкослойной хроматографии. При растворении сконцентрированного петролейного экстракта меланина в этаноле получены два объекта исследования: осадок - объект А (3,5 % от экстрактивных веществ) и оставшаяся часть - объект Б (96,5 %).

Объект исследования А. В объекте А с помощью ТСХ обнаружено до 12 тритерпеноидных и стероидных соединений. При использовании стандартов и по литературным значениям Rf идентифицированы сквален, ланостерол. 3-гидрокси-8,24-диен-ланоста-21,23-лактон, 3,22-дигидроксиланоста-8,23-диен-25-пероксид, 3,22,25-тригидрокси-ланоста-8,23-диен, 21,24-цикло-пенталаноста-3,21,25-триол-2-ен, инотодиол, траметеноловая кислота. Специфическая окраска пятен говорит о наличии в объекте исследования А также моно- и сесквитерпенов.

Объект исследования Б. Для разделения веществ объекта Б применен метод колоночной хроматографии в тех же условиях, что и при разделении экстрактов из сырья и шрота. В полученных пробах с помощью ТСХ были определены тритерпеноидные и стероидные соединения (7,60 %), сопутствующие соединения: углеводороды и воски (41,5 %), жирные кислоты и алифатические спирты (8,15 %), ацилглицериды и эфиры глицерина (5,05 %). Использование ВЭЖХ позволило показать в объекте Б присутствие моно- и сесквитерпенов, лактонов и других сопутствующих соединений (23 %). Содержание тритерпеноидных и стероидных соединений в нем в 7 и 9,5 раз ниже по сравнению с количеством этих соединений в экстрактах из сырья и шрота. При этом преобладают углеводороды и воски, что подтверждает высказанное ранее предположение об участии этих соединений в формировании частицы меланина.

Определение состава тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений в сырье, шроте и меланине методом ГХ/МС.

Состав углеводородов. Их исследование представляется интересным, поскольку они составляют большую часть экстрактивных веществ в экстрактах из сырья и меланина и вероятно, играют большую роль в проявлении меланином его физико-химических и биологических свойств. Ранее в чаге были обнаружены нормальные алканы Ci5H32 - С19Н40, C2iH44, С22Н46, C32H66, С36Н74 [Mazurkiewicz W. [and others] // Acta Pol. Pharm., 2010, V.67, 1.4, P. 397-406; Sun Y. [and others] // Int. J. of Med. Mush., 2011, V.13, 1.2, P. 121130]. Проведенный ГЖХ-анализ позволил выявить, что алканы представлены спектром гомологов состава Ct4-C4o. В экстракте из сырья преобладают С28Н58-Сз5Н72, в меланине преобладают С24Н50,-С26Н54. Показано наличие незначительного количества насыщенных углеводородов изостроения в сырье (i-C26-C38) и в меланине (i-C22-C34). Углеводороды в природных объектах входят в состав воскоподобных и смолообразных композиций и выполняют функцию защитных барьеров.

Впервые в меланине чаги обнаружены изопреноидные углеводороды -приетан С19Н40 и фитан С2оН42. Фитан является производным самого распространенного в природе изопреноидного спирта фитола, входящего в состав хлорофилла. С помощью ГХ/МС в меланине обнаружены полициклические углеводороды - стераны и терпаны. В составе стеранов найдены холестан С27, эргостан С28, кампестан С28, стигмастан или ситостан С29 (пики 1, 2, 3 и

4 соответственно, рис. 1), в составе терпанов - гопан С29 и олеанан Сзо (пики

5 и 6, рис. 1).

Стераны и терпаны образуются в результате потери стероидными и тер-пеноидными соединениями удлиненной боковой цепи, а также функциональных групп в результате естественных метаболитических процессов.

! 2 б

Рисунок 1 - Масс-хроматограммы углеводородов в меланине по фрагментарным ионам: а) для стеранов m/z 217; б) для терпанов m/z 191

Состав тритерпеноидных и стероидных соединений. Полученные с помощью ГХ/МС данные о составе фракций после разделения экстрактов из сырья, шрота и объекта Б колоночной хроматографией, а также объекта А представлены на рисунках 2-5 и таблицах 3-6.

В составе фракции, полученной из сырья (таблица 3), обнаружено 13 тритерпеноидных и стероидных соединений сырья соединений, из них ла-ностерол, инотодиол, траметеноловая кислота идентифицированы ранее с помощью ТСХ.

В шроте кроме найденных в петролейном экстракте из сырья соединений 3-гидрокси-5-холен-24-овой кислоты, инотодиола, ланостерола, ино-нотсуоксида и траметеноловой кислоты (пики 4, 5, 6, 7, 8 соответственно, рисунок 3) выявлены соединения, которые представлены в таблице 4.

(я I РОД) СЮ) ,5 ГПС

4,0 3.5

9 ^

6° на-^^Г"

5.7 «

10<*| н

1

1ц ■![.. ¿1, >.

Я1?.?.

. к»

Д,

-г-

253 300 250 400 450

Рисунок 2 - Хромато-масс-спектральные характеристики тритерпеноидных и стероидных соединений, полученных из сырья: А - хроматограмма; Б - масс-спектр соединения с временем удерживания 20,57 мин (пик 11)

дат

у*.

Таблица 3

Состав тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений в

Пик Соединение Брутто-формула % М+ т/г

5 холестан С27Н48 2,08 372

6 3-гидрокси-5-холен-24-овая кислота С24Н38О3 3,53 374

7 производное холестерола С27Н4бО 4,00 398

8 холестерол с27н46о 3,06 385 (М-1)

9 инотодиол С10Н,пО, 2,18 442

10 траметеноловая кислота С30Н48ОЗ 4,60 456

11 22,25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол С30Н50ОЗ 59,59 458

12 ланостерол С30Н50О 2,94 426

13 лупеол С30Н50О 4,39 426

1 гексадекан С16Н34 1,35 226

2 октадекан С18Н38 1,25 254

3 эйкозан С20Н42 1Д4 282

4 пентакозан С25Н52 1,08 352

Рисунок 3 — Хромато-масс-спектральные характеристики тритерпеноид-ных и стероидных соединений, полученных из шрота: А - хроматограмма; Б - масс-спектр соединения с временем удерживания 22,37 мин (пик 9)

Таблица 4

Состав тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений в экстрактах, полученных из шрота_

Пик Соединение Брутто-формула % М+

3 стигмастан С29Н52 1,00 400

9 3 -гидроксиланоста-8,24-диен-21-аль СзоН4802 18,97 440

10 ланоста-8-ен-3,22,24-триол С30Н50О3 25,47 458

11 3,25-дигидроксиланоста-8-ен-20,24-олид СзоН4804 4,90 472

12 3 -гидроксиланоста-8,24-диен-21,23-лактон СзоН4бОз 4,87 454

13 3,22-дигидроксиланоста-8,23-диен-25-пероксид СзоН5004 6,07 472

14 25-метокси-21,22-циклоланоста-8-ен-3,21 -диол С31Н52О3 8,17 472

1 пальмитиновая кислота С,5Н31СООН 2,30 256

2 стеариновая кислота С,7Нз5СООН 2,88 284

5Д 7^5 10,0 12,5 15,0 17,5 20.0 ¿',5 25,0 27,5 30,11 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5

А

Рисунок 4 - Хромато-масс-спектральные характеристики тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений объекта А: А- хроматограмма; Б - масс-спектр соединения с временем удерживания 42,78 мин (пик 17)

Таблица 5

Состав тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений, определенных в объекте А____

Пик Соединение Брутто-формула % М+

6 холеста-5,24-диен-3-ол С27Н44О 19,00 383 (М-1)

7 5-холестан-3-ол с27н460 1,00 386

8 4-холестан-7-ол с27н460 1,00 386

9 производное эргостерола - 1,00 409

12 производное ланостерола - 1,00 441 (М-1)

16 бетулин С30Н50О2 2,00 442

1 эйкозан С2оН42 16,00 282

2 докозан С22Н46 14,00 311

3 тетракозан С24Н5о 3,00 338

4 6-(1-гидроксиэтил)-2-метокси-2,4,6-циклогептатриен-1 -он С10Н12О3 1,00 358

5 пентакозан С25Н52 2,00 352

2, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, О. О, О,

Рисунок 5 - Хромато-масс-спектральные характеристики тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений объекта Б: А - хроматограм-ма; Б - масс-спектр соединения с временем удерживания 20,23 мин (пик 26)

Таблица 6

Состав тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений, определенных в объекте Б_

Пик Соединение Брутто-формула % М+

21 халинастерол с28н46о 1.00 398

23 ланоста-8,24-диен-3.11-диол СзоН4802 1,00 440

30 21,22-циклоланоста-8-ен-3,21-диол ацетат с32н48о4 1,00 460

1 каириновая кислота с9н19соон 0.30 172

2 додеканол с12н25он 0.30 186

3 лауриновая кислота СпН23СООН 2.50 200

4 тридеканол С13Н27ОН 0.30 200

5 миристииовая кислота С|3Н27СООН 0.70 228

6 молекулярная сера 58 2.00 256

7 пентадеканол С14Н31ОН 2.00 228

8 нонадеканол С19Н390Н 2.00 284

9-16 эйкозан - дотриаконтан (четное число атомов С) С2оН42- С32Н6б 52,50 282-450

18 тетратриаконтан С34Н70 5,90 479

А

%

В объекте А кроме соединений, обнаруженных ранее в сырье и шроте (ланостерол, 21,24-циклопенталаноста-3,21,25-триол-8-ен, инотодиол, 22,25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол, траметеноловая кислота - соответственно пики 10, 11, 13, 14, 15, 17 на рисунке 4), обнаружены соединения, представленные в таблице 5.

В объекте Б состав тритерпеноидных и стероидных соединений шире, чем в объекте А. В нем также присутствуют ланостерол, 21,24-циклопента-ланоста-3,21,25-триол-8-ен, инотодиол, 22,25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол, траметеноловая кислота, бетулин (пики 22, 25, 26, 27, 29, 31 соответственно на рис. 5). Дополнительно обнаружены, как и в экстракте из сырья, 3-гидрокси-5-холен-24-овая кислота (пик 17), холестерол (пик 19), а также соединения, которые представлены в таблице 6.

Тритерпеноидные и стероидные соединения составляют основную часть экстрактивных веществ сырья и шрота, около 56 и 73 % соответственно, а в меланине только около 11 %. Из них на ланостановую группу соединений приходится 39 % в сырье, 65 % в шроте и 6 % в меланине.

Стероидные соединения занимают соответственно в сырье, шроте, меланине примерно 5,4, 3,5 и 1,3 % от экстрактивных веществ.

Пентациклические тритерпены в следовых количествах присутствуют: в экстракте из сырья - лупеол, в меланине - бетулин. В качестве сопутствующих соединений в сырье в следовых количествах присутствуют насыщенные углеводороды. В шроте показаны алифатические кислоты. В меланине обнаружены насыщенные углеводороды, алифатические кислоты и спирты, а также в следовых количествах 6-(1-гидроксиэтил)-2-метокси-2,4,6-циклогептатриен-1 -он.

Разработанный комплексный подход, включающий извлечение тритерпеноидных и стероидных соединений из сырья, меланина и шрота и последовательное их разделение, позволил суммарно определить до 26 соединений этого класса, уточнить их состав, вьмвить сопутствующие им липо-фильные вещества.

Физико-химические характеристики, биологическая активность и нормы качества Липофита чаги.

В состав петролейного экстракта из шрота входит до 50 % соединений, проявляющих противоопухолевую активность, поэтому перспективно разработать на его основе лекарственное средство для терапии онкологических заболеваний. После удаления растворителя из петролейного экстракта из шрота получена сухая субстанция — Липофит чаги. Для анализа основных действующих веществ Липофита чаги разработана методика определения тритерпеноидов изменением пробоподготовки объектов исследования, по сравнению с * заменен экстрагент - диэтиловый эфир на петролейный эфир. Это позволило исключить стадию очистки экстракта от сопутствующих фе-нольных соединений и избежать возможных потерь тритерпеноидов и оце-

нить в объектах исследования их содержание, более близкое к реальному (табл. 7).

Таблица 7

Сравнение количества тритерпеноидов, определенного по разработанной и воспроизведенной литературной методикам_

Объект Содержание тритерпеноидов, % от экстрактивных веществ объекта

по воспроизведенной методике* по разработанной методике

Бефунгин 8,73±0,56-28,6±1,45 18,6±0,99 - 61,9±3,01

Сырье 4,7±0,16 - 33,0±0,20 40,0±2,55 - 53,1±0,62

* - Жукович E.H. // Химико-фармацевтический журнал, 2010, №3, С. 35-37.

Как показано в табл. 7, разработанная методика позволяет определить в среднем в 2 раза больше тетрациклических тритерпеноидов в препарате чаги «Бефунгин» и до 10 раз больше - в сырье чаги (подана заявка на изобретение №2014126328). Разработанная методика является универсальной, применима к анализу сырья, извлечений и лекарственных средств на основе чаги, и в таком виде пригодна для стандартизации Липофита чаги. Количество тритерпеноидов, определенное по разработанной методике, в петро-лейном экстракте из сырья составляет 45 % от экстрактивных веществ, из шрота - 85 %, из меланина - 20 %.

При оценке общей токсичности по ГОСТ Р 52337-2005 на инфузориях-стилонихиях (в концентрации 10 мг/мл), мышах (зондовое введение, в концентрациях до 750 мг/кг) и кожной пробе на кроликах (в концентрациях до 40 мг/см2) установлено, что Липофит чаги не токсичен. Исследования in vitro в отношении клеток рака молочной железы человека MCF-7 (АТСС, США) показали высокую цитотоксичность Липофита чаги 1С50 = 7,87 мкг/мл, а при культивировании клеток кожи (фибробласты Hs-68) показана его низкая цитотоксичность в отношении соматических клеток СС50 более 85 мкг/мл.

Полученные данные обобщены, и на их основе разработаны и приведены нормы качества на субстанцию Липофит чаги, в которых основными параметрами стандартизации являются количественное содержание и качественная реакция на тритерпеноидные и стероидные соединения, растворимость.

Таким образом, на основании полученных результатов можно рекомендовать фракции меланина, выделенные после обработки исходного меланина петролейным эфиром, для разработки лекарственных средств, обладающих антиоксидантным действием, а петролейный экстракт, полученный из шрота — Липофит чаги, для разработки противоопухолевого лекарственного средства.

выводы

1. Разработан комплексный подход для исследования тритерпеноидных и стероидных соединений чаги, который позволил: а) уточнить, что в чаге содержится до 0,25 % этих соединений; б) определить их выход в сырье, шроте и меланине чаги - 45, 85 и 20 % соответственно. Из них на ланоста-новую группу соединений приходится 39 % в сырье, 65 % в шроте и 6 % в меланине, а на стероидные соединения соответственно 5, 3,5 и 1,3 %; в) определить состав тритерпеноидных, стероидных и сопутствующих им соединений в шроте и меланине, а также уточнить их состав в сырье.

2. Установлено, что наибольшее количество тритерпеноидов присутствует в меланине - 12 соединений. Впервые определено, что в состав шрота и меланина входят траметеноловая кислота, 22,25-эпоксиланост-8-ен-3,24-диол, 3-гидроксиланоста-8,24-диен-21-аль, ланоста-8-ен-3,22,24-триол, 25-метокси-21,22-циклоланоста-8-ен-3,21 -диол, 3,22-дигидроксиланоста-8,23 -диен-25-пероксид. Кроме того, в шроте впервые показан 3,25-дигидроксиланоста-8-ен-20,24-олид, а в меланине - 21,24-цик-лопенталаноста-3,21,25-триол-8-ен, ланоста-8,24-диен-3,11-диол, 21,22-ци-клоланоста-8-ен-3,21-диол ацетат.

3. Установлено, что наибольшее количество стероидов присутствует в меланине - 7 соединений. Впервые в составе шрота идентифицированы 3-гидрокси-5-холен-24-овая кислота и стигмастан, в меланине З-гидрокси-5-холен-24-овая кислота, 4-холестен-7-ол, холеста-5,24-диен-3-ол, 5-холестан-3-ол, халинастерол.

4. Установлен состав веществ, сопутствующих тритерпеноидам и стероидам. Показано, что основная их часть представлена насыщенными углеводородами. Впервые обнаружены С14Н42, С20Н42, С2зН48- С31Н64, С34Н70, С35Н72, С37Н76. В меланине впервые идентифицированы изопреноидные углеводороды — пристан и фитан, полициклические - холестан, эргостан, кампестан, стигмастан или ситостан, гопан, олеанан.

5. Показана возможность разработки новых лекарственных средств с высокой АОА и низкой зольностью на основе фракций, полученных после экстракции меланина петролейным эфиром.

6. Получена субстанция — Липофит чаги, обладающая противоопухолевым действием и содержащая до 85 % тритерпеноидных и стероидных соединений. Для нее разработаны методика количественного определения тритерпеноидов, а также нормы качества.

Публикации в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертаций 1. Никитина, С.А. Исследование золя водных извлечений чаги. XIV. Количественный и качественный состав липидных веществ водного извлечения чага / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. -Т.15, №18. -С.217-219.

18

2. Никитина, С.А. Исследование меланина чаги. I. Липофильные вещества меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // Химия рас-ти-тельного сырья. - 2014. -№3. - С. 185-191.

Патенты на изобретения

3. Пат. 2522952 Российская Федерация МПК8 А61К30/06, А61К31/56, B01D11/02. Способ получения фракции липофильных веществ из чаги / М.А. Сысоева, С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова; заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО КНИТУ. - 2013116569/15; заявл. 15.04.2013, опубл. 20.07.2014, Бюл. №.20.- 7 с.

4. Пат. 2523414 Российская Федерация МПК8 А61К36/07, B01D11/02. Способ получения меланина из чаги / М.А. Сысоева, С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова; заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО КНИТУ. - №2013129227/15; заявл. 25.06.2013, опубл. 20.07.2014, Бюл. №.20. - 6 с.

5. Пат. 2530636 Российская Федерация МПК8 А61К36/06, B01D11/02. Способ получения фракции липофильных веществ из чаги / М.А. Сысоева, С.А. Никитина,

B.Р. Хабибрахманова; заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО КНИТУ. -№2013136838/15; заявл. 06.08.2013, опубл. 10.10.2014, Бюл. №28,- 6 с.

Тезисы докладов

6. Никитина, С.А. Изучение биологически активных соединений полифено-локсикарбонового комплекса чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2008. - С. 199-200.

7. Никитина, С.А. Отделение и исследование липидов меланина чаги /

C.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XI Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2010.-С. 259.

8. Никитина, С.А. Выделение липидных веществ из меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // IV Международная конференция «Экстракция органических соединений»: тез. докл. - Воронеж: ВГТА, 2010. -С. 413.

9. Никитина, С.А. Липиды, выделяемые из меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // VI Всероссийская научно-техническая конференция «Интенсификация тепло- и массообменных процессов в химической технологии»: тез. докл. - Казань, 2010. - С. 150.

10. Никитина, С.А. Исследование коллоидных систем, формируемых на основе водных извлечений чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева, Е.С. Чугунова // I Всероссийский симпозиум по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии»: тез. докл. - Казань, 2011. - С. 125.

11. Никитина, С.А. Исследование меланина чаги на наличие стеринов и их производных / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // III Международный симпозиум «Клеточная сигнализация у растений»: тез. докл. - Казань, 2011.-С. 127.

12. Никитина, С.А. К вопросу о липидном составе меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: в 4 т. - Т. 2: тез. докл. - Волгоград, 2011. - С. 470.

13. Никитина, С.А. Липидный состав гриба чаги, водных извлечений и шрота / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // II Всероссийская молодежная научная конференция «Химия и технология новых веществ и материалов»: тез. докл. - Сыктывкар, 2012. - С. 80.

14. Никитина, С.А. Биологически активные углеводороды меланина [попоШб оЬНцииэ / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // V Всероссийская конференция с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»: тез. докл. - Барнаул: изд-во Алт. ун-та, 2012.-С. 305.

15. Никитина, С.А.. Разработка биологически активных добавок на основе меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // X Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2012. - С. 135- 138.

16. Никитина, С.А. Адаптация спектрофотометрического определения стери-новых веществ в чаге и препаратах, полученных на ее основе / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, Н.Д. Шарафутдинова, Д.А. Гайнанова // X Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. -Казань, 2012.-С. 146.

17. Никитина, С.А. Анализ антиоксидантной активности водных экстрактов трутовых грибов / С.А. Никитина, А.И. Носов, М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // Всероссийская конференция «Современные проблемы химической науки и образования» : в 2 т. — Т. 2: тез. докл. - Чебоксары, 2012.-С. 172- 173.

18. Никитина, С.А. Роль базидиомицетов в биоценозе леса и биологически активные вещества, продуцируемые ими / С.А. Никитина, А.И. Носов, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XIII Международная научно-техническая интернет-конференция «Актуальные проблемы лесного комплекса»: тез. докл. - Брянск: Б ГИТА, 2012. - С. 165 - 167.

19. Никитина, С.А. Способ реорганизации нативного меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // Всероссийская молодежная научная школа «Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности»: тез. докл. - Казань, Отечество, 2012. - С. 16.

20. Никитина, С.А. Элементный состав меланина чаги / С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева // XII Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2014. - С. 40.

Соискатель

С.А. Никитина

Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага офсетная №1 Печать RISO. Уч.-изд.л.1,2. Тираж 100 экз.

ЦЕНТР ПЕЧАТИ "Линк". Казань, ул. Карла Маркса, 51