Применение пробиотика-гепатопротектора "Генопро" при токсических поражениях печени у собак

Панина, Татьяна Владимировна

Диссертации по ветеринарии → Патология, онкология и морфология животных

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Применение пробиотика-гепатопротектора "Генопро" при токсических поражениях печени у собак

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Панина, Татьяна Владимировна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.02

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Применение пробиотика-гепатопротектора "Генопро" при токсических поражениях печени у собак

003459526

На правах рукописи

ПАНИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКА-ГЕПАТОПРОТЕКТОРА «ГЕПОПРО» ПРИ ТОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ У СОБАК

16.00.02 - Патология, онкология и морфология животных 16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

| Ч „.у,у

МОСКВА 2008

003459526

Работа выполнена в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») и ГО ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ) (г. Москва).

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, академик РАСХН, профессор Уша Б.В. доктор биологических наук, профессор Малик Н.И.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Паршин П.А. доктор ветеринарных наук, профессор Субботин В.В.

Ведущая организация: Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита состоится « t^J » февраля 2009 года в / / часов на заседании диссертационного совета Д 212.149.03 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии (109316, Москва, ул. Талалихина, дом 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии и на вебсайте университета www.msaab.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат ветеринарных наук, профессор

И. Г. Серегин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние годы в ветеринарии приобрела особую актуальность проблема роста патологий гепатобилиарной системы.

В последние годы отечественными и зарубежными учеными достигнуты определенные успехи в изучении патологий гепатобилиарной системы различной этиологии у собак (Уша Б.В., 1994; Конопатов Ю.В., Рудаков В.В., 1996; Митин В.Н., 1999; Barnett С., Curtis R., 1981; Zentek J., 1999).

Современные экологические условия, увеличение интенсивности воздействия химико-физических и биологических факторов, а также чрезмерное назначение лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков и гормонов, несбалансированное кормление создают предпосылки к росту гепатопатий.

При этом большая часть гепатобилиарных патологий этиологически и патогенетически взаимосвязана с желудочно-кишечными патологиями.

При этом повреждение печеночных клеток, снижение их функциональной активности неизбежно ведет к увеличению воздействия токсических веществ на кишечную микрофлору, что может являться причиной нарушений микробиоценоза кишечника, в свою очередь, эти нарушения индуцируют детоксикационную функцию микрофлоры, тем самым увеличивая токсическую нагрузку на печень (Данилевская Н.В., Колев Г.И, 2000; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007; Тармакова С.С., 1999; Fry S.W., Seeff L.B., 1995)

Одним из перспективных направлений в комплексном решении проблемы печеночных и желудочно-кишечных патологий является создание новых комбинированных препаратов - пробиотиков-гепатопротекторов, использование которых способствует своевременной детоксикации организма, восстановлению гепатобилиарной и желудочно-кишечной систем, а также будет являться эффективным инструментом в компенсации патологии печени и нарушении микробиоценоза.

Назначение пробиотиков при патологиях печени позволяет снизить степень эндогенной интоксикации, уменьшая образование токсических эндогенных соединений, в том числе и солей желчных кислот (Гулаг ПЛ., Яковенко Э.П., 1996.; Роджер Батт, Вивиен Е. Рольф, Ричард Ф. Батгервик, 2001).

В ассортименте лекарственных препаратов, применяемых в комплексной терапии для лечения заболеваний печени, выделяют небольшую группу веществ, действие которых направлено на восстановление гомеостаза печени, нормализацию активности органа и стимуляцию регенеративных процессов -гепатопротекторы, которые составляют 9,2 % от общего количества лекарственных средств.

Самыми применяемыми в ветеринарии являются препараты, в основу которых входят естественные или полусинтетические флавоноиды расторопши пятнистой (Silybum marianum).

Полагают, что в механизме гепатопротективного действия препаратов расторопши главным является свойство стабилизировать клеточные и субклеточные мембраны. Они усиливают детоксицирующую и внешнесекреторную функцию печени, оказывая спазмолитическое и небольшое противовоспалительное действие (Венгеровский А.И., Саратиков A.C., 1988; Модестова JI.B., Акованцева Н.В., 1984; Шкиль H.H., Быков Э.Г., 2005).

Использующиеся в настоящее время гепатопротекторы не могут одновременно восстанавливать функции печени и оказывать действие на измененную микрофлору кишечника, которая участвует в процессе метаболизма желчных кислот и детоксикации. Отдельное назначение пробиотиков, в свою очередь, не дает возможности полностью купировать воспалительные процессы в печени.

Таким образом, патогенетический подход к комплексному лечению гепатопатий предполагает восстановление микрофлоры кишечника и печени посредством использования пробиотиков и гепатопротекторов.

Многокомпонентный препарат, сочетающий в себе пробиотик и гепатопротектор, позволит действовать на несколько патогенетических механизмов одновременно.

В настоящее время в нашей стране на рынке ветеринарных препаратов нет отечественных комбинированных препаратов, в состав которых входит композиция пробиотических штаммов и гепатопротективного компонента.

Исходя из этого, является очевидной необходимость изучения вопросов совместного влияния компонентов комбинированных препаратов на гепатобилиарную и желудочно-кишечную системы и оценка их эффективности, так как они не только дополнят имеющиеся сведения о механизме действия пробиотиков и гепатопротекторов, но и будут способствовать обоснованному применению пробиотиков-гепатопротекторов в ветеринарии.

Цели и задачи исследований

Целью настоящих исследований явилась разработка нового комплексного пробиотика-гепатопротектора, изучение патогенеза гепатобилиарной системы и восстановления микробиоценоза кишечника собак в комплексной терапии гепатитов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

► в опытах на лабораторных животных изучить безвредность, острую и хроническую токсичность препарата «Гепопро»;

► оценить влияние препарата «Гепопро» на морфологическое и функциональное состояние печени лабораторных животных;

► установить гепатопротективную эффективность препарата на экспериментальной модели острого и хронического гепатита на лабораторных животных;

► провести оценку безопасности применения препарата «Гепопро»;

► изучить влияние препарата «Гепопро» на динамику восстановления кишечного микробиоценоза собак с токсическим поражением печени;

► оценить влияние препарата «Гепопро» на восстановление биохимических и клинико-морфологических показателей крови у собак с токсическим поражением печени;

► разработать методы стандартизации пробиотика-гепатопротектора «Гепопро».

Научная новизна

Впервые представлены экспериментальные данные об эффективности использования препарата пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» при токсических поражениях печени и коррекции микробиоценоза кишечника собак. Экспериментально обоснована доза и схема применения пробиотика-гепатопротектора «Гепопро».

Установлена положительная динамика влияния пробиотика-гепатопротектора на восстановление морфо-функциональной структуры печени и кишечного микробиоценоза.

Подтверждена безвредность и отсутствие острой и хронической токсичности препарата «Гепопро» в доклинических и клинических испытаниях.

Экспериментально обосновано, что разработанный пробиотик-гепатопротектор эффективен при гепатитах собак токсической этиологии. Практическая значимость

Разработана и утверждена нормативная документация на пробиотик-гепатопротектор «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®): технические условия 9337-008-16414608-2008 (согласованы с Россельхознадзором); инструкция по применению пробиотика-гепатопротектора «Гепопро^) (коммерческое название «Биопротектин»®) в ветеринарии (Утверждена Россельхознадзором)

На базе ЗАО «Партнер» (г. Москва) организовано производство препарата.

Препарат внедрен в ветеринарную практику в клиниках г. Москвы. Апробация результатов

Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактерийных болезнях животных Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»); 9-м СлавяноБалтийском форуме «Санкт-Петербург-Гастро, 2007»; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); 6-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, МГУПБ,

2007); 7-й Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, МГУПБ,

2008).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- параметры токсичности пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» для животных;

- влияние пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» на динамику восстановления морфо-функциональной структуры печени и кишечного микробиоценоза;

- биохимические и клинико-морфологические показатели крови собак при лечении токсических гепатитов различной этиологии пробиотиком-гепатопротектором;

- дозы и схема применения пробиотика-гепатопротектора «Гепопро»;

- методы контроля качества пробиотика-гепатопаротектора «Гепопро».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы из них 1 - в издании, рецензируемом ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 8 рисунками. Список использованной литературы включает 141 источник, в том числе 44 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 2004 по 2008 гг. в соответствии с планом НИР ФГУ «ВГНКИ» в лаборатории качества и стандартизации пробиотиков Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, ЗАО «Партнер», на базе ГИСК им. Л.А. Тарасевича; на кафедре незаразных болезней сельскохозяйственных животных Московского государственного университета прикладной биотехнологии и в ветеринарной клинике «На Талалихина» г. Москвы.

Пробиотик-гепатопротектор «Гепопро», содержит очищенный сухой экстракт, получаемый из плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum), и лиофилизированную массу живых антагонистически активных бактерий вида Bifidobacterium bifidum штамм № 1, Lactobacillus fermentum № 90Т-С4, иммобилизированных на лактулозе - синтетическом дисахариде и сорбированных на полисорбе. Штаммы бактерий пробионтов, входящие в состав препарата, депонированы в коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Лекарственная форма - желатин'овые капсулы. В качестве контрольного препарата сравнения использован фармакопейный препарат гепатопротектор -«Легалон».

Эксперименты проведены в два этапа (доклинические и клинические исследования) на 48 собаках различного веса и разных пород в возрасте от 1,5

до 5 лет, 65 нелинейных белых мышах и 70 мышах линии «Ыаск» массой 1419 г, 163 беспородных крысах массой 220-250 г.

Проведено 634 гематологических исследований проб крови, в том числе 317 биохимических исследований сыворотки крови и 267 бактериологических исследований проб фекалий.

Патоморфологические и гистологические исследования проведены в количестве 157 образцов.

2.1.1. Доклинические исследования

Эксперименты по определению безвредности, острой и хронической токсичности и эффективности препарата проводили на белых нелинейных мышах, мышах линии «Ыаск» и белых беспородных крысах.

Исследования проводили в четыре этапа. Препарат суспендировали в физиологическом растворе из расчета получения экспериментальных доз. Контрольным животным вводили физиологический раствор в таком же объеме, как и подопытным.

Оценку безвредности препарата проводили на 20 белых нелинейных мышах массой 18±1 г. Содержимое 6 капсул препарата разводили в 10 см3 0,9%-го раствора хлорида натрия. По 1 см3 полученной взвеси вводили 10 мышам внутрижелудочно. Наблюдение осуществляли в течение 5 суток. Критерием безвредности служили показатели выживаемости и изменение групповой массы тела мышей при сравнении опытной и контрольной групп.

Острую токсичность определяли по стандартным методикам в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ (ГФ 11 том 2), а также в соответствии с СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» (табл. 1). Исследования проводили на 70 белых мышах обоего пола массой 14-19 г (30 нелинейных белых мышей, 40 мышей линии «Ыаск»), а также на 80 нелинейных крысах обоего пола массой 220-250 г. Оценивали летальность и патоморфологические и гистологические изменения внутренних органов экспериментальных животных.

Изучение хронической токсичности проводили в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ, а также в соответствии с СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» (табл. 2) на 30 белых нелинейных и 30 мышах линии «Ыаск» массой 14-19 г, а также на 27 нелинейных крысах -самках массой 150-240 г. Оценивали летальность, массу тела и внутренних органов, морфологическое и функциональное состояние печени, а также гистологические изменения в органах и тканях.

На четвертом этапе оценивали эффективность препарата «Гепопро» на моделях острого и хронического ССЦ-индуцированного гепатита в соответствии с Методическими указаниями по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ на крысах обоего пола массой 160-200 г.

Таблица 1

Группа Вид и количество животных в группе Вес животных до введения препарата, г Вид препарата и доза введения

Опытная группа (крысы)

1 Нелинейные крысы п=16 230±10 :<Гепопро» 500 мг/кг

2 Нелинейные крысы п=16 230±10 «Гепопро» 1000 мг/кг

3 Нелинейные крысы п=16 230±10 «Гепопро» 5000 мг/кг

4 Нелинейные крысы п=16 230±10 «Гепопро» 10000 мг/кг

Контрольная группа (крысы)

5 Нелинейные крысы п=8 230±10 Физ.расгвор1 см3

6 Нелинейные крысы п=8 230±10 -

Опытная группа (мыши)

1 Белые нелинейные мыши п=10 17,2±0,2 «Гепопро» 48,8 г/кг

2 Мыши линии «black» n=I0 14,2±0,2 «Гепопро» 59,1 г/кг

3 Мыши линии «Ыаск»п=10 14,2±0,2 «Гепопро» 39,4 г/кг

Контрольная группа (мыши)

1 Белые нелинейные мыши п=10 18,0±0,8 физ. раствор 1 см3

2 Мыши линии «Ыаск» п=10 14,4±0,4 физ. раствор I см3

3 Белые нелинейные мыши п=10 17,2±0,2 интактные

4 Мыши линии «Ыаск» п=10 14,2±0,2 интактные

Таблица 2

Схема испытаний препарата «Гепопро» по оценке хронической токсичности

Группа Вид и количество животных в группе Вес животных до введения препарата, г Вид препарата и floja

Опытная группа (крысы)

1 Нелинейные крысы п=9 160±10 «Гепопро» 500 мг/кг

2 Нелинейные крысы п=9 160±10 «Гепопро» 2500мг/кг

Контрольная группа (крысы)

3 Нелинейные крысы п=9 160±10 Физ.раствор 0,5 см3

Опытная группа (мыши)

1 Белые нелинейные мыши п=10 17,2±0,2 «Гепопро» 50 мг/кг

2 Мыши линии «Ыаск» п=10 14,2±0,2 «Гепопро» 500 мг/кг

Контрольные животные (мыши)

1 Белые нелинейные мыши п=10 18,0±0,8 Физ. раствор 1 см3

2 Мыши линии «Ыаск» п=10 14,4±0,4 Физ. раствор 1 см3

3 Белые нелинейные мыши п=10 17,2±0,2 интактные

4 Мыши линии «Ыаск» п=10 14,2±0,2 интактные

Острое поражение печени вызывали внутрижелудочным однократным введением СС14 в дозе 4 см3/кг на 100 г массы тела животного. Препарат «Гепопро» в дозах 54 мг/кг, 108 мг/кг, 162 мг/кг и препарат сравнения «Легалон» в дозе 28 мг/кг вводили в желудок животного за 1 час до гепатотоксина. Наблюдение за животными велись в течение 5 дней.

Хроническое токсическое поражение печени вызывали ежедневным подкожным введением СС14 в течение 9 дней. «Гепопро» вводили внутрижелудочно ежедневно за 1 час до введения гепатотоксина в дозах 54 мг/кг, 108 мг/кг, 162 мг/кг. В качестве контроля использовали группу интактных животных и группы сравнения с острым и хроническим CCI4-индуцированным гепатитом, которые получали препарат «Легалон» в дозе 28 мг/кг.

Гематологические и биохимические исследования проб крови и сыворотки крови проводили на лабораторных анализаторах НС 5710 и Stat Fax по стандартным методикам. Функциональное состояние печени оценивали по активности в крови органоспецифических ферментов: АлАт и АсАт, щелочной фосфатазы, ЛДГ, тимоловой пробы.

Патоморфологические исследования включали в себя некропсию, макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов, которые проводили по общепринятым методикам. При вскрытии и осмотре внутренних органов оценивали состояние серозных покровов и содержимое полостей. Гистологическому исследованию подвергали следующие органы: корень языка; сердце; легкие с бронхами; тимус; желудок; печень; тонкий кишечник; почки; надпочечники; брыжеечные лимфатические узлы; головной мозг; селезенка.

Материал внутренних органов опытных и контрольных животных размером не более 10x10x0,5мм фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм изготавливали на ротационном микротоме фирмы «Reichert» (Германия). Препараты депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином.

2.1.2. Клинические исследования

Оценка безопасности применения пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» для собак в клиническом эксперименте проводилась в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ на основании результатов доклинических токсикологических экспериментов. Клинические испытания проведены на 48 собаках различных пород обоего пола. Для определения клинической эффективности препарата «Гепопро» были сформированы 6 групп собак, три группы составляли опытные животные: по 10 собак в каждой, с разными весовыми категориями (до 5 кг, от 5-10 кг, свыше 10 кг), и три контрольные группы: по 6 собак в каждой - с препаратом сравнения «Легалон», подобранные по таким же параметрам. За клиническим состоянием животных вели наблюдения в течение 30 дней.

Исследования проб крови и сыворотки крови, а также проб фекалий животных проводили до применения препарата, затем на 3, 7, 14 и 23 день исследований (табл. 3). Пробы крови брали из лучевой вены передней конечности собак. Отбор фекалий проводили после дефекации животных.

Таблица 3

Схема постановки эксперимента_

Сроки исследований, дни Группы животных, количество животных в группе

1 опыт (п=10) 2 опыт (п=10) 3 опыт (п=10) 1 контр. (п=6) 2 контр. (п=6) 3 контр. (п=6)

1 1-2 2-4 1 1-2 2-4

Дозировка препарат (капсула/ в сутки)

До введения препарата, на 3, 7,14 и 23 день введения 1.Отбор фекалий для бактериологического исследования. 2. Взятие крови для клинического и биохимического анализа крови

Клинический осмотр проводили по общепринятым методикам. В процессе исследований при необходимости применяли методы визуализации -УЗИ диагностику.

Оценка эффективности препарата «Гепопро» проводили по результатам клинических наблюдений, биохимических и клинических анализов крови, а также по результатам бактериологических анализов проб фекалий собак. Влияние исследуемых препаратов на микробиоценоз кишечника оценивали по динамике формирования популяции бифидобактерий, лактобацилл, энтерококков и кишечной палочки, как наиболее индикаторных групп микроорганизмов нормофлоры кишечника собак.

Гематологические и биохимические исследования крови собак проводили на лабораторных анализаторах по стандартным методикам. Биохимические исследования включали определение ряда показателей, характеризующих морфо-функциональное состояние печени, таких как активность АлАт, АсАт, ЛДГ, щелочная фосфатаза и концентрация общих липидов.

Микробиологические исследования фекалий собак проводили методом количественного группового анализа, согласно методическим рекомендациям Минздрава СССР «Дисбактериозы кишечника. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями, диагностика и лечение дисбактериозов кишечника» (1988). Количество микроорганизмов рассчитывали в ^ КОЕ/г по общепринятой методике.

2.1.3. Разработка методов стандартизации препарата «Гепопро» проводилась по следующим показателям: определение внешнего вида, цвета и запаха; определение растворимости; определение рН; распадаемости; определение массовой доли влаги; определение количества жизнеспособных

микроорганизмов (КОЕ); определение подлинности и количества силимара; определение микробиологической чистоты.

Полученные данные обрабатывали методом статистического анализа, с использованием пакета компьютерных статистических программ Statgraf, Systaf, Statgraf plus. Кроме того, проводили анализ результатов по Плохинскому Н.А, по Ашмарину И.П., Воробьеву A.A. (1962).

Все экспериментальные данные по изучению влияния препарата «Гепопро» в клинических исследованиях выполнены лично автором. Работа по оценке токсичности препарата «Гепопро» выполнены совместно с д.биол.н. И.Г. Осиповой, с.н.с. Н. В. Терешкиной (ГИСК им. Л. А. Тарасевича), н.с. И.В. Высочиным (Научный центр по безопасности биологически активных веществ). Всех соавторов настоящих исследований автор искренне благодарит.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Доклинические исследования

Определение безвредности препарата в доклинических испытаниях показало, что однократное внутрижелудочное введение препарата в дозе 162 мг/кг не вызвало гибели белых мышей в течение 5-дневного срока наблюдения. Данные табл. 4 свидетельствуют, что испытуемый препарат «Гепопро» безвреден. На это указывает 100%-я выживаемость опытных мышей по окончании эксперимента. При этом групповая масса мышей не стала ниже исходной величины, что подтверждает безвредность препарата и возможность его дальнейшего использования.

Таблица 4

Оценка безвредности лабораторных серий препарата «Гепопро»

Номер серии Групповая масса животных, г

Опытная группа (n= 10) Контрольная группа (п=10)

до опыта 5 день опыта до опыта 5 день опыта

1 68,86 ±0,10 76,60 ± 0,13 70,30 ±0,12 74,30 ±0,10

2 71,60 ±0,15 74,14 ±0,10 69,40 ±0,13 72,30 ±0,10

2.2.1.1. Результаты определения острой токсичности При исследовании препарата на острую токсичность все подопытные животные остались живы как при введении минимальной дозы препарата «Гепопро», которая составляла 500 мг/кг, так и при введении максимальной дозы препарата, которая составляла 10000 мг/кг, что позволило сделать вывод о приблизительной величине среднесмертельной дозы ЛД50, составляющей величину более 10000 мг/кг препарата. Следовательно, исследуемое вещество относится к малоопасным - 4 классу опасности по (ГОСТ 12.1.007-76).

Установлено, что реальная токсическая доза препарата находится в пределах от 39 до 59 г/кг, что составляет среднюю величину 55 г/кг, которая значительно превышает предлагаемую для клинических испытаний дозу.

Исследования внутренних органов опытных мышей показали отсутствие патологических изменений, при этом было отмечено, что доза 51 г/кг вызывала неравномерное полнокровие всех внутренних органов, тогда как при введении дозы 48,8 г/кг были выявлены лишь умеренные гемодинамические нарушения, выраженные в неравномерном полнокровии легких, почек и стенок толстого кишечника.

2.2.1.2. Результаты определения хронической токсичности Исследования показали, что при введении препарата «Гепопро» в дозе 50 мг/кг, а также в дозе 500 мг/кг в течение 30 дней испытуемые мыши остались живы и не имели видимых изменений общего состояния.

Введение дозы до 2500 мг/кг опытным крысам также показало 100%-ю выживаемость животных и отсутствие видимых изменений.

Кроме того, биохимические показатели крови исследуемых крыс свидетельствовали о нормальной активности в сыворотке крови ферментов -маркеров лизиса гепатоцитов.

Показатели белка, глюкозы, мочевины, билирубина и холестерина также находились в пределах физиологической нормы на 30 день применения препарата.

2.2.1.3. Результаты гистологических исследований Анализ гистологических исследований при определении хронической токсичности препарата «Гепопро» показал, что применение препарата в испытуемых дозах не вызывает структурных патологических изменений во внутренних органах лабораторных животных, что позволяет сделать заключение об отсутствии вредного токсического влияния на организм животных.

2.2.1.4.0ценка гепатопротективной эффективности препарата «Гепопро» на модели острого и хронического гепатитов По данным табл. 5 следует, что у мышей всех опытных групп, которым давали препарат «Гепопро», регистрировали снижение в сыворотке крови уровня аланинаминотрансферазы (АлАт) в полтора раза. При этом незначительно изменялся уровень аспартатаминотрансферазы (АсАт), на 30 % снижался коэффициент Ритиса (АсАт/АлАт), на 17 % уменьшилась щелочная фосфатаза, на 30 % снижалась тимоловая проба и на 25 % снижался уровень общего белка.

Тогда как у мышей в группе с препаратом сравнения «Легалон» было также отмечено снижение в сыворотке крови уровня АлАт и АсАт, коэффициент Ритиса снизился на 37 %, уменьшилось значение щелочной фосфатазы, тимоловой пробы и общего белка, по сравнению с группой опытных животных «модель», но в меньшей степени, нежели по сравнению с группой опытных животных, которым давали препарат «Гепопро».

Биохимические показатели сыворотки крови свидетельствовали о наличии умеренной гиперферментемии, следовательно, и умеренной степени цитолитического синдрома (цитолиза гепатоцитов) в группе сравнения с препаратом «Легалон».

Таблица 5

Влияние «Гепопро» на биохимические показатели сыворотки крови крыс с

хроническим гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом, __(п=Ю) ___

Вещества Доза, мг/кг АлАт, АсАт, АсАт/ АлАт ЩФ Тимол, проба, ед. Белок, г/л

«Гепопро» 54 772±103 818±29 1,0б±0,07 3836±677 2,2±0,2 82,2±9,0

«Гепопро» 108 755±94 808±22 1,07±0,06 3652±850 1,70±0,33 85,8±1,5

«Гепопро» 162 704±48* 800±22 1,14±0,09 3420±380 1,36±0,28 88,1±2,0

«Легалон» 28 815±95 816±24 0,96±0,09 3813±43б 3,12±0,23 80,3±4,0

Модель — 992±125* 836±29 0,84±0,08* 4114±370* 4,14±0,3* 76,2±1,0*

Интактная — 684±47 802±22 1,17±0,08 3528±451 1,38±0,3 90,0±12,0

Примечание: *достоверное отклонение от интактных животных (р< 0,05); - модель - группа животных с индуцированным гепатитом; — группа животных без применения терапии.

Однако одновременное введение животным препарата «Гепопро» во всех испытанных дозах улучшило биохимические показатели сыворотки крови. Наиболее значительно снизило степень цитолиза введение препарата «Гепопро» в дозе 162 мг/кг.

При анализе биохимических показателей выявлено, что введение животным СС14 вызывало значительные сдвиги в липидном обмене гепатоцитов.

Как видно из данных табл. 6, уровень общего холестерина в печени крыс вырос более чем в 3 раза и, соответственно, возросли в процентном соотношении: триглицериды. (ТГ); эфиры холестерина (ЭХ), а в абсолютных величинах: ЭХ, ТГ, неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), свободный холестерин (СХ), общий холестерин (ОХ), фосфолипиды (ФЛ). Кроме того, изменилось процентное соотношение липидных фракций в печени.

Таблица 6

Влияние «Гепопро» на липидный состав печени крыс с хроническим

гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом(%), п = 10

Вещества Доза, мг/кг ФЛ СХ НЭЖК ТГ ЭХ ОХ, %

«Гепопро» 54 27,2±1,4* 23,4±0,8* 7,2±0,5* 10,8±1,7* 6,4±0,3* 1,36±0,08

«Гепопро» 108 28,0±0,2* 26,3±0,4 9,4±0,4* 11,9±2,0* 5.9±1,2* 1,09±0,05*

«Гепопро» 162 31,2±1,3* 33,6±0,3* 10,8±0,5* 13,0±3,0* 5,1±1,3* 0,76±0,09*

«Легалон» 28 26,5±1,4* 22Д±0,7* 6,9±0,3* 10,1±1,2 6,8±0,1* 1,92±0,02

Модель — 39,1±3,0 15,7±0,8** 4,0±0,6** 34,0±3,4* 7,2±0,8 2,08^,02**

Интактная — 32,0±3,8 35,5±0,8 12,8±2,2 15,5±0,9 4,5±1,8 0,62±0,08

Примечание:* - достоверное отклонение от модели (р< 0,05); ** - достоверное отклонение от интактных животных (р<0,05)

Введение препарата «Гепопро» привело к снижению доли общего холестерина по сравнению с контрольными показателями модели гепатита, уровень фосфолипидов как в абсолютном, так и процентном отношении приблизился к показателям интактных животных, снизился по сравнению с моделью уровень эфиров холестерина и повысился уровень неэтерифицированных жирных кислот, что является показателем стимуляции компенсаторных механизмов, направленных на нормализацию липидного обмена в печени. При введении более высоких доз препарата возрастает доля фосфолипидов, триглицеридов и снижается доля свободного холестерина и неэтерифицированных жирных кислот, что свидетельствует о превышении процессов липосинтеза над процессами липолиза.

Введение препарата «Легалон» также снизило уровень фосфолипидов, но в меньшей степени по сравнению с препаратом «Гепопро», при этом уровень неэтерифицированных жирных кислот повысился незначительно.

Полученные результаты подтверждены результатами гистологических исследований. При введении гепатотоксина было выявлено значительное повреждение паренхимы печени экспериментальных животных, при этом балочная структура печени сохранялась лишь в центре дольки печени у 60 % животных, а у остальных структура была нарушена как в центре, так и на периферии дольки. Во всех случаях наблюдалась белковая и жировая дистрофия печени.

Введение пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» в дозах 28 и 54 мг/кг оказывало гепатопротективное действие, при этом была снижена степень белковой дистрофии. Однако применение препарата в дозах 108 и 162 мг/кг оказывало более выраженный гепатопротективный эффект, который выражался в отсутствии признаков белковой и жировой дистрофии, при этом балочные структуры паренхимы печени не отличались от структуры печени у интактных животных

2.2.1.5. Оценка безопасности пробиотика-гепатопротектора «Гепопро»

После исследований на лабораторных животных нами была проведена экстраполяция результатов на собак разного веса, что позволило на стадии доклинического изучения нового комбинированного пробиотика-гепатопротектора прогнозировать его безопасные дозы и курс применения препарата.

При этом была сделана оценка безопасности препарата «Гепопро». Вычисление индекса безопасности показало, что число, получаемое при его расчете, составляет величину, большую 5, следовательно, по классификации безопасности лекарственных средств препарат «Гепопро» можно отнести к 3 классу опасности, т. е. к классу малоопасных препаратов.

Все полученные в ходе доклинических исследований данные позволяют охарактеризовать «Гепопро» как безвредный, нетоксичный, с широким диапазоном терапевтического действия препарат.

2.2.2. Клинические исследования 2.2.2.1. Оценка клинического статуса животных с токсическим

гепатитом

Следующим этапом исследований было проведение клинических испытаний комплексного пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» на собаках, больных токсическим гепатитом различной этиологии. При этом клинический осмотр животных выявил общее угнетенное состояние со сниженной динамической активностью. Во всех случаях наблюдалась брадикардия и полипное. В 89 % случаев были отмечены рвота и диарея. Наблюдали истеричность слизистых оболочек ротовой полости и склер глаз у 65 %, а также выявляли болезненность в области печени и гепатомегалию.

2.2.2.2.Результаты изучения микробиоценоза кишечника собак больных токсическим гепатитом По результатам исследований (табл. 7) кишечного микробиоценоза собак поступивших с предварительным диагнозом токсический гепатит, до применения препарата «Гепопро» установлено статистически достоверное (р<0,05) снижение количества лактозопозитивных эшерихий до показателя на два логарифма ниже показателя нормы, т.е. до показателя 5,56±0,19 4? КОЕ/г -у собак в первой подгруппе; 6,02±0,49 КОЕ/г - во второй подгруппе и 6,48±0,14 КОЕ/г - в третьей подгруппе опытной группы.

В группах собак, сформированных для сравнительной оценки с испытуемым препаратом «Легалон», показатели лактозопозитивных эшерихий составили 5,49±0,27 КОЕ/г в первой подгруппе; 6,18±0,02 /£ КОЕ/г - во второй подгруппе и 5,64±0,24 1% КОЕ/г - в третьей подгруппе.

Количество выделенных эшерихий со сниженной ферментативной активностью составило 6,73±0,24 4г КОЕ/г у собак в первой подгруппе; 7,03±0,20 4? КОЕ/г - во второй подгруппе; 7,57±0,31 КОЕ/г - в третьей подгруппе опытной группы, сформированных для оценки терапевтической эффективности препарата «Гепопро». При этом в группах сравнения с препаратом «Легалон» были выделены эшерихии со сниженной ферментативной активностью в количестве: 7,67±0,08 /£ КОЕ/г - в первой подгруппе; 6,83±0,54 КОЕ/г - во второй подгруппе и 6,56±0,01 /£ КОЕ/г - в третьей подгруппе.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что при токсическом гепатите в пробах фекалий собак значительно увеличивается количество условно патогенных микроорганизмов, таких как сальмонеллы. Так, у собак в первой подгруппе их количество было равно 3,27±0,24 /# КОЕ/г, во второй подгруппе - 3,88±0,41 КОЕ/г ; в третьей подгруппе опытной группы - 3,07±0,17 КОЕ/г. Такая же картина наблюдалась в контрольной группе, показатели в которой составили -3,97±0,17 КОЕ/г - в первой подгруппе; 4,03±0,05 КОЕ/г - во второй подгруппе и 3,57±0,06 КОЕ/г в третьей подгруппе.

Таблица 7

Состояние кишечного микробиоценоза собак с клиническими признаками токсического гепатита до применения исследуемых препаратов

Микроорганизмы Группы собак

Опытная («Гепопро») I Контрольная («Легалон»)

1 подгруппа опытная п=10 2 подгруппа опытная п=10 3 подгруппа опытная п=10 1 подгруппа контр. п=6 2 подгруппа контр. 11=6 3 подгруппа контр. п=6

Количество микроорганизмов (lg КОЕ /г)

E.coli лактазопозити-вные 5,56±0,19 6,02±0,49 6,48±0,14 5,49±0,27' 6,18±0,02'" 5,64±0,24

E.coli со сниженной лакт. активн. 6,73±0,24* 7,03±0,20' 7,57±0,31 7,67±0,08 6,83±0,54 6,56±0,0Г"

Salmonella 3,27±0,24* 3,88±0,41 3,07±0,17" 3,97±0,17 4,03±0,05'" 3,57±0,0б"'

Enterococcus 6,67±0,17 6,54±0,09 6,47±0,52 6,41±0,07" 7,01±0,07*" 7,78±0,14

Staphylococcus 3,66±0,16 4,16±0,18 4,22±0,28' 4,86±0,09" 3,98±0,07'" 4,07±0,17

Lactobacillus 6,11 ±0,69 6,81±0,32 6,29±0,61 6,56±0,23 6,20±0,29 6,38±0,25*

Bifidobacterium 7,48*0,04'" 8,03±0,05"' 8,42±0,32 8,57±0,06к" 8,78±0,31 8,86±0,09'"

Дрожжи 4,49±0,14 4,77±0,43 4,54±0,09*" 4,47±0,0б" 5,01±0,19" 5,П±0,13

Протей 2,57±0,17" 3,56±0,41 3,82±0,04'" 3,12*0,09'" 3,23±0,42 2,98±0,02

Примечание. * р<0,10; " р<0,05; *** р<0,01 достоверность различий с соответствующим показателем контрольной группы

В кишечном микробиоценозе больных собак с большой долей достоверности (р<0,01) уровень энтерококков достигал значения 6,67±0,17 ^ КОЕ/г в первой подгруппе; 6,54± 0,09 КОЕ/г - во второй подгруппе и 6,47±0,52 ^ КОЕ/г - в третьей подгруппе опытной группы, а также 6,41±0,07 КОЕ/г; 7,01±0,07 1% КОЕ/г; 7,78±0,14 КОЕ/г - в трех подгруппах контрольной группы по сравнению с показателями нормобиоза, которые составляли 7,59±0,45 ^ КОЕ/г.

Фактор токсикоза вызвал незначительное увеличение популяционного уровня коагулазонегативных стафилококков до 3,66±0,16 ^ КОЕ/г в первой подгруппе, 4,16±0,18 /£ КОЕ/г во второй подгруппе и 4,22±0,28 КОЕ/г в третьей подгруппе опытной группы. У собак трех групп, предназначенных для сравнительных испытаний с контрольным препаратом «Легалон», количество стафилококков составляло 4,86±0,09 КОЕ/г; 3,98±0,07 1% КОЕ/г; 4,07±0,17 КОЕ/г соответственно.

Уровень лактобацилл у собак с токсической формой гепатита так же был занижен и составлял в первой группе 6,11±0,69 КОЕ/г, во второй -6,81±0,31 КОЕ/г и в третьей - 6,29±061 /£ КОЕ/г и, соответственно, уровень

бифидобактерий составил в первой подгруппе опытной группы 7,48±0,04 КОЕ/г, 8,03±0,05 ^ КОЕ/г - во второй подгруппе и 8,42±0,32 1% КОЕ/г - в третьей подгруппе опытной группы.

Такая же тенденция наблюдалась в группе с контрольным препаратом «Легалон»: уровень лактобацилл составил 6,56±0,23 /£ КОЕ/г в первой подгруппе; 6,20±0,29 ^ КОЕ/г - во второй подгруппе и 6,38±0,25 КОЕ/г - в третьей подгруппе. В то время как уровень бифидобактерий в контрольной группе составил 8,57±0,06 ^ КОЕ/г в первой подгруппе; 8,78±0,31 КОЕ/г -во второй подгруппе и 8,86±0,09 КОЕ/г - в третьей подгруппе.

Дрожжи были выделены так же у 100 % животных: 4,49±0,014 ^ КОЕ/г - в первой подгруппе; 4,77±0,43 /§ КОЕ/г - во второй продгруппе и 4,54±0,09 ^ КОЕ/г - в третьей подгруппе опытной группы, подобранных для испытаний с препаратом «Гепопро». Уровень дрожжей в пробах фекалий собак группы сравнения с препаратом «Легалон» составил соответственно 4,47±0,06 КОЕ/г в первой подгруппе; 5,01±0Д9 КОЕ/г - во второй подгруппе и 5,11±0,13 /£ КОЕ/г - в третьей подгруппе, тогда как клиническая норма составляет 3,69± 0,87 /я КОЕ/г.

У собак всех групп при исследовании кишечного микробиоценоза до применения терапии были выделены микроорганизмы рода Протей. В опытной группе показатели составили 2,57±0,17 % КОЕ/г в первой подгруппе; 3,56±0,41 КОЕ/г - во второй подгруппе и 3,82±0,04 /^ КОЕ/г - в третьей. Так же микроорганизмы этого вида были выделены в контрольной группе в количестве 3,12±0,09 /£ КОЕ/г в первой подгруппе; 93,23±0,42 /£ КОЕ/г - во второй подгруппе и 2,98±0,02 /£ КОЕ/г - в третьей подгруппе.

Таким образом, характер изменения микроэкологии кишечника у собак с токсическим гепатитом свидетельствует о наличие дисбактериоза.

2,2.2.3. Влияние препарата «Гепопро» на микробиоценоз кишечника собак с токсическим гепатитом Было отмечено, что на третий день терапии показатели кишечного биоценоза не улучшились и оставались на уровне состояния до проведения терапии. Данный факт, по-видимому, связан с проявлением токсикоза и длительной, более 3 дней, диареей (рис. 1).

Рисунок 1

10 ъ □ Ecoli 10 п Ш Есой

в 1 | а Salmonella a Salmonella

4 □ Enterococcus IT □ Enterococcus

2 1 п_ □ Staphylococcus 2 -JBl— jl □ Staphylococcus

[HI я Lactobacillus

/ / А / / V Q Bifidobacterium а Дрожжи □ Протей # ^ ¿Г ^ Jy с «Ъ / ^ ^ ^ О Bifidobacterium О Дрожжи □ Протей

применение «Гепопро» применение «Легалон»

Применение препарата «Гепопро» на 7 день улучшило показатели микробиоценоза кишечника во всех группах исследуемых собак. Отмечена статистически достоверная тенденция к снижению количества условно патогенных микроорганизмов. Однако следует отметить, что препарат «Гепопро» значительно повысил уровень энтерококков, лактобацилл и бифидобакгерий, тогда как в группах с контрольным препаратом «Легалон» уровень пробиотичекой флоры увеличился незначительно.

Более выраженные изменения нами наблюдались на 14 день проведения лечения и имели тенденцию к восстановлению нормобиоза кишечника к 23 дню. При этом применение препарата «Гепопро» на всех сроках исследований, начиная с 14 дня, значительно влияло на повышение уровня лактофлоры и бифидобактерий по сравнению с контрольной группой, где применялся препарат «Легалон». Популяционный уровень лактобацилл и бифидобактерий увеличился и достиг показателей нормобиоза, тогда как в контрольных группах к 23 дню популяционный уровень лактобацилл был меньше нормы на один логарифм так же, как и показатель популяционного уровня бифидобактерий.

На фоне увеличения пула пробиотической флоры было отмечено статистически достоверное снижение уровня условно патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл, протея, стафилококков. Уже через 14 дней применения препарата «Гепопро» популяционный уровень сальмонелл снизился до показателя нормы, тогда как в контрольных группах с препаратом «Легалон» он находился выше нормативного показателя (табл. 8).

Таблица 8

Состояние кишечного микробиоценоза собак с клиническими признаками токсического гепатита на 23 сутки комплексной терапии с опытным препаратом «Гепопро» и контрольным препаратом «Легалон»

Микроорганизмы Группы собак

1 опытн. п=10 2 опытн. п=10 3 опытн. п=10 1 контр. п=6 2 контр. п=6 3 контр. п=6

Количество микроорганизмов (/# КОЕ /г)

E.coli лактазопозитивные 6,41±0,0Г" 7,01±0,19 " 7,11±0,13" 6,16±0,18 6,32±0,42 6,22±0,28

E.coli со сниж. лакт. активн. 5,57±0,0б" 5,64±0,52" 6,23±0,4" 7,11±0,69 6,09±0,08 6,27±0,5

Salmonella - - - 2,42±0,32 2,78±0,31 2,57±0,54

Enterococcus 7,22±0,49" 7Д2±0,7 7,29±0,07 6,66±0,17 6,88±0,4 7,17±0,1

Staphilococcus - - 2,88±0,41" 3,22±0,35 3,54±0,09 4,03±0,62

Lactobacillus 7,82±0,07"' 7,99±0,5l"j 8,01±0,18"j 7,68±0,14 7,81±0,32 7,98±0,69

Bifidobacterium 8,96±0,1б"' 9,03±0,05" 9,51±0,l"* 8,98±0,22 8,87±0,92 8,84±0,24

Дрожжи 3,03±0,59 3,56±0,23 3,29±0,6 4,0,3±0,61 4,75±0,75 4,38±0,25

Протей - - • 2,42±0,25 2,84±0,24 2,56±0,23

Примечание.' р<0,10; " р<0,05; *" р<0,01-достоверность различий с соответствующим показателем контрольной группы

К 23 дню комплексной терапии во всех опытных группах с применением препарата «Гепопро» микроорганизмы рода сальмонелл выделены не были, тогда как в контрольных группах этот показатель находился в пределах нормы.

При этом применение препарата «Гепопро» наиболее эффективно сдерживало рост условно-патогенной дрожжеподобной микрофлоры, чем применение контрольного препарата «Легалон».

Таким образом, можно сделать вывод, что восстановление микробиоценоза кишечника при токсическом поражении печени собак приходится не ранее, чем на 7 день и проявляется уменьшением количественного состава условно патогенных микроорганизмов и увеличением популяционного уровня нормофлоры.

2.2.2.4. Оценка функции гепатобилиарной системы собак больных токсическим гепатитом, по биохимическим показателям крови до

применения препарата Результаты биохимических исследований крови собак, представленные на рис. 2, показали явные отклонения от нормы в сторону увеличения по показателям АлАт, АсАт, холестерина, общего билирубина, щелочной фосфатазы, ЛДГ, общего белка, альбумина, глобулинов.

Так, показатели АлАт у собак в опытной группе варьировали от 88,24±0,03 до 96,66±0,03 МЕ/л, у собак в контрольной группе - от 58,55±0,04 до 69,55±0,04 МЕ/л; при этом показатель АсАт варьировал от 85,10±0,01 до 111,20±0,03 МЕ/л в опытной группе и от 68,12±0,02 до 95,44±0,01 МЕ/л в контрольной группе.

Концентрация ЛДГ составляла 165,10±0,01 Е/л; 171,50±0,02 Е/л; 160,20±0,04 Е/л в опытной группе и 138,00±0,04 Е/л; 128,00±0,01 Е/л; 115,30±0,03 Е/л в контрольной группе, а щелочной фосфатазы 77,30±0,4 МЕ/л; 82,10±0,3 МЕ/л; 93,30±0,06 МЕ/л в опытной группе и 65,50±0,07 МЕ/л; 89,60±0,03 МЕ/л; 82,20±0,002 МЕ/л в контрольной группе. Показатели общего билирубина превышала норму и составили 3,83±0,02 мкмоль/л; 4,10±0,02 мкмоль/л; 3,60±0,03 мкмоль/л в опытной группе и, соответственно, 4,30±0,06 мкмоль/л; 3,90±0,01 мкмоль/л; 4,19±0,07 мкмоль/л - в контрольной группе. Показатели холестерина также были выше нормы и составили 10,60±0,03 ммоль/л; 9,90±0,01 ммоль/л; 10,20±0,03 ммоль/л у собак в опытной группе и 6,80±0,02 ммоль/л; 7,10±0,02 ммоль/л; 6,60±0,05 ммоль/л у собак в контрольной группе, при этом показатель глюкозы превысил нормативный показатель лишь в одном случае в опытной группе, что составило 6,43±0,01 ммоль/л.

Количество общего белка варьировало от 73,60±0,30 до 75,60±0,20 г/л в опытной группе и от 74,99±1,30 до 75,30±0,30 г/л в контрольной.

Рисунок 2

Влияние препарата «Гепопро» и «Легален» на биохимические показатели ______крови собак

а билирубин общий □ АЛТ О АСТ

■ Щелочная фосфатаза

сз лдг

а холестерин

на 23 день применения препарата «Гепопро»

до применения препарата «Легалон»

до применения препарата «Гепопро»

О обилий белок еш билирубин общий

□ АЛТ

□ АСТ

в Щелочная фосфа газа

[ О общий бело« ; в билирубин общий ОЩ а АСТ

* Щелочная фосфата» | О ЛДГ

I Я иэлесторин__

2.2.2.5. Влияние препарата «Гепопро» на биохимические показатели крови собак с токсическим гепатитом

Следует отметить, что в процессе применения препаратов изменения биохимических показателей сыворотки крови в сторону улучшения были зарегистрированы у собак во всех группах.

При этом щелочная фосфатаза и ЛДГ имели тенденцию к снижению уже на 7 день терапии, тогда как показатели АлАт и АсАт оставались на прежнем уровне.

Наиболее заметные изменения имели место при применении препарата «Гепопро» в комплексной терапии гепатитов на 23 день. Показатели белка, билирубина, АлАт и АсАт, ЛДГ, ЩФ и холестерина приблизились к норме. Показатели восстановления индикаторных ферментов при терапии с применением препарата «Легалон» были значительно ниже.

2.2.2.6. Оценка функции гепатобилиарной системы собак с токсическим гепатитом по клиническому анализу крови Как видно на рис. 3, при клиническом анализе крови собак с токсическим гепатитом во всех случаях было зафиксировано значение гематокрита в опытной группе 44,20±0,30 %; 43,50±0,05 %; 44,80±0,30 % и 45,10±0,10 %; 42,50±0,50 %; 44,25±0,25 % в контрольной группе. Показатели гемоглобина составили 9,60±0,02 г/дл; 11,50±0,05 г/дл; 10,20±0,40 г/дл в опытной группе и 12,000±0,002 г/дл; 11,90±0,03 г/дл; 12,20±0,70 г/дл в контрольной группе, что ниже нормативного показателя.

Кроме того, у больных собак было зафиксировано повышение СОЭ до показателей: 9,00±0,60 мм/ч; 8,26±0,90 мм/ч; 13,10±0,90 мм/ч у собак в опытной группе и 11,70±0,80 мм/ч; 9,50±0,20 мм/ч; 10,30±0,20 мм/ч у собак в контрольной группе. При этом значения показателей лейкоцитов находились в пределах физиологической нормы.

Анализ лейкоцитарной формулы у собак, больных токсическим гепатитом, выявил отклонение от физиологической нормы. Так, например, палочкоядерные нейтрофилы составляли 6,50±0,03%; 3,50±0,005%; 4,00±0,02% в опытной группе и 5,15±0,02%; 5,70±0,2%; 4,25±0,2% в контрольной группе, что превышает физиологическую норму. Относительное количество сегментоядерных нейтрофилов составляло 3б,20±0,03 %; 36,10±0,02 %; 32,80±0,20 % в опытной группе и 31,70±0,30 %; 38,20±0,70 %; 35,00±0,03 % - в контрольной группе, находясь в пределах нормы так же, как эозинофилы и моноциты. Следует отметить, что показатели базофилов и юных нейтрофилов незначительно завышали верхние границы нормы.

2.2.2.7. Влияние препарата «Гепопро» на восстановление морфологических показателей крови собак, больных токсическим гепатитом

Результаты исследований анализа крови животных на 3 день во всех группах как в опытных, так и в контрольных, не показали существенных изменений, что связано, вероятно, с высокой степенью интоксикации организма животных.

Рисунок 3

Влияние препарата «Гепопро» на динамику восстановления морфологических показателей крови

до применения

Гепопро Гепопро Гепопро Легалон Легалон Легалон

□ эритроциты

ш гематокри

□ гемоглобин

□ соэ

ш лейкоциты

ЕЗ нейтрофилы

Ш юные

□ папочкоядерные

т сегментоядерные

ш лимфоциты

□ эозинофилы

а моноциты

т базофилы

ш базофилы

Ез эритроциты Ш гематскри

□ гемоглобин

□ соэ

О лейкоциты О нейтрофилы Ш юные

□ палочкоядерные В сегментоядерные т лимфоциты

□ эозинофилы |ЕЭ моноциты Ш-€азофияы-------

1 опыт Гепопро

2 опыт Гепопро

3 опыт Гепопро

1 контр Легалон

2 контр Легалон

3 контр Легалон

На 23 день применения

Однако уже на 7 день комплексной терапии нами было отмечено увеличение гематокрита и гемоглобина. При этом уровень СОЭ и лейкоцитов во всех группах с препаратом «Гепопро» находился в пределах нормы, тогда как в контрольных группах с препаратом «Легалон» эти показатели все еще превышали норму.

К 23 дню терапии наблюдалась положительная динамика восстановления показателей крови животных во всех группах. Однако в группах с препаратом «Легалон» гематокрит, так и не достиг физиологической нормы, а показатель СОЭ по-прежнему оставался выше нормы.

Следует отметить, что лейкоцитарная формула в опытной группе животных с применением препарата «Гепопро» не имела отклонений от нормы, тогда как в контрольной группе животных на 23 день применения препарата «Легалон» все еще сохранялось повышенное значение показателей палочкоядерных нейтрофилов и лейкоцитов.

Таким образом, применение препарата «Гепопро» имело наибольший положительный эффект по сравнению с контрольным препаратом «Легалон». При этом следует отметить, что восстановление клинических показателей крови животных с контрольным препаратом «Легалон» происходило медленно и к концу срока исследования приблизилось к показателю физиологической нормы, однако его не достигло.

Эффективность терапии обусловлена более быстрой дезинтоксикацией и регенерацией гепатоцитов за счет двойного действия препарата, как на желудочно-кишечный тракт, так и на печень. Побочных действий в процессе применения препарата «Гепопро» выявлено не было.

2.2.3. Стандартизация показателей качества пробиотика-гепаТопротектора «Гепопро»

Для разработки нормативной документации на пробиотик-гепатопротектор «Гепопро» была проведена стандартизация препарата по показателям, указанным в табл. 9.

Комплексный препарат пробиотик-гепатопротектор «Гепопро» содержит лиофилизированную микробную массу бифидобактерий Bifidobacterium bifidum № 1 и лактобактерий Lactobacillus fermentum № 90Т-С4, сорбированных на полисорбе и лактулозе (синтетический дисахарид), а также гепатопротекторе - Силимар® (очищенный сухой экстракт, получаемый из плодов Расторопши пятнистой (Silybum marianum).

Указанные показатели позволяют оценить препарат «Гепопро» как соответствующий требованиям, предъявляемым к категории

иммунобиологических препаратов.

Таблица 9

Показатели качества препарата «Гепопро»

Наименование показателя Хараетеристика и нормы Методы испытаний

капсула № 0 капсула № 3

1 2 3 4

Внешний вид и цвет и запах Твердая голубая желатиновая капсула, цилиндрической формы с полусферическими концами, в которой содержится порошок от светло-желтого до светло-коричневого цвета, без запаха Прозрачная желатиновая капсула, цилиндрической формы с полусферическими концами, в которой содержится порошок от серого до светло-бежевого цвета, со специфическим кисломолочным запахом Определение внешнего вида и цвета проводят визуально (устанавливается сравнением образца с характеристик ой, указанной в ТУ)

Растворимость, мин 5,0 5,0 По ГФ X, стр 133

Определение рН 6,0 По ГФ X

Массовая доля влаги, % не более 5 По ГОСТ 13496.4-93

Распадаемость, мин Не более 20 По ГФ XI, 156

Количество жизнеспособных микроорганизмов КОЕ/капсула, не менее Bifidobacterium bifidum Lactobacillus fermentum 5х107 5x107 По ГОСТ 10444.12

Подлинность силимара Появление малинового окрашивания По ФС 423879-99

Количество силимара калсула/r, не менее 0,1 По ФС 423879-99

Микробиологическая чистота, наличие: Pseudomonas aeruginosa; Enterobacteriaceae; Staphylococcus aureus; Посторонних микроорганизмов, в т.ч. грибов, не более тыс./капсула. Не допускается Не допускается Не допускается 50,0 По ГОСТ 28085-89

Безвредность в тест-дозе на одну мышь Безвреден На лабораторных животных по ГФ XI

выводы

1. Теоретически обоснована целесообразность и возможность конструирования нового пробиотика-гепатопротектора «Гепопро».

2. Теоретически обоснован композиционный состав пробиотка-гепатопротектора «Гепопро», включающий в себя гепатопротеетивную субстанцию и пробиотическую композицию

3. В опытах на лабораторных животных изучена безвредность, острая и хроническая токсичность пробиотика-гепатопротектора «Гепопро». Установлено, что препарат относится к 3 классу безопасности и является малоопасным препаратом.

4. На модели животных с ССЦ индуцированным токсическим гепатитом установлено, что препарат способствует восстановлению морфо-функциональных показателей печени, а также показателей ферментного и липидного обмена. Дозы препарата «Гепопро» 108 и 162 мг/кг оказывают более выраженный гепатопротективный эффект. Отмечено значительное снижение белковой и жировой дистрофии, восстановление балочной структуры и паренхимы печени.

5. В доклинических исследованиях определены профилактические и лечебные дозы пробиотика-гепатопротектора, а также оптимальный курс лечения. Результаты исследований экстраполированы на собаках разных половозрастных групп.

6. Установлено, что применение пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» в комплексной терапии токсических гепатитов у собак способствует восстановлению микробиоценоза кишечника за счет повышения популяционного уровня бифидобактерий с 7,48±0,04 lg КОЕ/г; 8,030±0,005 lg КОЕ/г; 8,42±0,32 lg КОЕ/г до 8,96±0,16 lg КОЕ/г; 9,03±0,05 lg КОЕ/г; 9,51±0,10 lg КОЕ/г и лактобацилл с 6,11±0,69 lg КОЕ/г; 6,81±0,32 lg КОЕ/г; 6,29±0,61 lg КОЕ/г до 7,82±0,07 lg КОЕ/г; 7,99±0,51 lg КОЕ/г; 8,01±0,18 lg КОЕ/г соответственно, а также снижения интенсивности колонизации кишечника условно патогенными микроорганизмами на 23 день терапии.

7. Применение пробиотика-гепатопротектора в комплексной терапии гепатитов токсической этиологии у собак обеспечивает восстановление биохимических показателей крови на 23 день комплексной терапии, что проявляется позитивной тенденцией развития активности гепатоэнзимов АлАт и АсАт и ЛДГ, нормализацией активности щелочной фосфатазы до пределов физиологической нормы.

8. Применение пробиотика-гепатопротектора способствует восстановлению морфофункционального состояния печени и микробиоценоза кишечника у собак, следствием чего является стабилизация физиологического состояния и увеличение массы тела животного.

9. Разработанные методы контроля пробиотика-гепатопротекора «Гепопро» позволяют стандартизировать препарат для обеспечения производства лекарственного средства для животных стабильного качества.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация на препарат «Гепопро» коммерческое название «Биопротектин®»:

технические условия 9337-008-16414608-2008 (согласованы Россельхознадзором);

- инструкция по применению препарата «Гепопро» коммерческое название «Биопротектин®» в ветеринарии (Утверждено Россельхознадзором);

рекомендации по применению препарата «Гепопро» коммерческое название «Биопротектин®» для лечения токсических гепатитов собак.

2. Препарат внедрен в ветеринарную практику в клиниках г. Москвы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Панина Т.В. Изучение влияния препарата «Гепопро» на функцию печени животных / Т.А. Панина, Б.В. Уша // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГПБ, 2007. - С. 256.

2. Панина Т.В. Изучение влияния комплексного пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» в доклинических исследованиях на лабораторных животных / Т.А. Панина, Н.И. Малик, Б.В. Уша, Т.В. Мацулевич // Сб. научн. тр. ВГНКИ. М., 2007. - Т. 68. - С. 139.

3. Панина Т.В. Современный подход к терапии токсического поражения печени различной этиологии у собак / Т.А. Панина, Н.И. Малик, В.Д. Болотов, Б.В. Уша // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: материалы Международного конгресса // Клиническое питание. - 2007. - № 1 -2. - С. А60.

. 4. Панина Т.В. Оценка токсичности препарата «Гепопро / Т.А. Панина, Н.И. Малик, Б.В. Уша, Т.В. Мацулевич // Ветеринария. - 2007. - № 10. - С. 4648.

Подписано в печать 22.12.2008. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ ООО «Полисувенир» 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

Тел. 677-03-86

Оглавление диссертации Панина, Татьяна Владимировна :: 2009 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ13

1.1. Классификация патологий печени13

1.2. Строение и функции печени18

1.3. Методы коррекции и восстановления гомеостаз печени23

1.4. Взаимосвязь гепатобилиарной и желудочно-кишечной систем и их роль в процессе детоксикации организма28

1.5. Микробиоценоз кишечника собак30

1.6. Методы коррекции микробиоценоза кишечника33

Введение диссертации по теме "Патология, онкология и морфология животных", Панина, Татьяна Владимировна, автореферат

Актуальность темы. За последние годы в ветеринарии приобрела особую актуальность проблема роста патологий гепатобилиарной системы, которые негативно влияют на физиологический статус организма животного.

Большая часть гепатобилиарных патологий этиологически и патогенетически взаимосвязана с желудочно-кишечными патологиями, в том числе с количественными и качественными изменениями микрофлоры желудочно-кишечного тракта, которые способствуют формированию неспецифического реактивного гепатита, внутрипеченочного холестаз, печеночно-клеточной дисфункции, воспалительных процессов внепеченочного билиарного тракта.

Современные экологические условия, увеличение интенсивности воздействия химико-физических и биологических факторов, а также чрезмерное назначение лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков и гормонов, несбалансированное кормление, создают предпосылки к росту таких патологий. Это касается, в первую очередь, аспектов воспроизводства и содержания собак.

Доказано, что печень и микрофлора кишечника участвуют в процессах печеночно - кишечной рециркуляции различных органических и неорганических соединений. Следовательно, печень и микрофлора пищеварительного тракта являются двумя взаимосвязанными детоксикационными системами микроорганизма [22, 72, 73, 112]. При этом повреждение печеночных клеток, снижение их функциональной активности неизбежно ведет к увеличению воздействия токсических веществ на кишечную микрофлору, что может быть причиной нарушений микробиоценоза кишечника, в свою очередь эти нарушения индуцируют детоксикационную функцию микрофлоры, тем самым, увеличивая токсическую нагрузку на печень [9, 21, 73, 75, 114].

Очевидно, что необходимость конструирования и применения пробиотика с гепатопротективным действием напрямую связана с частотой возникновения патологий гепатобилиарной и гастроинтестинальных систем различной этиологии.

Комбинированное применение гепатопротекторов с использованием пробиотических композиций является эффективным инструментом в компенсации патологии печени и нарушении микробиоценоза.

Пробиотики — лекарственные препараты, состоящие из микроорганизмов нормальной микрофлоры человека и животных и оказывающие полезное действие на животное-хозяина путем улучшения его кишечного микробного баланса [53,102,104].

Главной целью использования пробиотиков является защита целостности популяции кишечной микрофлоры посредством стимуляции роста полезных микроорганизмов или посредством внесения полезных бактерий путем прямого принудительного засева [89,98].

В современных условиях пробиотики служат важным и необходимым инструментом защиты организма, в первую очередь, от дисбактериозов, возникающих как следствие нерациональной антибиотикотерапии, перенесенных кишечных заболеваний, длительного применения противовоспалительных препаратов, цитотоксической терапии, неправильного питания и стрессов [36, 37,100].

Назначение пробиотиков при патологиях печени позволяет уменьшить степень эндогенной интоксикации, уменьшая образование токсических эндогенных соединений, в том числе и солей желчных кислот [23, 61].

Следует отметить, что ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной терапии для лечения заболеваний печени, составляет более одной тысячи лекарственных средств.

Однако среди них выделяют небольшую группу препаратов, действие которых направлено на восстановление гомеостаза печени, нормализацию активности органа и стимуляцию регенеративных процессов — гепатопротекторы, которые составляют 9,2% от общего количества лекарственных средств [11].

По механизму действия они подразделяются на следующие группы:

- антиоксиданты — растительные полифенолы (силибор, силимар, карсил, катерген, сибектан, гепатофальк планта, легалон, фламин, конвафлавин), витамины (а-токоферол, ретинол, пантотеновая кислота, витогепат), тиолы (цистеин, N-ацетилцистеин, малотилат);

- средства, осуществляющие репарацию мембран гепатоцитов - препараты фосфолипидов (эссенциале, липостабил);

- стимуляторы регенерации паренхимы печени (метионин, уридин, цитидин, оротовая кислота).

Вследствие наибольшей доступности, самыми применяемыми препаратами в ветеринарии являются лекарственные средства, в основу которых входят естественные или полусинтетические флавоноиды расторопши пятнистой (Silybum marianum).

Основным компонентом экстракта плодов расторопши пятнистой является силимар (силибинин), представляющий собой смесь трех основных изомерных соединений — силибинина, силикристина и силидианина. Все изомеры имеют фенилхроманоновую структуру (флавогликаны) [62,64]. Полагают, что в механизме гепатопротективного действия препаратов расторопши главным является свойство стабилизировать клеточные и субклеточные мембраны. Антиоксидантный эффект препаратов расторопши пятнистой обусловлен взаимодействием компонентов лекарственного средства со свободными радикалами в печени и преобразованием их в менее токсичные соединения, что приводит к сохранению высокой активности ферментов пентозофосфатного шунта, цикла трикарбоновых кислот Р-окисления жирных кислот в гепатоцитах, что обеспечивает достаточно высокий уровень энергетических и пластических процессов в печени; снижает солюбилизацию ферментов и уменьшает гиперферментемию. При этом ускоряется регенерация клеток печени за счет активации РНК-полимеразы, торможение проникновения токсинов в клетки печени, что вызывает физико-химическую стабилизацию клеточной мембраны гепатоцитов, тем самым, предотвращая выход из клетки ферментов и других веществ. Препараты расторопши обладают радиопротекторными свойствами, усиливает детоксицирующую и внешнесекреторную функцию печени, оказывая спазмолитическое и небольшое противовоспалительное действие [1 Г,47,95].

Гепатозащитные средства предназначены для нормализации функции и метаболизма печени при ее ■ поражениях, ускорения регенерации, восстановления функциональной активности гепатоцитов и используются в терапии острых, хронических гепатитов токсической, лекарственной этиологии, циррозов печени и жирового гепатоза.

Таким образом, патогенетический подход к*, комплексному лечению гепатопатий предполагает восстановление микрофлоры кишечника > и печени посредством использования пробиотиков > и гепатопротекторов, многокомпонентный препарат, сочетающий в себе пробиотик и гепатопротектор, позволит действовать на несколько патогенетических механизмов одновременно.

При создании нового препарата, основной целью является создание условий благоприятных для восстановления как гепатобилиарной, так и желудочно-кишечной систем, поэтому в рецептуру лекарственного средства должны быть включены компоненты с доказанной гепатопротективной активностью и влияющие на восстановление кишечного микробиоценоза, а также вспомогательные вещества, разрешенные для применения в области ветеринарии.

Все компоненты, входящие в состав препарата «Гепопро», (коммерческое название «Биопротектин»®), по отдельности хорошо изучены в доклинических и клинических исследованиях. Каждый из используемых компонентов зарегистрирован как фармакопейная субстанция.

В состав препарата входят основные вещества силимар (силибинин), пробиотическая композиция, состоящая из бифидо и лактобактерий, а также вспомогательные вещества, такие как лактулоза и высокодисперстный кремнезем.

Силимар (сиилибинин), используемый в-препарате представляет собой очищенный сухой экстракт из плодов расторопши пятнистой (Silibum marianum), содержащий комплекс флаволигнанов. Фармакологические свойства силибинина выражаются в подавлении нарастания индикаторных ферментов, торможении процесса цитолиза, предотвращении развития холестаза, нормализации функционально-морфологических показателей гепатобилиарной-системы и клинических показателей. [48].

Bifidobacterium bifidum штамм №1 и Lactobacillus fermentum № 90Т-С4, депонированные в институте им: JI. А. Тарасевича, включенные в состав препарата «Гепопро» (коммерческое название- «Биопротектин»®) в сорбированной форме, изучены в клинической дозировке суммарно 1x10 КОЕ. При этом детоксицирующие свойства микроорганизмов существенно усилены за счет сорбента — высокодисперстного кремнезема.

Высокодисперстный кремнезем (диоксид кремния) — субстанция, которая входит в состав многих лекарственных средств в таблетированной, порошковой, мазевой и суппозиторной формах. Вместе с тем диоксид кремния имеет не менее значимое самостоятельное клиническое применение, прежде всего благодаря своей мощной адсорбирующей способности и отсутствию токсичности для животных [46,86].

В препарате «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®) диоксид кремния (SiC^) использован в качестве сорбента бифидо- и лактобактерий для создания колонизационных агрегатов на стадии приготовления препарата.

Лактулоза - лекарственная субстанция, применена в составе «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®) в1 качестве бифидогенного фактора, необходимого для роста и вегетации бифидобактерий.

В мировой литературе имеются сведения о позитивном влиянии всех включаемых в состав препарата компонентов на восстановление* физиологического статуса организма животных, однако полностью отсутствуют данные, показывающие эффективность применения комбинации пробиотиков и гепатопротекторов в одном препарате для лечения патологий гепатобилиарной системы животных и влияние на микробиоценоз животных, в частности, собак.

В настоящее время в нашей-стране на рынке ветеринарных препаратов нет отечественных комбинированных препаратов, в состав которых входит композиция пробиотических штаммов и гепатопротективного компонента.

Исходя- из этого, необходимость изучения вопросов совместного влияния компонентов комбинированных препаратов гепатобилиарную и желудочно-кишечную системы и эффективности препарата является очевидной, так как они не только дополнят имеющиеся' сведения о механизме действия* пробиотиков и гепатопротекторов, но и будут способствовать обоснованному применению комбинированного лекарственного средства: пробиотика-гепатопротектора в ветеринарии.

Цель работы

Целью настоящих исследований явилась разработка нового комплексного пробиотика-гепатопротектора, для лечения патологий гепатобилиарной системы, восстановления микробиоценоза кишечника собак в комплексной терапии гепатитов. Основные задачи исследований в опытах на лабораторных животных изучить безвредность, острую и хроническую токсичность препарата «Гепопро»; оценить влияние препарата «Гепопро» на функциональное состояние печени лабораторных животных; установить гепатопротективную эффективность препарата на экспериментальной модели острого и хронического гепатита на лабораторных животных; провести оценку безопасности применения препарата «Гепопро»; изучить влияние препарата «Гепопро» на динамику восстановления кишечного микробиоценоза собак при комплексной терапии токсических гепатитов; оценить влияние препарата «Гепопро» на восстановление биохимических и клинико-морфологических показателей крови у собак при комплексной терапии токсических гепатитов препаратом «Гепопро»; разработать методы стандартизации пробиотика-гепатопротектора «Гепопро».

Научная новизна

Впервые разработан комбинированных препарат пробиотик-гепатопротектор для лечения токсических поражений печени к собак.

Установлено, что разработанный пробиотик-гепатопротектор, эффективен в комплексной терапии гепатитов собак токсической этиологии.

Показано позитивное влияние пробиотика-гепатопротектора на восстановление морфо-функциональной структуры печени и кишечного микробиоценозва.

Практическая значимость работы

Разработана и утверждена нормативная документация на пробиотик-гепатопротектор «Гепопро»: технические условия 9337-008-16414608-08 (согласованы с Россельхознадзором); инструкция по применению пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» в ветеринарии (Утверждена Россельхозназором).

На базе ЗАО «Партнер» (г. Москва) организовано производство препарата.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: параметры токсичности пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» для животных; влияние пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» на динамику восстановления морфо-функциональной структуры печени и кишечного микробиоценоза; биохимические и клинико-морфологические показатели крови собак при лечении токсических гепатитов различной этиологии пробиотиком-гепатопротектором. дозы и схема применения пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» методы контроля качества пробиотика-гепатопаротектора «Гепопро» Связь исследований с научной программой

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГУ «ВГНКИ».

Апробация результатов

Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактерийных болезнях животных Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»); 9-ом Славяно-Балтийском форуме «Санкт-Петербург-Гастро 2007» Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); 6-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), 7-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы из них 1 - в издание, рецензируемом ВАК РФ.

Заключение диссертационного исследования на тему "Применение пробиотика-гепатопротектора "Генопро" при токсических поражениях печени у собак"

ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснована целесообразность и возможность конструирования нового пробиотика — гепатопротектора «Гепопро».

2. Теоретически обоснован композиционный состав пробиотка-гепатопротектора «Гепопро», коммерческое название «Биопротектин»®, включающий в себя гепатопротективную субстанцию - Силимар и пробиотическую композицию Bifidobacterium bifidum штамм № 1 (не менее 50 млн КОЕ), Lactobacillus fermentum № 90Т-С4 (не менее 50 млн КОЕ).

3. В опытах на лабораторных животных изучена безвредность, острая и хроническая токсичность пробиотика-гепатопротектора «Гепопро». Установлено, что препарат относится к 3 классу безопасности, тоесть является малоопасным препаратом .

4. На модели живоных с токсическим гепатитом, индуцированным четыреххлористым углеродом, установлено, что препарат способстует восстановлению морфо-функциональных показателей печени и показателей ферментного и липидного обмена. Дозы препарата «Гепопро» 108 мг/кг и 162 мг/кг оказывали более выраженный гепатозащитный эффект. Отмечено значительное снижение белковой и жировой дистрофии гепатоцитов.

5. В доклинических исследованиях определены профилактические и лечебные дозы пробиотика-гепатопротектора, а также оптимальный курс лечения. Результаты исследований экстраполированы на собак разных половозрастных групп.

8,01±0,18 lgKOE/r соответственно, а также снижения интенсивности колонизации кишечника условно- патогенными микроорганизмами на 23 день терапии.

7. Применение пробиотика-гепатопротектора в комплексной терапии токсических гепатитов различной этиологии у собак обеспечивает восстановление биохимических показателей крови на 23 день комплексной терапии, что проявляется позитивной тенденцией развития активности энзимов АлАт и АсАт и ЛДГ, нормализацией активности щелочной фосфатазы до пределов физиологической нормы.

8. Применение пробиотика-гепатопротектора способствует восстановлению аппетита животных, нормализует желудочно-кишечное пищеварение, что в свою очередь приводит к повышению массы тела.

9. Разработанные методы контроля пробиотика-гепатопротекора «Гепопро» позволяют стандартизировать препарат для обеспечения производжства лекарственного средства для животных стабильного качества.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и утверждена нормативная документация на препарат «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®); -технические условия 9337-008-16414608-2008 (согласованы Россельхознадзором);

-инструкцию по применению препарата «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®) в ветеринарии (Утверждено Россельхознадзором 15 декабря 2008 г.);

-разработаны рекомендации по применению препарат «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®) для лечения токсических гепатитов собак;

-препарат внедрен в ветеринарную практику в клиниках г. Москвы.

Заключение

Механизмы развития: гепатопатий изучаются достаточно давно; но вопросам; значимости микробной; экологии кишечника в патогенезе , этой группы заболеваний уделяется недостаточное внимание.

Таким образом; исходя из литературных данных-, следует, что в процессах детоксикации> ксенобиотиков1, и других токсических веществ экзогенного и эндогенного; происхождения принимает участие не только-печень, но и кишечная микрофлора, являясь взаимосвязанными; детоксикационными системами макроорганизма.

Патогенетический подход к комплексному лечению гепатопатий предполагает восстановление функции печени и микрофлоры кишечника посредством использования гепатопротекторов и пробиотиков. Гепатозащитные средства предназначены для нормализации функции и метаболизма печени при ее поражениях, ускорения регенерации, восстановления функциональной активности гепатоцитов и используются в терапии острых, хронических гепатитов токсической, лекарственной и алкогольной этиологии, циррозов печени и жирового гепатоза.

Анализ литературы показал, что использующиеся в настоящее время гепатопротекторы-не могут одновременно восстанавливать функции печени и оказывать действие на измененную микрофлору кишечника, которая участвует в процессе метаболизма желчных кислот и детоксикации.

В клинической ветеринарной практике последних лет применялось большое количество гепатопротекторов, многие из которых оказались малоэффективными и вышли из употребления.

В настоящее время отдельное назначение пробиотиков не дает возможности полностью купировать воспалительные процессы в печени, а применение отдельно гепатопротекторов не восстанавливает кишечную нормофлору организма.

Многокомпонентный препарат, сочетающий в себе пробиотик и гепатопротектор, позволит действовать на* несколько патогенетических механизмов одновременно.

Основу препарата составляют пробиотические микроорганизмы — бифидо- и лактобактерии, главные представители нормальной микрофлоры организма человека. Бифидо- и лактобактерии, применяемые в препарате, изучены, и широко^ применяются в настоящее время в- составе многочисленных- пробиотиков?

Согласно полученным данным, комбинированное лечение с использованием бифидо- и лактобактерий является эффективным инструментом в компенсации1 патологии печени и* нарушении микробиоценоза при циррозе печени. Такому методу лечения сегодня многие гастроэнтерологи отдают предпочтение в сравнении с антибиотиками и другими фармацевтическими средствами, так как применение пробиотиков подавляет некоторые пусковые механизмы развития печеночной энцефалопатии; при этом метод пригоден для длительного использования без выявленных побочных эффектов.

Гепатопротективный компонент препарата — силимар (силибинин) представляет собой очищенный экстракт из плодов расторопши- пятнистой , содержащий комплекс флаволигнанов. Фармакологические свойства силибинина выражаются в подавлении нарастания индикаторных ферментов, торможении процесса цитолиза, предотвращении развития холестаза, нормализации функционально-морфологических показателей гепатобилиарной системы и клинических показателей. Он усиливает детоксицирующую и внешнесекреторную функцию печени, оказывает спазмолитическое и небольшое противовоспалительное действие. По механизму действия он относится к группе антиоксидантов. Его антиоксидантный эффект обусловлен взаимодействием, со свободными радикалами в печени и преобразованием их в менее токсичные соединения.

Совместное применение представителей' нормальной микрофлоры и известного гепатопротектора позволит достичь более выраженного клинического эффекта.

Таким образом, каждый из компонентов исследуемого препарата обладает самостоятельным доказанным гепатопротективным действием.

Вместе с тем очевидно, что при--одновременном; воздействии в составе единой;лекарственной-формы ожидается суммирование гепатопротективной* эффективности за счет одновременного влияния на разные звенья механизма • развития патологического процесса в печени'. . ,

Собственные исследования - посвещаны разработке и*" изучению лекарственного средства «Гепопро»- (коммерческое. . название «Биопротектин»®), а также изучениюшараметров эффективности:

2.1 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 2004 по 2008 год в соответствии с планом НИР ФГУ «ВГНКИ», ЗАО «Партнёр» на базе ГИСК им. Л. А. Тарасевича; Научного центра по безопасности биологически активных веществ; в отделе качества и стандартизации пробиотических препаратов ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»; кафедре внутренних болезней ГОУ ВПО Московского государственного университета прикладной биотехнологии; ветеринарной клинике «Ветклиника на Талалихина» г. Москвы. Материалы

Испытуемый препарат - пробиотик - гепатопротектор «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®), состоит из силимара (силибинина) - очищенного экстракта плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum) не менее 0,1 г, лиофилизированной микробной массы живых антагонистически активных бактерий вида Bifidobacterium bifidum штамм №

•7

1 не менее 50 млн колониеобразующих единиц (5x10' КОЕ), Lactobacillus

•у fermentum № 90Т-С4 не менее 50 млн (5x10 КОЕ), иммобилизированных на лактулозе (0,12 г + 5%)- синтетическом дисахариде и сорбированных на высокодисперстном кремнеземе (0,0006 г).

Штаммы бактерий пробионтов, входящие в состав препарата депонированы в коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин»®) по внешнему виду представляет собой' двойные желатиновые капсулы цилиндрической формы с полусферическими концами.

В наружной капсуле содержится очищенный экстракт из плодов к расторопши пятнистой - порошок от светло-желтого до светло-коричневого цвета, без запаха, во внутренней капсуле содержится лиофилизированная микробная масса бифидо- и лактобактерий, сорбированных на высокодисперстном кремнеземе, и лактулоза - порошок от серого до светло-бежевого цвета со специфическим кисломолочным запахом

В качестве контрольного вещества использован фармакопейный; препарат гепатопротектор - «Легалон». Оборудование

Термостат ТС- 80 с температурой нагрева- (37±1)°С; холодильник бытовой; водяная баня, микроскоп «Биолам»; лупа бинокулярная МБС-9; весы лабораторные общего назначения с допускаемой погрешностью взвешивания ± 0^01; весы: тип - ВНЦ с делением =2 гр. допустимый предел взвешивания от 20 г до 20 кг.; весы торсионные типа ВТ до 500 мг с делением; = 1 мг.; весы лабораторные ВЛТЭ-500, с наибольшим пределом взвешивания - 500 г., пределы допускаемой погрешности взвешивания весов - ±0,03 г.; шкаф сушильный электрический СЭШ -ЗМ; шприцы;медицинские

3 3 вместимостью- 1,0 см , 2,0 см ; термометр стеклянный ртутный; иглы для взятия крови; иглы с наплавленной оливой* диаметром, 1,0- 1,5см ; колбы, стеклянные вместимостью 250см 3; цилиндры мерные 250-500 см3; стекла;, предметные; пробирки стеклянные; пипетки Пастеровские; чашки Петри; эксикаторы;, пипетки мерные стеклянные объемом 1,0, 10,0 см3; лабораторный анализатор крови НС 5710; лабораторный анализатор крови Stat fax; шпатель металлический; термометр электронный ветеринарного назначения; эксикаторы; петля микробиологическая.

Питательные среды и растворы

Агар MRS (Fluka); полужидкий агар Блаурокк; агар Кранеп (OXOID); агар Сланец — Бартли (OXOID); среда Сабуро, среда: висмут-сульфитный; агар; сусло-агар; среда Эндо; среда мясо-пептонный агар.

Раствор^ хлорида натрия; спирт этиловый 96%; вата медицинская; вода дистиллированная; 50% раствор четыреххлористого углерода (CCI4) на оливковом масле.

Животные

Эксперименты проведены на 48 собаках различного веса и разных пород в возрасте от 1,5 до 5 лет, 65 нелинейных белых мышах и 70 мышах линии «Ыаск» массой 14-19 г.,163 беспородных крысах массой 220-250г.

Животных содержали в условиях вивария, которые соответствовали действующим: «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным МЗ СССР 06.07.73.

Кормление осуществляли в соответствии с приказом № 1179 от 10.10.83 МЗ СССР « О суточных нормах кормления лабораторных животных и продуцентов».

Патоморфологические и гистологические исследования проведены в количестве 157 образцов.

2.1.2 ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты по определению безвредности, острой и хронической токсичности и эффективности проводились с использованием белых нелинейных мышей, мышей линии «black» и белых беспородных крыс. v

До включения в эксперимент все животные помещались в карантин, длительность которого составляла 14 суток.

В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (внешний вид, общее состояние и поведение). Клетки с животными помещали в отдельные комнаты.

Световой режим 12 часов - свет, 12 часов - темнота.

Температура воздуха поддерживалась в пределах 19-25°С, относительная влажность - 50-70%.

Исследования проводились в четыре этапа.

1. На первом этапе оценку безвредности препарата проводили на нелинейных мышах массой 15±1 г, всего 20 особей.

Критерием оценки безвредности препарата служили показатели гибели и изменение групповой массытеламышей в опытной и контрольнойтруппах.

2. На втором этапе проводили изучение острой токсичности в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ, а также в соответствии с СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов».

Изучение острой токсичности проводили на белых нелинейных мышах (самцы и самки) массой 14-19 г, всего 70 особей (из них в опыте было 30 нелинейных белых мышей, 40 мышей линии «black»); а также на нелинейных крысах (самцы и самки) массой 220-250 г, всего 80 особей обоего пола.

Критериями оценки острой токсичности служили: летальность, экспериментальных животных и гистологическое исследование органов № тканей павших животных.

3. На третьем этапе проводили изучение хронической токсичности, в соответствии с методическими указаниями по изучению, общетоксического действия фармакологических веществ, в' соответствии: с СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых .медицинских' иммунобиологических препаратов» на белых нелинейных^ и линии: «black» мышах массой 14-19 г, всего 60 особей обоего пола (из них в опыте было 30' нелинейных белых мышей и 30 мышей линии «black»),1 а также на. нелинейных крысах - самках массой 150-240 г; всего 27 особей. Критериями оценки, хронической; токсичности являлись: летальность, масса тела и масса внутренних органов, функциональное состояние печени, показатели обменных процессов и результаты гистологических исследований органов и тканей опытных и контрольных животных.

4. На четвертом этапе оценивали эффективность «Гепопро» на моделях острого и хронического гепатита в соответствии с Методическими указаниями по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ [85] на крысах (самках и самцах) массой 160-200 г; всего 60 особей обоего пола.

На протяжении всех экспериментов велось наблюдение за поведением, общим состоянием животных, видом шерстного покрова, динамикой массы тела, поеданием корма.

2.1.1.1 Определение безвредности

Испытание проводили на 20 беспородных белых мышах обоего пола массой (18±20) г при пероральном введении каждой мыши содержимого 6 капсул, разведенныхых в объеме 10,0 смЗ 9% раствора хлорида натрия. Перед испытанием определяли групповую массу тела мышей.

Приготовление раствора заключалось в том, что шесть капсул препарата о раскрывали, высыпали содержимое и разводили в 10 см 0,9 % раствора хлорида натрия и выдерживали 30 мин при температуре (37±1)°С.

По 1 см полученной взвеси вводили пяти мышам в желудок (при о помощи специальной насадки на шприц вместимостью 1 см ).

Перед каждым введением взвесь перемешивали 8-10 раз. Наблюдение за мышами осуществляли в течение 5 суток.

2.1.1.2 Определение острой и хронической токсичности препарата

Гепопро»

Исследования проводились в соответствии со стандартнымиJ методиками, описанными в методических указаниях по изучению общетоксического действия фармакологических веществ [85].

47 т

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Панина, Татьяна Владимировна

1. Абидуева Е. Ю. Повреждение печени с/х и лабораторных животных и ихкоррекция лекарственными средствами природного происхождения /Е. Ю Абидуева //Автореферат диссертации на соискание степени д. б. н.; Улан-Уде., 2005-с. 12.

2. Ажунова Т. А. Фитотерапия при гепатитах/Ажунова Т.А, Алексеева Э.А //

3. Институт общей и экспериментальной биологии РАН, Практическая фитотерапия, №3., 2004-С.-23.

4. Амиров Н. Ш. Активность протеаз желудочного сока при гепатогенныхязвах: Заболевания органов пищеварения/ Амиров Н. Ш. Москва., 1984 -с.79-84.

5. Ануфриева Р. Г. Влияние рифампицина на генеративную функцию имикробную экологию кишечника/ Ануфриева Р. Г //Автореферат диссертации на соискание ст. канд. биол. наук., М.-1990-С.-17.

6. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ Ашмарин И.П., Воробьев II— Л.- 1962.

7. Беляков И. М. Функционально- метаболический статус и его коррекция при ОПН у животных./ Беляков И. М. // Автореферат на соискание ст. д.в.н. М., 2000- с. 10

8. Беляев А. А. Влияние бифидумбактерина на секреторную функциюжелудка/ Беляев А. А., Медведев А. и др. // Ставрополь., 1992- С.-23-25.

9. Болиева Л. 3. Влияние ацетилсалициловой кислоты и целекоксиба на канцерогенез печени и пищевода у крыс./ Болиева Л. 3., Кабаладзе С. А.//Бюллетень экспериментальной биологии и бедициныМ.,2007- Т.143-№ 1,с.-93-96.

10. Бондаренко В. М. Дисбактериоз кишечника как клинико- лабораторныйсиндром. Современное состояние проблемы./ Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В //Гэотар-Медиа.,2007-с.39-42

11. Бурровс Колин. Современный взгляд на проблемы ветеринарной гастроэнтерологии./ Бурровс Колин// Гастроэнтерология, Материалы ветеринарной ассоциации по мелким домашним животным, Москва -Ростов-Рига., 2000-С.-1-30.

12. Венгеровский А.И. Механизм действия гепатопротекторов при токсических поражениях печени/ Венгеровский А.И., Саратиков А.С.// Фармакология и токсикология.- 1988.-Т. 51, № 1.-С. 89-92.

13. Волкова Е. С. Влияние карсила и оксиметиурацила на функцию печени/

14. Волкова Е. С., Байматов В. Н.,//М., Ветеринария.,-2002- №1- С.-48-50.

15. Гаскелл Р. М. Инфекционные болезни кошек и собак./ Гаскелл Р. М., БеннетМ. //М. Аквариум.-1999-С.-206.

16. Гальперин Э. И. Недостаточность печени/ Гальперин Э. И., Семендяева М. И., Неклюдова Е. А. //М.Медицина.-1978- С.-6-14.

17. Гладских Л. В. Ятрогенные осложнения при лекарственной терапии и эффективные средства их коррекции/ Гладских Л. В. //М. Авикон-информ.-2004- №1, с.35.

18. Гладских Л. В. Создание новых тканевых препаратов на основе гепатоцитов для коррекции функции печени// Автореферат диссертации доктора фарм. Наук/ Гладских Л. В. //М. 1997.

19. Гладских Л. В. Этиологическая защита печени/ Гладских Л. В., Пархоменко и др // М.-Практикующий врач. -2004-е. 15.

20. Грачева Н. М. Новые препараты «Бифиумбактерин — мульти» в практикелечения дисбактериозов кишечника детей./ Грачева Н. М. , Петрова М. С. И др// Вопросы диетологии.-2003-Т 1-№5.-с.-68-70.

21. Григорьев П. Я. Диагностика и лечение хронических болезней органов пищеварения/ Григорьев П. Я. Яковенко Э. П. //М. Медицина.- 1990.-е.-200.

22. Гребнев A. JT. Руководство по гастроэнтерологии/ Гребнев A. JI., Хазанов

23. A. И. Т. 2- Болезни печени и билиарной системы, Медицина.-1995-с.528.

24. Гулаг И. Я. Диагностика и лечение органов пищеварения./ Гулаг П. Я., Яковенко Э. П.//1996.-с.515.

25. Данилевская Н: В. О целесообразности использования пробиотических препаратов при гепатопатиях у мелких домашних животных./ Данилевская Н. В., Колев Г.И.: Материалы 8 международного конгресса по проблемам мелких домашних животных,- М.- 2000, с-77-78.

26. Данилевская Н. В. Микрофлора кишечника собак: физиологическое значение, возрастная динамика, дисбактериозы. Коррекция: Часть 1. Нормальная микрофлора кишечника собак/ Данилевская Н. В., Субботин

27. B.В.,М., Ветеринар.- 2002.-№1.

28. Денисов И. Н. «2000 болезней от Л до Я»/ Денисов И. Н., Улумбеков Э; Г. J/Ml Гэотар^Медицина, Медицинская академическая книга.-1998.

29. Дональд К. Фармакологические препараты в ветеринарной медицине./ Дональд К. Пламб М. Практика ветеринарного врача//М. Аквариум.-2002.-c.-445.

30. Дисбактериозы кишечника: Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения' больных кишечными; инфекциями, диагностика и лечение дисбактериозов; кишечника// Методические рекомендаций.Минздрав РФ.-М.-1988-45с.

31. Евплов Н.Н. Практикум по диагностике инвазионных болезней животных./ Евплов Н. Н. М." «Колос»Д994,с.150//Изменения печени щенков при токсокарозе. Ветеринария.-2006- № 10:-с:-17-18.

32. Жавнис С. Э. Комплексная терапия хронических гепатитов у собак и кошек старческого возрастав Жавнис С. Э., Горовая Т. Б.: Материалы 8международной ветеринарной конференции по болезням мелких домашних животных.- 2006- С.-35.

33. Зотина М. И. Иммунные комплексы при хронических заболеваниях печени. Зотина М. И. // Вопросы иммунологии при хронических заболеваниях печени: Материалы сборника трудов ЦНИИГ//М.- 1983-с.-26.

34. Карачковская В. А. Терапевтическая эффективность различных гепатопротекторов при лечении бабезиозов собак/ Карачковская В. А., Ермолович М.:Сборник трудов /Новосибирский ГАУ. //Новосибирск,-2005.

35. Катикова О. Ю. Болезни печени в пожилом возрасте клинические проявления, особенности патогенеза, лечения/ Катикова О. Ю // Клиническая геронтология.М.- 2004.-№7-с.38-42.

36. Казаков Д. Н. Этиология, диагностика и лечение при гепатитах собак./ Казаков Д. Н.Автореферат на соискание ст. к.в.н., СП6.-2004.

37. Конн Г. О. Синдром печеночной комы и лактулоза/ Конн Г. О., Либерталл

38. М. М. //М.- Медицина.- 1983.

39. Корочкин О. Л. Фармакология и применение бифидобактерий/ Корочкин

40. О. Л. Автореферат канд. вет. наук.//Уральская Академия вет. медицины, Троицк.- 1997.

41. Крылов А. А. Неотложная гастроэнтерология./ Крылов А. А. и др. //М. Медицина.-1998.-с.-264.

42. Кухаренко Н. С. Пробиотики в комплексе с минеральными добавками вкачестве стимуляторов резистентности организма при, патологии обмена веществ./Кухаренко Н. С. //М.- 1992.-c.-77.

43. Ларионова В. Б. Токсичность лекарственных препаратов у онкологических больных/ Ларионова В. Б. Горожанская Э. Г. //М.-Вестник интенсивной терапии.-2004-№3,с.21.

44. Лебедев А. В. Незаразные болезни собак и кошек/ Лебедев А. В., Старченков С. В, ММ: 2000.

45. Лехатинова Т. Ч. Микроэкологические и биохимические нарушенияпри токсических гепатитах и их коррекция фитобактериопрепаратами / Лехатинова Т. Ч. Автореферат на соискание ст. канд. мед. наук.//.-М.- 1995.-147с.

46. Левтеров Д. Е. К вопросу патолого-анатомической диагностике инфекционного гепатита собак/ Левтеров Д. Е.// Ветеринарная практика.-2003.- №2(21).-с.-24.

47. Лепахин В. К. Клиническая фармакология и фармакотерапия/ Лепахин В. К//М., 1997.-С.-24-42.

48. Лопаткина Т.А. Лекарственные поражения печени/ Лопаткина Т.А., Бурневич Э.// Русский врач,//М.,2007.-с.12.

49. Логинов А. С. Клинико-морфологичекие особенности персистирующегогепатита/ Логинов А. С. //М.,1984,.- №2-с.66-68.

50. Макарьева Е. Д. Значение накопления коллагена в гепатоцитах в формировании внутриклеточного фиброза при хроническом поражении печени./ Макарьева Е. Д.: материалы конгресса терапевтов//М.: 1987.-с.324-325.

51. Машковский М.Д. Лекарственные средства/ Машковский М.Д. В двухтомах. //Изд. 13. Харьков: Торсинг., 1998.Т-1. 560с.

52. Модестова Л. В. Состав желчи при различном физиологическом состоянии пищеварительной системы./ Модестова Л. В. Акованцева Н. В.// Заболевания печени и поджелудочной железы//М., 1984.-е.-105.

53. Надинская М. Ю. Заболевания печени, протекающие с синдромом холестаза/ Надинская М. Ю. // Консилиум. Гастроэнтерология., 2006-Т-4, № 6.-С.-279-283.

54. Ниманд X. Г. Болезни собак./ Ниманд X. Г. Сутер П. Ф.М. Аквариум, 1998.,с. 17.

55. Осидзе Д. Ф. Инфекционные болезни животных /Осидзе Д. Ф. //М. Агропромиздат, 1987с.-215.

56. Панин А.Н. Иммунология и кишечная микрофлора./ Панин А.Н., Малик Н. И., Малик Е. В., 1992//Аграрная наука., 1998.-С.14-18.

57. Петров Р. В. Иммунология/ Петров P. В.//М. Медицина, 1982,с.-З82

58. Петров В. В. Эффективность терапии острых отравлений собак./ Петров В. В. , Зелютков Ю. Г.//: материалы 9 международного конгресса по болезням мелких животных, 2001 .,с.-156-157.

59. Послов Г. А. Патогенез и клинические признаю! дисбактериоза у собак./

60. Послов Г. А. , Илларионов В. ЮЛ Болезни мелких домашних животных, Ветеринария, 1987, с.-53-55.

61. Пыцкий В. Н. Аллергические заболевани/ Пыцкий В. Н. и др. //М. Медицина, 1991, С.-368.

62. Реутова Е.А. К вопросу о гепатопатиях собак./ Реутова Е.А., Стрижкова М.А.// Актуальные вопросы ветеринарной медицины// Новосибирский государственный аграрный университет, 2004,с.-156-157.

63. Рейзис А. Р. Вирусные гепатиты у больных онкогематологическими заболеваниями./Рейзис А.Р., Нурмухаметова Е.А. //Клиническая онкогематология; Руководство для врачей М., 2001,с.—539-553.

64. Ричард Г. Харвей. Пищевая аллергия: взгляд изнутри и снаружи/ Ричард

65. Г. Харвей. // Waltham Focus,с.-33.

66. Роджер Батт. Пищевая аллергия и перспективы лечения • гиперчувствительности желудочно — кишечного тракта./ Роджер Батт,

67. Вивиен Е. Рольф, Ричард Ф. Баттервик.// Waltham Focus, С.-28-34.

68. Саратиков А. С. Фармакология и токсикология/ Саратиков А. С., Венгеровский А. И., Паульс О. В. и др//М.-1990, №5,с.-42-45.

69. Саратиков А. С. Влияние гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды,на независимую от цитохрома Р 450 антитоксическую функцию печени при экспериментальном токсическом гепатите/ Саратиков А. С. , Венгеровский А. И.// ,Томск, 1998 .

70. Субботин* В. В. Нормальная кишечная микрофлора и ее становление у собак/ Субботин В. В. , Данилевская Н. В. // Материалы международной конференции по мелким домашним животным//, М.-2001.t

71. Серов В.В. Этиологическая и нозологическая оценка патологии печени /

72. Серов В.В., Войнова JI.B.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопротологии//.М 2000. - № 2. - С. 41-44.

73. Сидоров И! В. Лечебная^ помощь собакам при отравлениях хлорорганическими соединениями/ Сидоров И. В.// Материалы 9 международного ветеринарного конгресса по болезням мелких домашних животных//, 2001, С.-159-160.

74. Скобелева Т. В. Активность ферментов субклеточных структур печени в i процессе развития экспериментального цирроза/ Скобелева Т. В. //1. Рукопись ВНИТИ, 1984.

75. Стайер JI. Биохимия: В 3-х т./ Стайер Л. //Т. 2. Пер. с англ//. М.: Мир,1985. Т. 2 ,312с.

76. Сошенко Л. П. Симптомокомплексы печеночной недостаточности и её лечение/ Сошенко Л. П. , Сафонова А. П. , Озеренко О. А. и др. //М. Изд-во РУДН.-2003,с.-165.

77. Субботин В. М Современные лекарственные средства в ветеринарии./ Субботин В. М. , Субботина С. Г. , Александров И. Д.// Ветеринария ичживотноводство, 2000.

78. Субботин В. В. Микробная экология кишечника при гепатопатиях у собак/ Субботин В. В., Н. В. Данилевская, Ко лев Г. И.// Материалы тезисов 8 ветеринарного конгресса//; М. 2000, С.-72-74.

79. Сьюзан Шоу. Последствия поражения кошек и собак клещами/ Сьюзан Шоу, Ирвин П.// Waltham Focus Том 11, №3, 2001, С.-21.

80. Тарнуев Ю. А. Клинические и морфофункциональные изменения печенипри токсической дистрофии печени/ Тарнуев Ю. А. , Бутуханова М. Н.//Международная научная конференция» Болезни животных Дальнего востока». Благовещенск,!999,С.-55-57.

81. Типпи Л. Болезни кошек и собак/ Типпи Л., Смит Ф , Ветеринария//М.: Геотар, 2001,с.-415-418.

82. Уколова М. В. Гепатиты собак в условиях мегаполиса/ Уколова М. В.//; Автореферат на соиск. ст. к.в.н,;М 2005.

83. Уколова М. В.Терапия гепатопатий собак гомеопатическими препаратами/ Уколова М. В., Озеренко О.// Материалы 10 международного ветеринарного конгресса по проблемам болезней мелких домашних животных, 2002, С.-132.

84. Уша Б.В., Ветеринарная гепатология/ Уша Б.В //М, «Колос»1979, С.-5-9.

85. Уша Б. В. Патогенез постнатального ОПН синдрома при дисфункции пищеварения./ Уша Б. В. , Беляков И. М. // М. МГАВМиБ,1999,с.168-170.

86. Уша Б.В. Вторичная жировая дистрофия печени у собак. /Уша Б.В., Жавнис Э. В., Горовая Т.Б.// Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности с.х. продукции// М., МГУПБ, 2004, С.-181.

87. Фисенко В. П./Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Фисенко В. П.; М.-2000, «ИИА Ремедиум», е.-18-371.

88. Хазанов А. И. Особенности лекарственных и вирусных поражений печени/ Хазанов А. И. Румянцев * О. Н. , Калинин А. В. // Клинический вестник-2000.-№1.

89. Цыдыпова Т.Б. Фармакотерапевтическая эффективность фитобактериальных и бифидосодержащеих средств при токсических повреждениях печени/ Цыдыпова Т.Б: Автореферат, дисс. на соиск канд. мед. наук; 1989-9с.

90. Чижов В. А. Инфекционные болезни./ Чижов В. А. Данилов Е. П. и др. //Справочник болезней собак. М.- ВО «Агропромиздат», 1990.

91. Шарабрин И. Г. Патология обмена веществ и ее профилактика у животных в специализированных хозяйствах промышленного типа/ Шарабрин И. Г., Данилевский В. М. и др //М. Колдос.1983,с.-143-145.

92. Шендеров Б. А. Функциональное питание и пробиотики: микроэкологические аспекты/ Шендеров Б. А., Манвелова М. А. //М. Аграр,1997.

93. Шендеров Б. А. Механизм действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных/ Шендеров Б. А. // Ветеринария,2000,№ 1,с.47-54.

94. Шерлок Ш.Заболевания печени и желчевыводящих путей/ Шерлок Ш., Дули Дж //М.: 1999, С.-423.

95. Шульпекова Ю. О. Патология печени: лекарственные поражения печени/

96. Шульпекова Ю. О. //Ж. Консилиум медикум, том 8', № 7, 2006.

97. Щавелева С. А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты./ Щавелева С. А.//Современное состояние вопроса. Вопросы питания; 1999,т.68, №2, С.-32-40.

98. Энциклопедия лекарственных средств, PJIC-2006.

99. Ястреб В. Б. Побочные эффекты антгельминтиков/ Ястреб В. Б. , Новик Т.

100. С.// Материалы 8 международного конгресса по болезням мелких домашних животных,2000,с.-172.

101. Banks S. G. Liver function in sepdis chok/. Banks S. G., Foulis A. K., Ledingham S. M// S.Clin. Padh., 1982, Vol.35,p.-1249-1252.

102. Birther Y. Hepatic drug disposition in liver disease./ Birther Y. //Gn.Clinicalhepatology, Berlin, 1983, p.-45-51.

103. Blom A. et al. Hepatic drug transport in the rat./Blom A. et al.//, Biohem.,1982,8, p.-l 153-1565.

104. Bengmark S. Colonic food: pre-and probiotics/Bengmark S.//Am. J.Gastroenterol.2000; #95(1) Suppl: S5-7.

105. Berg R. D! Probiotics, prebiotics, or "cynbiotics'V Berg R. D. /Trends Microbiol.-1998.,Vol.6,p.-89-92.

106. Bergey's Manual®Systematic Bacteriology //Eds. H.A. Sneath, Mair N. S., Sharpe M. E. Williams&Wilkins. Baltimor-1984.

107. Bircher J. Treatmen of chronic portal systemic encephalopathy with lactulose/ Bircher J., Haemmerli U. P.// Am J. Med., 1971,Vol.51,№6,p.-148-159:

108. Collins M. D. Probiotics, prebiotics and synbiotics:approaches formodulating the microbial ecology of the gut/ Collins M. D. and Gibson R.// Am. J. Clin. Nytr., Vol. 69, P.-1052-1057.

109. Conn H. O. The hepatic coma syndromes and lactulose/ Conn H. O., Lieberthal M. M. //Baltimore: Williams ana Willkins, 1983, p.-516.

110. Conway P. L. Strategies for the isolation and characterization of functional probiotics/ Conway P. L. Henriksson A. // In Human Health: The constribution of microorganisms(ed S. A. W. Gibson), London, 1994,Vol.45,p.-47-52.

111. Cummings I. H. Role of intestinal bacteria in nutrient metabolism/ Cummings I. H., Mac.Farlane G. T. // Clin. Nytrition-1997, Vol. 16, №l,p.-3-l 1.

112. Clausen M. R. Lactulose, disaccharides and1 colonic flora/ Clausen M. R., Morten P: В // Clin. Consequense Drugs.-1997, Vol. 53, p.-930-942.

113. De Vuyst L, Antimicrobial potential of lactic acid bacteria/ed L.De Vuyst and E.I. Vandamme.// Blackie Academic and Professional, Glasgow, 1994.Pp.-91-lll 1.

114. Dubois R. S.Chronic active hepatitis and pregnancy: a report of two cases in adolescence/ Dubois R. S., Slovis Th.,Amer//. Gastroenterology, 1982,Vol.77,p.-649-651.

115. Hednagle S: N. Chronic type hepatitis./ Hednagle S. N., J.// Gastroenterology,1983,Vol.84, p.422-424.

116. Drossman D. A". The functional gastrointestinal disoders. Diagnostic, Patophysiology and treatment/ Drossman D. A. // Multinational consensus. Boston/Toronto/London, 1994, p.-370.

117. Fry S.W. Hepatotoxity of analgetics and anti-inflammatory drygs./ Fry S.W., Seeff L. В.// Gastroenterol.Clin. Am, 1995, 24,875-905.115., Fuller R. Probiotics in man and animal/ Fuller R. //J.:Applied bacteriology,1989,Vol.66,p.-365-378.

118. Fooks L. J. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology./ Fooks L. J., Fuller R., Gibson G.R// Intern.Dairy J.,.1999, Vol 9, №l,(p.-53-61.

119. Fuller R. Probiotics and pribiotics: microflora management for improved gut health/ Fuller R., Gibson G. R // Clin. Microbiology.-1998:№4, p.-477-480.

120. Fuller R. The importance of lactobacilli in main taining normal microbial balance in the crop/ Fuller R.,British poulty science,Vol. 18,№1,1997, p.-85-94.

121. Goldin B. R. Helf benefits of probiotics/ Goldin B. R.//, Brit J. Nutrition, 1998, p.-203-207.

122. Gifter L. D. The significance of bloody ascides in partients with cirrhosis/ Gifter L. D., Rector W. G Amer. Sc.// Gastroenterology. , 1984,Vol. 79, p.-136-138

123. Gibson G. R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics. and prebiotics for human use/ Gibson G. R // J. Nytr.-200: Vol: 13 0(2),p.-391 -395.

124. Hoogenraad Т. Effective treatment of Wilson disease with oral zinc sulphate/. Hoogenraad Т., Hamer C., Hattum S.,Brit. J.,1984,Vol.289, p.-273-276.

125. Kaplowitz N. Mechanism of drug liver disease./ Kaplowitz N.// Gastroenterol clin N Am, 1995;24:7787-810.

126. Klaver F.A., van der Meer R. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugating activity.// Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59 (4), P. 11201124.

127. Lars A. "Probiotics othes nutritional factors and intestinal microflora"/ Lars A. Hanson, Robert H. Yolken,// Nestle Nutr. Serv., 1996, p.-190-199.

128. Lee L. F., Sharma J. M. Survival of lactobacillus acidophilus and bifidobacterium spp. in presense of acid and bile salts// Cult. Dairy Prod. J. 1995, ol. 30(3), p.-2-4

129. Lebovics E. The liver in the acquired immunodeficiency syndrome./ Lebovics E., Thung S.// American clinical and histologycal studies., hepatology., 1985,Vol.5,p.-293-298.

130. Mac Farlane. Probiotics and prebiotics. Can regulating the activities of intestinal bacteris benefit healf/ Mac Farlane // Br. Med. Gast. J.-1999, Vol. 318, p.-999-1003.

131. Molder H. W. Bifidobacteria and bifidogenic factors/ Molder H. W., McKellar R. C. , Yaguchi M. // Can. Inst Food Sci. Thecnology 1990,N23, Pp.29-41.

132. Rielly C. A. Acute fatty liver of pregnancy/ Rielly C. A.// Digest. Science 1984, Vol. 29, p.-456-457.

133. Roberts D.K., et al The cholesterol-lowering effect of a breakfast cereal containing psylllium fiber/ Roberts D.K. // Med.J.-1994,Vol. 16, p.600-604.

134. Schicano Т. D. Drug- inducted and toxic liver diseasese. In; Friedman L. S. Handbook of liver disease./ Schicano T. D., Black M. // Churcill Livingstone 1998, p.- 103-203.

135. Sherlock S. Diseases of the liver and biliary system/ Sherlock S., Dooley J. //Oxford-London: Blackwell Sc. LTD-1998, p.-714.

136. Stewart c. S. Making sense of probiotics/ Stewart c. S., Chesson A.// Pig veterinary J., 1993, vol. 31, p.-33.

137. Tahri K. Bifidobacteria strain behavior toward cholesterol: coprecipitation with bile salts and assimilation/ Tahri K., Grill J.P., Schneider F.// Cuur. Microbiol.-1996 (Sep); 33 (3); P. 187-193.

138. Taylor G.R.J. Effect of probiotics and prebiotics on blood lipids/ Taylor G.R.J., Williams С. M. //British J. Nutrit., 1998, Vol.80, №4,p.-225-230.

139. Tamura Y. Lactulosae and its application to th food and pharmacular indusrties/ Tamura Y., Mizota T // Bull, Int. Dairy feed, 1994, p.-43-53.).

140. Ziemes C. J. An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in functional food consept: perspectives and future strategies/ Ziemes C. J., Gibson G. R.// Intern.Dairy J., 1998,Vol 8, №516,p.-473-479.

141. Zennon T. Effect of oral administration, or direct sensitization by prebiotics on stimulation of splee-derived monocytes from mice/ Zennon T.//Alltech,inc.Reserch and technical bulletin, 1995.