Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Влияние гемодиализа на гемолитический компонент анемии у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности

На правах рукописи

Мондоев Леонид Геннадьевич

ВЛИЯНИЕ ГЕМОДИАЛИЗА НА ГЕМОЛИТИЧЕСКИЙ КОМПОНЕНТ АНЕМИИ У БОЛЬНЫХ С ТЕРМИНАЛЬНОЙ СТАДИЕЙ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.48 - нефрология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003459253

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Бирюкова

Людмила Семеновна Ершова

Людмила Ивановна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Шутов

Евгений Викторович Цветаева

Нина Валентиновна

Ведущее учреждение

ФГУ Главный военный клинический госпиталь им. академика H.H. Бурденко Министерства обороны Российской Федерации

2009 г. в

часов на заседании

Защита состоится « М//Г

диссертационного совета Д.001.042.01 в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН. /7

Автореферат разослан

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Программный гемодиализ (ГД) является одним из основных методов лечения больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ТХПН). Важной задачей современной медицины является решение клинических проблем, неизбежно возникающих у этой категории пациентов вследствие тяжести их состояния и длительности лечения.

Одним из основных синдромов, сопровождающих хроническую почечную недостаточность (ХПН), является анемический синдром. Коррекция анемии у больных с ТХПН, получающих заместительную почечную терапию (ЗПТ), не только улучшает реабилитацию и качество жизни пациентов и уменьшает частоту их госпитализации, но и непосредственно влияет на смертность диализных больных (Шило В.Ю., Денисов А.Ю., Хасабов Н.Н., 2005).

Одной из причин анемии является гемолиз, инициированный в процессе процедур ГД, обусловленный прямым контактом крови с чужеродной поверхностью, воздействием на кровь пациента движущихся частей аппарата «искусственная почка», повышенным давлением в экстракорпоральном кошуре, а также действием остаточных примесей в воде для ГД или веществами, используемых для дезинфекции и декалыдафикации диализной аппаратуры (Canaud В. et al., 2005). Этому способствует и то, что при ХПН изменяется обмен липидов мембраны эритроцитов; клетки становятся более жесткими, теряют механическую стойкость и быстрее разрушаются (Kameneva M.V. et al., 1995; Шостка Г.Д., 1997; Svenmarker S., 2000).

Так как в процессе лечения программным ГД кровь больных подвергается агрессивному физическому и химическому воздействию на протяжении длительного времени, в стратегии лечения анемии помимо совершенствования аппаратуры и техники проведения ГД необходимо детальное изучение свойств эритроцитов и механизмов воздействия на них травмирующих факторов экстракорпоральной гемокоррекции. Изучение влияния терапии программным ГД на эритроциты, исследование изменения их физико-химических показателей под воздействием данного вида ЗПТ и изыскание способов защиты эритроцитов с целью предотвращения шгградиализного гемолиза и, соответственно, уменьшения выраженности анемии является одним из актуальных и наименее изученных вопросов, решение которого будет способствовать повышению устойчивости эритроцитов, положительному воздействию на гемолитический компонент анемии у больных, находящихся на лечении программным ГД.

Цель исследования. Целью исследования является изучение влияния процедур ГД на физико-химические показатели структуры эритроцитов, изучите механизмов интрадиалгоного гемолиза, определение возможности применения L-карнитина в

качестве препарата, оказывающего протекторное действие на эритроциты.

Задачи исследования.

1. Определение иммунного и иеиммунного компонентов повреждения эритроцитов у больных, находящихся на лечении программным ГД.

2. Изучение ферментной защитной системы эритроцитов, гемолитической активности сыворотки крови, микрореологических свойств крови у больных, находящихся на лечении программным ГД.

3. Оценка результатов воздействия L-карнитина на состояние эритроцитов и выраженность анемии у исследуемых больных.

Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование влияния процедур ГД на состояние мембраны эритроцитов и показатели гемолиза и гемореологии у больных с ТХПН. Показано, что проведение процедур ГД активно воздействует на состояние эритроцитов, сопровождается гемолизом, аутоиммунными реакциями, повышением активности ферментной системы эритроцитов. Показано влияние L-карнитина на состояние мембраны эритроцитов и их ферментную систему, выраженность шпрадиализного гемолиза и анемии у больных, находящихся на лечении программным ГД. Показана эффективность и дана оценка возможности применения L-карнитина в качестве протектора эритроцитов у этих больных.

Практическая значимость. Результаты диссертационного исследования дополняют сведения о механизмах развития анемии в условиях ТХПН и терапии ГД. Научно-практическая ценность результатов исследования состоит в том, что было установлено: изменение физико-химических показателей структуры эритроцитов под влиянием лечения программным ГД свидетельствует о повреждающем воздействии на эритроциты данного вида терапии, что усугубляет анемию за счет увеличения выраженности ее гемолитического компонента. С целью защиты эритроцитов и уменьшения интрадиализного гемолиза было предложено использование препарата L-карнитин, клинико-лабораторная эффективность которого была показана в проведенной работе.

Апробация диссертационного материала. Основные положения работы изложены на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2007 г.), на конференции молодых ученых «Реология и физико-химические механизмы гетерофазных систем» (Карачарово, 2007 г.), на 24 Симпозиуме по реологии (Карачарово, 2008 г.), на семинаре Лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН.

Внедрение результатов работы в практику. Результаты научных исследований, изложенные в диссертационной работе, внедрены в практику Отделения скорой медицинской помощи, полиорганной патологии и гемодиализа ГУ Гематологический научный центр РАМН и Отделения пересадки почки, сосудистой

хирургии в урологии и гемодиализа ФГУ НИИ урологии Росмедгехнологий.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 101 странице текста компьютерной верстки и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав с описанием результатов исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Библиографический указатель содержит 64 отечественных и 106 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками. Работа выполнена на базе Отделения скорой медицинской помощи, полиорганной патологии и гемодиализа (научный руководитель отделения д.м.н. Бирюкова JI.C.), Лаборатории патологической физиологии (научный руководитель лаборатории д.м.н., проф. ¡Горбунова Н.А.|) и Лаборатории клинической биохимии (заведующий лабораторией д.м.н. Егорова М.О.) Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Процедура ГД наряду с положительными эффектами, такими, как снижение уровня эндогенной интоксикации, коррекция водно-электролетного и кислотно-щелочного состояния крови, оказывает повреждающее воздействие на эритроциты.

2. Проведение процедур ГД сопровождается аутоиммунными реакциями, повышением активности ферментной системы эритроцитов, гемолизом.

3. L-карнитин оказывает мембранопротекторное действие на эритроциты у больных, находящихся на лечении программным ГД, уменьшает выраженность анемии за счет воздействия на ее гемолитический компонент.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных

Были сформированы следующие группы обследуемых: 1 группа (27 человек) -больные с ТХПН, находящиеся на лечении программным ГД, принимавшие L-карнитин; 2 группа (15 человек) - больные с ТХПН, находящиеся на лечении программным ГД, не принимавшие L-карнитин. Также были обследованы 25 больных с ТХПН до начала лечения программным ГД и 10 доноров.

Больные получали лечение программным ГД и имели постоянный сосудистый доступ в виде артериовенозной фистулы. ГД проводился 3 раза в неделю по 4-4,5 ч. Использовались диализаторы с мембраной из полисульфона производства «Fresenius» со средней площадью поверхности 1,8 м2. Доза ГД контролировалась по значению индекса Готча (> 1,2 за процедуру). Расчет индекса Готча: ИГ= СТ/0,65(га+тпД), где: С - клиренс мочевины для используемого диализатора (мл/мин), Т- длительность ГД (мин), ш -«сухой вес» пациента (кг), шД — междиализное изменение веса пациента (кг), 0,65- коэффициент распределения мочевины в организме. Аитикоагуляция во время процедур ГД осуществлялась введением в экстракорпоральный контур

гепарина в средней дозе 7,5 тыс. ЕД.

Возраст больных составил от 18 до 75 лет. Более половины (54,7%) были в возрасте старше 50 лет. Заболеваниями, приведшим к ТХПН, были хронический гломерулонефрит (в 56,6% случаев), хронический пиелонефрит (21,7%), сахарный диабет (8,7%) и другие (13%). Диализный стаж (длительность нахождения больного на лечении ГД) составлял от 5 мес. до 12 лет. Более всего пациентов было в группе со временем пребывания на ГД от 3 до 5 лет (47,8%).

У всех больных отсутствовал дефицит железа, витамина В12, фолиевой кислоты, не было выраженного гиперпаратиреоза, инфекционных заболеваний. Больные соблюдали диету с ограничением количества употребляемой жидкости, продуктов, содержащих повышенное количество калия и фосфора. В плановом порядке больные получали относительно постоянный набор лекарственных средств. Для лечения анемии использовались препараты эритропоэтина в/в после ГД в дозе от 2000 до 12000 ед. в неделю с поддержанием целевой концентрации гемоглобина 100-115 г/л. С целью восполнения дефицита железа применялся препарат сахарата железа венофер в/в после ГД в дозе 100 мг от 2 раз в неделю до 1 раза в месяц в зависимости от состояния феррокинетики. С целью коррекции артериальной пшертензии у части больных (около 30%) постоянно или эпизодически применялись гипотензивные препараты, чаще блокаторы кальциевых каналов и |}-адреноблокаторы короткого и пролонгированного действия. С целью коррекции фосфорно-кальциевого обмена больные принимали карбонат кальция в дозе 10 г/сут и альфакальцидол в дозе 0,75 мкг в неделю под контролем уровня кальция, фосфора и паратгормона крови. С целью восполнения потерь водорастворимых витаминов назначалось в/в введение витаминов группы В. Применение препаратов эритропоэтина и железа позволяло корригировать анемию у всех обследованных больных; проведение гемотрансфузий не понадобилось ни одному из пациентов в течение всего периода исследования.

25 больным был проведен ряд исследований на додиализной стадии. Это были пациенты, поступившие на лечение в состоянии ТХПН, но еще не получавшие ЗПТ, что позволило выделить их в отдельную группу обследованных.

Указанная характеристика больных и методов терапии свидетельствует о том, что состав групп по формам, течению заболеваний и методам лечения был типичным; по половому, возрастному составу и диализному стажу группы были сопоставимы.

Методы исследования

Кислотную резистентность эритроцитов определяли методом регистрации в фотоэлектрическом колориметре кинетики гемолиза, эритроцитов при воздействии кислотного гемолитика (Воробьев А.И., 1960). Для определения качественного состава эритроцитов получаемая эритрограмма делилась на 3 группы по

б

устойчивости эритроцитов к гемолитическому агенту (низко-, средне- и высокостойкие фракции эритроцитов - соответственно участки 0-4, 5-8, >8 мин на оси категорий). Количественной характеристикой кислотной резистентности служила их суммарная резистентность (СР), являющаяся суммой произведений процента гемолизировавшихся эритроцитов на время в минутах, соответствующее данной группе эритроцитов, вычисляемой по формуле: СР = П1Т1 + п2Т2 + п3Т3 + пкТк, где СР - суммарная резистентность эритроцитов, п - процент эритроцитов, разрушившихся за единицу времени (мин), Т - время в минутах между двумя отсчетами при получении эритрограммы.

Деформируемость эритроцитов определяли методом измерения скорости протекания суспензии эритроцитов через мембранные фильтры (Лисовская И.Л. с соавт., 1993). Использовали сконструировали,ш в Лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН фильтрометр ИДА-01. Время (сек) прохождения через фильтр ресуспендирующего раствора и исследуемой суспензии ((,), гематокрит суспензии

■■ .... и-1Ь 100 (тсяшр) использовались для расчета индекса ригидности (ИР): ИР =-х-.

(6 Ню$шр

Определение гемолитической активности сыворотки крови (ГС) производили после инкубации в ней эталонных донорских эритроцитов 0 (I) группы (резус-отрицательные) по формуле, выражающей линейную зависимость между ГС и параметрами эритрограмм, характеризующих резистентность эталонных эритроцитов

(СРа-СРк)хт

к гемолитическому воздействию исследуемой сыворотки. ГС = --^^ -,

где СРо СРк, СРдо - суммарная резистентность эритроцитов соответственно после инкубации в исследуемой, кмпрольной сыворотках и до инкубации (%мин). ГС оценивалась в единицах активности (ЕА). Метод определения ГС разработан в лаборатории патофизиологии ГНЦ РАМН (Ершова Л.И., 1990 г.).

Свободный гемоглобин в плазме определяли по методу Рождественской М.А. (1955). Наличие гемовой группы в гемоглобине обусловливает его реакцию с бензидино.м, являющегося индикатором гемовой группы, с образованием конечного продукта, окрашенного в голубой цвет. Экстинкцию определяли фотометрированием наФЭКе.

Определение кислотной резистентности, деформируемости эритроцитов, гемолитической активности сыворотки крови и свободного гемоглобина проводилось под руководством ведущего научного сотрудника д.м.н. Л.И. Ершовой в лаборатории патологической физиологии ГНЦ РАМН.

С целью исследования влияния ГД на состояние эритроцитов больных проводилось количественное определение иммуноглобулинов (^О, IgA, IgM) и фракций системы комплемента (С1д, СЗ) на поверхности эритроцитов методом

иммуноферментного анализа. В основе метода лежит взаимодействие иммуноглобулинов и компонентов комплемента, фиксированных на мембране эритроцитов, с моноспецифическими антителами, коньюгированными с ферментом. Был использован разработанный в лаборатории клинической биохимии отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН вариант твердофазного ферментного анализа с применением полученных собственных конъюгат антител против IgG, IgA, IgM, Clq и СЗ (Левина A.A., 1997).

Состояние ферментной системы эритроцитов оценивали путем определения активности каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и уровня восстановленного глутатиона. Активность каталазы определяли измерением скорости утилизации перекиси водорода в реакционной смеси, в которую вносился биологический материал (эритроциты), содержащий фермент по Beutler Е. (1975). Активность супероксиддисмутазы в эритроцитах определяли модифицированным методом по Beauchamp С. (1971). Концентрацию восстановленного глутатиона определяли в гемолизате эритроцитов по Beutler Е. (1963). Активность глутатионредуктазы в эритроцитах определяли по методу Верболович В.П. с соавт. (1987).

Определение карнитина в плазме и эритроцитах проводилось модифицированным ферментным методом, основанном на реакции ацетилирования свободного карнитина при воздействии ацетил-КоА в присутствии карнитин-ацетил-трансферазы (Deufel Т., 1990).

Количественное определение иммуноглобулинов и фракций системы комплемента на поверхности эритроцитов, ферментов эритроцитов, карнитина, а также исследование обмена железа проводилось в лаборатории клинической биохимии отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН ведущим научным сотрудником к.б.н. Левиной A.A. и к.б.н. Мамуковой Ю.И..

Статистическая обработка данных проводилась методами описательной статистики и одномерного однофакгорного анализа (критерии Стьюдента и Вилкоксона) с использованием статистического пакета «Statistica», v. 6.0. Критическая величина уровня значимости для оценки статистической значимости принята равной 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Показатели эритродиереза и реологические свойства крови у больных с ТХПН в додиализный период

Были рассмотрены изменения показателей эритродиереза и реологических свойств крови у 25 больных с ТХПН в додиализный период, т.е. до начала лечения программным ГД. При исследовании кислотной резистентности эритроцитов, позволяющей качественно оценить состав эритроцитов, кривая эритрограммы

больных с ТХ1ТН по сравнению с эритрограммами доноров имела более сглаженную форму и имела сдвиг вправо. Максимум гемолиза приходился в среднем на 7 мин (у доноров - 5,5-6 мин); длительность гемолиза была увеличена более чем на 1 мин.

Таблица 1

Показатели кислотной резистентности эритроцитов у больных с ТХП11

до начала лечения программным ГД

Показатели Больные с ТХПН до начала Доноры

лечения программным ГД (п=25) (П=10)

Суммарная резистентность, 638,4±23,27 608,0±11,12

%'МИИ

Эритроциты, %: низкостойкие 15,1±2,25 13,7±1,94

сред нестойкие 68,5-1-6.19 77,1±1,51

высокостонкие 16,4±2,21* 9,2±1.42

Максимальный гемолиз: мни 7,1 ±0,3 9* 5,8±0,23

% 19,9±1,64** 28,0±1,02

Длительность, мин 12.0±0,53 10,8±0,41

Примечание. *, ** - соответственно р < 0,01; 0,001 с донорами.

Выявлялась тенденция к повышению резистентности эритроцитов к действию кислотного гемолитика, проявляющаяся уплощением эритрограмм (снижением пика наибольшего лизиса эритроцитов), увеличением количества высокосггойких, тенденцией к повышению количества низкостойких эритроцитов, но снижением количества их среднестойких форм. Увеличение количества прегемолитических форм эритроцитов представляло собой проявление гемолитического компонента анемии.

Таблица 2

Содержание свободного гемоглобина в сыворотке крови у больных с ТХПН

до начала лечения программным ГД (М±т)

Показатели Больные с ТХПН до начала лечения программным ГД (п=25) Доноры (п=10)

Свободный гемоглобин, мг/дл 5,1±0,26 5,0±0,36

Количество свободного гемоглобина, как показателя внутрисосудистого гемолиза, у этих больных не отличалось от нормальных показателей (референсные значения - менее 7,00 мг/дл) (таб. 2).

О состоянии ферментной системы эритроцитов судили по изменению активности каталазы, супероксидцисмутазы, глутатионредуктазы и уровня восстановленного глутатиона, утилизирующих липопероксиды (таб. 3). Содержание основных аетиоксидантных ферментов имеет тенденцию к повышению, что говорит об имеющемся у них умеренном напряжении аитиоксидантной системы (АОС), свидетельствующем об активации процессов перекисного окисления липидов в эритроцитарной мембране.

Таблица 3

Состояние ферментной системы эритроцитов у больных с ТХПН до начала _лечения программным ГД (М±т)__

Анализируемые показатели Б-ные с ТХПН до начала лечения гемодиализом (п=25) Доноры (п=10)

Каталаза, мКат/л 3,4А0,86 2,3±0,42

СОД, ед/мл 2,1+0,48 1,6±0,04

Глутатионредуктаза, мКат/л 1,2±0,09* 0,8±0,08

Восстановленный глутатион, мкг/л 2,6±0,31 2,2±0,21

Примечание. * - р < 0,05 с донорами.

При определении гемолитической активности сыворотки крови выявлено ее повышение до 10,10±1,46 ЕЛ, что являлось выше контрольных значений на 46,5%.

При исследовании прохождения взвеси эритроцитов через поры фильтра значительного изменения их деформируемости, выражающейся индексом ригидности, выявлено не было. Результаты исследования деформируемости эритроцитов у больных ХПН в додиализный период практически не отличались от данных доноров (таб. 4).

Таблица 4

Деформируемость эритроцитов у больных с ТХПН

до начала лечения программным ГД (М±т) _

Показатели Больные с ТХПН до начала лечепия программным ГД (п=25) Доноры (п=Ю)

Индекс ригидности, усл. ед. 28,8±3,74 25,0±5,65

Плазменная концентрация карнитина у больных до начала лечения ГД, составила 48,9±18,0 мкмоль/л, что находится в пределах нормальных значений - 45,1-53,6 мкмоль/л.

Таким образом, в додиализный период изменения системы красной крови носят защитно-компенсаторный характер, что проявляется напряжением антиоксидантной системы, и, несмотря на тенденцию к увеличению в циркуляции количества прегемолитических форм эритроцитов, увеличением суммарной резистентное™ эритроцитов, вероятно, за счет появления повышенного количества молодых эритроцитов. Результаты проведенных исследований не зависели от длительности заболевания и исходной нозологической формы, вызвавшей развитие ХПН.

2. Исследование и сравнительный анализ воздействия процедуры ГД на показатели эритродиереза и реологические свойства крови у больных с ТХПН до начала лечения Ь-карннтнном

Обследовано 42 пациента с ТХПН, получающих лечение программным ГД. Было выявлено, что после проведенного ГД значительно повышается содержание свободного гемоглобина - по сравнению с показателями до процедуры почти в 2 раза, что свидетельствует о произошедшем гемолизе (таб. 5).

ю

Таблица S

Содержание свободного гемоглобина до и после процедуры ГД (М±ш)

Показатели Д°ГД (п=42) После ГД (п=42) Д, % Доноры (п=10)

Свободный гемоглобин, мг/дл 5,0±0,22 11,4±0,77* +128,0 5,0±0,36

Примечание: * - р < 0,001 с показателями до ГД.

При исследовании кислотной резистс1гтности эритроцитов отмечалось достоверное уменьшение суммарной резистентности эритроцитов. Происходил сдвиг кислотной эритрограммы в сторону меньших временных значений, вершина кривой смещалась влево. Количество высокостойких эритроцитов достоверно снижалось с одновременным повышением количества среднестойких и низкостойких форм эритроцитов (таб. 6).

Таблица 6

Кислотная резистентность эритроцитов до и после гемодиализа (М±т)

Показатели ДоГД(п=42) После ГД (п=42) Доноры (п=10)

Суммарная резистентность, %-мин 639,1±21,16 565,6±18,14** 608,0±11,12

Эритроциты, % низкостойкие среднестойкие высокостобкие 15,0±2,18 69,2±5,14 15,8±2,07 21,6±2,3 6* 72,4±5,68 6,0±1,09*** 13,7±1,94 77,1±1,51 9,2±1,42

Максимальный гемолиз, мин % 6,8±0,21 21,1±1,32 6,3±0,18 23,1± 1,67 5,8±0,23 28,0± 1,02

Длительность, мни 12,1±0,52 10,0±0,44* 10,8±0,41

Примечание. *,**,***- р<0,05; 0,01; 0,001 соответственно с показателями до ГД.

Исследование степени повреждения эритроцитов во время ГД проводилось измерением количества иммуноглобулинов (1^, 1{»М) и фракций системы комплемента (СЦ и СЗ) на их поверхности.

Таблица 7

Уровень иммуноглобулинов и компонентов комплемента на поверхности

эритроцитов до и после гемодиализа (М±т)

Анализируемые показатели ДоГД(п=42) После ГД (п=42) А, % Доноры

Иммуноглобулины (кол-во молекул/ эритроцит) IgG 171,9±34,33 827,4±148,96* +381,3 120±20

IgA 55,5±20,38 104,1±40,18 +87,6 40±15

IgM 8,3±2,72 19,5±8,44 +134,9 5±1

Компоненты комплемента (колнчество молекул/ эритроцит) Clq 4,3±2,12 9,7±4,54 +125,6 10,5±5,5 0

СЗ 14,4i6,23 27,7±11,27 +92,4 40±15

Примечание. *- р < 0,001 с показателями до ГД.

Отмечалось повышение количества всех трёх классов иммуноглобулинов с наиболее выраженным повышением иммуноглобулинов класса в, что можно

II

расценивать как признак произошедшего повреждения мембраны эритроцитов (Подберезин М.М. с соавт., 1997). Количество компонентов комплемента на поверхности эритроцитов не превышало пределов нормальных значений (таб. 7).

Агрессивные условия перфузии оказали воздействие и на состояние ферментных систем эритроцитов, являющихся компонентами системы антиоксидантной защиты организма. При исследовании основных антиокислительных ферментов глутатиона, глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах больных, находящихся на лечении программным ГД отмечалось повышенное их содержание до процедуры ГД по сравнению с показателями у доноров и пациентов с ТХПН в додиализшй период, что свидетельствовало об имеющемся напряжении антиоксидантной системы.

Таблица 8

Состояние ферментной системы эритроцитов

до и после процедуры ГД (М±т)__

Показателя До ГД (п=42) После ГД (п=42) А,% Доноры (п=10)

Каталаза, мКат/л 4,8±1,12 7,3±0,31* +52,1 2,3±0,42

СОД, ед/мл 2,8±0,70 3,9±0,84 -439,3 1,6±0,04

Глутатионредуктаза, мКат/л 1,6±0,12 2,9±0,52* +81,2 0,8±0,08

Восстановленный глутатион, мкг/л 3,1±0,31 5,8±1,08* -87,1 2,2±0,21

Примечание, р < 0,05 с показателями до ГД.

В результате процедуры ГД происходило повышение уровня глутатиона и активности антиокислительных ферментов. Полученные данные свидетельствуют о том, что в эритроцитах активируется антиоксидантная система в ответ на воздействие процедуры ГД. Результаты исследования подтверждают интенсивность стрессорного воздействия перфузии при ГД, что приводит к напряжению АОС.

Подтверждением стрессорного влияния процедуры ГД на организм послужило повышение уровня ферритина сыворотки крови в результате процедуры. Его преддиализный уровень имел значительные колебания - от 138,4 до 1594,5 мкмоль/л. Процедура ГД достоверно увеличивает уровень ферритина (в среднем на 34%). При определении уровня ферритина эритроцитов отмечалась тенденция к его увеличению -12,14±1,26 мкг/гНЬ (при нормальных значениях 5-10 мкг/гНЬ).

Было выявлено, что в результате процедуры ГД возрастает гемолитическая активность сыворотки крови. Исходно увеличенная у пациентов, находящихся на лечении программным ГД, ГС повышается после процедуры на 70,3%. Причем отмечается, что ГС у больных с ТХПН на преддиализной стадии несколько ниже, чем у тех, кому была начата ЗПТ: 10,1011,46 ЕА и 12,80±1,62 ЕА соответственно.

Таблица 9

Гемолитическая активность сыворотки крови _до и после процедуры ГД (М±ш) _

Показатели До ГД (п=42) После ГД (п=42) А,% Доноры (п=10)

Гемолитическая активность, ЕА 12,8±1,62 21,8±2,45* +70,3 5,5±0,25

Примечание. * - р < 0,01 с показателями до ГД.

Ранее Л.И. Ершовой (1992) было отмечено, что усиление механизмов разрушения эритроцитов связано с наличием соединений с молекулярной массой 80100 кДа, не выводящихся через мембрану диализатора. Этим можно объяснить и повышенную ГС у диализных пациентов по сравнению с балышми, получавшими только консервативную терапшо, более длительное пребывание в состоянии уремии предполагает и большее накопление уремических токсинов, не удаляемых диализом.

При исследовании деформируемости эритроцитов, взятых до и после ГД, не было выявлено достоверного изменения индекса ригидности эритроцитов в процессе процедуры. Величина, определяющая деформируемость эритроцитов, измеренная после проведения ГД, была сравнима с исходной. Описанное в литературе влияние изменения параметров и свойств эритроцитов у больных уремией, находящихся на лечении ГД, на деформируемость в нашем исследовании выявлено не было.

3. Показатели эрнтроднереза, реологические свойства крови, состояние ферментной системы эритроцитов у диализных больных на фоне применения Ь-карнитина

Актуальной проблемой является поиск способов стабилизации биологических мембран, утрачивающих свои свойства при ряде патологических процессов (в том числе при уремии), что приводит к нарушению их метаболизма. Особое внимание привлекает вопрос улучшения мембранных характеристик клеток у больных, чья кровь находится в нефизиологичсских, экстремальных условиях в течение длительного времени. В настоящей главе представлены результаты исследования показателей состояния эритроцитов на фоне применения Ъ-карнитина, чьи фармакологические свойства позволили нам предположить, что его использование может оказать протекторное воздействие на мембрану эритроцитов.

Начало лечения программным ГД сопровождается уменьшением содержания плазменного каршггина у больных. Благодаря низкой молекулярной массе и гидрофильности, каршп-ин легко проникает через мембрану диализатора и элиминируется из организма во время процедуры ГД. Его содержание в плазме больных, получающих лечение ГД, не превышало 30,8 ± 4,5 мкмоль/л (до 57,5% от нормальных значений) и в результате процедуры уменьшалось до 18,5±3,7 мкмоль/л.

27 больных получали Ь-каршшш (МНН - левокарнитин) в виде 20% раствора для приема внутрь в течение 4 месяцев в дозе 1 г в день. Длительность и способ

применения препарата были выбраны в соответствии с рекомендациями Рабочей группы качественного исхода заболеваний почек (КЛЭОС}1) Нью-йоркского национального почечного фонда (1994). Контрольную группу составили 15 человек, находящиеся на лечении программным ГД и не принимавшие Ь-карнитин. Лечение пациентов Ь-карнитином привело к повышению уровня плазменного карнитина до нормальных значений. Между тем, во 2 группе (не принимавшие Ь-карнитин) отмечалась тенденция к снижению уровня карнитина по сравнению с исходными данными. Степень элиминации карнитина в процессе процедур ГД оставалась примерно одинаковой во всех группах (таб. 10).

Таблица 10

Изменение уровня карнитина сыворотки крови в результате проведения

процедуры гемодиализа (М±т)

Группы" ~ ----- Карнитин, мкмоль/л Л, % Р

ДоГД После ГД

До начала применения Ь-карнитипа (п=42) 30,8 ± 4,53 18,5±3,78 -39,9 <0,05

Группа 1 (принимавшие Ь-карнитнн, п=27) 48,8 ±5,24** 26,8±4,64* -45,1 <0,01

Группа 2 (не принимавшие Ъ-карнптин, п=15) 26,9±5,82 15,1±3,27 -43,9 >0,05

Норма 45,1-53,6

V* - Р < 0,05 и Р < 0,01 с группой 2.

При определении свободного гемоглобина в сыворотке крови выявлено, что в результате проведения ГД у больных группы 2 его содержание повысилось более чем в 2 раза по сравнению с показателями до процедуры, что свидетельствует о произошедшем гемолизе.

Таблица 11

Влияние процедуры гемодиализа на содержание свободного гемоглобина (М±т)

Группы Свободный гемоглобин, мг/дл А, % Р

ДоГД После ГД

До начала применения Ь-карнитина (п=42) 5,0 ± 0,22 11,4±0,77 +128,0 <0,001

Группа 1 (принимавшие Ъ-карнитии, п=27) 5,0±0,20 6,8±0,55* +36,0 <0,01

Группа 2 (не принимавшие Ь-карнитин, п=15) 5,0±0,35 11,7±1,30 +134,0 <0,001

Норма <7,0

*- р<0.01 с группой 2.

После процедуры ГД гемолиз был значительно менее выражен у пациентов, принимавших Ь-карнитин, чем у пациентов 2 группы, прирост свободного гемоглобина составил 36%, и, несмотря на тенденцию к повышению, в целом он не выходил за пределы значений, считающихся нормальными (таб. 11).

Таблица 12

Показатели кислотной резистентности эритроцитов больных с ТХПН до и после процедуры гемодиализа

после курса лечення L-карпитином (М±ш)

Показатели До начала применения карннтнна (п=42) Группа 1 (принимавшие L-карннтин, п=27) Группа 2 (не принимавшие L-карннтин, п=15) Доноры, п=10

ДоГД После ГД А, % Р До ГД После ГД А, % Р ДоГД После ГД Д, % Р

Суммарная резистентность, %-мин 639,1 ±21,16 565,6 ±18,1 4 -11.5 <0,05 639.7 ±15.2 1 610,7 ±12,14* -4,5 >0,05 608.3 ±15,21 551,3 ±12,88 -9,4 <0,05 608,0 ±11,12

Эритроциты низкостойкие

15,0 ±2,18 21,6 ±2,36 +44.0 <0,05 11,9 ±2,12 * 12,1 ±1,52* +1,7 >0,05 18,9 ±2,23 25,3 ±2,48 +33,9 >0.05 13,7 ±1,94

средне-стойкие 69,2 ±5,14 72,4 ±5,68 +4,6 >0,05 76,8 ±3,86 80,7 ±4,84 +5,1 >0.05 67.4 ±4,82 70.3 ±3,76 +4,3 >0,05 77,1 ±1,51

высокостойкие 15,8 ±2,07 6,0 ±1,09 -62,0 <0,05 11,3 ±1,89 7,2 ±1.27 36,3 >0.05 13,6 ±1,98 4,4 ±1,13 -67.6 <0,05 9,2 ±1,42

Максим, гемолиз, мин 6,8 ±0,21 6,3 ±0,18 -7,4 >0,05 6,3 ±0,14 * 6,2 ±0,14* -1,6 >0,05 5,7 ±0,16 5.2 +0,21 -8.8 >0,05 5,8 +0,23

Длительность, мни 12,1 ±0,52 10,0 ±0,44 -17,4 <0,05 11,3 ±0.48 11,2 ±0,56 -0,9 >0,05 12,1 ±0,42 10,2 ±0,46 -15,7 <0,05 10,8 ±0,41

Примечание. *- Р < 0,05 с группой 2.

При изучении распределения эритроцитов по фракциям выявлено, что 1 группе больных отмечалось уменьшение количества низкостойких - с 15,00±2,18% до 11,92+2,12% и высокостоиких эритроцитов - с 15,80+2,07% до 11,26±1,89%, с одновременным увеличением количества среднестойких эритроцитов - с 69,2(Ь5,14% до 76,82±3,86% (таб. 12). После процедуры ГД количество высокостойких эритроцитов достоверно уменьшалось с одновременным увеличением количества среднестойких. Кроме того, несмотря на относительное уменьшение количества эритроцитов высокостойкой фракции, в группе 1 эритрограмма после ГД имела сдвиг в сторону больших временных значений, о чем свидетельствует увеличение ширины основания эритрограммы - увеличение длительности гемолиза на 1 минуту. Так, по данным исследования кислотных эритрограмм можно говорить об изменившемся качественном составе эритроцитов в группе 1. В группе 2 суммарная резистентпость имела меньшие значения как до процедуры ГД, так и после нее в сравнении с данными до начала исследования, что говорит о произошедшем снижении устойчивости эртрощггов. Об этом свидетельствует и более выраженный сдвиг эритрограммы влево после процедуры. Распределение эритроцитов по фракциям до и после процедуры ГД и длительность гемолиза существенно не отличались от данных, полученных в начале исследования. После проведения процедуры ГД количество высокостойких эритроцитов достоверно снижалось с одновременным повышеЕшем количества среднестойких и низкостойких форм эритроцитов.

При исследовании гемолитической активности сыворотки крови изменений ее в процессе лечения Ь-карнитином выявлено не было (таб. 13). Исходно увеличенная до начала применения Ь-карнитина, ГС практически не претерпевала изменений в результате лечения. Ее исходное повышение под воздействием процедуры ГД на 70,3%,сохранялось на прежнем уровне в обеих группах: значение ГС увеличивалось на 77,9% в группе 1 (принимавшие Ь-карнитин) и на 76,6% в группе 2 (не принимавшие Ь-каршшш).

Таблица 13

Влияние процедуры ГД на гемолитическую активность сыворотки крови

Группы^^ Гемолитическая активность, единицы актпвпости (ГА) Д,% Р

ДоГД После ГД

До начала применения Ь-карнитина (п=42) 12,8±1,62 21,8±2,45 +70,3 <0,01

Группа 1 (принимавшие Ь-карнитнн, п=27) 13,6±1,87 24,2±2,82 +77,9 <0,01

Группа 2 (не принимавшие Ь-кариитин, п=15) 12,8+1,83 22,6+2,15 +76,6 <0,01

Доноры (п=10) 5,5+0,25

Таблица 14

Влияние процедуры ГД на уровень иммуноглобулинов и компонентов комплемента на поверхности эритроцитов (М±т)

Анализируемые показатели До начала применении L-карнитина (п=42) Группа 1 (принимавшие L-карпнтип, п=27) Группа 2 (не принимавшие L-карпитин, п=15) Нор ма

До ГД После ГД А,% Р До ГД После ГД Л,% Р До ГД После ГД Л,% Р

Иммуноглобулины (кол-во молекул/ IgG 171,9 ±34.3 3 827,4 ±148,96 +381, 3 < 0,001 148,4 ±21,3 5 324,5 ±40,32* ±118, 7 <0,00 1 165.7 ±30,8 2 680,1 ±124,23 +310, 4 <0,001 120 ±20

эритроцит) IgA 55,5 =20,3 8 104,1 ±40,18 +87,6 >0,05 45,7 ±15,9 8 78,6 ±32,56 +72,0 >0,05 50,8 ±18,6 5 96.7 ±35.84 +90,4 >0,05 40 ±15

IgM 8,3 19,5 +134, >0,05 7,3 16,5 + 126, 0 >0,05 9,6 18,5 +92,7 >0,05 5±1

±2,72 ±8,44 ±2,84 ±3,97 ±2,94 ±4.61

Компоненты компле- Clq 4,3 ±2,12 9,7 ±4,54 +125, 6 >0,05 8,1 ±4,77 10,4 ±6,28 +28,4 >0,05 5,9 ±3,26 10,2 ±4,66 +72,9 >0,05 10,5 ±5,50

мента (кол-во молекул/ эритроцит) СЗ 14,4 ±6,23 27,7 ±11,27 +92,4 >0,05 17,3 ±6.31 28,7 ±10,18 +65,9 >0,05 20,1 ±6,15 31,8 ±10.57 +58,2 >0,05 40 ±15

Примечание. Р < 0,05 с группой 2.

Для определения степени повреждения эритроцитов во время ГД в группе 1 (принимавшие Ь-карнитин) измеряли количество иммуноглобулинов 1)*А, 1§>М) и фракций системы комплемента (С1ц, СЗ) на поверхности эритроцитов. В результате проведения ГД происходило пцвышение количества всех трех классов иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов, и так же наиболее выраженным оставалось повышение иммуноглобулинов класса в. Однако, по сравнению с данными до лечения Ь-карнитином, отмечалась тенденция к уменьшению количества иммупоглобулинов на поверхности эритроцитов до ГД, а воздействие процедуры ГД вызывало менее выраженное увеличение их количества. Особенно эти изменения видны на примере иммуноглобулинов класса в. Исходное их количество до проведения процедуры снизилось на 13,7%, а процент увеличения под воздействием ГД снизился на 262,6%. Исходя из этого, можно говорить об уменьшении степени повреждения мембраны эритроцитов в группе 1. В группе 2 при измерении количества иммуноглобулинов (^О, ^А, ¡¡>М) и фракций системы комплемента (СЦ, СЗ) на поверхности эритроцитов практически отсутствовали изменения по сравнению с исходными данными. Здесь отмечалось повышение количества всех трех классов иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов, так же оставалось наиболее выраженным повышение иммуноглобулинов класса Б; однако процент повышения

составлял 310,4%, что было сравнимо с исходными значениями и значительно выше аналогичного показателя в группе 1 (таб. 14).

После проведенного курса лечения Ь-карнитином до ГД в группе 1 содержание основных ферментов было повышенным по сравнению с донорами, с группой до начала лечения Ь-карнитином и группой 2, что свидетельствовало об имеющемся напряжении антиоксидаитной системы. Характерным различием являлось то, что в группе 1 напряжение антиоксидантной системы, проявлявшееся в более высоком уровне исследованных ферментов до процедуры ГД, сопровождалось меньшей степенью их повышения, чем аналогичные показатели в группе 2. Уровни каталазы, глутатионредукгазы и восстановленного глутатиона в группе 1, имеющие большее значение до ГД, имели меньший процент увеличения после ГД. Так, каталаза в группе 1 увеличивалась на 21,4%, во группе 2 - на 71,7%; глутатионредукгаза соответственно на 24,1% и 68,0%, восстановленный глутатион - на 23,2% и 93,3%. Уровень СОД оставаясь повышенным по сравнению со значениями в группе доноров, во 2 и 1 группах существенно не различался и был сравним с исходными значениями (таб. 15).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация ферментной системы в ответ на воздействие процедуры ГД в группе 1 была менее выражена по сравнению с группой 2. Учитывая то, что параллельно с этим

Таблица 15

Влияние процедуры ГД на состояние ферментной системы эритроцитов (М±т)

Анализи- До начала применения Группа 1 (принимавшие L- Группа 2 (не принимавшие L- Доноры

руемые кариитина (п~42) кариигнн, п=27) карннтин, п=15) (п=10)

показател

п До ГД Поел еГД Д,% Р До ГД После ГД А,% Р До ГД После ГД Л,% Р

Ката лаз а, 4,8 7,3 +52.1 <0,05 5,6 6,8±0,30 +21,4 >0,05 4,6 7,9±0.42 +71,7 <0,05 2.3±0,42

мКат/л ±1,12 ±0,31 ±1.23 * ±1.05

СОД, 2,8 3,9 +39,3 >0,05 2.8 3,8±0,71 +35,7 >0,05 2,7 4,0±0.63 +48,1 >0,05 1.6±0,04

ед/мл ±0.70 ±0,84 ±0,87 ±0.72

Глутатион 1,6 2,9 +81.2 <0,05 2,9 3,6±0,44 +24,1 >0,05 2,5 4,2±0.37 +68,0 < 0,8±0,08

-редуктаза, мКат/л ±0,12 ±0,52 ±0,18 ±0,18 0,001

Восстанов- зд 5,8 +87,1 <0,05 4,3 5,3±1,13 +23,2 >0,05 3,0 5,8±1,04 +93,3 <0,05 2,2±0,21

ленный глутатион, ±0,31 ±1,08 ±0,57 ±0,34

мкг/л

Примечание. * - Р < 0,05 с группой 2

отмечалось повышение преддиализного уровня ферментов эритроцитов у этих пациентов, можно говорить о возросшем аотиокислительном потенциале в группе 1, а по снижению выраженности ответа на воздействие процедуры ГД в сравнении с группой 2 - об уменьшение интенсивности стрессорного воздействия перфузии на эритроциты.

Проведение процедуры ГД сопровождалось повышением ферритина в обеих группах, различие в степени его повышения было несущественным, в среднем его уровень повышался на 35,2% в группе 1 и на 36,8% в группе 2, что, скорее всего, связано с повышением активности макрофагальной системы.

Больные обеих групп с целью лечения анемии получали препарат эритропоэтина («эпрекс») в поддерживающей дозе от 2 до 12 тыс. ЕД в неделю, подобранной индивидуально. В течение периода исследования с целью поддержания концентрации гемоглобина в пределах целевых значений 100-115 г/л проводилась коррекция дозы. Показанием к ее уменьшению или увеличению являлось соответственно увеличение концентрации гемоглобина выше 115 г/л (либо тенденция к его увеличению) и снижение ниже 100 г/л (либо тенденция к его снижению), что определялось индивидуально с учетом различных факторов, таких как масса тела пациента, междиализная прибавка массы тела, гемодинамика и др. Показательно, что у 11 (40,7%) больных из группы, получавших лечение L-карнитином, во избежание чрезмерпого повышения концентрации гемоглобина была проведена редукция дозы рчЭПО на 52,7 ± 16,2%, в то время как в группе больных, не получавших лечение L-каршгпшом, уменьшите дозы рчЭПО потребовалось у 2 (13,3%) больных, и в меньшей степени - на 33,3%. Коррекция дозы рчЭПО в сторону повышения была проведена у 3 пациентов (11,1%) на 55,6 ± 9,6% и у 3 (20%) на 44,4 ± 9,6% в группах принимавших и не принимавших L-карнитин соответственно. Таким образом, в 1 группе больных отмечалось положительное воздействие L-карнитина на лечение анемии. Об этом свидетельствует и то, что при определении уровня ферритина эритроцитов было отмечено, что тенденция к его увеличению сохранялась в группе больных, не принимавших L-карнитин, концентрация составила 13,22±1,27 мкг/гНЬ, в то время как у большинства пациентов группы 1 отмечалась нормализация уровня ферритина эритроцитов, который составил 7,25±2,12, лишь у троих пациентов эритроцитарный ферритин оставался повышенным.

При исследовании деформируемости эритроцитов не было выявлено достоверного изменения индекса ригидности в процессе процедуры. Изменение состояния эритроцитов fie оказало в нашем исследовании влияния на микрореологические свойства крови, в частности, на деформируемость эритроцитов.

Заключение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что проведение процедуры ГД сопровождается гемолизом. Так, при исследовании содержания свободного гемоглобина в плазме до и после ГД, выявлено его увеличение более чем в 2 раза, что говорит о произошедшем гемолизе. Об имеющемся повреждении эритроцитов свидетельствовали и результаты исследования иммуноглобулинов на их поверхности. Было отмечено увеличение количества всех трех классов иммуноглобулинов с наиболее выраженным повышением иммуноглобулинов класса G, что обусловлено нарушением целостности мембран эритроцитов, сопровождающегося обнажением гликопротеиновых антигенов и последующей иммунной реакцией (Garratty G., 1991, Connor J. et al., 1994).

При исследовании кислотной резистентности эритроцитов, характеризующей их устойчивость к гемолизу, выявлено, что после проведения процедуры ГД количество высокостойких эритроцитов снижалось с одновременным повышением количества среднестойких и низкостойких форм эритроцитов.

Поскольку часть эритроцитов в результате проведения процедуры ГД подверглась разрушению, а часть изменила свои свойства, в частности, устойчивость к гемолитическому воздействию, необходимо было провести исследование защитного потенциала эритроцитов. Так, нами было исследовано состояние основных компонентов ферментной защиты эритроцитов. Выявлено, что на фоне имеющегося напряжения антиоксидантной системы, проявляющегося изначальным повышением уровня основных ферментов эритроцитов, процедура ГД приводила к еще большему повышению их уровня.

Подтверждением стрессорного влияния процедуры ГД на организм послужило и наблюдение повышения уровня ферритина сыворотки крови и гемолитической активности сыворотки крови.

Комплексное лечение больных с ТХПН предполагает не только использование методик ЗПТ, но и медикаментозное воздействие на многие звенья патогенеза ХПН. Использование препаратов эритропоэтина и железа, средств, влияющих на фосфорно-кальциевый, жировой обмен позволило значительно улучшить качество лечения диализных пациентов, реабилитацию и качество жизни, уменьшить частоту госпитализации, повлиять на смертность. В последние годы многие специалисты проявляют интерес к еще одному лекарственному средству — L-карнитину, применение которого, как показал ряд исследований, позволяет решить некоторые проблемы пациентов, находящихся на лечении программным ГД, а, как известно, длительное лечение программным ГД является одной из основных причин развития вторичного дефицита карнитина, элиминирующегося во время процедур ГД.

В результате проведенного лечения 1^карнитином произошли следующие изменения. Гемолиз в группе больных, получавших лечение Ь-карнитином, был достоверно ниже (прирост свободного гемоглобина составил 36%) при сравнении с группой больных, не принимавших Ь-карнитин, и с исходными данными до начала лечения Ь-карнитином, где прирост свободного гемоглобина составил 134 и 128% соответственно.

Подтверждением уменьшения степени повреждения эритроцитов послужило и исследование количества иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов. По сравнению с данными до лечения Ь-карнитином, отмечалась тенденция к уменьшению количества иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов до гемодиализа (на 13,7%), а процент увеличения их количества под воздействием ГД уменьшился на 262,6%. Произошедшие изменения подтверждались при сравнении с группой больных, не принимавших Ь-карнитин, где практически отсутствовали изменения по сравнению с исходными данными.

При исследовании кислотной резистентности эритроцитов нами выявлено, что в группе больных, принимавших Ь-карнитин, суммарная резистентность эритроцитов до процедуры была одинаковой с определенной до начала применения Ь-карнитина и выше в сравнении с группой больных, не принимавших Ь-карнитин. После ГД суммарная резистентпосгь в группе больных, принимавших Ь-карнитин, претерпевала наименьшие изменения в сравнении с группой больных, не принимавших его, и показателями до начала приема Ь-карпитииа, т.е. кислотный гемолитик в группе больных, леченых Ь-карнитином, оказал минимальное деструктивное действие на эритроциты.

В группе больных, принимавших Ь-карнитин, также оказалось минимальным и изменение ширины основания кислотной эритрограммы; кроме того, в сравнении с группой больных, не принимавших его, вершина кривой имела правый сдвиг. Это означает, что в 1 группе скорость распада эритроцитов под влиянием соляной кислоты была замедлена, и время от начала до завершения гемолиза было увеличено. Также в этой группе уменьшилось количество низкостойких и высокостойких эритроцитов с одновременным увеличением количества среднестойких эритроцитов, а в результате процедуры ГД количество высокостойких эритроцитов достоверно уменьшалось с одновременным увеличением количества среднестойких эритроцитов, процент низкостойких оставался неизменным. Во 2 группе (не принимавших Ь-карнитин) распределение эритроцитов до и после процедуры ГД и длительность гемолиза существенно не отличались от данных, полученных в начале исследования. В процессе ГД происходил переход части эритроцитов из высокостойкой фракции во фракции со средней и, что показательно, с низкой стойкостью, часть эритроцитов

подверглась гемолизу, что проявлялось повышением количества свободного гемоглобина. Таким образом, но данным исследования кислотных эритрограмм можно говорить о положительных изменениях в качественном составе эршроцитов в группе больных, принимавших Ь-карнитин, и мембраностабилизирующем эффекте лечения.

В группе больных, получавших лечение Ь-карнитином, напряжение антиокислительной системы, проявлявшееся в более высоком уровне исследованных эритроцитарных ферментов до процедуры ГД, сопровождалось меньшей степенью их повышения после ГД, чем аналогичные показатели во 2-й, контрольной группе. Так, каталаза в группе ] увеличивалась на 21,4%, в группе 2 - на 71,7%; глутатионредуктаза - соответственно на 24,1% и 68,0%, восстановленный глутатион -на 23,2% и 93,3%. Полученные данные свидетельствуют о том, что активация ферментной системы в ответ на воздействие процедуры ГД в группе больных, получавших лечение Ь-карнитином, была менее выражена по сравнению с группой больных, не принимавших Ь-карнитин. Учитывая то, что параллельно с этим отмечалось повышение преддиализного уровня ферментов эритроцитов у этих пациентов, можно говорить о возросшем антиокислительном потенциале в 1 группе, а по уменьшению выраженности ответа на воздействие процедуры ГД в сравнении со 2 группой предположить уменьшение интенсивности сгрессорного воздействия перфузии на эритроциты.

При исследовании влияния процедуры ГД на уровень ферритина в 1 и 2 группах изменений в сравнении исходными данными выявлено не было. Повышение ферритина в обеих группах, скорее всего, было связано с повышением активности макрофагальной системы. Не было выявлено изменений и при исследовании гемолитической активности сыворотки крови. Исходно увеличенная перед началом исследования, до начала применения Ь-карнитина, гемолитическая активность сыворотки крови практически не претерпевала изменений в результате лечения. При исследовании деформируемости эритроцитов, взятых до и после ГД в 1 и 2 группах, не было выявлено достоверного изменения индекса ригидности эритроцитов.

Одним из важных нам представляется следующее наблюдение. При определении уровня ферритина эритроцитов было отмечено, что тенденция к его увеличению сохранялась в группе больных, не принимавших Ь-карнитин, в то время как у большинства пациентов группы, леченных Ь-карнитином, отмечалась нормализация уровня ферритина эритроцитов. Факт нормализации уровня ферритина эритроцитов может свидетельствовать о качественном изменении эритропоэза, поскольку повышенный уровень ферритина косвенно свидетельствует о его неэффективности.

В группе исследуемых пациентов, получавших лечение Ь-карнитином, во

избежание чрезмерного повышения концентрации гемоглобина потребовалось проведение редукции дозы применяемого препарата эритропоэтина «эпрекс» в большей степени и у большей части пациентов, чем в группе больных, не получавших лечение Ь-карнитином.

Анализ приведенного материала позволяет сделать следующее заключение. Нарушение структуры, функции и стабильности эритроцитарных мембран, нарушение метаболизма клеток при уремии и последующее травмирование эритроцитов приводит к гемолизу, который частично компенсируется усиленным эригропоэзом. Однако молодые формы эритроцитов, составляющие высокостойкую фракцию красных кровяных клеток в эритрограмме, являются продуктом неэффективного гемопоэза, о чем свидетельствует повышенный уровень ферритина в эритроцитах. Несмотря на высокое качество диализных систем и аппаратуры, перфузия при ГД оказывает комплексное повреждающее действие на эритроциты. Это проявляется посредством как неиммунного, связанного с прямым повреждающим воздействием на мембрану эритроцитов физических и химических факторов процедуры ГД, так и иммунного механизма, с участием иммуноглобулинов, воздействующих на обнажившиеся в результате повреждения мембран антигены. Результатом воздействия процедуры ГД является повреждение эритроцитарных мембран, фиксируемое, в частности, по повышению количества иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов. Также результаты позволяют заключить, что процедуры ГД сопровождаются нарушением окислительного баланса в организме, проявлением чего является повышение активности ферментной системы эритроцитов.

Гемолитическая активность сыворотки после курса лечения Ь-карнитином не изменилась, поэтому повышение кислотной резистентности эритроцитов в процессе лечения Ь-карнитином, скорее всего, не связано с гуморальным компонентом эритродиереза, т. е. с внеклеточным окружением, а, возможно, с изменением свойств самого эритроцита.

Таким образом, в результате процедуры ГД происходит потеря эритроцитарной мембраной исходных свойств. Проведенное исследование показало эффективность применения Ь-карнитина с целью улучшения состояния мембраны эритроцитов. Возможно, Ь-карнитин нивелирует недостаток энергообеспечения эритроцитов, что способствует улучшению внутриклеточного обмена на этапах созревания эритроцита с улучшением состояния мембраны, ферментной системы, повышенной устойчивостью к агрессивным воздействиям иммунной и иеиммунной природы. Тогда под действием Ь-карнитина происходит повышение уровня эритроцитарной антиокислителыюй активности, а, как известно, ослабление активности антиоксидантных ферментов приводит в первую очередь к изменению клеточных

мембран, которое, согласно мембранной концепции патогенеза неинфекционных заболеваний, является пусковым моментом их развития (Саркисов Д.С., 1988, Барабой В.А. с соавт., 1991, Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1991).

Поскольку мембрана эритроцитов в настоящее время рассматривается как универсальная модель цитоплазматической мембраны, особенности физиологии и патологии которой могут быть экстраполированы на клеточные мембраны других органов и систем, можно также говорить о комплексном положительном воздействии Ь-карнитина на организм.

Выводы

1. У больных с ТХПН наблюдается анемия, одним из компонентов развития которой является усиленный эритродиерез, выявляемый по изменению кислотной резистентности эритроцитов, повышению гемолитической активности сыворотки крови, повышению ферментативной активности эритроцитов.

2. Проведение гемодиализа сопровождается снижением резистентности эритроцитов н развитием гемолиза, что подтверждается достоверным (более чем в 2 раза) увеличением содержания свободного гемоглобина в сыворотке крови, повышением содержания низкостойких, прегемолитических фракций эритроцитов (на 44%), увеличением гемолитической активности сыворотки крови (на 70,3%).

3. Механизм активации интрадиализного эритродиереза связан с иммунным компонентом (увеличение количества фиксированных на поверхности эритроцитов иммуноглобулинов преимущественно класса в) и неиммунным звеном (повышение гемолитической активности сыворотки крови, активности ферментов эритроцитов).

4. У больных, находящихся на лечении программным гемодиализом, отмечается снижение уровня плазменного карнитина (на 57,5% от нормальных значений).

5. Применение Ь-карнитина нормализует уровень карнитина в плазме и увеличивает резистентность эритроцитов: снижается интрадиализный гемолиз и уменьшается количество фиксированных на мембране эритроцитов иммуноглобулинов, происходит перераспределение фракционного состава эритроцитов в сторону возрастания их среднестойких форм. Применение Ь-карнитина не оказывает воздействия на деформируемость эршроцитов и гемолитическую активность сыворотки крови. Реализация действия Ь-карнитина происходит через ферментативную систему эритроцитов с участием иммунного механизма.

6. Применение Ь-карнитина сопровождается нормализацией ферритина эритроцитов и повышением концентрации гемоглобина, что свидетельствует о повышении эффективности эритропоэза и позволяет редуцировать дозу применяемых препаратов эртропоэтина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мондоев Л.Г., Ершова Л.И., Бирюкова Л.С. (2007) Влияние процедур гемодиализа на некоторые показатели гемореологии и гемолиза. В сб: Сборник докладов научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» , Киров, с. 102-104.

2. Мондоев Л.Г., Ершова Л.И. (2007) Показатели эритродиереза у больных, находящихся на лечении программным гемодиализом. В сб: Сборник докладов конференции молодых ученых «Реология и физико-химические механизмы гетерофазных систем», Карачарово, с. 90-91.

3. Мондоев Л.Г., Бирюкова Л.С. (2007) Применение карнитина у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на лечении программным гемодиализом. Нефрология и диализ, 4, 391-394.

4. Мондоев Л.Г., Ершова Л.И., Бирюкова Л.С. (2008) Влияние L-карнитина на некоторые показатели гемолиза и гемореологии у больных, находящихся на лечении программным гемодиализом. В сб: 24 симпозиум по реологии. Карачарово, с. 82.

Подписано в печать:

10.12.2008

Заказ № 1369 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Программный гемодиализ (ГД) является одним из основных методов лечения больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ТХПН). Популяция этих пациентов неуклонно увеличивается, что связано как с увеличением продолжительности их жизни, так и с пересмотром многих критериев, регламентирующих отбор больных для лечения данным методом [59]. Решение клинических проблем, неизбежно возникающих у этой категории пациентов вследствие тяжести их состояния и длительности лечения, является важной задачей современной медицины.

Одним из основных синдромов, сопровождающих хроническую почечную недостаточность (ХПН), является анемический синдром. Коррекция анемии у больных с ТХПН, получающих заместительную почечную терапию, не только улучшает реабилитацию и качество жизни пациентов и уменьшает частоту их госпитализации, но и непосредственно влияет на смертность диализных больных [49, 60, 61].

Причинами анемии являются недостаток выработки эндогенного эритропоэтина, уменьшение срока жизни эритроцитов в условиях уремического окружения, дефицит железа, потеря крови во время процедур ГД, ятрогенные эксфузии при диагностических манипуляциях, хронические кровопотери [21, 161]. Также одной из причин анемии является гемолиз, инициированный в процессе процедур ГД и обусловленный прямым контактом крови с чужеродной поверхностью, воздействием на кровь пациента движущихся частей аппарата «искусственная почка», высоким давлением в экстракорпоральном контуре, а также действием остаточных примесей в воде для ГД или веществами, которые используются для дезинфекции и декальцификации диализной аппаратуры [89]. Этому способствует и то, что при ХПН изменяется обмен липидов мембраны эритроцитов; клетки становятся более жесткими, теряют механическую стойкость и быстрее разрушаются [62, 119, 156].

Учитывая то, что в процессе лечения программным ГД кровь больного подвергается агрессивному физическому и химическому воздействию на протяжении длительного времени, в стратегии лечения анемии помимо совершенствования аппаратуры и техники проведения ГД необходимо детальное изучение свойств эритроцитов и механизмов воздействия на них травмирующих факторов экстракорпоральной гемокоррекции.

Тканевая гипоксия, стимуляция перекисного окисления липидов (ПОЛ), нарушение антиоксидантной защиты организма, снижение механической стойкости эритроцитов и их хроническое травмирование в процессе повторяющихся процедур ГД диктуют необходимость проведения соответствующей терапии, проведения мероприятий, направленных на защиту эритроцитов. Так, одним из способов достижения данной цели может явиться применение препаратов, оказывающих протекторное воздействие на эритроциты.

Повышенный уровень ПОЛ в мембране эритроцитов у пациентов, находящихся на лечении программным гемодиализом [55, 109], создает предпосылки для применения препаратов антиоксидантного действия. Имеется ряд работ, посвященных этому вопросу [2, 16, 55, 46], однако нам представляется, что, помимо проведения непосредственной антиоксидантной терапии, необходимо изыскание способов увеличения собственного антиоксидантного потенциала эритроцитов.

В условиях гипоксии, сопровождающей уремию, главным источником энергии для клеток являются жирные кислоты, т.к., в отличие от глюкозы, они могут окисляться при низком уровне кислорода в крови, но требуют достаточного количества карнитина. Карнитин - вещество, родственное витаминам группы В, способствует переносу через мембраны митохондрий длинноцепочечных жирных кислот и их последующему расщеплению и образованию ацетил-КоА, необходимого для обеспечения активности пиру в ат кар б о к с ил аз ы в процессе глюконеогенеза, синтеза холина и его эфиров, окислительного фосфорилирования и образования АТФ. Конкурентно вытесняя глюкозу, карнитин включает жирнокислотный метаболический шунт, активность которого не лимитирована кислородом.

Недавние сообщения показали, что карнитин может играть важную роль в регуляции антиокислительных систем и его применение может улучшить защиту клеток посредством модуляции определенного каскада трансдукционных сигналов, активированных гиперпродукцией провоспалительных цитокинов [75, 144]. В то же время лечение ГД сопровождается значительным снижением содержания карнитина в организме вследствие его элиминации во время процедуры ГД [101, 124, 147].

Изучение влияния терапии программным ГД на эритроциты, исследование изменения их физико-химических показателей под воздействием данного вида заместительной почечной терапии и изыскание способов защиты эритроцитов с целью предотвращения интрадиализного гемолиза и, соответственно, уменьшения выраженности анемии является одним из актуальных и менее изученных вопросов, решение которого будет способствовать повышению устойчивости эритроцитов, положительному воздействию на гемолитический компонент анемии у больных, находящихся на лечении программным ГД.

Цель исследования

Целью исследования является изучение влияния процедур ГД на физико-химические показатели структуры эритроцитов, изучение механизмов интрадиализного гемолиза, определение возможности применения L-карнитина в качестве препарата, оказывающего протекторное действие на эритроциты.

Задачи исследования

1. Определение иммунного и неиммунного компонентов повреждения эритроцитов у больных, находящихся на лечении программным ГД.

2. Изучение ферментной защитной системы эритроцитов, гемолитической активности сыворотки крови, микрореологических свойств крови у больных, находящихся на лечении программным ГД.

3. Оценка результатов воздействия L-карнитина на состояние эритроцитов и выраженность анемии у исследуемых больных.

Научная новизна

Проведено комплексное исследование влияния процедур ГД на состояние мембраны эритроцитов и показатели гемолиза и гемореологии у больных с терминальной стадией ХПН.

Показано, что проведение процедур ГД активно воздействует на состояние эритроцитов, сопровождается гемолизом, аутоиммунными реакциями, повышением активности ферментной системы эритроцитов.

Показано влияние L-карнитина на состояние мембраны эритроцитов и их ферментную систему, выраженность интрадиализного гемолиза и анемии у больных, находящихся на лечении программным ГД.

Показана эффективность и дана оценка возможности применения L-карнитина в качестве протектора эритроцитов у этих больных.

Научно-практическая ценность

Результаты диссертационного исследования дополняют сведения о механизмах развития анемии в условиях терминальной стадии ХПН и терапии гемодиализом. Научно-практическая ценность результатов исследования состоит в том, что было установлено - изменение физико-химических показателей структуры эритроцитов под влиянием лечения программным гемодиализом свидетельствует о повреждающем воздействии на эритроциты данного вида терапии, что усугубляет анемию за счет увеличения выраженности ее гемолитического компонента. С целью защиты эритроцитов и уменьшения интрадиализного гемолиза было предложено использование препарата L-карнитин, клинико-лабораторная эффективность которого была показана в проведенной работе.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 101 странице текста компьютерной верстки и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав с описанием результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Библиографический указатель содержит 64 отечественных и 106 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. У больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности наблюдается анемия, одним из компонентов развития которой является снижение стойкости эритроцитов, выявляемое по изменению их кислотной резистентности, повышению гемолитической активности сыворотки крови, повышению ферментативной активности эритроцитов.

2. Проведение гемодиализа сопровождается снижением резистентности эритроцитов и развитием гемолиза, что подтверждается достоверным (более чем в 2 раза) увеличением содержания свободного гемоглобина в сыворотке крови, повышением содержания низкостойких, прегемолитических фракций эритроцитов (на 44%), увеличением гемолитической активности сыворотки крови (на 70,3%).

3. Механизм активации интрадиализного эритродиереза связан с иммунным компонентом (увеличение количества фиксированных иммуноглобулинов преимущественно класса G) и неиммунным звеном (повышение гемолитической активности сыворотки крови, активности ферментов эритроцитов: каталазы, глутатионредуктазы, восстановленного глутатиона).

4. У больных, находящихся на лечении программным гемодиализом, отмечается снижение уровня плазменного карнитина на 57,5% от нормальных значений.

5. Применение L-карнитина нормализует уровень плазменного карнитина и увеличивает резистентность эритроцитов к воздействию гемодиализа: достоверно снижается интрадиализный гемолиз и уменьшается количество фиксированных на мембране эритроцитов иммуноглобулинов, выявляется перераспределение фракционного состава эритроцитов в сторону возрастания их среднестойких форм. Применение L-карнитина не оказывает воздействия на деформируемость эритроцитов и гемолитическую активность сыворотки крови. Реализация действия L-карнитина происходит через ферментативную систему эритроцитов с участием иммунного механизма.

6. Применение L-карнитина сопровождается нормализацией ферритина эритроцитов и повышением концентрации гемоглобина, что свидетельствует о повышении эффективности эритропоэза и позволяет редуцировать дозу применяемого рекомбинантного эритропоэтина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в мире жизнь около полутора миллионов больных продолжается благодаря заместительной почечной терапии, и две трети из них находятся на лечении программным ГД. При проведении заместительной почечной терапии серьезной проблемой является влияние на функции крови таких факторов, сопровождающих процедуры ГД, как травма клеток крови в аппарате «искусственная почка», гепаринизация, нефизиологические температуры, контакт с химическими агентами. Действительно, повторяющиеся на протяжении многих лет многочасовые процедуры очищения крови не могут оставаться интактными как для всего организма в целом, так и, в особенности, для эритроцитов больного, непосредственно вступающих в контакт с чужеродной поверхностью экстракорпорального контура. Выявление воздействия процедуры ГД на физико-химические показатели структуры эритроцитов у больных с терминальной стадией ХПН, а также поиск путей улучшения состояния эритроцитов явилось целью настоящей работы.