Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Участие оксида азота в механизмах действия растительных и синтетических препаратов на экскреторную функцию почек

На правах рукописи

ПАНИН ВЯЧЕСЛАВ ПАВЛОВИЧ

УЧАСТИЕ ОКСИДА АЗОТА В МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

с о:з шг

Томск-2012

005010579

005010579

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Дубшцев Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Поветьева Татьяна Николаевна

доктор биологических наук,

профессор Петрова Ирина Викторовна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «0.^1 » февраля 2012 г. в _______ часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «______» января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из значительных достижений последних десятилетий стало открытие биорегуляторных свойств эндогенного оксида азота (N0). Он синтезируется практически во всех тканях организма и обладает широким спектром биологического действия (А.Ф. Ванин, 2001; Х.М. Марков, 2001; И.П. Серая, Я.Р. Нарциссов, 2002; П.П. Голиков, 2004; В.Г. Гранин, Н.Б. Григорьев, 2004). В почках N0 образуется как в сосудах, так и в нефроцитах (Ю.В. Наточин, 2009; V. Cattel et al., 1993; C.J. Lowenstein et al., 1994). Он участвует в регуляции почечного кровотока, клубочковой фильтрации, модуляции канальцевого транспорта электролитов и воды в нефронах как в норме, так и при почечной патологии (С.И. Рябов, Ю.В. Наточин, 1997; С.С. Паунова с соавт., 2000; И.И. Топчий, 2002). Однако, роль N0 в регуляции функции почек окончательно не установлена. Литературные данные в оценке значения оксида азота крайне противоречивы. В ряде экспериментальных и клинических исследований выявлена важная роль N0 в регуляции экскреторной функции почек (Е.В. Мелехина с соавт., 2001; Е.Г. Агапов, 2006; M.S. Goligorsky, E. Noiri, 1999). В то же время, генерируемый мезанги-альными и канальцевыми эпителиальными клетками N0 может усиливать тканевое повреждение (A. Furusu et al., 1998). Эта особенность была выявлена при гломерулонефрите у людей, на моделях клубочкового повреждения у животных и в экспериментах in vivo с использованием воспалительных цито-кинов (Р.A. Marsden, B.J. Ballermann, 1996; Н.М. Abu-Solid, S.I. Hazen, 2000; J.C. Zhang et al., 2001). Ингибитор NO-синтазы предотвращает гипоксическое повреждение проксимальных канальцев (L. Yu, P. Gengaro, 1997). Гиперпродукция N0 может способствовать развитию гломерулосклероза (Г.П. Арутюнов, Л.Г. Оганезова, 2009; С.В. Моисеев с соавт., 2009). Вот почему изучение роли N0 в регуляции функции почек является актуальной.

С другой стороны, широкому использованию лекарственных средств при патологии почек препятствует недостаточность сведений о механизмах нефропротекторного действия препаратов, в особенности лекарственных средств растительного происхождения. Фитопрепараты, в отличие от химиопрепаратов, обладают широтой и мягкостью терапевтического действия, а также относительной безопасностью при их применении, редкостью побочных эффектов, возможностью назначения при противопоказаниях к синтетическим препаратам (Д.А. Шейман, 2007; В.А. Куркин, 2009). Потребность в фитодиуретиках, которые, как правило, не нарушают электролитный, водный, кислотно-основной баланс, остается значительной.

Перспективными источниками лекарственных препаратов с диуретической активностью являются растения семейства Ивовых, широко представленные в природной среде. В различных частях этих растений содержится большое количество биологически активных соединений (БАС), обладающих разнообразными фармакологическими эффектами (Е.Н. Амосова с соавт., 2000; В.Н. Турецкова с соавт., 2011), в том числе и на мочевыделительную функцию почек (И.А. Губанов с соавт., 1976; С.Я. Соколов с соавт., 1977;

А.Г. Гилман, 2006). Однако, в настоящее время имеются лишь единичные

публикации по изучению диуретической активности препаратов семейства Ивовых (В.А. Волковой с соавт., 2002; М.Н. Кодакова с соавт., 2009). Весьма актуальным является выделение индивидуальных действующих веществ, обладающих диуретической активностью. Требуют дальнейшего раскрытия механизмы действия фитопрепаратов и их отдельных эффективных компонентов на клубочковый и канальцевый аппарат почек, с определением участия в них нитроксидзргической регуляции. Назрела острая необходимость научного обоснования использования препаратов, в том числе полученных из растений семейства Ивовых, а также выделенных из них БАС, для фармакологической коррекции острой почечной недостаточности (ОПН).

Изучение связи диуретической, салуретической и нефропротекторной активности препаратов с возможностью их изменять уровень N0 в почках, как мощного фактора регуляции микроциркуляторных и метаболических процессов, позволит раскрыть механизм защитного действия и откроет пути поиска препаратов лечебного и профилактического направления. Это подтверждает актуальность данного исследования не только для фармакологии, фармакогнозии, но и клинической нефрологии.

Цель исследования — оценить участие оксида азота в механизмах действия растительных и синтетических препаратов на экскреторную функцию почек при физиологических условиях и при токсической нефропатии.

Задачи исследования:

1. Исследовать почечную экскрецию N0 у крыс в физиологических условиях и при моделированной гентамициновой нефропатии.

2. Изучить влияние различных лекарственных средств, полученных из растений семейства Ивовых, а также сбора «Нефрофит-К» и синтетических препаратов (фуросемида, гипотиазида) на экскрецию воды, электролитов, креатинина и N0 у крыс в физиологических условиях с проведением корреляционного анализа связей между показателями экскреторной функции и содержанием N0 в моче.

3. Изучить действие активатора (предшественника - Ь-аргинина) и бло-катора (ингибитора фермента ИО-синтазы - Мж-нитро-Ь-аргинина) синтеза эндогенного N0 на экскрецию воды, электролитов, креатинина и N0 у крыс в физиологических условиях в течение 7 дней; провести корреляционный анализ связей между показателями экскреторной функции и содержанием N0 в моче при действии активатора и блокатора синтеза N0.

4. Провести анализ нефропротекторной эффективности отдельных растительных средств, полученных из фитосырья семейства Ивовых, при острой токсической нефропатии у крыс по критериям нормализации экскреторной функции почек и с учетом ЫО-экскреторной активности.

5. В острых опытах исследовать влияние индивидуальных БАС пруни-на и цинарозида, выделенных из сырья ивы остролистной, а также донатора N0 - перлинганита на показатели экскреции воды, натрия, калия, креатинина у крыс.

6. В модельных опытах на отрезках тонкой кишки и изолированных эритроцитах крыс провести анализ влияния БАС прунина и цинарозида, а

также активатора (Ь-аргинина) и блокатора (Ы„-нитро-Ь-аргинина) синтеза N0 на проницаемость биологических мембран для натрия и целлюлярный и парацеллюлярный транспорт.

Научная новизна. Впервые в экспериментальных условиях исследовано влияние препаратов растительного и синтетического происхождения на выделение N0 с мочой. На основании корреляционного анализа связей показателей экскреторной функции почек с уровнем выведения N0 определено участие оксида азота в механизмах действия растительных и синтетических препаратов на экскреторную функцию почек. Впервые в экспериментальных условиях проанализировано влияние активатора (Ь-аргинина) и блокатора (Ы\у-нитро-Ь-аргинина) синтеза оксида азота на экскреторную функцию почек крыс и выявлены корреляционные зависимости показателей экскреторной функции почек с уровнем выведения N0 под действием данных препаратов. Впервые в физиологических условиях у крыс определена сопряженность между почечной экскрецией натрия и N0. Установлена однонаправленность гентамициновой полиурии и возрастания выведения с мочой N0. Впервые проанализирована эффективность растительных средств при моделированной острой токсической нефропатии с учетом критерия ИО-экскреторной активности и предложена концепция поиска вероятной нефропротекторной активности препаратов по критерию экскреции оксида азота. Впервые в острых опытах изучено влияние индивидуальных БАС прунина и цинарозида, выделенных из лекарственного растительного сырья ивы остролистной, на показатели минутной экскреции воды, натрия, калия, креатинина у крыс. Впервые детально изучен механизм действия донатора N0 перлинганита на экскреторную функцию почек на уровне нефрона (на клубочковую фильтрацию и канальцевую реабсорбцию). В модельных опытах на биологических мембранах впервые проведен анализ канальцевого компонента диуретического эффекта БАС прунина и цинарозида. В модельных опытах на биологических мембранах впервые проведен анализ механизма модуляции канальцевого транспорта активатором (Ь-аргинином) и блокатором (Мш-нитро-Ь-аргинином) синтеза N0.

Научно-практическая значимость. Получены новые данные о диуретической и >Ю-экскреторной активности ряда растительных средств и индивидуальных БАС, выделенных из растений семейства Ивовых. Выявленная в эксперименте диуретическая активность фитосубстанций семейства Ивовых может быть перспективной для использования в клинической практике. Неф-ропротекторное действие изученных растительных средств при моделированной ОПН может представлять интерес для клинических испытаний. Активаторы и блокаторы синтеза оксида азота могут рассматриваться в качестве факторов управления экскреторной функцией почек, что делает возможным их использование в медицинской практике в схемах коррекции заболеваний почек. Перспективным представляется дальнейший поиск средств с диуретическими и нефропротективными свойствами среди лекарственных форм и индивидуальных БАС, выделенных из растений семейства Ивовых, а также среди синтетических лекарственных средств с учетом критерия N0-

экскреторной активности. Результаты исследования создают научную основу для поиска и расширения ассортимента лекарственных средств, в том числе . растительного происхождения.

Внедрение. Полученные в ходе исследования данные используются в научных исследованиях и включены в материалы лекций, практических занятий кафедр фармакологии, фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, профессиональных болезней и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрав-соцразвития России.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экскреция N0 с мочой в физиологических условиях сопряжена с выделением натрия; при гентамициновой нефропатии содержание N0 в моче значительно возрастает.

2. Большинство растительных средств, полученных из фитосырья семейства Ивовых, обладает диуретической активностью, коррелирующей с уровнем экскреции N0. Диуретический эффект фуросемида также коррелирует с уровнем выделения N0, а эффекты гипотиазида на экскреторную функцию почек не сопровождаются усилением экскреции N0.

3. Активатор синтеза оксида азота (Ь-аргинин) обладает выраженным стимулирующим эффектом на экскрецию воды, натрия, калия, креатинина с одновременным усилением выведения N0 с мочой. При действии блокатора синтеза N0 (Ыш-нитро-Ь-аргинина) проявляется антидиуретическое действие, сопровождающееся снижением почечной экскреции N0.

4. Анализ эффективности растительных средств, полученных из растений семейства Ивовых, при токсической гентамициновой нефропатии целесообразно проводить с учетом критерия ЫО-экскреторной активности.

5. Выделенные в чистом виде из сырья ивы остролистной БАС - пру-нин и цинарозид, а также донатор N0 - перлинганит обладают стимулирующими эффектами на экскреторную функцию почек. В основе диуретического и салуретического эффектов этих БАС лежат механизмы сочетанного влияния на клубочковую фильтрацию и канальцевый транспорт.

6. В модельных опытах на биомембранах прунин, а также активатор синтеза N0 Ь-аргинин оказывают стабилизирующее действие на клеточные мембраны, снижая их проницаемость для натрия; блокатор синтеза N0 оказывает противоположное действие; БАС цинарозид действует неоднозначно. Указанные вещества практически не влияют на проницаемость межклеточных соединений.

Апробация и публикация результатов работы. Апробация диссертации проведена на заседании межкафедрального коллоквиума фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России 27.06.2011 г.

Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на XIII и XVI Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2008, 2011); на 64-й Региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической

продукции» (Пятигорск, 2009); на Конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009); на V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010); на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); на Российском симпозиуме с международным участием «Патофизиология и клиника экстремальных и терминальных состояний» с изданием статьи в журнале «Медицинский вестник Башкортостана» (Уфа, 2009); на VIII и IX Международных конференциях «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2010, 2011); на региональной конференции «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2009); на научно-практической конференции, посвященной 25-летию кафедры восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии института последипломного образования Самарского государственного медицинского университета «Актуальные вопросы медицинской реабилитации, восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Самара, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 5 - в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 198 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 23 таблицами. Рукопись состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 334 источника, из которых 97 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Опыты поставлены на 433 белых беспородных крысах обоего пола массой 160-260 г, а также на 84 отрезках тонкой кишки и 42 порциях крови крыс. Крысы получены из вивария НИИ «Института экспериментальной медицины и биотехнологий» ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России. Животные содержались на обычном рационе при свободном доступе к воде (Н.Н. Каркищенко, 2004) в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (European Convention ..., 1986). За экспериментальный период всего было поставлено: хронических опытов — 393, острых опытов — 40, модельных опытов — 126. Работа выполнялась по следующим направлениям:

1. Исследование почечной экскреции NO у крыс в физиологических условиях и при моделированной гентамициновой нефропатии. Определение оксида азота в моче проводилось по конечным продуктам его метаболизма — нитратам и нитритам с предварительным восстановлением нитратов в нитриты по методике А.В. Виноградова в кадмиевом редукторе (А.В. Виноградов, 2003) и последующей идентификацией нитритов реактивом Грисса. Количественный результат реакции Грисса регистрировался колориметрически на колориметре ФЭК-56М при длине волны 320 нм. В день экс-

периментов крысы (п=60) помещались в обменные клетки на 4 часа для сбора мочи. В моче определялась также концентрация натрия и калия методом пламенной фотометрии на аппарате ПАЖ-1, концентрация креатинина - колориметрически по Фолину на колориметре ФЭК-56М при длине волны 492 нм.

Токсическая ОПН моделировалась семидневным внутрибрюшинным введением крысам гентамицина (Борисовский завод мед. препаратов РУП, Беларусь) в дозе 50 мг/кг (Н.А. Конопля, Л.Г. Прокопенко, Б.С. Утешев, 2002). При исследовании создавались 2 группы животных: контрольная (п=10) и опытная (п=10), ежедневно получающая внутрибрюшинно гентами-цин. Крысы помещались ежедневно в обменные клетки на 20 часов для сбора мочи. Регистрация показателей экскреторной функции почек (диуреза, экскреции натрия, калия, креатинина и N0) проводилась через 1, 3, 5 и 7 суток.

2. Изучение влияния различных растительных средств, полученных из фитосырья семейства Ивовых, и синтетических препаратов на экскреторную функцию почек и выведение N0 при физиологических условиях. В хронических экспериментах опытным крысам (по 10 животных в группах) внутрижелудочно вводили растительные средства, изготовленные на основе сырья осины, тополя, ивы в определенных лекарственных формах и дозах:

1. Осины коры отвар в дозе 100 мг/кг;

2. Осины почек отвар в дозе 100 мг/кг;

3. Осины листьев настой в дозе 100 мг/кг;

4. Осины коры экстракт спиртовой в дозе 100 мг/кг;

5. Тополя бальзамического коры экстракт спиртовой в дозе 100 мг/кг;

6. Ивы остролистной коры экстракт сухой в дозах 30, 40, 50 мг/кг.

Все исследуемые растительные средства были получены по разработанным на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России технологическим способам и соответствовали требованиям Государственной фармакопеи XI издания и другим нормативным документам. В качестве препаратов сравнения были взяты сбор «Нефрофит-К» (В.А. Куркин с соавт., 2000) в виде настоя в дозе 100 мг/кг и синтетические препараты - классические диуретики: фуросемид (лазикс, Aventis Pharma, Ltd, Индия) в дозах 5,10 мг/кг подкожно и гипотиа-зид (hydrochlorothiazie, Chinoin Pharmaceutical and Chemical Works Private, Co. Ltd, Венгрия) в дозе 25 мг/кг внутрижелудочно. После введения препаратов крысы помещались в обменные клетки на 4 или 20 часов (в зависимости от условий постановки эксперимента) с последующим определением в моче концентрации и экскреции натрия, калия, креатинина и NO.

3. Изучение действия активатора и блокатора синтеза эндогенного NO (L-аргинина гидрохлорида и 1Чж-нитро-Ь-аргинина) на экскреторную функцию почек крыс в физиологических условиях в хронических опытах проводилось при ежедневном подкожном введении препаратов в течение 7 дней. Экспериментальным путем были подобраны эффективные дозы препаратов: 100 мг/кг - для L-аргинина гидрохлорида (Ajinomoto, Япония), 10

мг/кг - для Nw-нитро-Ь-аргинина (L-NNA, Sigma, Германия). Крысы (п=10 в группе) помещались ежедневно на 20 часов в обменные клетки для сбора мочи. В течение первых 2 суток, а затем на 7-е сутки в моче определялось содержание натрия, калия, креатинина и NO.

4. Исследование влияния отдельных растительных средств и фитосубстанций растений семейства Ивовых на экскреторную функцию почек при токсической нефропатии, вызванной ежедневным внутрибрю-шинным введением гентамицина в дозе 50 мг/ кг, проводилось в течение 7 дней. Для исследования были взяты: экстракт ивы остролистной сухой в дозе 50 мг/кг и два индивидуальных БАС: тремулоидин в дозе 50 мг/кг и салицин в дозе 10 мг/кг, выделенные из сырья осины и ивы остролистной, соответственно. Создавались 2 группы животных: контрольная (п=9), которая получала ежедневно гентамицин внутрибрюшинно, и опытная (п=9 в группе), получающая антибиотик внутрибрюшинно и исследуемый препарат внутрижелу-дочно. Животные (п=36) помещались в обменные клетки на 20 часов для сбора мочи. Ежедневно определялась экскреция воды, натрия, калия. Для оценки тяжести ОПН за 3-и, 5-е и 7-е сутки в моче регистрировалось содержание креатинина колориметрическим методом, мочевины - уреазно-глутаматдегидрогеназным методом с фотометрией при длине волны 340 нм, общего белка - методом окрашивания при взаимодействии с бромфеноловым синим с последующей фотометрией при длине волны 620 нм, а также экскреция N0.

5. Изучение механизма действия прунина (в дозах 5 и 10 мг/кг) и цинарозида (в дозах 1 и 5 мг/кг), полученных из сырья ивы остролистной, а также донатора NO перлинганита (glyceryl trinitrate, Jenahexal Pharma, Gmbh, Германия) в дозе 0,15 мг/кг на клубочковую фильтрацию и канальцевый транспорт натрия проводилось в острых опытах на крысах. Благодаря огромным усилиям коллектива кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ под руководством зав. кафедрой проф.

В.А. Куркина из растительного сырья ивы остролистной были выделены в чистом виде БАС прунин и цинарозид, относящиеся к группе флавоноидов. Только тщательный анализ показателей острого эксперимента позволяет локализовать действие препаратов на уровне нефрона. Крысы (п=40) наркотизировались подкожным введением этаминала натрия в дозе 50 мг/кг. После внутривенного введения изучаемых препаратов через 30 и 60 минут в динамике определялась минутная экскреция натрия, калия, креатинина с мочой. Параллельно в крови определялась концентрация креатинина (РСг) и натрия (PNa). Рассчитывались концентрационный индекс креатинина, клиренс креатинина, экскретируемая фракция натрия:UCl/PCr - концентрационный индекс креатинина, уел. ед; CCr = UCl/Pcr*V - клиренс креатинина, мкл/мин/100 г; UNa*V*100/(PNa*Ccr,0,94) - экскретируемая фракция натрия, %. По окончании экспериментов животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1987).

6. В модельных опытах проанализировали влияние БАС прунина и цинарозида, а также активатора (L-аргинина) и блокатора (Nw-iniTpo-L-

аргинина) синтеза N0 на транспорт натрия и уранина на отрезках тонкой кишки крыс, флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталинсульфоната |. (АНС) на изолированных эритроцитах крыс. Определение содержания флуоресцентного зонда АНС и уранина проводилось на флуориметре БИАН-130, длина волны возбуждения 365 нм, флуоресценции - 485 и 510 нм, соответственно.

Статистическая обработка результатов производились с помощью пакета Statistica 6.1. Описательная статистика осуществлялась после проверки распределения показателей на нормальность с использованием критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении рассчитывали среднюю арифметическую величину (М), стандартное отклонение (s), при распределении, отличном от нормального, - медиану (Ме) и интерквартильный размах от 25-го процентиля (нижний квартиль) до 75 процентиля (верхний квартиль). Достоверность проверяли по критериям Манна-Уитни и Уилкоксона (С.А. Гланц, 1999; О.Ю. Реброва, 2003). Проводился корреляционный анализ данных с применением непараметрического метода определения коэффициентов ранговой корреляции Спирмена (О.Ю. Реброва, 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование экскреторной функции почек (гидро-, натрий-, калий-, креатининуреза), а также содержания NO в моче в физиологических условиях проводилось за 4-х часовой период наблюдений. В норме почечная экскреция NO составляет Ме = 7,5 [3,94+10,1] мкг/4 часа. Корреляционный анализ данных выявил значимую корреляционную связь (г=0,5, р<0,05) между показателями выведения N0 с мочой и экскрецией натрия, свидетельствующую об участии N0 в механизмах модуляции экскреции основного иона внутренней среды - натрия при физиологических условиях.

Для уточнения вопроса об участии нитроксидэргических механизмов в патогенезе токсической нефропатии и роли N0 в механизмах коррекции функции почек в ответ на токсическое повреждение проводилось исследование содержания N0 при моделировании гентамициновой ОПН (табл. 1). В течение 1-х суток в опытной группе отмечалась выраженная полиурия с возрастанием экскреции натрия и калия, что свидетельствовало о начале развития полиурической формы ОПН (K.M. Бушма, М.И. Бушма, 2009), параллельно увеличивалось выведение с мочой N0 (в 2,5 раза). На 3-и сутки эксперимента полиурия исчезла с одновременным уменьшением экскреции креатинина, но сохранялся повышенный (в 2 раза) натрийурез и NO-урез.

Эти данные говорят об угнетении клубочковой фильтрации (снижение креатининуреза), блокаде канальцевой реабсорбции натрия (увеличение натрийу-реза) и об участии NO в натрийуретической реакции (эквивалентное увеличение экскреции N0). На 5-е сутки экскреция креатинина оставалась низкой, а увеличенный диурез, натрийурез, NO-урез (в 2,7 раза) указывали на поражение почечных канальцев и определенную роль в этой реакции N0. На 7-е сутки моделирования токсической нефропатии клубочковая фильтрация оставалась низкой. Падал натрийурез, возможно, за счет восстановления канальцевого транспорта натрия, хотя экскреция N0 оставалась выше кон-

трольных величин в 1,5 раза. Таким образом, гентамицин существенно угнетает клубочковую фильтрацию на 3-й, 5-й и 7-й дни наблюдения, уменьшает канальцевую реабсорбцию натрия (1-й, 3-й, 5-й дни), стимулирует экскрецию N0 в течение всего периода наблюдения (1-й, 3-й, 5-й и 7-й дни). Проведенные исследования подтверждают значение нитроксидэргических механизмов в патогенезе токсической нефропатии и участие оксида азота в процессах коррекции функции почек при токсическом повреждении.

Таблица 1

Экскреторная функция почек крыс при моделированной гентамициновой

токсической нефропатии на 1, 3, 5, 7 дни эксперимента (за 20 часов)

д н и п Диу- рез, мл Экскреция натрия, мкМоль Экскреция калия, мкМоль Экскреция креатинина, мг Экскреция оксида азота, мкг

1 к 10 1,89± 0,35 155,48 Г101,73-222,221 35,59 [29,42-66,521 0,28±0,09 8,76±3,95

0 9 3,3 2± 0,88 * 329,34±134,70 * 68,78±28,81 * 0,18 f0,15-0,171 21,71±14,18 *

3 к 10 1,92± 0,94 162,32±6,57 63,44±3,36 0,28±0,03 9,76 [8,4-10,11

0 9 1,82± 0,41 375,34±173,85 * 46,61 Г29,68-84,441 0,14±0,05* 20,05±6,54 *

5 к 10 1,85± 0,38 160,70±8,40 63,67±7,07 0,29±0,04 9,70±2,14

0 9 2,64± 0,75 * 236,61 * Г230,26-413,121 31,21±10,14* 0,16 * ГО, 15-0,161 26,55±8,77 *

7 к 10 1,81± 0,23 165,70±8,40 64,47±6,01 0,28±0,03 9,40±2,11

0 9 2,09± 0,61 128,88 * Г123,61-131,921 96,27±27,20 * 0,13±0,03* 14,66 * [13,83-18,551

Примечание: здесь и далее в табл. 2 и 3 при нормальном распределении признаков приведены: Mis, где М - среднее значение, s — среднее квадратическое отклонение, при этом М=Ме; при распределении, отличном от нормального: Me [25-й -5- 75-й проценгали], где Me - медиана, [25-й - 75-й проценгали] — интерквартильный размах;

* - достоверность опытных показателей (о) по сравнению с контрольными (к) по критерию Манна-Уитни р<0,05 В связи с этим остро встает вопрос о поиске препаратов, обладающих диуретическими и нефропротективными свойствами. Перспективными источниками получения таких лекарственных средств являются растения семейства Ивовых. Под действием отвара коры осины (100 мг/кг) у крыс отмечалось значимое увеличение выделения мочи (в 1,9 раза), натрия (в 2,4 раза), калия (в 1,5 раза), креатинина (в 1,9 раза), N0 (в 2,4 раза) по сравнению с контролем (табл. 2). Отвар почек осины в аналогичной дозе проявлял более умеренное действие на экскрецию воды (увеличение в 1,8 раза), калия (в 1,4 раза), N0 (в 1,8 раза) и слабо влиял на натрий- и креатининурез. Корреляционный анализ показателей экскреторной функции под действием отваров ко-

ры (Г1) и почек (г2) осины выявил сильные корреляции между экскрецией N0 и выделением воды (Г1=0,99; Г2=0,9б), натрия (Г1=0,89; г2=0,79), а также умеренную корреляционную связь между экскрецией N0 и калия (Г]=0,57; г2=0,51); при этом более высокие значения коэффициентов корреляции г наблюдались при действии отвара коры осины, что подтверждает участие N0 в экскреторной реакции почек в ответ на введение указанных препаратов.

В экспериментах по изучению действия растительных средств, полученных из листьев осины и содержащих относительно небольшое количество действующих веществ, на показатели экскреторной функции почек крыс время сбора мочи было увеличено до 20 часов.

Исследования влияния настоя листьев осины в дозе 100 мг/кг проводились в сравнительном аспекте с эффектами настоя сбора Нефрофит-К в аналогичной дозе. При введении настоя листьев осины у крыс отмечалась неоднозначная реакция. Регистрировалось небольшое увеличение диуреза (в 1,35 раза) и натрийуреза (в 1,6 раза), в то же время калий- и креатининурез практически не изменялись, выведение N0 при этом возрастало существенно — в 2 раза. Сбор Нефрофит-К оказался более эффективным: все показатели экскреторной функции почек, кроме экскреции калия, возросли более значительно. Корреляционный анализ данных показал, что при действии настоев листьев осины (г,) и сбора Нефрофит-К (г2) прослеживались сильные корреляции между суточной экскрецией N0 и выделением воды (г1=0,81; г2=0,74), натрия (Г]=0,87; г2=0,74), а также значимые корреляции умеренной силы между выведением N0 и экскрецией калия (Г1=0,56; г2=0,59) и креатинина (гх=0,65; г2=0,78). По-видимому, в данном случае N0 участвует в более мягком, пролонгированном в течение суток, модулирующем действии этих растительных средств на экскреторную функцию почек, в отличие от быстрых диуретических и салуретических эффектов отваров коры и почек осины.

При исследовании влияния спиртовых экстрактов коры осины и коры тополя бальзамического (табл. 2) было обнаружено, что экстракт коры осины в дозе 100 мг/кг за 4 часа значимо увеличивал выведение воды и натрия (в 1,2 раза), экскрецию N0 - в 1,35 раза, но достоверных изменений калийуреза и креатининуреза при этом не наблюдалось. Под действием экстракта коры тополя бальзамического (100 мг/кг) за 4 часа значимых изменений экскреторной функции обнаружено не было. Корреляционный анализ данных показал, что при действии экстракта коры осины спиртового прослеживались значимые корреляции между экскрецией N0 и выделением воды, натрия, калия и креатинина (г=0,83-Ю,54).

Изучалось также действие растительных средств, полученных из сырья ивы остролистной, в частности, сухого экстракта коры в возрастающих дозах (табл. 2). При действии экстракта коры ивы сухого в дозе 30 мг/кг за 4 часа наблюдалось значимое увеличение диуреза (в 2,3 раза) и натрийуреза (1,4 раза) по сравнению с контролем, одновременно увеличивалось выведение N0 в 1,3 раза. Введение крысам экстракта коры ивы остролистной в дозе 40 мг/кг вызывало значительное возрастание всех показателей экскреторной функции: выведения воды — в 2,3 раза, натрия — в 2,5 раза, калия — в 2 раза,

Влияние растительных средств, изготовленных из сырья осины, тополя бальзамического и ивы остролистной, на экскре-_______________________________________торную функцию почек крыс (за 4 часа) ________________________________________

Препараты Диурез, мл Экскреция натрия, мкМоль Экскреция калия, мкМоль Экскреция креа-тинина. мг Экскреция оксида азота, мкг

п контроль опыт контроль опыт контроль опыт кон- опыт кон- опыт

Отвар коры осины, 100 мг/кг 10 0,84± 0,44 1,55± 0,3 * 101,82 [101,25+ 200.001 246,74± 114,23 * 43,03± 18,90 61,54± 24,84 * 0,24± 0,05 0,45± 0,21 * 7,94± 4,03 18,92± 7,18 *

Отвар почек осины, 100 мг/кг 9 0,84± 0,44 1,51± 0,53 * 101,82 [101,25+ 200.001 140,00 [101,85+ 357.891 43,03± 18,90 59,65 [46,67+ 74.481 * 0,24± 0,05 0,25 [0,24+ 0.451 7,94± 4,03 14,06± 4,22 *

Экстракт коры осины спиртовой, 100 мг/кг 10 1,09 [0,95+ 1,201 1,26 ±0,24 * 85,52 ±24,82 99,18± 50,46 * 52,50 [26,67+ 54,551 48,35± 19,00 0,29± 0,13 0,24 [0,16+0, 271 6,99± 1,80 9,45± 1,49 *

Экстракт коры тополя бальзамического спиртовой, 100 мг/кг 10 1,09 [0,95+ 1,20] 1,03± 0,32 85,52± 24,82 80,85± 30,1 52,50 [26,67+ 54,55] 31,20 [25,50+ 73,07] 0,29± 0,13 0,22± 0,13 6,99± 1,80 5,60± 3,06

Экстракт коры ивы остролистной сухой, 30 мг/кг 10 0,95 [0,61- 1,63] 2,20 [1,64+ 2,35] * 65,24 [55,36+ 98,45] 90,43 [85,37+ 110,42] * 35,28 [20,12+ 48,58] 33 [29,47+ 37,33] 0,1 [0,08+ 0,2] 0,2 [0,15+ 0,21] 7,95± 4,06 10,61± 1,52 *

Экстракт коры ивы остролистной сухой, 40 мг/кг 10 0,95 [0,61- 1,63] 2,14 [1,62-2,741 * 65,24 [55,36+ 98,451 160,46 [90,23+ 240,371 * 35,28 [20,12+ 48,581 72,43 [38,29+ 105,411 0,1 [0,08+ 0,2] 0,31 [0,24+ 0,421 * 7,95± 4,06 15,92± 4,21 *

Экстракт коры ивы остролистной сухой, 50 мг/кг 10 0,95 [0,61- 1,63] 1,64 [1,53+ 1,651* 65,24 [55,36+ 98,451 130,28 [65,42+ 140,121 *' 35,28 [20,12+ 48,581 30,92 [28,4+ 45,161 0,1 [0,08+ 0,21 0,28 [0,25+ 0,311 * 7,95± 4,06 8,45± 1,51

* - достоверность опытных показателей по сравнению с контрольными по критерию Манна-Уитни р<0,05

креатинина - в 3 раза, N0 - в 2 раза. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг/кг увеличивало экскрецию только воды (в 1,7 раза), натрия (в 2 раза) и креатинина (в 2,9 раза), в то же время, выделение калия и N0 не изменялось. По-видимому, большие дозы растительного средства могут оказывать действие на другие органы и системы, что вторично сказывается на функции почек. Корреляционный анализ данных показал, что при действии экстракта коры ивы остролистной в возрастающих дозах в течение 4 часов прослеживались значимые корреляции, в основном умеренной силы, между экскрецией N0 и выделением воды, натрия, калия и креатинина (г=0,56+0,84). Наибольшие значения коэффициентов корреляции г наблюдались при действии экстракта коры ивы в дозе 40 мг/кг.

Таким образом, обнаруженные тесные корреляции между уровнями экскреции N0 с мочой под действием различных растительных средств и экскрецией воды, электролитов, креатинина в физиологических условиях подтверждают участие нитроксидэргических механизмов в процессах реализации почечных эффектов большинства растительных средств.

Были исследованы также эффекты таких синтетических препаратов, как фуросемид и гипотиазид, применяемых в качестве эффективных мочегонных средств. Указанные препараты были взяты для сравнения. Введение фуросемида в дозе 5 мг/кг сопровождалось выраженным диуретическим и салуретическим эффектами. За 4 часа наблюдений диурез возрастал в 1,7 раза по сравнению с контролем, натрийурез - в 2,3 раза, калийурез — в 1,9 раза, креатининурез — в 1,4 раза; выведение N0 увеличивалось в 3,7 раза. Увеличение дозы до 10 мг/кг приводило к усилению всех параметров экскреторной реакции (соответственно в 1,6; 5,5; 4,4; 2 раза); выведение N0 увеличилось в 5,5 раза по сравнению с контрольной группой.

Гипотиазид, вводимый в дозе 25 мг/кг внутрижелудочно, вызывал умеренное увеличение диуреза (в 1,3 раза), сопровождающееся увеличением экскреции натрия в 1,6 раза, калийуреза - в 1,4 раза по сравнению с контролем. При этом значимых изменений креатининуреза зафиксировано не было. Содержание N0 в моче под действием гипотиазида за 4 часа не увеличилось, а наоборот, уменьшилось — в 3,8 раза по сравнению с контрольной группой.

Корреляционный анализ данных показал, что при действии фуросемида (5 и 10 мг/кг) прослеживаются значимые, умеренные и сильные положительные корреляции между уровнем выведения N0 и показателями экскреции воды (Г1=0,65; г2=0,57), электролитов натрия (пЮ.77; г2=0,74) и калия (Г1=0,62; г2=0,79), а также креатинина (г=0,82 для дозы 10 мг/кг). Полученные данные свидетельствуют о тесной связи диуретического и салуретического эффектов фуросемида с экскрецией N0 и об участии эндогенного N0 в формировании механизмов действия изучаемого препарата на экскреторную функцию почек. При действии гипотиазида была выявлена одна значимая обратная связь умеренной силы между уровнем выведения N0 и экскрецией ионов калия (г=-0,65). По-видимому, почечные эффекты гипотиазида могут осуществляться без регулирующего участия нитроксидэргических механизмов.

Мы изучили действие активатора (Ь-аргинина гидрохлорида - предшественника N0, в дозе 100 мг/кг) и блокатора синтеза N0 (Ы„-нитро-Ь-аргинина - блокатора 1МО-синтазы, в дозе 10 мг/кг) на экскреторную функцию почек крыс при ежедневном введении препаратов в течение 7 дней (табл. 3). Через сутки после первого подкожного введения Ь-аргинина достоверных изменений водовыделительной функции опытных крыс зафиксировано не было, но выведение натрия и N0 с мочой к концу 1-х суток уже значимо увеличивалось. В конце 2-х суток эксперимента активатор синтеза N0 вызывал резкое увеличение экскреции: воды - в 1,7 раза, натрия - в 2,6 раза, калия - в 3,6 раза, креатинина - в 3,3 раза по сравнению с контролем. Одновременно значительно (в 6,7 раза) возрастало выведение N0 с мочой. В конце 7-х суток наблюдались повышенные уровни суточного выведения воды -выше контроля в 1,6 раза, натрия — в 2,8 раза, калия — в 3,8 раза, креатинина -в 3,4 раза; содержание N0 в моче превышало контрольные показатели в 7 раз.

Блокатор синтеза N0 на экскреторную функцию почек крыс действовал неоднозначно (табл. 3). Через сутки после введения 1Ч„-нитро-Ь-аргинина был отмечен временный, но достаточно отчетливый диуретический эффект и повышение экскреции натрия; увеличивалась и экскреция N0. Описанный эффект связан, возможно, с почечной экскрецией экзогенно введенных нитрогрупп препарата Ы„-нитро-Ь-аргинина. В конце 2-х суток выделение воды в данной группе крыс не отличалось от контроля, но сохранялись повышенные показатели экскреции электролитов и креатинина; выведение N0 уменьшилось по сравнению с 1-м днем, превышая, однако, контрольные показатели. В дальнейшем, через 7 суток проявлялось выраженное антидиуре-тическое действие Ну-нитро-Ь-аргинина, связанное, по-видимому, с ингибированием ферментативного синтеза N0 в организме. Диурез через 7 суток введения блокатора ЫО-синтазы снизился в 1,8 раза, натрийурез — в 2 раза по сравнению с контролем, экскреция креатинина также была значимо сниженной. Выведение с мочой N0 под действием препарата также значимо уменьшилось (в 1,6 раза) по сравнению с контрольной группой.

При действии активатора синтеза оксида азота между экскрецией N0 и воды (г=0,49), электролитов (г=0,78-Ю,90), креатинина (г=0,85) выявлены значимые, достаточно сильные корреляции. При действии блокатора синтеза оксида азота сильные корреляции выявлялись между выведением N0 и экскрецией воды (г=0,79) и натрия (г=0,75). Активаторы и блокаторы синтеза N0 можно рассматривать в качестве факторов управления экскреторной функцией почек, что делает возможным их использование в медицинской практике в схемах коррекции заболеваний почек.

В работе проводился анализ эффективности растительных средств и фитосубстанций, полученных из растений семейства Ивовых, при токсической гентамициновой нефропатии по критерию Ж)-экскреторной активности для выявления их возможного нефропротекторного действия. У животных, одновременно получающих гентамицин и экстракт коры ивы остролистной

Таблица З

Действие активатора (Ь-аргинина, 100 мг/кг) и блокатора синтеза эндогенного оксида азота (Ы„-нитро-Ь-аргинина, 10 мг/кг) на экскреторную функцию почек крыс через 1,2 и 7 суток ежедневного введения препаратов (за 20 часов)

Дни Препарат п Диурез, мл Экскреция натрия, мкМоль Экскреция калия, мкМоль Экскреция креа-тинина, мг Экскреция оксида азота, мкг

1 день Контроль 10 1,89±0,36 155,48 [101,74+222,221 35,59 [29,43+66,52] 0,29±0,09 8,77±3,95

Ь-аргинин 10 1,40 ГО, 56+2,631 288,85 [133,33+346,671 * 47,28±24,86 0,19 [0,16+0,32] 16,38±5,37 *

Ы-нитро-Ь- аргинин 10 2,97 [2,08+3,681 * 243,55 [219,27+288,191 * 43,75 [32,22+55,79] 0,26 [0,23+0,33] 24,10± 6,93 *

2 день Контроль 10 1,92±0,94 162,33±6,58 63,44±3,36 0,29±0,04 9,76 [8,40+10,10]

Ь-аргинин 10 3,27±0,79 427,61±110,48* 227,47 [101,02+267,001 * 0,95±0,28 * 65,50±27,49 *

№нитро-Ь- аргинин 10 2,04±0,32 212,29 Г189,60+224,601 * 144,80±24,95 * 0,48 [0,41+0,56] * 15,28±3,44 *

7 день Контроль 10 1,85±0,38 160,70±8,41 63,68±7,076 0,29±0,044 9,70±2,15

Ь-аргинин 10 3,01±0,31 * 455,20±118,39 * 240,85 Г107,99+284,091 * 1,01±0,3 * 67,95±28,48 *

Ы-нитро-Ь- аргинин 10 1,03±0,31 * 80,28 [75,16+83,48]* 64,28± 11,49 0,22 [0,19+0,26] * 6,06±1,39 *

* - достоверность опытных показателей по сравнению с контрольными по критерию Манна-Уитни р<0,05

сухой в дозе 50 мг/кг, наблюдалось увеличение диуреза на 6-е сутки, снижение (на 2-3-и сутки) и увеличение (на 7-е сутки) натрийуреза, дополнительное ослабление калийуреза на 2-3-и сутки, снижение выведения мочевины на 5-е сутки, повышение экскреции креатинина на 7-й день; протеинурия не менялась (по сравнению с контрольной группой животных, получающих только гентамицин). Выведение N0 значимо снижалось на 3-и сутки, в остальные дни достоверно не отличалось от контроля. Таким образом, экстракт коры ивы остролистной сухой в дозе 50 мг/кг не обладает защитным нефропротек-торным действием. Экскреторная функция под действием этого препарата изменяется разнонаправлено; при этом экскреция воды, электролитов, креатинина и мочевины изменяется в отдельные дни неоднозначно. Препарат не изменяет такой показатель нефротоксичности, как протеинурию. При этом выведение N0 значимо не меняется под действием препарата, а на 3-и сутки достоверно снижается по сравнению с контролем, что сопровождается значительными нарушениями ионовыделительной функции почек.

В исследованиях было выявлено, что вещество тремулоидин, выделенное из сырья осины, обладает нефропротекторным действием при токсической ОПН. Со 2-х суток моделированной нефропатии тремулоидин увеличивает диурез, экскрецию натрия, калия (на 2-е и 5-7-е сутки); с 3-х суток стимулирует выведение креатинина и мочевины; с 5-х суток - уменьшает протеинурию у опытных крыс. Под влиянием тремулоидина с 3-х суток значительно возрастает выведение с мочой N0. Тремулоидин, равнонаправленно увеличивая выведение почками воды, электролитов, креатинина, действует как диуретик. Блокируя канальцевый транспорт натрия и воды, увеличивая клубочковую фильтрацию, тремулоидин дополнительно к эффекту гентами-цина усиливает экскреторную функцию почек. Высокий уровень креатини-нуреза, экскреции мочевины и ослабление лротеинурии уже на 5-й день эксперимента под действием препарата свидетельствует о сохранности клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции.

Было обнаружено, что салицин, выделенный из ивы остролистной, не только не обладает нефропротекторным действием, но и усиливает нефро-токсическое действие гентамицина, особенно сильно на 2-е сутки, существенно снижая диурез, элекгролитвыделительную функцию почек. Изолированно снижая диурез на 3-и сутки, салицин при этом не вызывал значимого ухудшения других показателей почечных функций в этот период, что могло быть связано с однократным повышением Ж)-экскреторной активности препарата в этот период. На 5-е сутки параллельно со снижением выведения N0 у опытных крыс наблюдалось ухудшение экскреции креатинина, мочевины, нарастание протеинурии. К заключительному дню эксперимента салицин вызывал значимое ограничение выведения воды, дополнительные потери белка с мочой, существенно не меняя выведение N0. Таким образом, салицин не только не предотвращает развитие гентамициновой нефропатии, но даже утяжеляет поражение почек.

Результаты исследования влияния выделенных в чистом виде из растительного сырья ивы остролистной флавоноидов — прунина (в дозах 5 и 10

мг/кг) и цинарозида (в дозах 1 и 5 мг/кг) - на экскреторную функцию почек крыс в острых опытах следующие. При введении в вену прунина в дозе 5 мг/кг к концу 30-й мин отмечалось увеличение диуреза в 1,6 раза по сравнению с исходными показателями. При этом показатели минутной экскреции натрия увеличились в 1,8 раза, калия — в 2 раза. Минутная экскреция креати-нина значительно возросла по сравнению с контролем в несколько раз, отражая существенное увеличение скорости клубочковой фильтрации. Значительное различие диапазонов изменений минутной экскреции креатинина и экскреции воды и электролитов свидетельствует, в свою очередь, о дополнительном включении механизмов модуляции канальцевого транспорта ионов и реабсорбции воды. К концу 60-й мин диурез несколько снижался по сравнению с 30-й мин эксперимента, но превышал исходный уровень в 1,2 раза. Экскреция калия оставалась повышенной в 1,8 раза по сравнению с контролем.

При введении прунина в дозе 10 мг/кг диуретический и салуретический эффект был отсроченным, но более выраженным. К 60-й мин эксперимента минутный диурез превысил контрольный уровень в 1,8 раза, экскреция натрия - в 4,2 раза, калия - в 3,8 раза, экскреция креатинина возросла значительно. Различные диапазоны изменений экскреции воды, электролитов и креатинина под действием прунина в дозе 10 мг/кг свидетельствовали о сочетанном влиянии препарата, как на клубочковую фильтрацию, так и на канальцевый транспорт ионов и воды.

Под действием цинарозида в дозе 1 мг/кг значимых изменений экскреторной функции зафиксировано не было. Введение в вену цинарозида в дозе 5 мг/кг приводило к увеличению диуреза на 30-й мин эксперимента в 2,1 раза по сравнению с контролем. При этом минутная экскреция натрия возрастала в 1,7 раза, калия - в 5 раз. Отмечалось значимое (в 3 раза) увеличение минутной экскреции креатинина. К 60-й мин диурез превышал исходные показатели в 1,9 раза, параметры минутной экскреции натрия и калия тоже были выше контрольных в 1,5 и 4 раза, соответственно, экскреция креатинина осталась выше контроля в 1,9 раза.

Результатом внутривенного введения крысам донатора N0 перлингани-та (0,15 мг/кг) спустя 30 и 60 минут стал рост показателей диуреза на 50-40% по сравнению с контролем. При этом показатели натрийуреза на 30-й и 60-й мин были выше исходных на 37-40%, клиренса креатинина - на 36-21%. Экскреция калия выросла более значительно - в 1,94 и 2 раза, соответственно, на 30-й и 60-й мин. Концентрационный индекс креатинина снизился после ин-фузии перлинганита на 8-12 % по сравнению с контролем, отражая снижение обратного всасывания воды в почечных канальцах. К концу 60-й мин было отмечено увеличение экскретируемой фракции натрия, свидетельствующее о снижении канальцевой реабсорбции иона. Таким образом, введение донатора N0 сопровождается ростом показателей диуреза, повышением экскреции креатинина, салуретическим эффектом, в основе которых лежат механизмы сочетанного влияния на клубочковую фильтрацию и канальцевый транспорт ионов.

Для детализации механизма канальцевого эффекта препаратов прунина и цинарозида, как наиболее эффективной точки приложения действия веществ, а также выяснения участия N0 в прямом эффекте на биомембраны, нами было поставлено несколько серий модельных опытов на биологических мембранах с использованием активатора и блокатора синтеза N0.

В модельных опытах на отрезках тонкой кишки крыс (рис. 1) под действием прунина в первые 3 часа эксперимента регистрировалось достоверное снижение транспорта натрия от мукозной поверхности кишки к серозной - в 1,4 раза по сравнению с контролем. За 4-й час перенос натрия практически не изменился. Таким образом, прунин тормозит ионный транспорт натрия через биологические мембраны. При введении в инкубационные среды цинарозида отмечалось достоверно снижение транспорта натрия на 2-м часу - в 1,2 раза по сравнению с контролем, на 3-м часу перенос натрия не отличался от контрольных величин, а на 4-м часу ионный транспорт даже был выше контроля в 1,2 раза. Таким образом, эффект снижения проницаемости биологических мембран для натрия под действием цинарозида был менее существенным и нестойким, сменяясь затем повышением переноса ионов натрия через мембраны.

Рис. 1. Влияние прунина (1 мМоль/л), цинарозида (1 мМоль/л), 1--аргинина гидрохлорида (1 мМоль/л) и Ну-нитро-Ь-аргинина (1 мМоль/л) на транспорт натрия от мукозной поверхности к серозной оболочке стенки тонкой кишки.

При введении Ь-аргинина (рис. 1) было установлено достоверное снижение переноса натрия от мукозной поверхности кишки к серозной: в первые 2 часа - в 1,4 раза по сравнению с контролем, на 3-м часу - менее значительное, а на 4-м часу транспорт натрия практически не отличался от контроля, что свидетельствовало о стабилизирующем влиянии Ь-аргинина на проницаемость мембран для натрия, проявляющемся, однако, в ограниченном временном диапазоне. При исследовании влияния >4„-нитро-Ь-аргинина было выявлено снижение транспорта натрия от мукозной поверхности кишки к серозной в 1-й час эксперимента в 1,6 раза по сравнению с контролем, связанное, возможно, с введением в инкубационные среды экзогенных нитрогрупп препарата и стабилизацией биомембран для натрия. На 2-м часу перенос натрия практически не отличался от контроля. На 3-м и 4-м часу было зафиксировано усиление переноса натрия с внутренней поверхности кишки к наруж-

ной: в 1,2 раза по сравнению с контролем - за 3-й час и в 1,5 раза - за 4-й час, связанное, по-видимому, с торможением ферментативного клеточного высвобождения эндогенного N0 и повышением проницаемости биологических мембран для ионов натрия.

Зафиксированное угнетение транспорта натрия в почечных канальцах (в острых экспериментах с прунином, цинарозидом и донатором N0), а также в модельных опытах на отрезках тонкой кишки могло быть результатом изменения как клеточного (трансмембранного), так и парацеллюлярного переноса иона. Возможность регуляции переноса натрия по межклеточным промежуткам анализировалась на отрезках тонкой кишки крыс с использованием маркера межклеточного транспорта - флуоресцирующего вещества уранина (флуоресцеина динатриевая соль). При инкубации с прунином и цинарозидом наблюдалась тенденция к снижению показателей транспорта уранина в экспериментах по сравнению с контролем, но изменения не носили характера значимых. При инкубации с Ь-аргинином наблюдалось некоторое снижение транспорта уранина: в 1,3 раза по сравнению с контролем - за 2-й час и в 1,4 раза - за 3-й час, на 4-м часу эксперимента изменение транспорта значимо не отличалось от контроля. Видимо, Ь-аргинин может влиять и на парацеллю-лярный транспорт ионов, кратковременно стабилизируя проницаемость межклеточных соединений. При введении Ы„-нитро-Ь-аргинина транспортные процессы практически не отличались от контроля.

Влияние препаратов на клеточный (трансмембранный) транспорт ионов оценивалось с использованием флуоресцентного зонда АНС в опытах на эритроцитах, в которых перенос маркера возможен только через цитоплазматическую мембрану. Добавление в инкубационную среду с АНС прунина (рис. 2) вызывало выраженное снижение адсорбции флуоресцентного зонда на поверхности эритроцитов: за 1-ю мин эксперимента концентрация зонда снизилась на 20%, что достоверно было меньше степени снижения в контроле. Кроме того, прунин замедлял и перенос флуоресцентного зонда через мембрану внутрь эритроцитов, о чем свидетельствовала последующая динамика концентрации АНС. Цинарозид, добавленный в инкубационную среду,

Рис. 2. Влияние прунина (1 мМоль/л), цинарозида (1 мМоль/л), 1.-аргинииа гидрохлорида (1 мМоль/л) и Кичаитро-Ь-аргинина (1 мМоль/л) на динамику поглощения флуоресцентного зонда АНС эритроцитами крыс.

также препятствовал адсорбции флуоресцентного зонда на поверхности эритроцитов: за 1-ю мин концентрация зонда снизилась на 33% - меньше величины снижения в контроле. Замедлялся и перенос АНС через мембрану внутрь эритроцитов, о чем свидетельствовала динамика поглощения зонда эритроцитами в течение часа.

Ь-аргинин существенно препятствовал адсорбции флуоресцентного зонда на поверхности эритроцитов (рис. 2): за 1-ю мин концентрация АНС снизилась на 47%, что было достоверно меньше величины снижения в контроле. Кроме того, замедлялся и перенос зонда через мембрану внутрь эритроцитов, о чем свидетельствовала динамика поглощения АНС эритроцитами в течение часа. При добавлении в инкубационную среду Ыж-нитро-Ь-аргинина за 1-ю мин концентрация зонда снизилась на 42% — еще меньше величины снижения, вызванного Ь-аргинином, и достоверно меньше степени снижения в контроле. Из этого следует, что Ну-нитро-Ь-аргинин оказывает выраженное тормозящее влияние на адсорбцию АНС на поверхности эритроцитов, что, возможно, могло быть связано с поступлением в инкубационные среды экзогенных нитрогрупп. Кроме того, Н*-нитро-Ь-аргинин более существенно, чем Ь-аргинин, замедлял и перенос флуоресцентного зонда через мембрану внутрь эритроцитов, это было видно из последующей динамики поглощения АНС эритроцитами.

ВЫВОДЫ

1. В опытах на крысах вьивлено, что в действии ряда растительных средств, полученных из растений семейства Ивовых, а также синтетических веществ на экскреторную функцию почек в физиологических условиях и при гентамициновой нефропатии принимает участие N0, установлена его роль в регуляции клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции.

2. В физиологических условиях содержание N0 в моче крыс составляет Ме = 7,5 [3,94+10,1] мкг/4 часа. При гентамициновой нефропатии выведение почками N0 возрастает в 2-3 раза. Почечная экскреция N0 наиболее тесно сопряжена с натрийурезом.

3. В хронических экспериментах установлено, что отвары коры и почек осины, экстракт коры ивы (40 мг/кг) существенно увеличивают почечную экскрецию воды, натрия, калия, креатинина и N0. Экстракт коры осины, настои сбора Нефрофит-К и листьев осины проявляют умеренную диуретическую и >Ю-экскреторную активность. Экстракт коры тополя оказывает слабое действие на выделительную функцию. При действии большинства растительных средств, полученных из растений семейства Ивовых, а также фуро-семида обнаружены тесные корреляционные связи между выведением воды, натрия, калия, креатинина, с одной стороны, и N0, с другой. Диуретический эффект гипотиазида не коррелирует с ИО-урезом.

4. Анализ эффективности фитосубстанций растений семейства Ивовых при токсической гентамициновой нефропатии с учетом критерия N0-выделительной активности показал, что нефропротекгорное действие связано прямо пропорционально с количеством экскретируемого с мочой N0: наибольший эффект - у тремулоидина (действующее вещество осины), слабее

действует сухой экстракт коры ивы остролистной, а салицин, выделенный из сырья ивы остролистной, значительно снижающий экскрецию N0, усиливает нефротоксичность гентамицина.

5. При действии активатора синтеза N0 Ь-аргинина резко увеличивается почечная экскреция воды, натрия, калия, креатинина, одновременно значительно возрастает выведение с мочой N0; при этом выявлены сильные корреляционные связи меязду выделением воды, электролитов, креатинина и N0. Блокатор синтеза N0 Н^-нитро-Ь-аргишш оказывает угнетающее действие на экскреторную функцию почек, под его влиянием сильные корреляции обнаружены между диурезом, натрийурезом и ЫО-урезом.

6. В острых опытах на крысах установлено, что флавоноиды прунин (5 и 10 мг/кг), цинарозид (5 мг/кг), выделенные из ивы остролистной, стимулируют выделительную функцию почек; аналогичный эффект оказывает донатор N0 перлинганит (0,15 мг/кг). В основе механизмов диуретической и на-трийуретической реакции лежит увеличение клубочковой фильтрации и угнетение канальцевой реабсорбции.

7. В модельных опытах на отрезках тонкой кишки крыс прунин вызывает угнетение транспорта натрия от слизистой оболочки к серозной; аналогичный эффект оказывает активатор синтеза N0 Ь-аргинин; блокатор синтеза N0 Ну-нитро-Ь-аргинин увеличивает перенос натрия через стенку кишечника; цинарозид действует неоднозначно. Прунин, цинарозид, активатор и блокатор синтеза N0 практически не влияют на межклеточный транспорт ура-нина.

8. В модельных опытах на эритроцитах крыс прунин, Ь-аргинин, Ну-нитро-Ь-аргинин препятствуют адсорбции флуоресцентного зонда АНС на поверхности эритроцитов и замедляют перенос через мембрану внутрь клеток; действие цинарозида выражено слабее.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Активаторы и блокаторы синтеза оксида азота могут рассматриваться в качестве факторов управления экскреторной функцией почек, что делает возможным их использование в медицинской практике в схемах коррекции заболеваний почек.

2. Перспективным представляется дальнейший поиск препаратов с диуретическими и нефропротективными свойствами среди растительных средств и индивидуальных БАС, выделенных из растений семейства Ивовых, а также среди синтетических лекарственных средств с учетом критерия N0-экскреторной активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние фуросемида на экскрецию оксида азота с мочой // Сборник тезисов докладов 72-й Итоговой конференции СНО. - Самара, 2004. - С. 148149 (соавтор Кучер Д.А.).

2. Влияние фуросемида и гипотиазида на экскрецию оксида азота с мочой // Сборник тезисов докладов 74-й Итоговой конференции СНО «Человек и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты российской науки». — Самара, 2006. - С. 236-237 (соавторы Анисимова М.М., Демина Н.С.).

3. Оксид азота и экскреторная функция почек при различных экспериментальных условиях // Сборник тезисов докладов I Всероссийской (75-й Итоговой) студенческой научной конференции «Студенческая наука и медицина XXI века; традиции, инновации и приоритеты». - Самара, 2007. - С. 244-245.

4. Роль оксида азота в нефропротекторном действии фитопрепаратов и синтетических средств при острой почечной недостаточности // Сборник материалов II Всероссийской (76-й Итоговой) студенческой научной конференции «Студенческая наука и медицина XXI века; традиции, инновации и приоритеты», посвященная 85-летию Студенческого Научного Общества Сам-ГМУ. - Самара, ОФОРТ, 2008. - С. 189.

5. Оксид азота и экскреторная функция почек в физиологических условиях и при моделировании острой почечной недостаточности // XV Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля 2008 г.: сборник материалов Конгресса. - Москва, 2008 - С. 619 (соавтор Дубищев A.B.).

6. Оксид азота как фактор реализации нефропротекторного действия препаратов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2008. - Специальный выпуск «XIII конгресс «Экология и здоровье человека», Т. 2. № 1. - С. 212-217 (соавторы Дубищев A.B., Куркин В.А.).

7. Участие оксида азота в механизмах фармакологической коррекции функции почек при экспериментальной нефропатии // Фармация и общественное здоровье: материалы ежегодной конференции. — Екатеринбург, 17 февраля 2009 г. — С. 162-163 (соавтор Дубищев A.B.).

8. Нитроксидэргические механизмы фармакологической коррекции функции почек при экспериментальной почечной недостаточности // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - Т. 4, № 2. - С. 196-199 (соавторы Дубищев А.В., Панина М.И.).

9. Анализ эффективности фитопрепаратов при острой почечной недостаточности по критерию NO-экскреторной активности // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск, 2009. — Вып. 64. - С. 483-485 (соавторы Дубищев A.B., Куркин В.А.).

10. Поиск фитопрепаратов с нефропротекторными свойствами по критерию NO-экскреторной активности II Аспирантские чтения - 2009: труды региональной конференции «Молодые ученые - медицине». - Самара, 2009. - С. 306-310.

11. Активаторы и блокаторы синтеза оксида азота как факторы управления экскреторной функцией почек // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы VIII Международной конференции, 2-3 апреля 2010 г., Минск. - Минск: «Издательский центр БГУ», 2010. - Ч. 1. -

С. 145-146 (соавтор Дубищев A.B.).

12. Влияние препаратов L-аргинина на экскреторную функцию почек // Материалы 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010 г. -Москва: «Фолиум», 2010. - С. 71 (соавтор Дубищев A.B.).

13. Влияние донатора оксида азота на ионорегулирующую функцию почек // Аспирантский вестник Поволжья. - 2010. - № 3-4. - С. 223-228.

14. Почечные эффекты перлинганита как донатора оксида азота // Актуальные вопросы медицинской реабилитации, восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии: матер, научно-практ. конф., посвящ. 25-летию каф. восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии института последипломного образования Самарского государственного медицинского университета. - Самара, 2010. - С. 242-243 (соавторы Дубищев А.В., Панина М.И.).

15. Диуретическая активность препаратов и биологически активных соединений, полученных из фитосырья ивы остролистной // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы IX Международной конференции, 1-2 апреля 2011 г., Минск. - Минск: «Издательский центр БГУ»,2011.- С. 378-381 (соавторы Дубищев A.B., Куркин В.А.).

16. К механизму влияния фитопрепаратов ивы остролистной на клубочковоканальцевый аппарат почек // Аспирантский вестник Поволжья. - 2011. -№ 1-2.-С. 204-209.

17. Модельные исследования роли оксвда азота в канальцевых эффектах фитодиуретиков // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13, № 1 (8). — С. 2026-2030 (соавторы Дубищев A.B., Панина М.И., Браславский В.Б.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

N0 - оксид азота (валентность II)

АНС — 1-анилино-8-нафталин-сульфонат

БАС - биологически активные соединения

ОПН - острая почечная недостаточность

Подписано в печать: 19.01.2012 г. Формат: 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем: 1,5 уел. печ. л. Тираж: 150 экз. Заказ №301.

Отпечатано в типографии ООО «Сатур» 443016, г. Самара, ул. Ново-Вокзальная, 161а