Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фенольные и сопутствующие им соединения водного извлечения гриба чаги

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический

университет»

На правах рукописи

04201 4535 35

БУРМАСОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФЕНОЛЬНЫЕ И СОПУТСТВУЮЩИЕ ИМ СОЕДИНЕНИЯ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ГРИБА ЧАГИ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Сысоева Мария Александровна

Казань-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

1 ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Терапевтические свойства водных извлечений и меланинов чаги......... 10

1.2 Коллоидная система водного извлечения чаги................................ 14

1.2.1 Дисперсная фаза коллоидной системы водного извлечения чаги - меланин.................................................................................. 16

1.3 Исследование химического состава водного извлечения и меланина чаги.................................................................................... 20

1.3.1 Применение химического гидролиза в исследовании водного извлечения меланина чаги.................................................................. 20

1.3.2 Применение колоночной хроматографии в исследовании водного извлечения меланина чаги.......................................................... 23

1.3.3 Применение экстракции водного извлечения чаги органическими растворителями для исследования его химического состава.................. 25

1.4 Биологическая активность фенольных и сопутствующих им соединений и их применение в медицине................................................ 27

1.4.1 Фенолы.............................................................................. 28

1.4.2 Фенолоксикарбоновые кислоты................................................ 29

1.4.3 Флавоноиды......................................................................... 30

1.4.4 Терпены.............................................................................. 33

1.5 Антибактериальная и фунгицидная активности препаратов чаги......... 35

1.6 Пробиотики и биоценоз желудочно-кишечного тракта человека......... 36

2 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы исследования......................................................... 38

2.1.1 Материалы, необходимые для проведения последовательной обработки водного извлечения чаги органическими растворителями.............. 39

2.1.2 Материалы, необходимые для проведения микробиологических исследований............................................................................... 39

2.2 Способы получения объектов исследования....................................................................41

2.2.1 Получение водного извлечения чаги ремацерацией..................................................41

2.2.2 Получение экстрактов из водного извлечения чаги с помощью органических растворителей............................................................................................................................42

2.2.3 Способ выделения меланина из водного извлечения чаги....................................45

2.2.4 Химический гидролиз экстрактов..............................................................................................45

2.2.5 Проведение колоночной хроматографии на силикагеле..........................................46

2.2.6 Способы получения экстрактов из меланина с помощью органических растворителей..............................................................................................................................................46

2.2.7 Получение сухого экстракта М......................................................................................................47

2.2.8 Подготовка образца для исследования токсичности..................................................47

2.2.9 Подготовка исследуемых образцов и посевного материала для проведения и испытания образцов на пребиотическую активность..........................47

2.3 Общие методы анализа........................................................................................................................48

2.3.1 Определение антиоксидантной активности объектов исследования..........48

2.3.2 Определение суммы экстрактивных веществ в органических экстрактах........................................................................................................................................................................................48

2.3.3 Определение размера частиц методом фотон-корреляционной спектроскопии ......................................................................................................................................................49

2.3.4 Количественное определение фенолов в объектах исследования..................49

2.3.5 Количественное определение Сахаров в объектах исследования....................50

2.3.6 Количественное определение белка в объектах исследования........................50

2.3.7 Количественное определение липидов в объектах исследования..................50

2.3.8 Качественная реакция с основным ацетатом свинца................................................51

2.3.9 Электронная спектроскопия............................................................................................................51

2.3.10 Хроматографический анализ - одномерная восходящая бумажная хроматография............................................................................................................................................51

2.3.11 Хроматографический анализ - тонкослойная хроматография..........................52

2.3.12 Высокоэффективная жидкостная хроматография........................................................53

2.3.13 Хромато-масс-спектрометрия........................................................................................................53

2.3.14 ПМР-спектроскопия................................................................................................................................54

2.3.15 Определение острой токсичности..............................................................................................54

2.3.16 Анализ лекарственного препарата «Бефунгин»............................................................54

2.3.17 Определение антибактериальной и фунгицидной активностей........................55

2.3.18 Определение количества микроорганизмов (бифидобактерий, лакто-бактерий, кишечных палочек)......................................................................................................55

2.3.19 Обработка полученных результатов............................................ 56

3 ГЛАВА 3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Исследование фенольных и сопутствующих им соединений водного извлечения чаги..................................................................... 57

3.2 Применение последовательной исчерпывающей экстракции органическими растворителями с возрастающей полярностью для исследования фенольных соединений водных извлечений чаги........................... 60

3.2.1 Исследование экстракта, полученного с применением диэтилового эфира.................................................................................. 64

3.2.2 Исследование экстракта, полученного с применением хлороформа............69

3.2.3 Исследование экстракта, полученного с применением этилацетата............73

3.2.4 Исследование экстракта, полученного с применением бутанола..................76

3.3 Выбор экстракта из меланина чаги, обладающего максимальной анти-оксидантной активностью................................................................................................................78

3.3.1 Определение химического состава бутанольного экстракта из меланина чаги................................................................................ 79

3.4 Определение биологических свойств сухого экстракта М................. 95

3.4.1 Исследование антибактериальной и фунгицидной активностей.......... 95

3.4.2 Изучение пребиотических свойств сухого экстракта М и «Бефунги-на»..................................................................................... 98

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................106

ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................................................................................124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время в комплексной терапии для лечения хронических гастритов и язвенной болезни желудка успешно применяются галеновые препараты на основе водных извлечений (ВИ) гриба чаги, а именно: «Бефунгин», «Чагалюкс», «Чагавит» и другие. Согласно литературным данным, наряду с меланином чаги основными компонентами, обуславливающими активность этих препаратов, являются фенольные соединения, которые содержатся в ВИ чаги в свободном и связанном с меланином состоянии. Количество «свободных» фенольных соединений незначительно, в основном они входят в состав меланина. К настоящему времени фенольные соединения чаги не достаточно изучены, так как выделить их из меланина чрезвычайно сложно. Ранее с этой целью проводили химический гидролиз ВИ чаги и меланина, приводящий к разрушению части фенольных соединений. ВИ чаги экстрагировали этилацетатом для извлечения липофильной компоненты. Фенольные соединения как сопутствующие выделяли по многоступенчатой схеме с применением щелочных и кислотных агентов, диэтилового эфира, этилацетата и бутанола (В.Р. Хабибрахманова, 2008). При этом проанализированы только те фенольные соединения, которые отделены этилацетатом из ВИ чаги. Этот способ оказался более результативным и позволил определить ряд других фенольных соединений, не обнаруженных ранее. Это свидетельствует о том, что для определения фенольных веществ из ВИ чаги перспективно использовать органические растворители. Для создания более эффективных или усовершенствования уже существующих препаратов на основе ВИ чаги необходимо расширить представления о составе и содержании в нем фенольных соединений.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту №_01201252915 от 28.02.2012 г. тема: "Разработка биологически активных добавок на основе супрамолекулярных бионаносистем", также автор принимал актив-

ное участие в организации Всероссийской молодёжной научной школы «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» по государственному контракту № 12.741.11.0101 федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Цель работы. Определить состав и содержание фепольных и сопутствующих им соединений, содержащихся в ВИ чаги в свободном и ассоциированном состоянии и обеспечивающих его биологическую активность.

Для достижения цели ставились следующие задачи:

• определить количество фепольных соединений, находящихся в ВИ чаги в свободном и ассоциированном состоянии;

• определить состав фепольных и сопутствующих им соединений, находящихся в ВИ чаги в свободном и ассоциированном состоянии;

• выделить фракцию меланина - сухой экстракт М, - обладающую высокой ан-тиоксидантной активностью (АОА), исследовать её компонентный состав, а также определить её токсичность, антибактериальные и фунгицидные свойства;

•исследовать влияние сухого экстракта М и лекарственного препарата «Бе-фунгин» на культуры микроорганизмов родов: Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia - основных представителей микрофлоры толстого кишечника человека.

Научная новизна. Разработанный и применённый метод последовательной исчерпывающей экстракции ВИ чаги органическими растворителями с возрастающей полярностью позволил: увеличить выход фенольных соединений, извлекаемых из ВИ чаги; впервые выделить и идентифицировать индивидуальные вещества, находящиеся в ассоциированном с меланином состоянии - м-оксифенилпропионовую кислоту, салициловую кислоту, 2,4-диметоксифенол, гликозид 7-гидрокси-6-метоксикумарипа, метилдифенилацетат, 1,1-дифенил-2-пропанон, 2-аллил-3-этокси-4-метоксифенол, изорампетин, лютеолин, а также лейкоантоцианы и метилированные уроновые кислоты, способные обеспечивать биологическую активность ВИ чаги; получить экстракты с наноразмерными частицами меланина.

Впервые на основе меланина чаги получен сухой экстракт М, обладающий высокими антиоксидантными свойствами. С помощью электронной спектроскопии, ВЭЖХ, ЯМР, хромато-масс-спектрометрии определён его состав, а также показана фунгицидная и фунгистатическая активность сухого экстракта M в отношении грибов Candida albicans, Pénicillium notatum, Aspergillus fiimigatus, Trichoderma viride.

Впервые установлены пребиотические свойства лекарственного препарата «Бефунгин» и сухого экстракта М.

Практическая значимость. Разработан способ получения экстракта из меланина чаги, который позволил получить сухой экстракт М, обладающий высокой АОА, фунгистатической активностью и пребиотическими свойствами.

Модифицирована методика определения воздействия лекарственных препаратов и экстрактов на жизнедеятельность микрофлоры толстого кишечника, которая может применяться в научно-исследовательской деятельности на кафедре пищевой биотехнологии КНИТУ и в других научно-исследовательских центрах РФ.

Внедрение результатов исследования. Разработанные методы хроматогра-фического и хромато-масс-спектрометрического анализа экстрактов, полученных из природных объектов, а также методика по определению их пребиотических свойств внедрены в учебный процесс на кафедре пищевой биотехнологии КНИТУ в учебных дисциплинах: «Биоорганическая химия», «Технология продуктов функционального питания», «Технология белков и биологически активных веществ».

На защиту выносятся: положения, сформулированные в разделе Научная новизна и в выводах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на: Межрегиональных и международных конференциях молодых учёных «Пищевые технологии» (г. Казань) 2001, 2004, 2009, 2010 г.г.; III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Саратов 2004 г.); Всероссийской молодёжной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (г. Казань, 18-22 июня 2012 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 3 статьях в журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертаций, 7 тезисах докладов на конференциях.

Личный вклад автора. Автор принимал участие в постановке цели и задач исследования, проведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов, формулировке научных выводов, написании и оформлении статей.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проведён: на оборудовании ЦКП ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН совместно с к.х.н. Ризвановым И.Х.; в ГУЧ «Башкирский республиканский научно-исследовательский экологический центр» в г.Уфа совместно с к.х.н. Коржовой Л.Ф. Антибактериальная и фунгицидная активность определена в ФБУН КНИИЭМ к.б.н. Лисовской С.А., к.б.н. Глушко Н.И. Определение токсичности осуществлено в ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН в сотрудничестве с н.с. Ланцовой A.B., д.б.н., проф. Зобовым В.В. Определение АОА образцов проведено в ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» в сотрудничестве с к.х.н. Зи-ятдиновой Г.К., д.х.н., проф. Будниковым Г.К. Фотон-корреляционная спектроскопия проведена на оборудовании ЦКП ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН совместно с д.х.н. Захаровой Л.Я.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка, приложения. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 11 таблиц и 176 литературных источников.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Терапевтические свойства водных извлечений и меланинов чаги

Чага, растущая на берёзах, служит лекарственным сырьём [1].

В качестве лекарственных средств из ¡попоШб оЬ^иш в России зарегистрированы сам гриб чага (включая плодовые тела), сухой экстракт чаги и препараты из него: «Бефунгин» - водный экстракт, и «Гастрофунгин» - спиртовая настойка на 70%-ном этиловом спирте [2]. Фармацевтическая промышленность выпускает биологически активные добавки (БАД) фитокомплекс «Чаговит», капсулы «Экстракт чаги с витамином С», сироп «Чага-янтарь», криопорошок и другие, которые рекомендуются в качестве общеукрепляющих средств [3-5].

Лекарственные препараты берёзового гриба действуют как активные биогенные стимуляторы, они увеличивают защитные свойства организма, стимулируют центральную нервную и нейрогуморальную системы, улучшают обмен веществ; проявляют противоопухолевое, адаптогенное и противоязвенное действия; обладают радиопротекторными, антиоксидантными и противовирусными свойствами [6-10]. Препараты чаги нетоксичны. При изучении острой токсичности сухого экстракта чаги было показано, что однократное введение препарата в дозах 1000-6000мг/кг при наблюдении в течение 15 суток не вызывает гибели мышей, потери массы тела, изменений состояния кожного покрова и двигательной активности, возникновения диареи. По данным учёных пятидесятых годов, ЫЭ50 препарата чаги (водного извлечения чаги) для белых мышей составляет при перораль-ном введении 0,5 г и при энтеральном введении 6,5г на 1 кг веса [11-12]. Хроническая токсичность исследована на осаждённом препарате чаги [13].

Водные извлечения из чаги применяют для лечения заболеваний, таких как хронический гастрит, полипозы и язва желудка. Действие водных экстрактов чаги на ферментную систему больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки проявляется в нормализации ранее сниженной активности каталазы и

протеазы, что приводит к исчезновению болей, прекращению диспептических расстройств, восстановлению трудоспособности [14-16].

Учёные доказали, что водный экстракт чаги оказывает также выраженное нейротропное (ноотропное) влияние: у