Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние фуросемида на экскреторную функцию почек крыс в разное время суток

На правах рукописи

РЫКУНОВА АННА ЯКОВЛЕВНА

ВЛИЯНИЕ ФУРОСЕМИДА НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК КРЫС В РАЗНОЕ ВРЕМЯ СУТОК

(экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2012

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Брюханов Валерий Михайлович Официальные оппоненты:

Трифонова Ольга Юрьевна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, отделение кардиологии, заведующий отделением

Левицкий Евгений Федорович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра восстановительной медицины, физиотерапии и курортологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт кардиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

3« ,,_. 2012 , . _ час» „а

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_ // » -2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

Актуальность исследования.

В последние годы все большее внимание привлекают проблемы хронобиологии. Сегодня совершенно ясно, что на протяжении всей жизни организм существует в условиях ритмических колебаний, которые характеризуются различной периодичностью и частотой от нескольких секунд (ритмы мозга, сердца, дыхания) до недельных, месячных и многолетних, как это часто происходит с обменными и эндокринными процессами. Однако наиболее ярко проявляющимися и обеспечивающими такие жизненно важные процессы, как цикл сон-бодрствование, ритмические колебания артериального давления, температуры тела, секреции гормонов, функции почек, являются суточные или циркадианные ритмы. Эти ритмы напрямую связаны с 24-часовым солнечным циклом, часть которого мы находимся в контакте с окружающим миром в течение дневного времени, а затем уходим от него во время ночного сна.

Оказалось, что развитие многих заболеваний связано с нарушением функционирования внутренних часов организма, которые определяют и контролируют наши биоритмы. Выяснилось, например, что в ночные часы (с 24°° до 6°°) происходит ухудшение состояния больных с хронической сердечной недостаточностью, обострение язвенной болезни желудка, чаще возникают эпилептические припадки, приступы бронхиальной астмы; для утренних часов (с 6°® до 12°°) характерны приступы мигрени, проявления ревматоидного артрита, аллергических заболеваний, чаще фиксируются случаи острого инфаркта миокарда и внезапной сердечной смерти; в послеобеденный и вечерний периоды времени (с 12°° до 24°°), как правило, обостряются хроническая боль различного генеза, проявления остеоартрита, дерматозов, возникают анемические кризы, чаще случаются прободения язвы желудка.

Это и обусловило появление и развитие хронофармакологии. В последние годы выяснено, что эффективность многих лекарственных средств также связана с суточными ритмами организма. Поэтому фармакологическая активность и безопасность значительного количества лекарственных препаратов напрямую зависит от точного времени их попадания в организм.

Все сказанное выше в полной мере относится к диуретику фуросемиду, широко применяемому для создания форсированного диуреза при многих ургентных состояниях, включая острую сердечную недостаточность, гипертонический криз, отек мозга и другие. Это и обусловило наш интерес к проблеме хронофармакологии в целом и к мочегонному препарату фуросемиду в частности.

Цель исследования.

Выявить особенности влияния диуретика фуросемида на экскреторную функцию почек крыс при его введении в разное время суток и установить механизмы обнаруженных различий.

Задачи исследования.

1. Сравнить влияние фуросемида на экскреторную функцию почек у крыс при его вйедении днем (в 12°°) и ночью (в 24°°) в условиях естественного освещения.

2. Исследовать различия активности фуросемида, вводимого в разное время суток, на фоне угнетения центральной регуляции экскреторной функции почек с помощью нейролептика хлорпромазина и при отсутствии периферической регуляции экскреторной функции почек в условиях двухсторонней адрена-лэктомии.

3. Определить морфологические особенности функциональной активности почек крыс в различные периоды суточной активности, а также на фоне введения фуросемида в разное время суток.

4. Изучить влияние фуросемида на экскреторную функцию почек у крыс, длительно (7 суток) пребывавших в условиях темноты или на свету.

5. Изучить влияние фуросемида на экскреторную функцию почек у крыс в условиях инверсии светового режима, когда день и ночь искусственным путем меняются местами.

6. Исследовать влияние фуросемида, вводимого крысам в разное время суток, на фоне частичной водной депривации.

Научная новизна исследования.

Впервые в суточных экспериментах на крысах показаны различия активности фуросемида в отношении экскреторной функции почек в зависимости от времени введения диуретика. Выявлено более выраженное диуретическое и, особенно, натрийуретическое действие в первые 6 часов после ночного внутрибрюшинно-го введения препарата в дозе 20 мг/кг. При этом ночной диуретический, но не натрийуретический, эффект компенсировался в последующие до окончания суток часы.

Выяснено, что отсутствует параллелизм в развитии диуретического и на-трийуретического эффектов при парентеральном введении фуросемида. В то время как мочегонное действие распределяется более равномерно в течение суток, подавляющая часть экскреции натрия (более 90%) происходит в первые 6 часов после введения препарата.

Установлено, что выявленные различия в действии фуросемида полностью нивелируются на фоне угнетения центральной регуляции экскреторной функции с помощью нейролептика хлорпромазина и частично - в отсутствие периферической регуляции экскреторной функции у адреналэктомирован-ных животных.

Предположено, что выявленные различия эффектов фуросемида обусловлены неодинаковой функциональной активностью почек в разное время суток. С помощью морфологического исследования показано, что у крыс, яв-

ляющихся типичными ночными грызунами, уровень метаболизма и биосинтетической активности в клетках дистального нефрона в ночной период времени существенно превосходит дневной.

Показано, что длительное пребывание крыс в условиях инверсии светового режима, а также на свету, но не в темноте, значительно ослабляет влияние фуросемида на экскреторную функцию почек. Сходным образом эффект диуретика ослаблялся на фоне частичной водной депривации. При этом различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения, практически исчезали. Полученные результаты позволили высказать предположение о том, что стрессовые воздействия различного характера нарушают механизмы регуляции, обусловливающие возникновение указанных отличий в эффектах фуросемида.

Научно-практическая значимость.

Получены новые сведения относительно различной фармакологической активности фуросемида в зависимости от времени его введения.

Выявленные отличия эффекта фуросемида у крыс, зависящие от времени введения препарата, позволяют с учетом видовых и эволюционных особенностей предположить наличие подобных различий и у человека, что может иметь важное значение при клиническом использовании этого диуретика. При этом следует учитывать, что различные стрессовые воздействия могут нивелировать обнаруженные особенности в действии препарата.

Установленные различия в диуретической и, особенно, натрийуретиче-ской активности фуросемида в зависимости от времени введения позволяют более взвешенно и дифференцированно подходить к дозированию данного диуретика.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В суточных экспериментах на крысах фуросемид проявляет более выраженную диуретическую и, особенно, натрийуретическую активность в первые часы после ночного введения. Выявленные различия не зависят от количества попавшего в мочу фуросемида.

2. Обнаруженные отличия в действии фуросемида у крыс нивелируются на фоне угнетения центральной регуляции экскреторной функции почек с помощью хлорпромазина и существенно ослабляются при отсутствии периферической рефляции экскреторной функции почек у адреналэкгоми-рованных животных.

3. Морфологическое исследование почек крыс показало более выраженную метаболическую и биосинтетическую активность клеток дистального нефрона в ночное время, что, по-видимому, и обусловливает выявленные различия в эффектах фуросемида.

4. В условиях длительного пребывания животных в темноте активность фу-росемида сохраняется на уровне контрольных показателей, в то время как при длительном нахождении на свету эффект диуретика значительно ослабляется.

5. На фоне инверсии светового режима, обусловленной искусственной сменой дня и ночи, активность фуросемида значительно ослабляется и соответствует таковой при длительном пребывании животных на свету. При этом различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения, исчезают.

6. Частичная водная депривация ослабляет диуретическую и натрийуретиче-скую эффективность фуросемида у крыс и нивелирует суточные различия в действии диуретика.

Внедрение результатов работы.

Результаты научного исследования используются в учебном процессе на кафедрах фармакологии, клинической фармакологии, гистологии, госпитальной и поликлинической терапии с курсом профболезней и эндокринологии ГБОУ ВПО АГМУ Минздравсоцразвития РФ.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII съезде научного общества нефрологов России (г. Москва, 2010 г.), на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2011 г.), на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011 г.), на Ежегодной конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (г. Екатеринбург, 2011 г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Педиатрия Алтая на рубеже тысячелетия» (г. Барнаул, 2011 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками, 15 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследова-

ний, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 267 источника, из них 249 - иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн исследования

Для проведения исследования, направленного на изучение влияния фуросе-мида на экскреторную функцию почек в разное время суток, была избрана следующая экспериментальная схема:

Установление факта различий в действии фуросемида в зависимости от времени введения

При подавлении центральной регуляции экскреторной функции почек (фуросемид на фоне хлор-промазина)

При отсутствии периферической регуляции экскреторной функции почек (фуросемид на фоне адрена-лэктомии)

Роль изменений функциональной активности почек в дневное и ночное время суток

Влияние стрессовых воздействий на эффекты фуросемида, введенного в разное время

«Субъективная ночь»

«Субъективный День»

Инверсия светового режима

Водная депривация

Эксперименты проведены на 205 сертифицированных крысах ^Л^аг обоего пола массой 160-250 г, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск), в стандартных лабораторных условиях, при световом режиме с чередованием по 12 часов света (с 8°° до 20°°) и темноты (с 20°° до 8°°). Животные помещались в индивидуальные клетки, приспособленные для сбора мочи. Освещение на уровне клеток в течение светового периода находилось в пределах 750 люксов. В условиях темного

времени допускался только тусклый красный свет (до 0,5 люкса), который включался лишь на время необходимых процедур по обслуживанию животных и введению препаратов. На протяжении всего эксперимента животные получали обычный виварный пищевой рацион при свободном доступе к пище и воде (кроме опытов с частичной водной депривацией). После 7-10 суток, в течение которых крысы адаптировались к индивидуальным клеткам, в течение 24 часов производили сбор мочи, фиксируя суточный диурез. В собранной моче определяли содержание креатинина, служившего мерой скорости клубочковой фильтрации (СКФ), а также концентрацию натрия и калия для расчета их суточной экскреции.

Перед введением фуросемида крыс рандомизировали по массе тела и полу на две сопоставимые группы. Фуросемид в дозе 20 мг/кг вводили внутрибрю-шинно первой группе в 12°°, второй группе - в 24°°. Мочу собирали через 6 и 24 часа после введения препарата, регистрируя уровень мочеотделения. В обеих порциях собранной мочи определяли содержание креатинина, натрия, калия и фуросемида.

Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом пламенной фотометрии. Содержание креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанным на реакции Яффе. Определение концентрации фуросемида в моче проводили с использованием метода высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по методике, ранее разработанной в нашей лаборатории.

В экспериментах, посвященных изучению роли центральной регуляции экскреторной функции в реализации эффектов фуросемида, по истечении 10-дневного периода стабилизации, в ходе которого определялись контрольные показатели функции почек, на протяжении 5 дней крысам подкожно вводили классический нейролептик хлорпромазин в дозе 1 мг/кг в сутки. После этого первой группе животных внутрибрюшинно вводили фуросемид в дозе 20 мг/кг в 12°°, второй группе - в 24°°. В собранной за 6 часов и за сутки моче производили указанные выше определения.

Для выяснения значимости периферической регуляции экскреторной функции, осуществляемой надпочечниками, были изучены эффекты фуросемида, вводимого в разное время суток адреналэкгомированным крысам.

С этой целью использовалась известная методика одномоментной двухсторонней адреналэктомии. В качестве контроля использовали ложноопе-рированных крыс, оперативное вмешательство у которых ограничивалось разрезами с последующим зашиванием мягких тканей. Через 7 дней после операции крыс вводили в эксперимент, помещая в индивидуальные клетки, определяли исходные параметры экскреторной функции почек и вводили фуросемид, как это описано выше.

Для выяснения механизмов полученных фармакологических эффектов диуретика провели исследование морфологической структуры нефрона крыс в разное время суток и на фоне введения фуросемида. Для гистологи-

ческого исследования животных декапитировали путем дислокации шейного позвонка под эфирным наркозом с соблюдением требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других научных целей» (Страсбург, 1986 г.) и Федерального Закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.

Почку забирали в середине светлого и темного периодов (в 14°° и в 2°°), а также через 2 часа после введения фуросемида. Поперечные срезы через почечный сосочек толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для определения биосинтетической активности и общей функциональной жизнеспособности клеток использовали полихромную методику окраски сафранином-0 (Т) по А.Н. Яцковскому, дающую возможность судить о клеточной активности по степени конденсации хроматина.

Морфометрические исследования проводили с использованием программного пакета Axio Vision 4.7 (Carl Zeiss, Germany). Рассчитывали известное ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) в эпителиоцитах дис-тальных канальцев нефронов области наружной медуллы по формуле: ЯЦО = S«flpa/(SioiCTKH - 5адра), ГДе Бадра ~ ПЛОЩЭДЬ ядра эпителиоцита В мкм2, Sклетки -площадь клетки в мкм2. Помимо этого оценивали размер просвета дисталь-ных почечных канальцев в мкм2.

Дальнейшее исследование эффектов фуросемида проводили в условиях стрессовых воздействий на течение нормальных суточных ритмов.

В первой серии экспериментов в попытке воздействовать на нормальные суточные биоритмы крыс в течение недели выдерживали в условиях обычного светового режима для определения исходных показателей функции почек. Затем на сутки часть животных помещали в условия полной темноты («субъективная ночь»), а вторую половину - в условия постоянной освещенности («субъективный день»), после чего внутрибрюшинно вводили фуросемид в дозе 20 мг/кг и вновь помещали на сутки в те же условия.

Во второй серии опытов фуросемид вводили в той же дозе после 7 суток пребывания животных на свету или в условиях полной темноты и исследовали те же параметры.

В следующей серии экспериментов с целью инверсии светового режима на протяжении 7 суток в дневное время с 8°°до 20°° животные помещались в условия полной темноты, а с 20°° до 8°° включался электрический свет одинаковой интенсивности (750 люксов). После этого вводили фуросемид и производили все описанные выше измерения.

В четвертой серии опытов стрессовым фактором служила частичная хроническая водная депривация, нарушающая привычный питьевой режим и существенно влияющая на объем жидкости в организме. После 10-дневного периода стабилизации, в ходе которого определялись контрольные показатели функции почек, животные на протяжении 5 дней с 20°° до 8°° лишались

питьевой воды. Затем части крыс фуросемид вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг в 12°°, второй половине - в 24°°.

Для расчетов и статистической обработки использовались компьютерные программы Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, США) и Sigma Stat 3. для Windows. Статистическая обработка полученных количественных расчетов проводилась с использованием параметрического критерия Стью-дента и непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Результаты представлены в виде среднего арифметического (М) ± стандартная ошибка среднего арифметического (т).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В таблицах 1 и 2 представлены результаты дневного и ночного введения фуросемида на функцию почек крыс.

Таблица 1

Влияние дневного введения фуросемида (20 мг/кг) на функцию почек у 20 крыс

Показатели Исходный суточный уровень Введение фуросемида

За 6 часов За 18 часов За 24 часа

Диурез, мл Экскреция Na+, мкМ Экскреция К+, мкМ Экскреция креатинина, мхМ Экскреция фуросемида, мг 3,9±0,34 31+3,0 175±14,1 8,5±0,33 7,1±0,35'" 2338+183,8*'* 854±30,3*" 3,7±0,17*" 2,18±0,066 10,4±1,95"* 191+48,0*'* 307±31,2"* 10,7±0,4б"' 0,16±0,032 17,6±2,1б'" 2576+225,0"' 1170±37,6*" 14,4±0,42*" 2,34±0,084

Примечание: здесь и в таблице 2 звездочками обозначены достоверные отличия от показателей исходного суточного уровня ( р<0,001; * р<0,05).

Таблица 2

Влияние ночного введения фуросемида (20 мг/кг) на функцию почек у 20 крыс

Показатели Исходный суточный уровень Введение фуросемида

За 6 часов За 18 часов За 24 часа

Диурез, мл Экскреция Na+, мкМ Экскреция К\ мкМ Экскреция креатинина, мкМ Экскреция фуросемида, мг 3,8+0,43 28±3,4 153±10,8 7,6±0,33 8,1±0,50"" 3056±185,Г" 1137±64,7"' 4,5±0,30*" 2,17±0,189 4,7±0,81 186±19,9"" 197±14,2' 7,8±0,37 0,095±0,005 12,8±1,03"" 3241±184,7*" 1335±67,0'" 12,3±0,47*** 2,27+0,180

Из таблиц видно, что после внутрибрюшинного введения крысам в дозе 20 мг/кг фуросемид оказывал мощное воздействие на экскреторную функцию почек как при дневном, так и при ночном введении. При этом выясни-

лось, что процессы нарастания диуретической реакции и выделения с мочой натрия происходят отнюдь не параллельно. Если выраженный диуретический эффект развивался, обеспечивая равномерный прирост на протяжений суток, в конце которых мочеотделение в 3,5 раза превосходило контрольные значения, то экскрецию натрия характеризовала иная динамика. Уже за первые 6 часов обеспечивалось около 90% суточного натрийуретического эффекта, когда выделение этого иона в 75 раз превышало уровень исходной суточной экскреции. За последующие 18 часов величина экскреции натрия составила лишь около 10% от суммарного суточного выделения. Важно отметить, что динамика экскреции с мочой фуросемида практически соответствовала таковой для выделения натрия, что может свидетельствовать о сопоставимой эффективной концентрации препарата. Так, в первые 6 часов в моче обнаруживалось 55-60% от введенной дозы препарата, что составляло более 90% от выделившегося за сутки фуросемида. Сходным образом, хотя и более равномерно, распределялась в пределах суток экскреция калия. За первые б часов выделилось 70-75% от суточного калийуреза, который, в свою очередь, в 7 раз превосходил контрольный уровень. Следует отметить, что введение фуросемида как в дневные, так и в ночные часы сопровождалось существенным увеличением суточной экскреции креатинина. Рост последнего показателя на 65-75% за сутки по сравнению с исходным уровнем, без сомнения, вносил вклад в развитие диуретического действия препарата. При этом выделение креатинина распределялось равномерно в пределах суток, когда прирост за первые 6 часов составил около 25%, соответствуя, скорее, динамике диуретической реакции.

Отметим, что этот факт неравномерного прироста выделения из организма воды и электролитов независимо от времени введения препарата явился для нас весьма неожиданным. Из этого следует, что, возможно, для создания адекватного диуреза вполне достаточно значительно менее сильного подавления канальцевой реабсорбции натрия. Этот вопрос, касающийся тактики применения и дозировки фуросемида, требует дальнейшего изучения.

Сравнивая эффект фуросемида после ночного и дневного введения, на фоне качественно сходной картины мы выявили явные количественные различия. Оказалось, что в первые часы после ночного введения диуретика все основные параметры экскреторной функции значительно превосходили таковые после дневного введения фуросемида. При этом различия в величине диуретического действия и скорости клубочковой фильтрации были выражены в меньшей степени, а ночная экскреция электролитов, особенно натрия, значительно превосходила дневную. Интересно, что со стороны экскреции фуросемида с мочой существенных различий зафиксировано не было.

В последующие 18 часов картина несколько менялась. Если разница в экскреции натрия и калия, зафиксированная в первые 6 часов, сохранялась практически в неизменном виде до конца суток, поскольку именно за счет

первых часов обеспечивалась основная часть прироста натрий- и калийуреза, выделению воды была свойственна иная динамика. После мощного, но кратковременного действия фуросемида, особенно в ночные часы, происходило значительное уменьшение диуретического эффекта, приходившееся, заметим, в основном на последующий дневной период времени, что ослабляло суммарное суточное влияние диуретика. Эта особенность действия петлевых диуретиков, когда острое ударное воздействие (0-6 часов после введения) сменяется так называемым рикошетом в последующие 6-24 часа, обусловленным, по-видимому, компенсаторным повышением реабсорбции воды, известна в клинике, что несколько ослабляет их эффективность и делает сопоставимыми с тиазидовыми диуретиками.

После установления факта различий в действии фуросемида у крыс была предпринята попытка установить механизм выявленного эффекта. У млекопитающих главный пейсмекер, задающий циркадианную ритмичность, локализован в парных супрахиазматических ядрах, расположенных в основании гипоталамуса. Перед нами возник вопрос, сохранятся ли обнаруженные нами различия в действии диуретика в условиях подавления активности центральной регуляции экскреторной функции почек с помощью хлорпромазина. Применяя этот препарат, мы исходили из общеизвестного и многократно подтвержденного факта, согласно которому хлорпромазин, являясь классическим нейролептиком, подавляет дофаминергическую иннервацию различных отделов головного мозга, в том числе и нейронов гипоталамуса, и угнетает активность оси гипоталамус - гипофиз - надпочечники, играющую важную роль в регуляции водно-солевого обмена.

Оказалось, что хотя 5-дневное применение хлорпромазина не повлияло на функцию почек у крыс, на этом фоне эффекты фуросемида в результате дневного и ночного введения практически не отличались друг от друга, демонстрируя исчезновение обнаруженных ранее отличий.

Таким образом, было установлено, что применение хлорпромазина нивелировало зафиксированные нами различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения. Этот факт подчеркивает роль центральной регуляции экскреторной функции почек в обеспечении различий в активности препарата на протяжении суток у крыс.

Важную роль в обеспечении нормальной функции почек играет ее периферическая регуляция, осуществляемая кортикоидными гормонами надпочечников. Будучи тесно связанными нейрональным и гуморальным путями с центральными механизмами, надпочечники посредством регулируемого синтеза и высвобождения этих гормонов обеспечивают ритмичное функционирование многих внутренних органов, синхронизируя их деятельность. У нас возник резонный вопрос, влияют ли надпочечники на выявленные нами различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения. Это и обусловило проведение серии экспериментов на адреналэктомированных животных.

Выяснилось, что в наших экспериментальных условиях при свободном доступе к воде и пище в течение двух недель после удаления надпочечников экскреторная функция почек крыс несколько отличалась от таковой у лож-нооперированных животных. Было зафиксировано увеличение исходных показателей суточного мочеотделения, а также экскреции калия. Это представляется вполне объяснимым, если учесть отсутствие у этих животных действия альдостерона и глюкокортикоидов, мощных стимуляторов реабсорбции в почечных канальцах. Некоторое же снижение экскреции натрия в исходном периоде у адреналэктомированных крыс было обусловлено, по-видимому, истощением к этому времени запасов данного иона в связи с отсутствием альдостерона.

В этих условиях диуретический, натрийуретический и калийуретический эффекты фуросемида независимо от времени введения были существенно ослаблены. Относительно показателей экскреторной функции почек в зависимости от времени введения фуросемида отметим, что столь выраженных различий, как у ложнооперированных крыс, в условиях адреналэктомии зафиксировано не было. Наблюдалось лишь некоторое увеличение диуретического действия, натрийуретического и калийуретического эффектов после ночного введения препарата в сравнении с дневным - как в ближайшие 6 часов, так и через сутки после инъекции. Впрочем, отмеченное увеличение ни в одном случае не достигло достоверных различий.

Полученные данные совпадают с имеющимися единичными сведениями и указывают на участие надпочечников в обеспечении различий эффектов фуросемида в отношении экскреторной функции почек у крыс в зависимости от времени введения диуретика.

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что зависящие от времени введения различия в эффектах фуросемида у крыс определяются синхронизированным влиянием центральной и периферической регуляции экскреторной функции почек.

Факт более активного острого действия фуросемида у крыс в ночные часы для нас не явился сюрпризом, если учесть, что данные животные относятся к грызунам, ведущим активный образ жизни в ночное время, т.е. имеющим обратный суточный ритм в сравнении с человеком и так называемыми дневными животными. У нормальных крыс жизненная активность синхронизируется с наступлением темноты, и бОльшую часть ночи они проводят в поисках воды, пищи и партнера. С наступлением же рассвета обычные крысы прячутся в норы, где бОльшую часть дневного времени спят. Так что, наблюдавшиеся в наших экспериментах отличия, по всей вероятности, были обусловлены различной функциональной активностью почек крыс в дневное и ночное время. Косвенным подтверждением этого явились данные цито-морфометрии почечных срезов.

С помощью морфометрического изучения эпителиоцитов дистальных канальцев нефрона нами были получены данные, представленные в таблице 3,

свидетельствующие, что у крыс в темное время суток функциональная активность почек существенно выше, чем в дневные часы. На это указывает статистически значимое увеличение ядерно-цитоплазменного отношения клеток эпителия дистальных кадальцев почки в ночное время, подчеркивая усиление их функциональной активности и более высокий уровень метаболизма в клетках. Более высокая активность функционирования дистальных канальцев в темный период времени подтверждается и значительным расширением их просвета, что свидетельствует об увеличении объема протекающей по канальцу мочи. В составе эпителиальной выстилки дистальных канальцев ночью отмечалось увеличенное количество эпителиоцитов (до 91%), ядра которых содержат эухроматин, что указывает на более высокую степень активности биосинтетических процессов в клетках. Количество таких функционально активных клеток ночью оказалось на 18% больше, чем в дневное время.

Таблица 3

Изменения активности клеток дистальных канальцев нефрона крыс - по данным морфометрического исследования - до и после введения фуросемида

(20 мг/кг)

Показатели Интактные крысы После введения фуросемида

День Ночь День Ночь

ЯЦО 0,48+0,017 0,67±Ю,017*" 0.65+0,016"* 0,66±0,01б"'

п 89 129 119 97

Функциональная активность эпителиоцитов, % 77 91 85 82

п 796 1663 1400 1292

Площадь просвегга дистального канальца, мкм2 31±7,2 63+6,8" 55+7,1* 72±6,9*"

п 31 53 38 32

Примечание: ЯЦО - ядерно-цитоплазменлое отношение; р<0,001; р<0,01; рс0,05 в сравнении с показателями интактных крыс в дневное время, п - число наблюдений

Таким образом, из проведенной работы следует, что зафиксированные различия в действии фуросемида у крыс зависят от активности функционирования почечных канальцев. Вероятно, их более активная деятельность в ночные часы обусловливает выявленный нами больший диуретический эффект фуросемида в этот период времени.

Это же подтверждается и более высоким приростом скорости клубочко-вой фильтрации в первые 6 часов после ночного введения препарата. Важно

отметить, что введение фуросемида в дневное, но не в ночное, время, как следует из полученных результатов, приводило к существенному росту активности почечных клеток, по-видимому, за счет имеющихся резервных возможностей. В то же время, применение препарата в любое время не приводило к значительным изменениям в сравнении с ночными показателями интактных крыс. Не исключено, что в этот период времени клетки функционируют на уровне своего максимума, и введение фуросемида не способно существенно изменить основные параметры их жизнедеятельности.

Важно отметить, что в наших экспериментах экскреция фуросемида четко коррелировала с выделением натрия (но не воды!) и практически не различалась при его введении днем и ночью. Последний факт заслуживает особого внимания и может быть объяснен следующим образом. Хорошо известно, что фуросемид, как и большинство других диуретиков, попадает в почечные канальцы главным образом путем секреции в 82 сегменте проксимальных канальцев с помощью системы транспорта органических анионов. По-видимому, этот процесс не подвергается существенным суточным колебаниям, что и обусловливает отсутствие каких-либо различий в его экскреции. Наблюдавшиеся же различия в действии фуросемида, по всей вероятности, зависят от флюктуации процесса канальцевой реабсорбции, что находит подтверждение в недавних исследованиях, проведенных с использованием современных методов молекулярной биологии.

Следующим этапом нашего исследования явились попытки воздействовать на стабильность почечных циркадианных ритмов и выяснить, способны ли их изменения повлиять на выявленные нами различия в действии фуросемида.

Оказалось, что 7-дневное пребывание крыс в условиях полной темноты не отразилось на экскреторной функции почек. Это не кажется нам удивительным, если учесть, что крысы, являющиеся ночными грызунами, оказывались в условиях, близких к естественным. Закономерным представляется и то, что эффект фуросемида, развившийся у крыс, длительное время находившихся в условиях «субъективной ночи», мало чем отличается от такового при ночном введении диуретика животным с нормально чередующимися суточными ритмами.

Таким образом, в условиях «субъективной ночи», приближающихся у крыс к естественным, циркадианные часы функционируют без сбоев, обеспечивая различия в действии фуросемида.

Иная картина наблюдалась при длительном нахождении животных в условиях постоянной освещенности. В наших экспериментах впервые было обнаружено, что одно лишь пребывание крыс на свету существенно повлияло на функцию почек, резко увеличивая исходную экскрецию натрия с мочой.

Таблица 4

Показатели почечной функции у крыс после длительного пребывания в условиях измененных суточных ритмов

Сугочны е показатели

Условия Диурез, мл Экскреция Экскреция Экскреция

эксперимента натрия, мкМ калия, мкМ креатинина, мкМ

«Субъективная 3,6+0,62 32+4,0 366+4,8 8,0+0,37

ночь»

«Субъективный 1,9±0,26* 247+40,6"* 386±36,4 5,8±0,30**"

день»

Инверсия 7.3±0.65"* 17ШЗ,1*" 367±22,7 8.5±0,71

светового режи-

ма

Примечание: подчеркнуты цифры, достоверно отличающиеся от соответствующих показателей графы «Субъективный день »(р<0,001); звездочками отмечены достоверные отличия от соответствующих показателей графы «Субъективная ночь»( р<0,.001; р<0,05)

Выявленный нами натрийурез в 9 раз превосходил исходный и, как видно из таблицы 4, в 8 раз - показатели крыс, находившихся в условиях «субъективной ночи». Скорость клубочковой фильтрации, напротив, при этом существенно снижалась. По-видимому, этот результат был обусловлен стрессовым влиянием постоянного освещения на организм ночных животных. И здесь, как нам представляется, определенное значение в развитии обнаруженной десинхронизации циркадианного ритма экскреции натрия играет ось гипоталамус - гипофиз - надпочечники. С одной стороны, хорошо известна роль этой оси в обеспечении реакции организма на стресс. С другой стороны, значимость оси гипоталамус - гипофиз - надпочечники существенно возрастает в контексте описанного выше пейсмекерного механизма регулирования суточной ритмичности. Повышение экскреции при длительном воздействии света может иметь несколько объяснений. Во-первых, это может зависеть от уменьшения плазменной концентрации аль-достерона - основного гормона, обеспечивающего реабсорбцию Ыа+ в дис-тальном нефроне. Хорошо известно, что уровень альдостерона в крови подвергается суточным колебаниям с акрофазой у крыс в ночное время и минимальными значениями в дневные часы. Можно предположить, что длительное воздействие света обусловило супрессию плазменной концентрации альдостерона с последующим ослаблением канальцевой реабсорбции натрия. Во-вторых, повышение экскреции Иа+ могло быть обусловлено стрессовым воздействием света, которое реализовалось в натрийуретическом эффекте глюкокортикоидных гормонов. И для такого предположения имеются основания. Так, установлено, что различные стрессовые воздействия, в том числе гипокинезия в результате принудительного ограничения локомоторной активности, воздействие низкой температуры, условий космического полета

вызывают у крыс выраженную натрийуретическую реакцию без изменений активности ренина и концентрации альдостерона в плазме крови. В условиях же развившейся стрессовой реакции повышенная стимуляция глкжокорти-коидных рецепторов, как было показано, обусловливает усиление экскреции натрия с мочой, а такие специфические агонисты глюкокортикоидов, как дексаметазон или ЕШ 28362, увеличивают выделение из организма.

Введение фуросемида крысам, длительно находившимся в условиях постоянной освещенности, индуцировало эффект, существенно отличающийся от действия препарата в условиях «субъективной ночи». Во-первых, инъекция диуретика оказывала значительно более слабое воздействие на функцию почек. Во-вторых, зависящие от времени введения различия в действии фуросемида, столь выраженные у интактных крыс и животных, длительно пребывавших в темноте, практически исчезали. Полученные результаты позволяют нам предположить, что стрессовые факторы, к которым, без сомнения, относится длительное воздействие света на ночных животных, способны нарушить ритмичность почечных циркадианных ритмов, что, в свою очередь, подавляет выраженность зафиксированных нами различий в действии фуросемида при его введении в разное время суток в нормальных условиях.

Высказанное предположение получило подтверждение в следующих сериях наших экспериментов. В первой из них инверсия светового режима с помощьй длительного нарушения чередования дня и ночи привела к результатам, близким к воздействию постоянной освещенности: резкому повышению суточной экскреции натрия после 7 дней измененных биоритмов (см. таблицу 4); ослаблению воздействия фуросемида на экскреторную функцию почек; потере различий в действии фуросемида, зависящих от времени его введения. Отдельно отметим, что лишь суточная экскреция фуросемида с мочой не претерпела при этом существенных изменений и сохранялась на уровне 53-60% от введенной дозы. Это еще раз указывает на отсутствие значимых колебаний со стороны канальцевой секреции в проксимальных канальцах почек - как, возможно, эволюционно более древнего и стабильного процесса, направленного на удаление из организма ксенобиотиков.

В следующей серии экспериментов хроническое ограничение потребления воды, также рассматриваемое сегодня как фактор, индуцирующий развитие обусловленного водной депривацией оксидативного стресса, в значительной степени угнетало экскреторную функцию почек. При этом включаются компенсаторные механизмы (в первую очередь - выброс антидиуретического гормона), обеспечивающие максимальное сохранение внеклеточной жидкости за счет увеличения обратного всасывания воды в дистальных отделах нефрона. Эти данные подтвердились результатами нашего гистологического исследования. Мы зафиксировали значительное возрастание индекса ЯЦО, увеличение которого отразило подъем функциональной акгив-

ности клеток дистального нефрона. Причем этот рост был обусловлен усилением активности уже функционирующих клеток, а не включением резервных, поскольку соотношение активных и неактивных клеток осталось неизменным. Об активизации дистальной реабсорбции говорит существенное расширение просвета дистальных канальцев и, особенно, собирательных трубок, предназначенных для обратного всасывания воды под влиянием АДГ. Нами было зарегистрировано увеличение диаметра последних в условиях водной депривации на 24%. При этом столь существенный прирост обеспечивался не равномерным увеличением диаметра всех собирательных трубок, а лишь части из них. Так, если количество собирательных трубок, имевших площадь просвета 800 мкм2 и более, при средней величине 414+7,9 мкм2 в интакгаых почках составило 3,6%, то в условиях депривации их число возросло до 10%.

Введение фуросемида в этих условиях существенно ослабило экскреторный ответ почек животных. Причем, как видно из рисунков 1 и 2, это наблюдалось в условиях как дневного, так и ночного введения диуретика.

Оказалось, что абсолютные цифры суточного мочеотделения и, особенно, экскреции натрия у депримированных животных значительно уступают показателям интакгаых крыс. Зафиксированные изменения были обусловлены существенным уменьшение количества молекул фуросемида, попавших в просвет почечных канальцев. Исходя из того, что фуросемид попадает в просвет канальцев в основном путем почечной секреции, можно предположить, что в условиях водной депривации происходит ослабление и этого процесса. Важно отметить, что наблюдавшиеся нами изменения происходили на фоне неизменного уровня количества активных клеток, а показатель ЯЦО оставался на уровне, достигнутом в условиях водной депривации per se.

за 6 часов за 24 часа

□ д su Na. а к а кр а ф

Рисунок 1. Функция почек при дневном введении фуросемида депримированным крысам в сравнении с показателями нормальных животных

Примечание: здесь и на рисунке 2 штриховая линия обозначает показатели нормальных крыс. Звездочками обозначены достоверные отличия от показателей интактных животных

за 6 часов за 24 часа

□ д ав^а'ак икр эф

Рисунок 2. Функция почек при ночном введении фуросемида депримированным крысам в сравнении с показателями нормальных животных

Примечание: все цифры достоверно ниже показателей интактных животных

Интересно, что введение фуросемида привело к усилению активности процессов, направленных на спасение солей и воды в конечных отделах дистальных канальцев и в собирательных трубках, т.е. в отделах нефрона, находящихся «ниже по течению» места, где фуросемид осуществляет свой салуретический эффект, ингибируя активность Ыа+-К+-2СГ - котранспорте-ра в толстом восходящем отделе петли Генле. Максимума этот эффект достиг после введения фуросемида депримированным крысам в собирательных трубках, просвет которых увеличивался более чем на 30% по сравнению с интактными почками, причем эффект обеспечивался за счет 12% собирательных трубок.

Таким образом, в условиях хронической водной депривации экскреторная функция почек ослабляется в основном за счет усиления процессов ре-абсорбции воды в собирательных трубках нефрона. Действие фуросемида в условиях водной депривации существенно ослабляется за счет уменьшения его количества, поступающего в просвет почечных канальцев.

Кроме того, на этом фоне, как и в случае с нарушенными биоритмами, введение фуросемида обусловило развитие эффекта, который значительно уступал действию в условиях нормальных циркадианных ритмов. При этом изменения в действии препарата, зависящие от времени его введения, фактически отсутствовали.

Подводя итог обсуждению полученных результатов, отметим, что проведенные эксперименты показали наличие у диуретика фуросемида существенных различий в отношении экскреторной функции почек в зависимости от времени его введения. При этом действие препарата у крыс в первые часы после ночного введения превосходило результат его дневного приме-

нения. По-видимому, это различие объясняется наличием тонкого механизма циркадианных часов, контролирующих в том числе и почечную функцию. В то же время, механизм этой циркадианной регуляции, по всей вероятности, весьма хрупок, поскольку стрессовые воздействия различного характера легко нарушают этот процесс.

ВЫВОДЫ

1. Действие фуросемида в отношении экскреторной функции почек крыс различается в зависимости от времени введения с более выраженным эффектом в первые часы после ночного (в 24°°) внутрибрюшинного введения в дозе 20 мг/кг.

2. Суточные различия в действии фуросемида зависят от центральной и периферической регуляции экскреторной функции почек. Подавление этих регуляторных механизмов ведет к потере различий в действии фуросемида, зависящих от времени его введения.

3. Различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения, определяются функциональной активностью почек, которая не одинакова в ночной и дневной периоды суток.

4. Инверсия светового режима приводит к исчезновению различий в действии фуросемида, зависящих от времени его введения, в отношении экскреторной функции почек.

5. Хроническая водная депривация обусловливает нивелирование различий в действии фуросемида на почки крыс, зависящих от времени его введения.

6. Стрессовые факторы различного происхождения ослабляют или полностью подавляют различия в действии фуросемида, зависящие от времени его введения, в отношении экскреторной функции почек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Роль почки в регуляции суточных ритмов организма / Брюханов В.М., Зверева А.Я. // Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 3. - С. 17-31.

2. Устранение хлорпромазином суточных колебаний в действии фуросемида у крыс / Зверева А.Я. // Вестник уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации. - 2011. - Т. 37, № 3/1. -С. 27.

3. Влияние хронической водной депривации на почечные эффекты фуросемида у крыс / Зверева АЛ., Брюханов В.М. // Вестник уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации. -2011.-Т. 37, №3/1.-С. 27-28.

4. Различия в почечных эффектах фуросемида при введении крысам в условиях субъективного дня и субъективной ночи / Зверева АЛ. // Вестник Россий-

ского Университета Дружбы Народов. Серия: медицина. - 2011. - № 4. - С. 128-130.

5. Влияние спиронолактона на суточные колебания функции почек у крыс / Брюханов В.М., Зверева А.Я. // Тезисы докладов VII съезда научного общества нефрологов России / М.: 2010. - С. 162-164.

6. Суточные колебания функциональной активности нефрона крыс (по данным морфологического исследования / Зверева АЛ. // Материалы научно-практической Всероссийской конференции «Педиатрия Алтая на рубеже тысячелетия»/ Барнаул, 2911. - С. 96-98.

7. Исследование хронофармакологии фуросемида в эксперименте / Зверева АЛ. II Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс»/ Барнаул, 2011.-С. 29-30.

8. Влияние стрессовых факторов на суточные колебания в действии фуросемида у крыс / Зверева АЛ. // Ежегодный сборник научных и методических работ преподавателей, молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы фармакологии и фармации»/ Барнаул, 2011, выпуск УШ. - С. 65-69.

9. Влияние фуросемида на функцию почек у крыс с нарушенными циркади-анными ритмами / Зверева АЛ. // Материалы ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье». Сборник статей. / Екатеринбург, 2011.-С. 15-17.

РЫКУНОВА АННА ЯКОВЛЕВНА

ВЛИЯНИЕ ФУРОСЕМИДА НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК КРЫС В РАЗНОЕ ВРЕМЯ СУТОК (экспериментальное исследование)

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата медицинских наук.

Подписано в печать 11.03.2012 Заказ № 754 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз.

Отпечатано в Типографии «ПРИНТ-технология» г. Барнаул, Чкалова, 21

V 7: - 8 7 4 5

2012099320

2012099320