Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Состав и свойства водных извлечений и меланинов чаги, полученных с применением СВЧ

п ?

СЫСОЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИСЛАВОВНА

СВОЙСТВА ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ И МЕЛАНИНОВ ЧАГИ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ СВЧ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2011

1 1 МАР 2011

4840840

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководи гель:

доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семёновна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

кандидат химических наук, доцент Галкина Ирина Васильевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт» (Технический университет)

Защита состоится «18» марта 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет» по адресу: 420015, г.Казань, ул.К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещён на сайте Казанского государственного технологического университета (www.kstu.ru)

Автореферат разослан «15 » февраля 2011 г.

Ученый секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Водные извлечения (ВИ) гриба чаги широко применяются в косметике и медицине, в том числе для профилактики и лечения онкологических заболеваний различной этиологии. В И чаги представляют собой коллоидную систему, дисперсной фазой которой, а так же и основным компонентом, обеспечивающим их терапевтическую эффективность, является хромогенный комплекс или меланин чаги. ВИ чаги получают с использованием различных методов экстракции: мацерацией, ремацерацией, реперколяцией, - однако все эти процессы длительны и энергоёмки. Интенсификация процессов экстракции при производстве галеновых препаратов является актуальной задачей, так как позволяет усовершенствовать технологический процесс этой стадии производства, рационально использовать ценное лекарственное сырьё, повысить эффективность извлечения экстрактивных веществ, а также во многих случаях повысить активность получаемых препаратов. Для интенсификации экстракции чаги в работе использованы СВЧ (сверхвысокие частоты), ранее не применявшиеся в технологиях получения извлечений из этого сырья.

Цель работы. Разработать способ получения ВИ чаги с использованием СВЧ, определить их физико-химические свойства и безопасность применения.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- разработать способ экстракции чаги с применением СВЧ;

- определить устойчивость дисперсных, фаз ВИ чаги, полученных различными способами экстракции, по отношению к различным осаждающим агентам и исследовать физико-химические свойства полученных меланинов;

- для определения безопасности ВИ, полученных с применением в экстракции СВЧ:

- разработать методику проведения гидролиза ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта, но аналогии с процессами, происходящими с ними in vivo;

- определить наиболее безопасный режим СВЧ при получении ВИ чаги.

Научная новизна работы. Впервые для интенсификации процесса экстракции чаги применены СВЧ.

Для выделения меланинов из ВИ чаги впервые в качестве осаждающих агентов использованы хлорид кальция и трихлоруксусная кислота, определен их минеральный состав и размер частиц.

Впервые для оценки безопасности ВИ и меланинов чаги разработана и применена методика получения гидролизатов ВИ чаги - модели гидроли-

затов этих извлечений, получающихся in vi vo, исследование которых подтвердило безопасность ВИ чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой.

Практическая ценность работы. Предложенные способы получения ВИ чаги - мацерацией с СВЧ обработкой позволили более чем в три раза сократить как длительность процесса, так и его энергоёмкость. Меланин из ВИ чаги выделен с помощью хлорида кальция, это позволило повысить его выход, изменить его структурную организацию, а также компонентный состав по сравнению с меланином, осаждённым хлористоводородной кислотой. Разработанные подходы позволяют повысить эффективность извлечения биологически активных компонентов из сырья чаги, обеспечить безвредность получаемых продуктов и поэтому могут быть рекомендованы для применения на фармацевтическом производстве.

Внедрение результатов исследования. По способу получения ВИ чаги с применением и экстракции СВЧ получен патент на изобретение. Результаты исследований внедрены в учебный процесс Казанского государственного технологического университета в дисциплине «Физиолого-бнохимические основы разработки продуктов детского питания».

На защиту выносятся:

- способы экстракции чаги с применением СВЧ и результаты исследования ВИ чаги и меланинов;

- способы выделения меланина с применением хлористого кальция и трихлоруксусной кислоты;

- экспериментальные данные по разделению хромогенов и белковых фракций ВИ чаги с применением зонального электрофореза;

- экспериментальные данные исследований протеолша ВИ чаги, полученных с применением СВЧ обработки, in vitro ферментами желудочно-кишечного тракта;

- результаты исследования гидролнзатов ВИ чаги, полученных с применением СВЧ обработки, и выделенного из них меланина.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на: Межрегиональной конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2004 г.); III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007 г.); 2-ой международной научно-практической конференции (Тамбов,

2009 г.); XI Международной конференции молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010 г.); VI Всероссийской конференции «Химия растительных веществ» (Санкт-Петербург, 14-18 июня

2010 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 2 статьях, рекомендованных ВАК, 7 публикациях но материалам конференций, 1 патенте на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка. В тексте приведены ссылки на 191 литературных источника. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, 33 таблицы.

Автор выражает благодарность научному руководителю профессору B.C. Гамаюровой, профессору Г.К. Будникову, доценту Г.К Зиятдиновой, профессору В.В. Зобову, профессору Л.Я. Захаровой и другим соавторам публикации за консультации и помощь в выполнении работы.

Основное содержание работы

В первой главе представлен литературный обзор. Рассмотрен спектр препаратов, выпускаемых на основе чаги, их применение и технологии получения. Приведены химический состав сырья чаги, В И и меланинов, описаны методы их исследования. Рассмотрены способы извлечения биологически активных веществ из сырья природного происхождения, а также процессы, протекающие при экстракции, и методы ее интенсификации. Показаны особенности применения СВЧ обработки при проведении экстракции природного сырья. Обоснована необходимость доказательства безопасности ВИ чаги, полученных экстракцией сырья с применением СВЧ.

Во второй главе изложена экспериментальная часть работы. Приведены характеристики сырья чаги и ферментных препаратов, использованных в работе. Представлены физико-химические свойства ВИ чаги, полученных ремацерацией. Приведены способы и условия получения, а также физико-химические характеристики ВИ и меланинов чаги с применением СВЧ обработки. Описаны способы выделения меланинов различными осаждающими агентами из ВИ, полученных сравниваемыми способами экстракции чаги. Приведены условия проведения протеолиза ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта, а также физико-химические свойства и токсичность пщролизатов ВИ чаги.

В работе использовалась микроволновая печь LG Intellowave (MS -192Н). Аминокислоты в исследуемых образцах проанализированы с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии. Содержание белка и аминокислот определены на спектрофотометре UNICO UV/VIS 2800. Ан-тиоксидантная активность определена кулонометрически по реакции с

электрогенерированными соединениями брома с использованием потенциометра П-5827М. Фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС) частиц меланина проведена при помощи коррелометра «ФотоКорр-М». Зональный электрофорез проведен в камере фирмы Helicon, в качестве поддерживающей среды использованы тонкослойные пластины «Сорбфил». Рентгенофлуоресцентный анализ проведен с помощью энергодисперсионного рентгенофлуоресцентного спектрометра EDX-800 HS2 фирмы «Shimadzu». Peíптсн оструктурный анализ проведен на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker D8 Advance. Оценка острой токсичности проведена в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.) на половозрелых белых беспородных мышах обоего пола.

В третьей главе приведено обсуждение полученных результатов.

Разработка способа экстракции чаги с СВЧ обработкой

Представлены результаты по определению оптимальных условий проведения экстракции ВИ чаги с применением СВЧ обработки. Сравнение результатов проведено в отношении извлечений и меланинов, полученных ранее ремаперацией, позволяющей получить наилучшие результаты: извлечения с высоким выходом меланина и высокой антиоксидантной активностью извлечений и меланинов. Процесс ремацерации проводят в две стадии настаивания при температуре 70°С; на первой стадии соотношение сырья и экстрагента составляет 1:6, на второй 1:4. Общее время экстракции 10 часов. Для снижения времени экстракции в ремацерации вместо одной из стадий настаивания применена стадия СВЧ обработки.

При разработке нового способа экстракции оптимизация проводилась по мощности, времени и кратности СВЧ обработки, а также температуре настаивания до и после СВЧ обработки. Оптимальные параметры проведения экстракции оценивали по выходу меланина.

Для сохранения терапевтической активности ВИ чаги температура при экстракции чаги не должна превышать 70"С. Установлено, что соответствующий нагрев в СВЧ печи исследуемого образца заданной массы происходит: в режиме 90 Вт - в течение пяти минут, в режиме 180 Вт - в течение двух минут, в режиме 360 Вт - в течение 1 минуты.

Проведена экстракция чаги, включающая одну или несколько стадий СВЧ обработки и стадии настаивания при комнатной температуре (20±2°С) продолжительностью 30-60 минут до и после СВЧ обработки.

При использовании мощности в режиме 360 Вт и неоднократной обработке, а также при общей продолжительности настаивания в 150-180 минут полученные В И чаги по выходу меланина приближаются к извлечени-

ям ремацерацией. Однако осуществление экстракции при этом продолжает оставаться трудоемкой и длительной (рис. I).

j 1«

-4.

"--

Ц 3-х кратная СВЧ обработка

[] 2-х кратная СВЧ обработка

П 1-кратная СВЧ оораоотка

Выход меланина при экстракции ремацерацией 12.4 %

Рисунок 1 - Диаграмма зависимости выхода меланина от кратности СВЧ обработки в режиме 360Вт и продолжительности экстракции при комнатной температуре

Настаивание при низких температурах ускоряет процесс набухания сырья и облегчает отделение лигнина от меланинов чаш, что способствует интенсификации экстрагирования. В связи с этим был рассмотрен способ, включающий стадию настаивания в холодильной камере 0 = -15±3°С), дальнейшую одно - двукратную СВЧ обработку и стадию настаивания при комнатной температуре после СВЧ обработки.

- г»г' ПРП комнатной при t — lri±3 I, температуре

до СВЧ обработки до СВЧ обработки

ИГ-!

Выход меланина при экстракции ремацерацией 12,4 %

180|Общее время дотаивания

П18011180 ¡Обще« L—-J I_I наста]

Рисунок 2 - Диаграмма зависимости выхода меланина от режима СВЧ обработки, времени и температуры проведения экстракции

Мощность СВЧ обработки

Замена стадии настаивания при комнатной температуре до СВЧ обработки на стадию настаивания при низких температурах в способе, включающем СВЧ обработку в режиме 360 Вт, не оказывает влияния на выход меланина. При более мягком микроволновом воздействии - в режиме 180

Вт, выход меланина увеличивается в два раза, однако по сравнению с ре-мацерацией, остается более низким (рис. 2).

Наиболее высокий выход меланина был получен при проведении второй стадии настаивания при 70 °С. Варьировали время её проведения от 120 до 240 минут и соотношение сырья к экстрагенту - 1:7,5;1:10;1:15. Близкие значения этих показателей к показателям, полученным методом ремацерации, наблюдались при проведении стадии настаивания при 70 °С после СВЧ обработки в течение 180 минут при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 (табл. 1).

Таблица 1 - Физико-химические свойства В И и меланинов чаги, полученных различными способами экстракции __

Режим СВЧ обработки Настаивание при 70°С, мин Масса сухого остатка, г Масса золы, г Масса меланина Содержание

%* %** Белка, мг/мл Аминокислот, мкг/мл

90 Вт 180 1,379+ 0,03 0,327+ 0,03 11,04 14,45 0,090± 0,005 221,4±15

180Вт 180 1,155+ 0,03 0,296± 0,03 9,61 12,18 0.118-1 0,005 167,1±15

360Вт 180 1,325± 0,03 0,327+ 0,03 9,65 12,07 0,104± 0,005 180ДЫ5

Ремацерация 600 1,379+ 0,03 0,327+ 0,03 12,4 17,89 0,156± 0,005 257,1±15

* - выделен осаждением хлористоводородной кислотой;

** - выделен осаждением спиртовым раствором щёлочи

Более низкое содержание белка н аминокислот в ВИ чаги, полученных с применением микроволновой обработки, в сравнении с ремацерацией, может быть объяснено отличием компоновки меланинов в полученных объектах. При воздействии микроволн на коллоидную систему ВИ чаги белково-полисахаридная компонента меланина может претерпевать различные изменения, что приводит к изменению размеров частиц меланина и их содержанию в ВИ (табл. 2).

Таблица 2 - Антиоксидантная активность, размеры и содержание частиц ВИ и меланинов чаги, полученных различными способами экстракции

Способ получения ВИ чаги Радиус частиц, им Содержание частиц, % АОА ВИ чаги, Кл/мл АОА. кКл/(100г меланина)

Ремацерация 161,10±2.40 85,3±1,3 3,70±0.20 37.0-2.0

Мацерация с СВЧ обработкой 90Вт 89,82+1,40 77,4±1,2 3,38±0,06 43,0±1,0

180Вт 104,10±1.60 76,3±1,1 3,52±0,07 48.2±0,9

360Вт 136,70±2,10 79,0±1,2 2,80 ±0,04 49,0±1,0

Для определения различий в составе частиц меланинов, они были проанализированы с помощью рентгенофлуоресцентного анализа (табл. 3).

Таблица 3 - Катионно-анионный состав меланинов, выделенных из ВИ ча-

гп хлористоводо юдной кислотой (в процентах)

Определяемый элемент Способ экстракции

Мацерация с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт Ремацерация

К 57,789 69.516

Са 8,491 11.948

Мп 0.107 0,293

Ре 0.120 0,154

Си 0.043 0,083

2п 0,093 0,277

С1 33,012 17.335

5 0.345 0,194

Р - -

Таким образом, показано, что, несмотря на близкие физико-химические характеристики ВИ чаги, полученных этими способами экстракции, структура их дисперсных фаз - меланинов - отличается не только размером частиц, но и но минеральному составу, что подтверждает высказанное предположение о различной компоновке их частиц.

Разработанный способ проведения экстракции чаги мацерацией с СВЧ обработкой позволяет получить ВИ чаги, близкие по содержанию меланина, антиоксидантной активности и другим свойствам к экстрактам, получаемым традиционным способом. При этом длительность процесса экстракции сокращается в 3,5 раза, более чем в три раза уменьшается энергоемкость, что в целом снизит себестоимость получаемой продукции. Кроме того СВЧ обработка оказывает обеззараживающее действие, подавляет развитие патогенной микрофлоры, что может увеличить качество и срок хранения получаемых препаратов.

Выделение меланина из ВИ чаги различными осаждающими агентами

Традиционно для осаждения меланинов из ВИ используется хлористоводородная кислота. Для изучения отличий в структурной организации ВИ, получаемых методом ремацерации, от мацерации с СВЧ обработкой рассмотрена устойчивость дисперсных фаз — меланинов - сравниваемых коллоидных систем в отношении к различным осаждающим агентам.

Разработан способ осаждения меланинов ВИ чаги трихлоруксусной кислотой. Выбор данного осаждающего агента обусловлен сложностью отделения белков от ВИ чаги. Соосаждение белков с меланинами чаги позволило отделить несколько белковых фракций с помощью электрофореза, что ранее не удавалось достичь общеизвестными методами. В дальнейшем этот способ может быть использован для более глубокого изучения белков чаги.

Разработана методика осаждения В И чаги хлоридом кальция, который ранее для выделения мел анина из В И чаги не использовался. Определены оптимальные: концентрация хлористого кальция и соотношение ВИ и осаждающего агента (рис.3). Как показано на диаграмме, оптимальный выход меланина достигается при добавлении к 10 мл ВИ 1 мл 10% раствора хлорида кальция.

Рисунок 3 - Исследование зависимости выхода меланина от количества осаждающего агента.

, Масса Обогащение

добавляемого

I иыШЯМ<!?|0саздаю11ИТ0 МСЛаНИНа КЗЛЬЦНСМ

1......... „-'1-1|_I* I агента, г

в"» ?",. ..............1 ] подтверждено с

Концентрация хлорида кальция " ПОМОЩЬЮ реШТеНО-

флуоресцентного анализа (табл. 4).Все выделенные меланины отличаются по минеральному составу.

Таблица 4 - Рентгенофлуоресцентный анализ меланинов, выделенных из В И чаги различными осаждающими агентами (в процентах)

Определяемый элемент. Осаждающий агент

Хлористоводородная кислота Хлорид кальция Трихлоруксусная кислота

К 69,516 8.240 56,934

Са 11,948 64,060 10,343

Мп 0,293 0,081 0,137

Ре 0.154 0,101 0.101

Си 0.083 0,029 0,044

Ъ\\ 0,277 0,464 0,096

С1 17.335 10.819 32.021

Б 0,194 0,967 0,324

Р - 15,236 -

Наиболее близкие значения по содержанию в них макро- и микроэлементов наблюдается у меланинов, осаждённых хлористоводородной и трихлоруксусной кислотами. В целом, меланин, осаждённый трихлорук-сусноп кислотой, содержит меньше этих микроэлементов. При выделении меланина хлоридом кальция, по сравнению с его выделением хлористоводородной кислотой, наряду с возрастанием содержания кальция в нём существенно снижается содержание других микроэлементов. Кроме того у меланина, выделенного с помощью хлорида кальция, существенно меняется анионный состав. Отличия в минеральном составе исследованных меланинов могут быть связаны с изменением компоновки частицы меланина при его осаждении.

С помощью рештеноструктурного анализа было установлено присутствие хлорида калия в кристаллическом состоянии в составе меланинов, выделяемых хлористоводородной кислотой из В И чаги, полученных ремацерацией (рис. 4). То есть, меланин находится в аморфном состоянии, а избыток калия, присутствующий в дисперсионной среде ВИ, соосаждается хлористоводородной кислотой в виде хлорида калия вместе с меланином. Согласно представленным спектрам (рис. 4) в меланинах, выделенных хлоридом кальция, как из ВИ, полученного ремацерацией, так и из включающего СВЧ обработку, в кристаллическом состоянии присутствует оксалат кальция. Образование и соосаждение с меланином оксалата кальция в кристаллическом состоянии можно объяснить высоким содержанием в дисперсионной среде ВИ щавелевой кислоты - до 6-8%.

г-

5...

5

_

Рисунок 4 - Рентгсно-структурный анализ меланинов:

а - меланин, осажденный хлористоводородной кислотой из ВИ чаги, полученного ремацерацией;

б - меланин, осажденный хлоридом кальция из ВИ чаги, полученного мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт;

в - меланин, осажденный хлоридом кальция из В И чаги, полученного ремацерацией.

[у - Оксалат кальция И - Хлорщ калия

В меланине, осажденном хлоридом кальция из ВИ, полученных ремацерацией, отсутствует кристаллический хлорид калия. В меланине, выделенном путем осаждения хлоридом кальция из ВИ, полученных с СВЧ обработкой, кристаллический хлорид калия присутствует. Это свидетельствует о различии в составе дисперсионных сред коллоидных систем, из которых выделяли меланины и структурной организации исследуемых образцов.

Устойчивость полученных разными способами ВИ чаги к рассмотренным осаждающим агентам подчиняется общей тенденции. Для ВИ чаги, полученных, как методом реманерации, так и мацерацией с СВЧ обработкой, при осаждении хлористым кальцием и трихлоруксусной кислотой, в сравнении с применением хлористоводородной кислоты, наблюдается увеличение выхода меланина (табл. 5).

Таблица 5 - М асса меланина из разл ичных В И чаги, полученн ых с применением разных осаждающих агентов_

Примененный осаждающий агент

Способ получения ВИ Хлористоводородная Хлорид 'Грихлоруксусная

чаги кислота кальция кислота

Масса меланина. %

Ре.мацсрация 7.62 11.97 9.22

Мацерация с 90 Вт 6.53 9,20 6.82

СВЧ 180 Вт 7.16 9,97 7.07

обработкой 360 Вт 6.85 9,24 6.91

Для дальнейшего изучения меланинов, выделенных хлористоводородной кислотой и хлоридом кальция из ВИ, полученных ремацерацией и мацерацией с СВЧ обработкой, были измерены их антиоксидантная активность, размеры частиц и их содержание в растворе (10 мг меланина/25 мл воды) (табл. 6).

Таблица 6 - Физико-химические свойства меланинов, выделенных из различных ВИ чаги хлористоводородной кислотой и хлоридом кальция

Способ получения ВИ чаги Меланни. осажденныii хлористоводородной кислотой Меланин, осажденный хлоридом кальция

Характеристики частиц ЛОЛ* Характеристики частиц ЛОЛ*

Радиус, им Содержание. % Радиус, им Содержание. %

Ремацерация 139.4±2.1 60,3±0,9 37,0±2,0 105,7+1,6 97,7±1,5 26,0±1,0

Мацерация с СВЧ обработкой 90Вт 138,2±2,1 72.1:1.1 47,9±0,9 133,2+2,0 90,7+1,4 34,0±1,0

180Вт 185,2±2,8 55.6±0,8 48,2±0.9 99,5±1,5 89.1 ±1.3 33.0±1,0

360В1 11S, 1 ±1,8 70.9±1.1 47,0±1.0 121,2± 1.8 <)().-! 1.4 36.0+1.0

* - Кл/(100г меланина)

При осаждении ВИ, полученных представленными способами экстракции, хлоридом кальция, структура меланина становится более монодисперсной, о чем свидетельствует увеличение содержание частиц одного размера, их радиус, в целом меньше, чем при осаждении хлористоводородной кислотой. Однако зависимости между размерами частиц и антиок-сидантной активностью обнаружить не удалось.

Антиоксидантная активность меланинов, осажденных хлористоводородной кислотой из ВИ. полученных с применением СВЧ обработки, зна-

чителыю превышает антиокеидаитпую активность меланинов, выделенных тем же осаждающим агентом из ВН, полученных ремацерацией.

При осаждении ВИ чаги хлоридом кальция в сравнении с использованием хлористоводородной кислоты, антноксидантная активность меланинов снижается (табл. 6). Однако для меланинов, выделенных из ВИ чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой, антноксидантная активность остается на уровне с активностью меланина, выделенного хлористоводородной кислотой из ВИ, полученных ремацерацией.

Различия физико-химических свойств и структурной организации меланинов В И чаги, полученных ремацерацией и мацерацией с СВЧ обработкой, вызывают необходимость доказательства безопасности ВИ, полученных мацерацией с СВЧ обработкой, и выделяемых из них меланинов при использовании их в качестве лекарственных средств.

Иротеолиз ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта

Наибольшему изменению в процессе СВЧ обработки могут подвергаться именно белки ВИ чаги. Под действием микроволн они могут не только изменять свою конформационную структуру, денатурировать, но и различные нх фракции могут агрегировать, или отделяться от частицы меланина. В этом случае их иротеолиз ферментами желудочно-кишечного тракта в организме человека может приводить к образованию пептидов иной молекулярной массы, которые могут быть токсичными. Для определения возможности таких изменений разработан метод по проведению протеолиза ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта в условиях, близких к происходящим в организме человека. Иротеолиз проводиллся в две стадии. На первой стадии использовался препарат «желудочный сок» пли препарат «ацидин-пепсин», на второй стадии - препарат «Энзистал». Протекание гидролиза регистрировалось но накоплению аминокислот с помощью бумажной, тонкослойной хроматографии в трех системах растворителей. Количественно ход протеолиза оценивался спектрофотомет-рически по убыванию белка и накоплению аминокислот. При подборе оптимальных условии протекания протеолиза варьировалось время протекания гидролиза, количество вводимых ферментных препаратов и ВИ чаги. Оптимальные условия протекания гидролиза наблюдаются: при проведении первой стадии - в течение 90 минут при соотношении ВИ и ферментного препарата 1:1; второй стадии - в течение 160 минут, при концентрации ферментного препарата «Энзистал 32 мг/мл. Согласно данным, приведенным в таблице 7, протеолиз ВИ чаги, полученных ремацерацией и мацерацией с СВЧ обработкой, протекает аналогично, но на разную глубину.

Наиболее близкие значения получены для ВИ чаги, полученных ремацера-цней и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт.

Таблица 7 - Физико-химические характеристики гидролизатов ВИ чаги

Способ получения ВИ чаги Характеристики глдролизата Концентрация белка, мг/мл* Глубина протекания гидролиза, %

Масса сухого остатка, г Масса меланина. % Исходная Итоговая

Ремацерация 0.13±0,03 2,870 0.084 0.035 58

Мацерация с СВЧ обработкой 90Вг 0,06±0,03 1,728 0,070 0.042 40

180Вт 0,08±0,03 3,168 0,084 0,033 60

360Вт 0,08±0,03 2,472 0.079 0.042 47

* - погрешность метода ±0.005

Это может свидетельствовать о близости структурной организации этих коллоидных систем. Для подтверждения этого предположения были определены размеры, содержание частиц и антиоксидантная активность полученных гидролизатов (табл.8).

Таблица 8 - Размеры и содержание частиц, антиоксидантная активность В И чаги и гидролизатов_

Способ получения ВИ чаги Водные извлечения чаги Гндролпзат

Характеристики частиц АОА* Характеристики частиц АОА*

Радиус, нм Содержание, % Радиус, нм Содержание. %

Ремацерация 161,1±2,4 85,3±1,3 3,70±0.20 117,1±1,8 92.4±1.4 5,10±0,04

Мацерация с СВЧ обработкой 90Вт 89,8±1.4 77,4±1,2 3,38±0,06 123,4±-1,9 88.2±1,3 3,21±0,07

180Вт 104,1±1,6 76,3±1,1 3,52±0,07 115,5±1,7 52,1+0,8 5,70±0,10

360В1 136,7±2,1 79,0±1.2 2.80±0,04 122.8+1.8 89,2±1,3 4.7.U0.07

* Кл/(100г меланина)

ВИ чаги, полученные разными способами экстракции, существенно различаются размерами частиц меланинов. После проведения гидролиза ВИ и частицы меланинов в них меньше отличаются по размерам между собой. Отмечено, что размеры меланинов, выделенных из ВИ, полученных мацерацией с СВЧ обработкой, меньше по сравнению с меланином, выде-

ленным из ВИ, полученного с помощью ремацерацни. В физиологических условиях это может приводить к повышению их бнодоступноети, Гидро-лнзаты извлечений, полученных рсмацсрацией и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт, практически не различаются по размеру частиц и обладают близкой антиоксидантиой активностью.

Для подтверждения безопасности ВЦ получаемых с применением СВЧ, проанализирована острая токсичность полученных ВИ и гидролизатов (табл. 9).

Таблица 9 - Острая токсичность анализируемых объектов и лекарствен-

ных препаратов

Объекты исследования п лекарственные препараты Острая токсичность ЛД50. мг/кг массы животного

ВИ чаш, полученные мацерацией с СВЧ обработкой 90 Вт 2913

180 Вт 2705

360 Вт 3043

Гидролизаты ВИ чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой 90 Вт 7260

180 Вт >8000

360 Вт 6400

«Бефунгин» 6500

Гидролизат «Бефунгнна» 2680

Карсил 1000

Экстракт эхпнацен 2500

Согласно полученным данным, ВИ, полученные методом мацерации с СВЧ обработкой, относятся к малотоксичным веществам и находятся на уровне с препаратом - экстрактом эхииацеи. После проведения протеолиза ферментами желудочно-кишечного тракта гидролизаты ВИ чаги, полученные мацерацией с СВЧ обработкой, по показателям острой токсичности относятся уже к нетоксичным веществам. Гидролизат ВИ, полученного мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт, является наименее токсичным как в сравнении с гидролизатами ВИ в других режимах СВЧ обработки, так и с гидролнзатом препарата «бефунгин». Это свидетельствует о безопасности применения исходного извлечения чаги.

Таким образом, показано, что применение мацерации с СВЧ обработкой позволяет получить безопасные ВИ чаги, на основе которых могут быть получены биологически активные добавки и лекарственные препараты.

выводы

1. Разработан способ получения ВИ чаги мацерацией с СВЧ обработкой, позволивший сократить продолжительность процесса экстракции чаги в 3,5 раза, а также более чем в три раза снизить его энергоёмкость, по сравнению с получением ВИ чаги ремацерацней.

2. Показано, что экстракция чаги мацерацией с СВЧ обработкой при использовании трёх режимов мощности СВЧ печи (90 Вт, 180 Вт и 360 Вт) позволяет получить ВИ чаги с физико-химическими и антиоксидантными свойствами, близкими к свойствам ВИ, полученного ремацерацней.

3. Установлено, что использование для выделения меланинов из В И чаги вместо хлористоводородной кислоты хлорида кальция увеличивает выход меланина в полтора раза, приводит к изменению размеров его частиц и их минерального состава, снижению его антиоксидантной активности; а использование трихлоруксусной кислоты облегчает отделение белковых фракций из меланина с помощью электрофореза.

4. Разработана методика протеолиза ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта, позволяющая определить глубину протекания этого процесса в условиях, близких к физиологическим.

5. Установлено, что ВИ чаги, полученные ремацерацней и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт, аналогичны по своим свойствам, имеют близкие показатели глубины протекания протеолиза ферментами жслу-дочно-кишечного тракта, с убыванием количества белка в гидролизатах в среднем на 59%.

6. Показано, что гидролизаты ВИ чаги, полученных ремацерацней и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 Вт, имеют близкие по размерам частицы меланина с эффективным радиусом около 116 нм, и в полтора раза превышают по антиоксидантной активности исходные ВИ. Доказано, что гидролизат ВИ, полученный мацерацией с СВЧ обработкой, обладает меньшей токсичностью в сравнении с гидролизатом препарата «бефун-гнн».

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций:

1. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги X. Проте-олиз ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта / М.А. Сысосва, Е.В. Сысоева, В.Р. Хабнбрахманова. B.C. Гамаюрова. Л.А. Кудрявцева // Химия растительного сырья. - 2008 -№ 2. - C.8 I - 86.

2. Сысоева, Е.В. Исследование водных извлечений чаги XV. Протеолиз водных извлечений чаги, полученных с применением СВЧ / Е.В. Сысоева, М.А.Сысоева, B.C. Гамаюрова, Д.И. Вахитова // Вестник Казанского технологического университета. - 2010 - №9. - С. 609-615.

3. Пат 2406514 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 36/06, В 01 D 11/02, А 61 Р 39/06. Способ получения водных экстрактов чаги / М.А. Сысоева, Е.В. Сысоева, A.B. Сысоева , B.C. Гамаюрова; заявитель и патентообладатель ГОУВПО"Казанский государственный технологический университет". - N'2 2009113400/15; заявл. 09.04.2009; опубл. 20.12.2010, Бюл. № 35. -5 с.

Тезисы докладов

4. Сысоева, М.А. Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно-кишечного тракта / М.А Сысоева, Е.В. Сысоева, Д.И. Вахитова, B.C. Гамаюрова /' XI Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2010. - С. 284.

5. Сысоева, Е.В. Антиоксиданты и их применение /' Е.В. Сысоева, М.А.Сысоева /У Межрегиональная конференция молодых ученых «Пищевые технологии»: тез. докл. - Казань, 20С9. - С. 97-99.

6. Сысоева, Е.В. Протеолиз белков водных извлечений Inonotus obliquus / Е.В. Сысоева, М.А.Сысоева, О.Ю.Кузнецова, В.Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова // III Всероссийская конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»: тез. докл. - Барнаул, 2007. - С.214-215.

7. Сысоева, Е.В. Подбор условий анализа белка в водных извлечений из чаги / Е.В. Сысоева, М.А.Сысоева, B.C. Гамаюрова // И Международная научно-практическая конференция «Составляющие научно технического процесса»: »: тез. докл. - Тамбов, 2009. - С. 125-126.

8. Сысоева, Е.В. Способ выделения белка из водных извлечений чаги / Е.В.Сысоева, М.А.Сысоева, B.C. Гамаюрова, O.A. Короткова // XI Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии»: тез. докл. - Казань, 2010. - С. 286.

9. Сысоева Е.В. Отделение и анализ белковой фракции водных извлечений чаги / Е.В. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, B.C. Гамаюрова, М.А. Сысоева, М.Ю. Макеева, A.A. Ахмадуллина // VI Всероссийская конференция «Химия растительных веществ»: тез. докл. - СПб, 2010. - С. 288.

Патент

Соискатель: