Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Особенности нефропротективного действия фуросемида и некоторых митохондриальных субстратов при поражении почек ртути дихлоридом

На правах рукописи

Захарова Светлана Григорьевна

ОСОБЕННОСТИ НЕФРОПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ФУРОСЕМИДА И НЕКОТОРЫХ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ПОЧЕК РТУТИ ДИХЛОРИДОМ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа 2008

003170670

Работа выполнена на кафедрах фармакологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубищев Алексей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Валеева Лилия Анваровна

доктор медицинских наук, профессор Кузьмин Олег Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 2008 года в часов на заседании

диссертационного Совета Д 208 006 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 450000, г Уфа, ул Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в научной в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 450000, г Уфа, ул Ленина, 3

Автореферат разослан «¿J_» ¿¿'¿UH 2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук,

профессор Мирсаева Г X

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Соли тяжелых металлов широко распространены в природе, они используются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту, попадают в растительную и животную пищу. Очень опасными ксенбиотиками являются соли ртути, платины, висмута, серебра, хрома, урана, они относятся к числу наиболее распространенных и опасных загрязнителей (Катцунг Бертрам Г , 1998, Римарчук ГВ, 1999) Длительное поступление соединений тяжелых металлов в организм в небольших дозах или однократное массивное поступление может вызвать тяжелое поражение почек вплоть до развития острой почечной недостаточности (Линг JI Дж и соавт, 2006) Это особенно относится к ртуть-содержащим соединениям (D'Souza Н S et al, 2003) Ртуть, вероятно, самое нефротоксичное вещество из группы тяжелых металлов (Wyngaarden James В, Smith LH, 1985) Ввиду того, что ртуть используется повсеместно, никто не может избежать контакта с этим металлом (Zalups R.K et al., 2004) Особая чувствительность почки к катионам тяжелых металлов обусловлена высоким уровнем кровоснабжения и большой протяженностью тубулярного аппарата (Bridges С С, Zalups R К, 2004) Несмотря на использование современных методов лечения, смертность от острой почечной недостаточности > при интоксикации солями ртути остается высокой (Toft Р, Gilsaa Т, 2007) Необходимость использования гемодиализа, трансплантации подчеркивает отсутствие эффективных фармакологических способов предупреждения поражения почек соединениями ртути Тот факт, что имеющиеся способы лечения этих отравлений не дают удовлетворительных результатов, делает проблему еще более актуальной и побуждает исследователей к экспериментальной разработке методов лечения

Вопрос о применении диуретиков при токсической нефропатии является одним из сложных В литературе имеются сообщения о протекторном действии увеличенного диуреза при нефротоксическом действии ртути дихлорида (Thiel G et al, 1976) Однако, ряд авторов указывают на неблагоприятное действие фуросемида при острой почечной недостаточности (Toft Р, Gilsaa Т, 2007) Убедительные данные о возможности фуросемида предупреждать ишемические поражения почек и развития постишемической почечной недостаточности (Лебедев А А, Дубищев АВ, 1986) дают основания для детального изучения эффективности диуретиков и при острой токсической нефропатии С другой стороны, фармакологическая регуляция энергетического обмена способствует эффективной коррекции патологических состояний, сопряженных с гипоксией, энергодефицитом (Хазанов В А, 2003) Можно полагать, что регуляторы энергетического обмена могли бы существенно повысить резистентность почечной ткани к токсическому действию солей тяжелых металлов В связи с этим актуальной задачей является детальное изучение эффективности диуретиков, митохондриальных регуляторов энергетического обмена при остром поражении почек соединениями тяжелых металлов

Цель исследования: на моделях токсического поражения почек ртути дихлоридом разработать способы фармакологической защиты нефронов фуросемидом и регуляторами энергетического обмена - янтарной и глутаминовой кислотами

Задачи исследования:

1 Разработать экспериментальные модели избирательного тяжелого поражения почек ртути дихлоридом.

2 Определить оптимальные условия нефропротективной эффективности фуросемида и механизм его действия на экскреторную функцию почек при остром поражении почек ртути дихлоридом

3 Изучить возможность фуросемида влиять на депонирование ртути в почках и экскрецию ее с мочой

4 Провести оценку энергетического статуса организма под действием фуросемида и митохондриальных субстратов янтарной и глутаминовой кислот по сукцинатдегидрогеназной активности лимфоцитов при ртутной нефропатии

5 Оценить эффективность регуляторов энергетического обмена янтарной и глутаминовой кислот при острой ртутной нефропатии по изменению экскреторной функции почек

6 Методами прижизненной морфометрии кортикальных структур и патоморфологического изучения почек выявить как ранние, так и поздние изменения, возникающие под действием изучаемых фармакологических средств при ртутном поражении почек

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фуросемид, введенный одновременно с ртути дихлоридом на фоне умеренной гиперволемии, предупреждает нефротоксическое действие ртути, нормализует экскреторную функцию почек и увеличивает выживаемость животных Оптимальным условием защитного эффекта диуретика является совпадение по времени экскреторной реакции почек с периодом токсического действия металла на почки

2. Фуросемид уменьшает депонирование ртути в корковом слое почек и увеличивает содержание металла в мозговом слое Это предотвращает поражение кортикальных структур (проксимальных канальцев) в первые сутки после введения ртути дихлорида и усиливает выведение металла из организма на третьи сутки экспериментального периода

3. Фуросемид на фоне нефротоксического действия ртути дихлорида значительно увеличивает просвет поверхностных почечных канальцев в первые 60 минут экспериментального периода и уменьшает гипергидратацию нефроцитов в последующие 60 минут наблюдения

4. Фуросемид и профилактическое курсовое введение регуляторов энергетического обмена янтарной и глутаминовой кислот активируют энергетический статус лимфоцитов при острой ртутной нефропатии

5 Янтарная и глутаминовая кислоты при однократном введении их в организм не обладают нефропротекторным действием при ртутной нефропатии, патоморфологически выявляется более тяжелое поражение почек Профилактическое курсовое назначение указанных митохондриальных субстратов нормализует отдельные параметры экскреторной функции и морфологических структур почек

6 Оптимальный результат возникает при предварительном 5-дневном введении митохондриальных субстратов и однократной инъекции фуросемида в момент действия ртути дихлорида Указанная комбинация препаратов нормализует экскреторную функцию почек в 1-3 дни развития острой почечной недостаточности, уменьшает степень структурных изменений и увеличивает сохранность почечной ткани

Научная новизна. Разработаны модели поражения почек ртути дихлоридом у экспериментальных животных (крыс) с высокой избирательной нефротропностькг в первой модели за счет уменьшения массы действующих нефронов с дополнительным ослаблением ишемией оставшихся структурных единиц почек, во второй модели за счет сенсибилизации к ртути секреторного аппарата проксимальных канальцев пенициллином Определены оптимальные условия эффективности фуросемида (доза, время, пути введения) при поражении почек ртути дихлоридом Установлена способность диуретика перераспределять депонирование ртути из коркового слоя почек в мозговой, что имеет важное значение в защите кортикальных структур от токсического действия металла Изучен механизм действия фуросемида в первые два часа развития патологии методом прижизненной морфометрии, показывающий важную роль ослабления гипергидратации нефроцитов и сохранения просвета канальцев для тока ультрафильтрата Проведена оценка энергетического статуса организма под действием фуросемида, регуляторов энергетического обмена - янтарной и глутаминовой кислот при токсической ртутной нефропатии по критерию сукцинатдегидрогеназной активности лимфоцитов Выявлена возможность янтарной и глутаминовой кислот при курсовом профилактическом введении ослаблять тяжесть некоторых параметров почечной недостаточности Исследованы морфологические особенности фармакологической защиты почек фуросемидом и регуляторами энергетического обмена

Теоретическая и практическая значимость исследования. Расширены представления о механизме действия фуросемида при остром токсическом действии ртути дихлорида Выявленные в эксперименте защитные свойства регуляторов энергетического обмена позволяют рекомендовать их для изучения возможности применения у лиц, профессионально связанных с воздействием соединениями ртути Разработанные модели могут использоваться в научных изысканиях

Результаты исследований включены в материалы лекций и практических занятий кафедр фармакологии Самарского государственного медицинского университета и Кировской государственной медицинской академии

Внедрение. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр фармакологии Самарского государственного медицинского университета и Кировской государственной медицинской академии

Апробация и публикация результатов работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), VII, IX, X Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2002, 2004, 2005), XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института «Актуальные вопросы военной медицины» (Самара, 2006), на межкафедральном заседании фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета 21 января 2008 года

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 27 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методик экспериментов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 151 источник, из которых 101 на иностранных языках

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 467 беспородных крысах обоего пола массой 180 - 220 г В контрольных и опытных группах количество животных составляло 7-12 Разработаны две модели избирательного тяжелого поражения почек ртути дихлоридом

Первая модель. У экспериментальных животных под эфирным наркозом проводилась односторонняя нефрэктомия и 30-минутная ишемия единственной почки После окончания ишемического периода подкожно вводился раствор ртути дихлорида Крысы содержались под наблюдением в течение 10 дней

Вторая модель. Во второй модели усиление нефротоксичности достигалось путем предварительной активации секреторного механизма проксимальных канальцев пенициллином (100 000 ЕД/кг массы тела 3 раза в день в течение 3 дней) (Берхин ЕБ, 1979) В дальнейшем удалялась левая почка, правая почка оставалась интактной После окончания операции крысам вводился ртути дихлорид Индуцированный пенициллином секреторный механизм проксимальных сегментов приводил к более активному поглощению металла единственной почкой Наблюдение велось в течение 10 дней Количество выживших и погибших крыс служило критерием тяжести поражения почек

Рассчитывали индекс выживаемости как отношение выживших животных к общему количеству крыс в группе

Изучалось влияние следующих препаратов и условий их применения на выживаемость животных 1% раствор дихлорида ртути подкожно в дозе 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг (первая модель) и в дозе 5 мг/кг (вторая модель), фуросемид - подкожно в дозе 0,5 мг/кг, 2 мг/кг, 4 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида подкожно в дозе 10 мл/кг, янтарная кислота подкожно в дозе 50 мг/кг вместе с глутаминовой кислотой подкожно в дозе 78 мг/кг (разработчик НИИФ ТНЦ СО РАМН, производитель НФК город Томск)

В качестве критерия степени органного поражения при острой почечной недостаточности определялась функция почек в первые 5 дней после начала патологии на модели сенсибилизированной к металлу почки (вторая модель) Для сбора мочи животные содержались в обменных клетках Через каждые 20 часов крысы помещались в обычные клетки со свободным доступом к пище и воде В суточной порции мочи регистрировались концентрация натрия и калия пламенной фотометрией на ПАЖ-1, креатинина - унифицированным методом по цветной реакции Яффе с предварительной депротеинизацией (Меньшиков В В , 1987г), с использованием готовых наборов реактивов "КлиниТест-Креатинин 200" научно-производственного центра "ЭКО-СЕРВИС" на колориметре ФЭК-56М В суммированном виде определялись следующие показатели V - диурез в мл/сутки, иКа - концентрация натрия в моче в мкМ/л, - концентрация калия в моче в мкМ/л, и сг - концентрация креатинина в моче (мг/л). Подсчитывалось количество выделенного с мочой натрия (мкМ/сутки) по формуле и^ V, количество выделенного с мочой калия (мкМ/сутки) вычислялось по формуле ик V Экскреция эндогенного креатинина (мг/сутки) рассчитывалась по формуле исг V С целью унификации показателей производили их перерасчет на 100 г массы тела Изучалась эффективность однократного подкожного введения фуросемида в дозе 2 мг/кг, инъецированного одновременно с раствором ртути дихлорида Параллельно подкожно инфузировали изотонический раствор натрия хлорида из расчета 10 мл/кг массы со скоростью 20 капель в минуту

Для оценки перераспределения ртути в почечных структурах и скорости выведения металла с мочой определялось содержание ртути в почках, в корковом и мозговом слоях, а также в моче атомно-абсорбционной пламенной спектрофотометрией на спекрофотометре АА8-1 (Германия) в первые и третьи сутки экспериментального периода Для сравнения концентрация металла регистрировалась в печени, кишечнике, селезенке Метод основан на окислении ртути в двухвалентный ион в кислой среде, восстановлении ее в металлическую форму Органы животных забирались через сутки и на третьи сутки отдельных серий экспериментов В эти же сроки собиралась суточная моча

Для изучения характера изменений, происходящих непосредственно в нефронах в первые часы после моделирования ОПН, был использован метод

прижизненной морфометрии кортикальных структур У животных с предварительной сенсибилизацией почек к ртути, наркотизированных этаминалом натрия (внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг массы тела), правая почка удалялась, левая почка обнажалась ^етЬаиБеп М, 1963) В дальнейшем с помощью специально сконструированной фотоустановки проводили фотографирование поверхности почки в отраженном свете при увеличении в 150 раз с применением обычного объектива с последующим считыванием результатов путем сканирования полученного увеличенного изображения с позитивной пленки и измерением контуров почечных структур по горизонтали и вертикали (Лебедев А А и соавт, 1983). Оптический профиль канальцев регистрировали в виде кривой линии, состоящей из подъемов (светлые стенки канальцев) и западений (темные просветы канальцев) и межканальцевых промежутков Регистрировали наружный диаметр, внутренний диаметр кортикальных канальцев, толщину стенки, ширину межканальцевых промежутков каждые 30 минут в течение 2 часов после развития ОПН, при ОПН, протекающей под нефропротекторным эффектом фуросемида, а также на сенсибилизированной почке без введения препаратов В каждом опыте биомикроскопия и фотометрия проводилась на 4-5 полях зрения, взятых в различных местах поверхности органа

Для оценки влияния регуляторов энергетического обмена (глутаминовой и янтарной кислот) на функциональную способность почек, морфологические изменения в них, а также энергетический статус организма при различных вариантах поступления препаратов животным с токсической нефропатией поставлено 5 серий экспериментов

а) после нефротоксического воздействия ртути дихлорида на сенсибилизированную к металлу почку,

б) при одновременном введении ртути дихлорида и однократной внутрибрюшинной инъекции препаратов РЭО (янтарной кислоты 50 мг/кг, глутаминовой кислоты 78 мг/кг) и ИРНХ (10 мл/кг),

в) подкожном одновременном введении ртути дихлорида (5 мг/кг), фуросемида (2 мг/кг) и ИРНХ (10 мл/кг),

г) профилактическом введении янтарной кислоты (50 мг/кг) и глутаминовой кислоты (78 мг/кг) в течение 5 дней до инъекции ртути дихлорида (5 мг/кг) и ИРНХ (10 мл/кг), в момент введения соли металла,

д) профилактическом введении янтарной кислоты (50 мг/кг) и глутаминовой кислоты (78 мг/кг) в течение 5 дней с последующей инъекцией ртути дихлорида (5 мг/кг), фуросемида (2 мг/кг), ИРНХ (10 мл/кг)

Наблюдение велось в течение 5 дней после введения повреждающего агента Регистрировали суточную экскрецию воды, натрия, калия, креатинина, делали забор крови через 1,3 и 5 суток после экспериментального воздействия

Энергетический статус организма животных оценивали по сукцинатдегидрогеназной активности лимфоцитов крови Метод количественного цитохимического анализа активности сукцинатдегидрогеназы основывается на

способности п-нитротетразолия фиолетового при окислении определенных типов субстратов восстанавливаться и образовывать в клетках периферической крови нерастворимые окрашенные пигменты в виде гранул формазана (Нарциссов Р П, 1969) Для определения активности СДГ лимфоцитов периферической крови использовали готовые цитохимические наборы (производитель ОО НПФ «Либрус» г Москва), в состав которых входит сукцинат натрия, п-нитротетразолий фиолетовый, фосфатный буфер и трилон Б Реакция проводилась на стандартных свежих мазках крови Микроскопирование мазков проводилось с водной иммерсией без покровного стекла, при увеличении 600, микроскоп «Биолам», окуляр АУ12

Для количественной оценки энергетического статуса лимфоцитов использовали показатели их ферментного статуса С) - среднюю активность СДГ, V - коэффициент вариации, А - коэффициент асимметрии

Об активности СДГ в лимфоцитах крови судили по средней величине ((})

N

Т.Х.

N

где Х-число гранул формазана в каждой 1-той клетке, N - число клеток

Коэффициент вариации (V) характеризует рассеивание вариантов относительно среднего значения, отражая разнородность клеточной популяции по активности СДГ При существенном различии клеток по активности фермента -показатель высокий (до 50% и выше).

V = -»100% б

где Б - среднеквадратичное отклонение

Коэффициент асимметрии (А) характеризует распределение клеток крови по уровню активности СДГ относительно средней величины Коэффициент асимметрии отрицательный (А<0) при преобладании клеток с высокой активностью и положительный (А>0) при преобладании низкоактивных клеток

АшШШ

Л£3

На 5 сутки экспериментального периода проведена морфологическая оценка почек Для этого под эфирным наркозом у крыс удалялась правая почка, фиксировалась в жидкости Шабадаша, проводка, заливка в парафин, приготовление срезов, окраска гематоксилином и эозином осуществлялись общепринятым способом На гистологических препаратах под микроскопом (ок х 15, об х 40) анализировались морфологические особенности почечных структур

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с расчетом средней и ошибки средней арифметической (М±т) и 95% доверительного интервала (Лакин Г Ф , 1973), с использованием критерия достоверности различий по Стьюденту и непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни

(статистически достоверным считалось при р<0,05) (Маймулов В Г, 1996) Анализ данных выполнялся с помощью пакета прикладных программ Exel 2003 (MS Office, USA), «STATISTICA» 6 0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Моделирование токсического поражения нефронов солями тяжелых металлов и возможность фармакологической коррекции

Так как ртуть является неспецифическим ядом, влияющим на многие органы и жизненные процессы, необходимо было добиться избирательного поражения почек Для повышения чувствительности нефронов на всем их протяжении к действию нефротоксина проводилось односторонняя нефрэктомия, другая почка подвергалась 30-минутной ишемии Это не вызывало гибель животных, однако резко повышало чувствительность почки к ртути дихлориду, о чем свидетельствует снижение выживаемости крыс со 100% до 20% в опыте (в 5 раз), хотя доза ртути дихлорида увеличена только в 2 раза (с 5 мг/кг до 10 мг/кг) (таблица 1)

На первой модели токсического поражения почек выявлены три условия нефропротекторного эффекта фуросемида (таблица 2)

1 Умеренная доза используемого диуретика меньше 2 мг/кг и больше 2 мг/кг не эффективны

2 Одновременное воздействие на почку фуросемида и ртути дихлорида По-видимому, возникновение взаимодействия двух веществ на уровне нефрона и является решающим фактором протекторного эффекта диуретика

3 Умеренная гиперволемия, которая достигалась введением изотонического раствора натрия хлорида, не позволяет нарушить системный гомеостаз и создает оптимальные условия функционирования нефронов (таблица 3)

Таблица 1 - Влияние ртути дихлорида на выживаемость крыс при различных _1__ экспериментальных условиях_

Условия опытов ртути дихлорид (контроль) ртути дихлорид (контроль) ртути дихлорид (контроль) Ртути дихлорид + ишемия единственной почки (30 мин) « ° " С-S s а 1 * i Ja? s £ 1 = х Е < и 1 " ^ а: -> s Ртути дихлорид + ишемия единственной почки (30 мин) пути дихлорид + ишемия единственной почки (30 мин) Ртути дихлорид + предварительная сенсибилизация нефронов единственной почки Нефрэктомия, односторонняя 30-минутная ишемия единственной почки, ртути дихлорад подкожно 10 мг/кг

Дозамг/кг 5 10 15 10 2,5 5 5 10

Индекс выживаемо сти 1 0,6 0,3 0,2* 1 0,88 0,8 0,1* 0,2

Примечание - * - здесь и далее достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Таблица 2 - Влияние фуросемида на выживаемость крыс при поражении ртути дихлоридом единственной почки, ослабленной 30-минутнон ишемией

Условия опытов Нефрэктомия, односторонняя 30-минутная ишемия единственной почки, ртути дихлорид подкожно 10 мг/кг - 0,5 мг/кг одновременно с ртути дихлоридом -2 мг/кг одновременно с ртути дихлоридом - 8 мг/кг одновременно с ртути дихлоридом - 2 мг/ кг за 30 минут до ртути дихлорида - 2 мг/ кг через 30 минут после ртути дихлорида - 2 мг/ кг через 60 минут после ртути дихлорида - 2 мг/ кг через 120 минут после ртути дихлорида

Индекс выживаемости 0,2 0,4 0,5 0,4 0,2 0 0 0

При других условиях введения фуросемида нефропротекторного действия не наблюдалось

Высокое сродство ионов ртути к сульфгидрильным группам приводит к окислительному стрессу, истощению клеточных антиокислителей, митохондриальным дисфункциям, разобщению митохондриального дыхания При этом снижается активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) клеток проксимального эпителия Исходя из этого, митохондриальные субстраты (МС) янтарная кислота (Ж) и глутаминовая кислота (ГК), могли бы обладать нефропротекторными эффектами за счет нормализации энеретического статуса эпителиальных клеток нефрона Однако однократное и одновременное с ртути дихлоридом введение регуляторов энергетического обмена (РЭО) ЯК и ГК не оказало защитного эффекта Этот результат может объясняться тем, что увеличение митохондриального метаболизма может вести к увеличенной восприимчивости почечной ткани к окислительному стрессу (таблица 3)

Таблица 3 - Влияние фуросемида, изотонического раствора натрия хлорида, янтарной и глютамнновой кислот иа выживаемость крыс при пефротоксическом поражении

Условия опытов Нефэктомия, 30 минутная ишемия единственной почки, ртути дихлорид 10мг/кг (контроль) Фуросемид2 мг/кг Изотонический раствор натрия хлорида 10мл/кг Фуросемид 2мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг Фуросемид 4мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг Фуросемид 20мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг Янтарная кислота 50 мг/кг, глутаминовая кислота 78 мг/кг Янтарная кислота 50мг/кг, глутаминовая кислота 78 мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг

Индекс выживаемости 0,2 0 0,1 0,9* 0 0,2 ОД 0

Для того, чтобы в еще большей степени повысить нефротоксичность ртути, нами использован принцип активации секреторного механизма пенициллином Нами было обнаружено, что после предварительной сенсибилизации нефронов пенициллином и односторонней нефрэктомии ртути дихлорид вызывает гибель 90% животных от дозы ртути дихлорида 5 мг/кг, то есть дозу удалось снизить в 3 раза по сравнению с первоначальной Это может быть связано с тем, что пенициллин при повторных введениях способен индуцировать ферментные системы, увеличивать синтез белков-переносчиков, что приводит к более активному поглощению ртути секреторным механизмом.

На данной модели тяжелого поражения почек ртути дихлоридом была предпринята попытка изучить возможность защиты почек фуросемидом в разных дозах и при различных режимах введения диуретика в зависимости от времени поступления его в организм относительно введения ртути дихлорида Исследование эффекта фуросемида на выживаемость животных на второй модели подтвердило результаты, полученные в опытах с нефротоксичностью ишемически ослабленной почки Только при совместном действии фуросемида и ИРНХ определяется четкий протекторный эффект на почку, что и проявляется выраженным повышением выживаемости крыс (таблица 4) Дальнейшие исследования были направлены на изучение механизма действия фуросемида только на модели сенсибилизированной нефротоксичности, и только при тех условиях, при которых он оказывал нефропротекторное действие Для этого изучалась экскреторная функция почек в первые 5 дней послеоперационного периода

Таблица 4 - Влияние фуросемида, изотонического раствора натрия хлорида, янтарной и

глютаминовой кислот на нефротоксичность ртути дихлорида после односторонней __нефрэкгомии сенсибилнзированиых животных _

Условия опытов Сенсибилизация, нефрэктомия, ртути дихлорид 5 мг/кг Фуросемид 2 мг/кг Изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг Фуросемид 2 мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг Янтарная кислота 50 мг/кг, глутаминовая кислота 78 мг/кг Янтарная кислота 50мг/кг, глутаминовая кислота 78 мг/кг, изотонический раствор натрия хлорида 10 мл/кг

Индекс выживаемости 0,1 0,66 0,54 0,8 0,2 0,1

2. Влияние фуросемида на функциональную способность почек при нефротоксическом действии ртути дихлорида

Исследование экскреторной функции почек показало, что выведение воды, электролитов, креатинина в контрольной группе сохраняется на достаточном уровне в первые 3 дня наблюдения, потом оно прогрессивно уменьшается к 4 и 5

дню наблюдения, что свидетельствует о тяжести поражения почек, развитии ОПН и соответствует максимальной гибели животных в этот период Фуросемид резко увеличивает экскрецию воды, натрия, калия, креатинина в первые сутки наблюдения по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы крыс По-видимому, фуросемид на фоне гиперволемии вызывает не только значительное угнетение канальцевой реабсорбции, но и увеличение клубочковой фильтрации Однако на 2 сутки все показатели экскреторной функции почек в опытной группе снижены Можно полагать, что эта реакция почек носит вторичный характер в ответ на выраженную стимуляцию выделительной функции в первые сутки, а не является результатом поражения почек Это подтверждается тем, что в дальнейшем выделение воды, электролитов, креатинина увеличивается и достигает статистической значимости на 5 сутки, при этом сохраняется и жизнеспособность животных

3. Влияние фуросемида на депонирование ртути в органах и экскрецию

металла с мочой при нефротоксическом действии ртути дихлорида

В защитном эффекте фуросемида определенную роль могла играть способность диуретиков изменять распределение и депонирование ртути, ускорять выведение из организма соль тяжелого металла Опыты по изучению влияния фуросемида на содержание ртути в почках, других органах, а также на ее почечную экскрецию показали, что через сутки после введения ртути дихлорида металл в большем количестве накапливается в почках по сравнению с другими органами В печени, селезенке, кишечнике депонируется металла соответственно в 12,4, 14,1, 26,1 раза меньше Кроме того, метод предварительной активации секреторного канальцевого аппарата приводит к увеличению поглощения нефронами ртути

Фуросемид не влияет на содержание ртути в почках в течение всего периода наблюдения В то же время выделение ртути в почках в опытной группе уменьшено в 2,1 раза По-видимому, диуретик препятствует секреции ртути в просвет нефрона На 3 сутки почечная экскреция ртути под действием фуросемида возрастат в 2,1 раза по сравнению с контролем (таблица 5) Возможно, сохранившиеся нефроны продолжают экскретировать ее в последующие дни В то же время прогрессирующее развитие почечной недостаточности у животных в группе без применения фуросемида препятствует выведению ртути из организма на 3 сутки Фуросемид хотя и не влияет на содержание ртути в печени, селезенке, кишечнике через 1 сутки после начала эксперимента, на 3 сутки вызывает существенное уменьшение депонирование ртути в этих органах, что соответствует увеличению почечной экскреции ртути в указанные сроки (таблица 6)

Таблица 5 - Влияние фуросемида на содержание ртути в почках и экскрецию ртути с

мочой при нефротоксическом действии ртути дихлорида (М±ш)

Условия опытов Содержание ртути в почках (мг/кг) Экскреция ртути с мочой (мг/л)

Контроль Опыт Контроль Опыт

1 сутки 35,5211,70 п=10 35,16±3,68 п=10 0,85±0,32 п=10 0,3910,15* п=10

3 сутки 27,0616,19 п=9 24,4214,12 п=9 0,54±0,11 п=9 1,1510,21* п=9

Таблица 6 - Влияние фуросемида на содержание ртути в органах при нефротоксическом

действии ртути дихлорида (М±т)

Дни

Органы 1 3

Контроль (мг/кг) Опыт (мг/кг) Контроль (мг/кг) Опыт (мг/кг)

Печень 2,8710,19 п=10 3,1010,21 п=10 4,7910,26 п=9 4,2310,26* п=9

Кишечник 1,36+0,06 1,2210,15 1,10+0,11 0,9110,07*

п=10 п=10 п=9 п=9

Селезенка 2,5210,14 п=10 2,50+0,25 п=10 3,5510,32 п=9 2,83+0,34* п=9

Несмотря на то, что фуросемид не препятствует депонированию ртути в почках, а экскрецию ртути с мочой в 1 сутки даже снижает, диуретик оказывает нефропротективное действие Для разрешения указанного противоречия было изучено влияние фуросемида на распределение ртути в слоях почек Содержание ртути в корковом и мозговом слоях определялось через 1 и 3 суток после введения ртути дихлорида В контроле ртуть в большем количестве накапливается в корковом слое Фуросемид снижает депонирование ртути в корковом слое через сутки после введения, одновременно повышает содержание металла в мозговом слое (таблица 7) Диуретик, по-видимому, за счет конкуренции за секреторный аппарат, препятствует накоплению ртути в проксимальных сегментах Не исключено, что фуросемид способствует поступлению большего количества ртути в мозговой слой, вызывая увеличение мозгового кровотока Перераспределение ртути в мозговой слой может играть чрезвычайно важную роль для сохранения проксимальных канальцев По-видимому, дистальные канальцы, собирательные трубочки, петля Генле, локализующиеся в основном в мозговом слое почек, менее чувствительны к повреждающему действию ртути дихлрида по сравнению с проксимальными канальцами Возможно, этим и объясняется большая резистентность нефронов к действию ртути дихлорида под действием фуросемида в 1 сутки

Таблица 7-Влияние фуросемнда содержание ртути в корковом и мозговом слоях при _нефротоксическом действии ртути дихлорида (М±т)_

Условия опытов Корковый слой (мг/кг) Мозговой слой (мг/кг)

Контроль Опыт Контроль Опыт

1 сутки 32,77±1,23 п=20 29,94±1,87* п=20 30,23±1,34 п=20 33,08±2,06* п=20

3 сутки 20,74±2,30 п=10 21,40±2,18 п=10 23,84±2,04 п=10 23,25±2,33 п=10

4. Влияние фуросемнда на функционально-морфологические показатели поверхностных кортикальных структур при нефротоксическом действии

ртути дихлорида

При остром токсическом поражении почки ртути дихлоридом увеличение наружного диаметра и толщины стенок канальцев свидетельствует о прогрессирующей гипергидратации нефронов, что подтверждается сужением просвета на 28,1% уже через 30 минут после введения ртути дихлорида и увеличением толщины стенок на 44% через 60 минут Увеличение внутреннего диаметра канальцев на 90 и 120 минутах, вероятно, свидетельствует о внутриканальцевой закупорке и блоке потока мочи, который возникает в результате прогрессирующего развития патологии на уровне нефрона (таблица 8)

Фуросемид, введенный экспериментальным животным, блокируя активный транспорт натрия, способствует накоплению ультрафильтрата в просвете, вызывает расширение просвета нефронов

Таблица 8- Влияние ртути дихлорида на функционально-морфологические показатели

кортикальных структур сенсибилизированных почек в течение 2-х часового периода __наблюдения (М±т)_

Время Показатели (мкм)

Наружный диаметр канальцев Внутренний диаметр канальцев Толщина стенки канальцев Ширина межканальцевых промежутков

Опыт Контроль % Опыт контроль % Опыт контроль % Опыт контроль %

Исходное состояние 32,6± 1,17 10,6±0,46 11,9+0,4 14,1+0,6

30 35,3+1.4 33,6+0,9 5 9.2+0.4 12,8±0,6 -28,Г 13.2+0.5 11,7+0,4 12,8 16,1+0.7 11,0+0,3 +46'

60 42.2+1.2 33,0+1,19 +27,8' 10.4+0.3 10,6+0,5 -1,8 15.7+0.4 10,9+0,3 +44,0' 11.1+0.8 13,2+0,6 -15,9'

90 41.9+0,6 34,8±1,05 +20,4' 12.1+0.6 10,3 ±0,4 17,4 15.5+0.5 12,2+0,4 +27,0" 13.3+0,8 14,2+0,7 -6,3

120 49.5±1.9 33,5+0,98 +47,7* 17.6+0.6 10,4+0,5 +69,2' 17.9+0.3 11,5+0,5 +55,6' 18.7+0.7 14,3+0,6 +30,7"

Примечание - * - опыт - ртути дихлорид (п=40),

контроль - сенсибилизированная к ртути дихлориду почка (п=45)

Анализ динамики функционально-морфологических структур показывает, что защитный эффект фуросемида формируется в 2 этапа на первом этапе (первые 30 минут) предотвращается коллапс канальцев за счет накопления ультрафильтрата в просвете нефрона, сохраняется проходимость нефрона, на втором этапе (90-120 минут) предупреждается гипергидратация эпителия канальцев Благодаря тому, что предотвращается сдавление сосудов отечными эпителиальными стенками, вторично нормализуется перитубулярное кровообращение (таблица 9)

Таблица 9 - Влияние фуросемида на динамику функционально-морфологических показателен кортикальных структур сенсибилизированных почек, находящихся под воздействием ртути днхлорида в течение 2-х часового периода наблюдення (М±т)

Время (мин) Показатели (мкм)

Наружный диаметр канальцев Внутренний диаметр канальцев Толщина стенки канальцев Ширина межканальцевых промежутков

Опыт Контроль % Опыт Контроль % Опыт Контроль % Опыт Контроль %

30 51 ¿±1.7 35,3+1,4 +45,0' 19.2±1.2 9,2+0,4 +108,6" 15.9+0.5 13,2±0,5 20,4 17.4+1.5 16,1+0,7 8

60 47.6+2.8 42,2+1,2 12,7 23.0+1.8 10,4+0,3 +121,1* 10.5+0.3 15,7±0,4 -33,1* 19.1+1.0 11,1+0,8 +72,0*

90 34.8±1.0 41,9+0,6 -16,9« 11.0+0.5 12,1+0,6 -9 10,9+0.3 15,5+0,5 -29,6* 11.0+0.5 13,3+0,8 -17,2*

120 34.7±1.0 49,5+1,9 -29,8* 11.4+0.4 17,6+0,6 -35,2* 11,6+0.3 17,9+0,3 -35,1* 11.8+0.4 18,7+0,7 -36,8*

Примечание - * - опыт - фуросемид+ртути дихлорид (п=39), контроль - ртути дихлорид (п=40)

Способность фуросемида предупреждать повреждение нефроцитов согласуется с уменьшением накопления ртути в кортикальных структурах и с благоприятными функционально-морфологическими сдвигами в проксимальных отделах нефронов (таблица 10)

Таблица 10 - Влияние фуросемида н ртути дихлорида на функционально-морфологические характеристики кортикальных структур сенсибилизированных почек в __течение 2-х часового периода наблюдения (М ±т)_

Время (мин) Показатели (мкм)

Наружный диаметр канальцев Внутренний диаметр канальцев Толщина стенки канальцев Ширина межканальцевых промежутков

Опыт Контроль % Опыт Контроль % Опыт Контроль % Опыт Контроль %

30 51,2+1.7 33,6+0,9 +39,8' 19.2±1.2 12,8+0,6 +50,0' 15.0+0.5 11,7+0 4 +28,2' 17.4+1.5 11ДШ,3 +58, Г

60 47.6±2.8 33,0±1,1 +44,2' 23.0±1.8 10,б±0,5 +116,9* 10.5+0.3 10,9+0,3 -3,6 19.1+1.0 13,2+0,6 +44,6*

90 34.8+1.01 34,8+1,05 0 11.0+0.5 10,3±0,4 6,7 10.9+0.3 12,2+0,4 -10,6 11.0+0.5 14,2+0,7 -22,5*

120 34.7±1.0 33,5+0,9 +3,5 11.4±0.4 10,4+0,5 +9,6 11.6+0.3 11,5+0,5 +0,8 11.8+0.4 14,3+0,6 -17,4*

Примечание - * - опыт - фуросемид+ртути дихлорид (п=39), контроль- сенсибилизированная к ртути дихлориду почка (п=45)

5. Влияние янтарной, глутаминовой кислот, фуросемида на функциональную способность почек при нефротоксическом действии ртути дихлорида

Анализ результатов однократного введения янтарной и глутаминовой кислот как энергетического материала показывает, что они могут только на короткий срок ослабить проявления ртутной полиурической нефропатии, что выявляется уменьшением диуреза на 2 сутки, натрийуреза в первые 2 суток, калийуреза в креатининуреза в 1 сутки Следовательно, РЭО в виде однократного воздействия в момент введения ртути дихлорида не могут существенно повышать резистентность почек к токсическому действию ртути Профилактическая подготовка почек РЭО оказывает некоторый нефропротективный эффект При предварительном пятидневном введении Ж и ГК с последующей инъекцией фуросемида РЭО оказывают сильное нефропротекторное действие Это проявляется в нормализации диуреза, натрийуреза, калийуреза в основные периоды наблюдения Данные результаты подчеркивают ведущую роль гидроуретической и салуретической реакций, а не воздействия на энергетический статус нефроцитов Фармакологический эффект фуросемида позволяет выявить и положительную роль РЭО 6. Влияние янтарной, глутаминовой кислот, фуросемида на энергетический статус лимфоцитов при нефротоксическом действии ртути дихлорида Энергетическое состояние организма при патологии и под влиянием препаратов оценивалась гистохимическим методом по активности СДГ лимфоцитов Так как СДГ - фермент, локализующийся в митохондриях - есть во всех функционирующих клетках организма, можно полагать, что динамика изменений активности этого фермента в лимфоцитах отражает динамику

аналогичных изменений во всех тканях Кроме того, известно, что ртути дихлорид вызывает угнетение СДГ в почках (АпскеоЬ БР, 1991) Анализ изменений активности СДГ в лимфоцитах показал, что ртути дихлорид вызывает ее угнетение в 1 и 3 сутки экспериментального периода Фуросемид, профилактическое введение РЭО и комбинированное применение фуросемида и профилактического введения РЭО предотвращают депрессию удельной активности ((}) СДГ в эти же сроки При этом комбинированное применение препаратов позволяет добиться дополнительной стимуляции этого фермента Однократное введение РЭО одновременно с ртути дихлоридом не способно предупредить угнетение СДГ

Ртути дихлорид увеличивает разнородность клеточной популяции (V), что с учетом данных о снижении активности СДГ говорит о значительном увеличении количества лимфоцитов с низкой ферментативной активностью Фуросемид, профилактическое введение РЭО и комбинированное применение фуросемида и профилактического введения РЭО предупреждают сдвиг в сторону низкоактивных лимфоцитов Однократное введение РЭО не оказало положительного влияния на коэффициент вариации

Ртути дихлорид увеличивает коэффициет асимметрии (А), что также свидетельствует о преобладании клеток с низкой активностью Все варианты введения препаратов ослабляют действие ртути дихлорида на этот показатель

Таким образом, ртути дихлорид изменяет внутриклеточные и клеточно-популяционные характеристики энергетического статуса лимфоцитов крови, что свидетельствует о дизрегуляции клеточной энергопродукции и популяционной структуры лимфоцитов Профилактическое применение РЭО, фуросемид сам по себе, а также в комбинации с профилактическим назначением РЭО предотвращают неблагоприятные эффекты ртути дихлорида на энергетику лимфоцитов, оказывают положительное действие на клеточно-популяционные характеристики лимфоцитов, сохраняют резерв клеток с типичной активностью, предупреждают сдвиг пула лимфоцитов в сторону популяций с низкой ферементной активностью РЭО при однократном введении не оказывают протекторного действия на популяционные характеристики лимфоцитов

7. Влияние фуросемида, регуляторов энергетического обмена на патоморфологические характеристики почечных структур при нефротоксическом действии ртути дихлорида Морфологическая картина структурных изменений почки через 5 суток после начала развития нефротоксической ОПН, вызванной введением в организм ртути дихлорида, типична для этой патологии В целом картина препарата характерна для острой тубулопатии - некротического нефроза со слабыми признаками регенераторной активности

ЯК и ГК однократно в момент введения ртути дихлорида не оказывают положительного влияния на морфологическую картину к 5 дню развития ОПН Отмечается более выраженная гистопатологическая динамика картина

тубулопатии обозначена более ярко, дистрофические и некротические процессы усилены, канальцы расширены, в просветах много белка, слущенного эпителия, солей кальция Выражено полнокровие В целом морфологическая картина свидетельствует о более тяжелом поражении почек, чем только под действием ртути дихлорида К тому же компенсаторная пролиферация эпителия значительно уменьшена.

Профилактическое применение препаратов РЭО в течение 5 дней до введения ртути дихлорида приводит к уменьшению процессов экстракапиллярной гломерулопатии Дистрофические процессы в канальцах менее выражены В просвете меньше белка и солей

Характерно, что фуросемид способен предупредить тяжелое нефротоксическое действие ртути дихлорида Меньше поражен фильтрационный аппарат, дистрофические изменения в канальцах слабо выражены, признаки пролиферативной активности, имеются молодые клетки эпителия

Комбинированное действие фуросемида и профилактического применения РЭО уменьшает степень повреждения почки ртути дихлоридом по данным морфологического исследования Как дистрофические, так и некротические изменения носят не диффузный, а очаговый характер

Таким образом, наиболее благоприятные морфологические сдвиги отмечены в группе при комбинированном воздействии фуросемида и РЭО Это соответствует и улучшению функциональных показателей почек в этот экспериментальный период

* * *

Установлены оптимальные условия защитного эффекта фуросемида время, доза, пути введения Вероятно, механизм протекторного действия фуросемида связан с его конкуренцией за секреторный аппарат и с ограничением поступления металла в наиболее чувствительные проксимальные канальцы Кроме того, фуросемид вызывает положительные сдвиги в гидродинамических характеристиках канальцев за счет блокады транспорта натрия и воды, способствуя накоплению ультрафильтрата в просвете, что и препятствует коллапсированию стенок канальцев, взаимному сдавлению поврежденных апикальных частей нефроцитов

Многократное профилактическое введение регуляторов энергетического обмена янтарной и глутаминовой кислот приводит к уменьшению выраженности морфологических изменений при ОПН, вызванной ртути дихлоридом Морфологическая картина почек через 5 суток развития почечной недостаточности при однократном введении РЭО показывает наболее тяжелое поражение почек

Лучший эффект оказывает комбинация фуросемида и профилактическое введение РЭО

выводы

1 Фуросемид в дозе 2 мг/кг, введенный подкожно сразу после ртути дихлорида в дозе 5 или 10 мг/кг на фоне умеренной гиперволемии, предупреждает нефротоксическое действие ртути и увеличивает выживаемость животных в обеих моделях развития острой почечной недостаточности Оптимальным условием защитного эффекта диуретика является совпадение по времени экскреторной реакции почек с периодом токсического действия металла на почки

2 Фуросемид не препятствует фиксации ртути в почках Однако уменьшает депонирование в корковом слое и увеличивает содержание его в мозговом слое в первые сутки, что имеет важное значение в защите проксимальных канальцев от токсического действия ртути Это соответствует уменьшению экскреции ртути с мочой в указанное время и резкому увеличению выведения металла из организма на 3 сутки экспериментального периода

3 Методом прижизненной морфометрии кортикальных структур почек установлена возможность фуросемида за счет блокады канальцевой реабсорбции жидкости резко увеличивать просвет почечных канальцев в первые 60 минут экспериментального периода и уменьшать толщину канальцевых стенок (в период 60-120 минут), что приводит к сохранению проходимости нефронов Сужение межканальцевых промежутков через 120 минут свидетельствует о ликвидации застойных явлений и нормализации перитубулярного кровообращения

4 Профилактическое 5-дневное назначение янтарной и глутаминовой кислот до введения ртути дихлорида, фуросемид сам по себе, а также в комбинации с предварительным назначением митохондриальных субстратов стимулируют сукцинатдегидрогеназную активность лимфоцитов на 1 и 3 сутки экспериментального периода, ослабляют проявления ртутной нефропатии с нормализацией отдельных параметров экскреторной функции почек и патоморфологических изменений в нефронах

5 Однократное применение регуляторов энергетического обмена сразу после введения ртути дихлорида не оказывает нефропротективного действия, при этом морфологическая картина поражения почек на 5 сутки показывает более тяжелое поражение почечных структур, чем при действии только ртути дихлорида

6 Разработаны две экспериментальные модели острого поражения почек ртути дихлоридом с высокой избирательной нефротропностью металла за счет уменьшения массы действующих нефронов с дополнительным ослаблением ишемией оставшихся структурных единиц почек или с сенсибилизацией к ртути секреторного аппарата проксимальных канальцев

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Разработанные экспериментальные модели острого поражения почек ртути дихлоридом с высокой избирательной нефротропностью металла могут быть рекомендованы для использования в научных исследованиях, посвященных

изучению механизмов и разработке методов фармакологической коррекции токсического поражения почек

2. Экспериментальные данные, полученные в данном исследовании, свидетельствуют о необходимости максимально приблизить оказание экстренной помощи к моменту острого отравления ртути дихлоридом, так как протективные свойства фуросемида наблюдаются только при его введении сразу после ртути дихлорида и на фоне умеренной гиперволемии Отсутствие защитных свойств фуросемида при уже развившейся острой почечной недостаточности, вызванной ртути дихлоридом, обосновывает исключение его применения при данной патологии

3 Выявленные в эксперименте защитные свойства янтарной кислоты, глутаминовой кислоты при их профилактическом применении позволяют рекомендовать их для изучения возможности профилактического применения регуляторов энергетического обмена у лиц, профессионально связанных с воздействием соединениями ртути

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Дубищев А В Моделирование токсического поражения нефронов солями тяжелых металлов и возможность фармакологической коррекции / А В Дубищев, С Г Захарова // Казанский медицинский журнал - 2007 - Т LXXXVIII, № 6 - С 640-641

2 Дубищев А В Возможности фармакологической коррекции при поражении почек солями тяжелых металлов / А В Дубищев, С Г Захарова // Сборник работ 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, часть II - Курск, 2002 - С 29-30

3 Дубищев А В Экологически обусловленная нефротоксичность солей тяжелых металлов и возможность фармакологической защиты / А В Дубищев, С Г Захарова // Экология и здоровье человека Труды VIII Всероссийского Конгресса - Самара, 2002 - С 73-74

4 Захарова С Г Влияние фуросемида на нефротоксичность и кинетику ртути дихлорида / С Г Захарова, А В Дубищев // Актуальные проблемы фармакологии Тезисы докладов научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета - Барнаул, 2003 - С 17

5. Захарова С.Г. Влияние фуросемида на кинетику тяжелых металлов в эксперименте / С Г Захарова, А В Дубищев // Фундаментальные проблемы фармакологии Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов Часть! -М,2003 -С 196

6 Влияние регулятора энергетического обмена на окислительные процессы в почках при действии вибрации / Н К Мазина, В А Кудрявцев, В В Воробьева и соавт // Нефрология и диализ - 2003 - Т 5, № 3 - С 257

7 Дубищев А В Гидродинамический эффект диуретиков как фактор нефропротекторного действия / А В Дубищев, О.Н Воронова, С Г Захарова // Материалы II всероссийского съезда фармацевтических работников - Сочи, 2005 - С 71-72

8 Захарова С Г Регуляция фуросемидом депонирования и экскреции металлов почками / С Г Захарова // Аспирантский вестник Поволжья - 2005 - №1 - С 103-104

9 Захарова С Г Фармакологическая регуляция функции почек при их токсическом поражении / С Г Захарова // Актуальные вопросы военной медицины Сборник тезисов и статей XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института - Самара, 2006 - С 95-96

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - антидиуретический гормон

БМК - быстрый метаболический кластер

ГК - глутаминовая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИРНХ - изотонический раствор натрия хлорида

МС - митохондриальные субстраты

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

ОПН - острая почечная недостаточность

ПГ - просгагландин

РЭО - регуляторы энергетического обмена СДГ - сукцинатдегидрогеназа ФАД- флавинадениндинуклеотид ЭСЛ - энергетический статус лимфоцитов ЯК - янтарная кислота

Захарова Светлана Григорьевна

ОСОБЕННОСТИ НЕФРОПРОТЕКТНВНОГО ДЕЙСТВИЯ ФУРОСЕМИДА II НЕКОТОРЫХ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ПОЧЕК

РТУТИ ДИХЛОРИДОМ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Лицензия № 0177 от 10 06 1996 г Подписано в печать 15 05 2008 г Бума1 а офсетная Отпечатано на ризографе Формат 60x84 1/16 Уел -печ листов 1,5 Уч -изд т 1,7 Тираж 100 экз Заказ №217

450000, г Уфа, ул Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет Росздрава»

Актуальность проблемы. Соли тяжелых металлов широко распространены в природе, они используются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту, попадают в растительную и животную пищу. Очень опасными ксенобиотиками являются соли ртути, платины, висмута, серебра, хрома, урана, они относятся к числу наиболее распространенных и опасных загрязнителей (Бертрам Г. Катцунг, 1998; Г.В. Римарчук, 1999). Длительное поступление соединений тяжелых металлов в организм в небольших дозах или однократное массивное поступление может вызвать тяжелое поражение почек вплоть до развития острой почечной недостаточности (JI. Дж. Линг и соавт., 2006). Это особенно относится к ртуть-содержащим соединениям (Н. S. D'Souza et al., 2003). Ртуть, вероятно, самое нефротоксичное вещество из группы тяжелых металлов (James В. Wyngaarden, L.H. Smith, 1985). Ввиду того что ртуть используется повсеместно, никто не может избежать контакта с этим металлом (R. К. Zalups et al., 2004.). Особая чувствительность почки к катионам тяжелых металлов обусловлена высоким уровнем кровоснабжения и большой протяженностью тубулярного аппарата (С.С. Bridges, R.K. Zalups, 2004). Несмотря на использование современных методов лечения, смертность от данной патологии остается высокой (P. Toft, Т. Gilsaa, 2007). Необходимость использования гемодиализа, трансплантации подчеркивает отсутствие эффективных фармакологических способов предупреждения поражения почек соединениями ртути. Тот факт, что имеющиеся способы лечения этих отравлений не дают удовлетворительных результатов, делает проблему еще более актуальной и побуждает исследователей к экспериментальной разработке методов лечения.

Вопрос о применении диуретиков при токсической нефропатии является одним из сложных. В литературе имеются сообщения о протекторном действии увеличенного диуреза при нефротоксическом действии ртути дихлорида (G. Thiel et al., 1976). Однако, ряд авторов указывают на неблагоприятное действие фуросемида при острой почечной недостаточности (P. Toft, Т. Gilsaa, 2007). Убедительные данные о возможности фуросемида предупреждать ишемические поражения почек и развития постишемической почечной недостаточности (А.А. Лебедев, А.В. Дубищев, 1986) дают основания для детального изучения эффективности диуретиков и при острой токсической нефропатии. С другой стороны, фармакологическая регуляция энергетического обмена способствует эффективной коррекции патологических состояний, сопряженных с гипоксией, энергодефицитом (В.А. Хазанов, 2003). Можно полагать, что регуляторы энергетического обмена могли бы существенно повысить резистентность почечной ткани к токсическому действию солей тяжелых металлов. В связи с этим актуальной задачей является детальное изучение эффективности диуретиков, митохондриальных регуляторов энергетического обмена при остром поражении почек соединениями тяжелых металлов. Цель исследования: на моделях токсического поражения почек ртути дихлоридом разработать способы фармакологической защиты нефронов фуросемидом и регуляторами энергетического обмена - янтарной и глутаминовой кислотами.

Задачи исследования.

1. Разработать экспериментальные модели избирательного тяжелого поражения почек ртути дихлоридом.

2. Определить оптимальные условия нефропротективной эффективности фуросемида и механизм его действия на экскреторную функцию почек при остром поражении почек ртути дихлоридом.

3. Изучить возможность фуросемида влиять на депонирование ртути в почках и экскрецию ее с мочой.

4. Провести оценку энергетического статуса организма под действием фуросемида и митохондриальных субстратов янтарной и глутаминовой кислот по сукцинатдегидрогеназной активности лимфоцитов при ртутной нефропатии.

5. Оценить эффективность регуляторов энергетического обмена янтарной и глутаминовой кислот при острой ртутной нефропатии по изменению экскреторной функции почек.

6. Методами прижизненной морфометрии кортикальных структур и патоморфологического изучения почек выявить как ранние, так и поздние изменения, возникающие под действием изучаемых фармакологических средств при ртутном поражении почек.

Научная новизна. Впервые разработаны модели поражения почек ртути дихлоридом у экспериментальных животных (крыс) с высокой избирательной нефротропностью: в первой модели за счет уменьшения массы действующих нефронов с дополнительным ослаблением ишемией оставшихся структурных единиц почек; во второй модели за счет сенсибилизации к ртути секреторного аппарата проксимальных канальцев пенициллином. Впервые определены оптимальные условия эффективности фуросемида (доза, время, пути введения) при поражении почек ртути дихлоридом. Впервые установлена способность диуретика перераспределять депонирование ртути из коркового слоя почек в мозговой, что имеет важное значение в защите кортикальных структур от токсического действия металла. Впервые изучен механизм действия фуросемида в первые два часа развития патологии методом прижизненной морфометрии, показывающий важную роль ослабления гипергидратации нефроцитов и сохранения просвета канальцев для тока ультрафильтрата. Впервые проведена оценка энергетического статуса организма под действием фуросемида, регуляторов энергетического обмена — янтарной и глутаминовой кислот при токсической ртутной нефропатии по критерию сукцинатдегидрогеназной активности лимфоцитов. Впервые выявлена возможность янтарной и глутаминовой кислот при курсовом профилактическом введении ослаблять тяжесть некоторых параметров почечной недостаточности. Исследованы морфологические особенности фармакологической защиты почек фуросемидом и регуляторами энергетического обмена.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Расширены представления о механизме действия фуросемида при остром токсическом действии ртути дихлорида. Разработаны две экспериментальные модели острого поражения почек ртути дихлоридом с высокой избирательной нефротропностью металла за счет уменьшения массы действующих нефронов с дополнительным ослаблением ишемией оставшихся структурных единиц почек или с сенсибилизацией к ртути секреторного аппарата проксимальных канальцев. Результаты исследований позволяют рекомендовать использование фуросемида в комбинации с умеренной гиперволемией сразу после отравления ртути дихлоридом. Выявленные в эксперименте защитные свойства янтарной кислоты, глутаминовой кислоты при их профилактическом применении позволяют рекомендовать их для изучения возможности профилактического применения регуляторов энергетического обмена у лиц, профессионально связанных с воздействием соединениями ртути. Результаты исследований используются в научных изысканиях и включены в материалы лекций и практических занятий кафедр фармакологии Самарского государственного медицинского университета и Кировской государственной медицинской академии.

Внедрение. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр фармакологии Самарского государственного медицинского университета и Кировской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фуросемид, введенный сразу после ртути дихлорида на фоне умеренной гиперволемии, предупреждает нефротоксическое действие ртути, нормализует экскреторную функцию почек и увеличивает выживаемость животных. Оптимальным условием защитного эффекта диуретика является совпадение по времени экскреторной реакции почек с периодом токсического действия металла на почки.

2. Фуросемид уменьшает депонирование ртути в корковом слое почек и увеличивает содержание металла в мозговом слое. Это предотвращает поражение кортикальных структур (проксимальных канальцев) в первые сутки после введения ртути дихлорида и усиливает выведение металла из организма на третьи сутки экспериментального периода.

3. Фуросемид на фоне нефротоксического действия ртути дихлорида значительно увеличивает просвет поверхностных почечных канальцев в первые 60 минут экспериментального периода и уменьшает гипергидратацию нефроцитов в последующие 60 минут наблюдения.

4. Фуросемид и профилактическое курсовое введение регуляторов энергетического обмена янтарной и глутаминовой кислот активируют энергетический статус лимфоцитов при острой ртутной нефропатии.

5. Янтарная и глутаминовая кислоты при однократном введении их в организм не обладают нефропротекторным действием при ртутной нефропатии, патоморфологически выявляется более тяжелое поражение почек. Профилактическое курсовое назначение указанных митохондриальных субстратов нормализует отдельные параметры экскреторной функции и морфологических структур почек.

6. Оптимальный результат возникает при предварительном 5-дневном введении митохондриальных субстратов и однократной инъекции фуросемида сразу после введения ртути дихлорида. Указанная комбинация препаратов

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация и публикация результатов работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), VII, IX, X Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2002, 2004, 2005), XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института «Актуальные вопросы военной медицины» (Самара, 2006), на межкафедральном заседании фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета 21 января 2008 года.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методик экспериментов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 151 источник, из которых 101 на иностранных языках.

выводы

1. Фуросемид в дозе 2 мг/кг, введенный подкожно сразу после ртути дихлорида в дозе 5 или 10 мг/кг на фоне умеренной гиперволемии, предупреждает нефротоксическое действие ртути и увеличивает выживаемость животных в обеих моделях развития острой почечной недостаточности. Оптимальным условием защитного эффекта диуретика является совпадение по времени экскреторной реакции почек с периодом токсического действия металла на почки.

2. Фуросемид не препятствует фиксации ртути в почках. Однако уменьшает депонирование в корковом слое и увеличивает содержание его в мозговом слое в первые сутки, что имеет важное значение в защите проксимальных канальцев от токсического действия ртути. Это соответствует уменьшению экскреции ртути с мочой в указанное время и резкому увеличению выведения металла из организма на 3 сутки экспериментального периода.

3. Методом прижизненной морфометрии кортикальных структур почек установлена возможность фуросемида за счет блокады канальцевой реабсорбции жидкости резко увеличивать просвет почечных канальцев в первые 60 минут экспериментального периода и уменьшать толщину канальцевых стенок (в период 60-120 минут), что приводит к сохранению проходимости нефронов. Сужение межканальцевых промежутков через 120 минут свидетельствует о ликвидации застойных явлений и нормализации перитубулярного кровообращения.

4. Профилактическое 5-дневное назначение янтарной и глутаминовой кислот до введения ртути дихлорида, фуросемид сам по себе, а также в комбинации с предварительным назначением митохондриальных субстратов стимулируют сукцинатдегидрогеназную активность лимфоцитов на 1 и 3 сутки экспериментального периода, ослабляют проявления ртутной нефропатии с нормализацией отдельных параметров экскреторной функции почек и патоморфологических изменений в нефронах.

5. Однократное применение регуляторов энергетического обмена сразу после введения ртути дихлорида не оказывает нефропротективного действия, при этом морфологическая картина поражения почек на 5 сутки показывает более тяжелое поражение почечных структур, чем при действии только ртути дихлорида.

6. Разработаны две экспериментальные модели острого поражения почек ртути дихлоридом с высокой избирательной нефротропностъю металла за счет уменьшения массы действующих нефронов с дополнительным ослаблением ишемией оставшихся структурных единиц почек или с сенсибилизацией к ртути секреторного аппарата проксимальных канальцев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные экспериментальные модели острого поражения почек ртути дихлоридом с высокой избирательной нефротропностью металла могут быть рекомендованы для использования в научных исследованиях, посвященных изучению механизмов и разработке методов фармакологической коррекции токсического поражения почек.

2. Экспериментальные данные, полученные в данном исследовании, свидетельствуют о необходимости максимально приблизить оказание экстренной помощи к моменту острого отравления ртути дихлоридом, так как протективные свойства фуросемида наблюдаются только при его введении сразу после ртути дихлорида и на фоне умеренной гиперволемии. Отсутствие защитных свойств фуросемида при уже развившейся острой почечной недостаточности, вызванной ртути дихлоридом, обосновывает исключение его применения при данной патологии.

3. Выявленные в эксперименте защитные свойства янтарной кислоты, глутаминовой кислоты при их профилактическом применении позволяют рекомендовать их для изучения возможности профилактического применения регуляторов энергетического обмена у лиц, профессионально связанных с воздействием соединениями ртути.