Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние фолликулярного микроокружения на жизнеспособность гранулезных клеток при некоторых формах эндокринного бесплодия

На правах рукописи

ПОЖИЛЕНКОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ГРАНУЛЁЗНЫХ КЛЕТОК ПРИ НЕКОТОРЫХ ФОРМАХ ЭНДОКРИННОГО БЕСПЛОДИЯ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2008

003457894

Работа выполнена в ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.-Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ, г. Красноярск

Научные руководители:

доктор медицинских наук Екимова Марина Викторовна

доктор медицинских наук,

профессор Салмина Алла Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Семинский Игорь Жанович

доктор медицинских наук,

профессор Сутурина Лариса Викторовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет министерства здравоохранения и социального развития РФ», г.Томск

Защита состоится «22» декабря 2008 г. В 12 часов на заседании диссертационного совета Д.001.038.02 при ГУ «Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук»

Автореферат разослан «21» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вспомогательные репродуктивные технологии, возникшие 20 лет назад на стыке двух наук - медицины и биологии, отчасти позволили решить проблему бесплодия человека. Однако она по-прежнему остается актуальной в связи с высокой частотой потери беременностей в стимулированных лечебных циклах при эндокринном бесплодии.

Ключевым патогенетическим механизмом гиперпролактинемии и гипе-рандрогении является измененный гормональный статус женщины, что оказывает непосредственное воздействие на дифференцировку, пролиферацию и гибель клеток фолликула и эндометрия.

В ходе фолликулогенеза ооцит развивается в условиях локального микроокружения. В составе фолликулярной жидкости идентифицировано большое количество гуморальных факторов (цитокины, факторы роста, гормоны), осуществляющих паракринную регуляцию. По мере развития фолликула, созревание ооцита поддерживается активностью стероидогенеза в гранулёзных клетках, а прогрессивное снижение уровня эстрогенов ведет к атрезии фолликула. Атретические изменения, начавшиеся в клетках гранулёзы, затрагивают ооцит, что приводит к нарушению процесса оплодотворения яйцеклеток и /или предимплантационного развития эмбриона [A. Peter et al., 2003, А. Mikkelsen et al., 2005].

Одним из современных подходов к пониманию патогенеза различных заболеваний является изучение процессов регуляции клеточной гибели (апоп-тоза), составляющей важный компонент эмбриогенеза. Гормоны и факторы роста (ФР) регулируют экспрессию генов, кодирующих белки с проапопто-тическими и антиапоптотическими свойствами. Повышенная или пониженная концентрация тех или иных гормонов и ФР может служить причиной появления признаков апоптоза в гранулёзных клетках, и вызывать атрезию фолликула, либо инициировать апоптоз ооцита напрямую.

По некоторым данным атрезия доминантного фолликула тесно ассоциирована с апоптозом гранулёзных клеток посредством системы взаимодействий

Л

(

FasR/FasL. Начальным этапом в этом процессе является активация FasR гранулёзных клеток. Считается, что взаимодействие между ооцитом, на мембране которых находится FasL, и гранулёзными клетками обеспечивает апоптоз последних и, следовательно, приводит к атрезии фолликула [J.K. Pru et al., 2002, Q. Chen et al., 2005, G. Onalan et al„ 2005].

В настоящее время остается практически не изученной роль периферических бензодиазепиновых рецепторов (ПБР) в регуляции функциональной активности клеток репродуктивной системы. Вместе с тем, интенсивный сте-роидогенез, протекающий в этих клетках, подразумевает существенный вклад ПБР в регуляцию физиологических и патологических процессов в репродуктивной системе [V. Papadopoulos et al., 1998, М. Castedo et al., 2002].

В связи с вышеизложенным, существует необходимость комплексного изучения взаимосвязи интенсивности апоптоза и экспрессии ПБР в гранулёзных клетках человеческих фолликулов в условиях нормального и патологического стероидогенеза. Это позволит получить сведения и представления, определяющие новые подходы к решению проблемы диагностики и лечения репродуктивных расстройств.

Все вышеизложенное и определило основную цель работы, заключающуюся в изучении особенностей гуморального микроокружения, экспрессии ПБР и реализации программы апоптоза гранулёзных клеток антральных фолликулов у женщин с гиперпролактинемией и гиперандрогенией.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Исследовать уровень андрогенов, эстрогенов, ЭФР, ИФР-1, оФРФ и СЭФР в сыворотке крови и фолликулярной жидкости при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролактинемии и гиперандрогении.

2. Оценить уровень апоптоза гранулёзных клеток фолликулов, растворимых медиаторов апоптоза в фолликулярной жидкости при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролактинемии и гиперандрогении.

3. Изучить уровень экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов при трубно-перитонеальной форме бесплодия (контроль), гиперпролак-тинемии и гиперандрогении.

4. Оценить вклад изменений паракринной регуляции апоптоза и экспрессии ПБР в патогенез нарушений развития фолликула при гиперпролак-тинемии и гиперандрогении.

Научная новизна

В работе впервые описаны новые механизмы регуляции стероидогенеза и выживаемости гранулёзных клеток in vivo в норме, при гиперпролакгинемии и гиперандрогении, ассоциированные с изменением локализации ПБР и развитием процессов апоптоза при фолликулогенезе.

Разработана оригинальная методика получения суспензии гранулёзных клеток из кумулюсного слоя фолликулов.

Впервые особенности экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов идентифицированы в качестве маркера стероидогенной активности, определяющей характер патофизиологических изменений при эндокринном бесплодии у женщин.

Впервые описаны физиологические эффекты ФР в фолликулярной жидкости, заключающиеся в инициации и регуляции прогрессии апоптотической гибели гранулёзных клеток: увеличение концентрации митогенных и про-апоптотических факторов и снижение концентрации факторов выживаемости.

Идентифицированы патогенетически обоснованные критерии прогноза апоптоза в гранулёзных клетках: соотношение ИФР-1/ЭФР, изменение концентрации оФРФ и СЭФР в фолликулярной жидкости, локализация ПБР в гранулёзных клетках.

Впервые показана патогенетическая роль изменения локализации ПБР в развитии апоптоза, установлено, что ПБР могут являться маркерами стероидной активности гранулёзных клеток фолликула.

Разработана гипотетическая причинно-следственная взаимосвязь влияния уровня стероидных гормонов, соотношения проапоптотических факторов

(вРавК/вРазЬ), митогенных факторов (ЭФР, оФРФ) и факторов выживаемости и их соотношений (ИФР-1, СЭФР, ИФР-1/ЭФР, Еа также экспрессии и особенностей локализации ПБР на жизнеспособность клеток фолликула яичников.

Обосновано, что регистрация апоптоза гранулёзных клеток по окрашиванию клеток РГГС-меченным Аппехт V и ПЙ может быть использована в качестве маркера жизнеспособности клеток гранулёзы.

Теоретическая и практическая значимость работы состоит в том, что обнаруженные закономерности дизрегуляции инициации и прогрессии апоптоза и редислокации ПБР в гранулёзных клетках позволят разработать новые диагностические методы определения жизнеспособности ооцита, определяющие эффективность лечебного цикла ЭКО при эвдокринопатиях.

Исследование экспрессии ПБР в гранулёзных клетках может применяться для оценки пролиферативной активности и эффективности стероидогенеза в гранулёзных клетках фолликула.

Полученные результаты могут быть применены в клинической медицине, патологической физиологии, клеточной и молекулярной биологии.

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, в диагностическую деятельность РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска, в учебный процесс кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры патологической физиологии, кафедры лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ, а также кафедры фундаментальных основ клинической медицины ГОУ ВПО СибГМУ МЗ и СР РФ. Основные положения, выносимые на защиту 1. Одним из важных звеньев патогенеза бесплодия при гиперпролакгинемии и гиперандрогении является измененный состав фолликулярного микроокружения с доминированием митогенных (ЭФР, оФРФ) и проапоптотиче-ских факторов (вРаэНАРазЬ);

2. Информативным методом в оценке жизнеспособности гранулёзных клеток кумулюса фолликулов яичников женщин, стимулированных в программе ЭКО, является экспресс-диагностика флуоресцирующего комплекса Аппехт V с фосфатидилсерином клеточной мембраны.

3. Ообенности экспрессии ПБР в гранулёзных клетках фолликулов соответствуют характеру изменения стероидогенной активности. ПБР экспресси-руются в гранулёзных клетках антральных фолликулов с преимущественной диффузной локализацией в цитоплазме. Развитие эндокринопатии сопровождается изменением субклеточной локализации ПБР: при гиперпро-лактинемии выявлена преимущественно перинуклеарная локализация; при гиперандрогении - гранулярная локализация.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены:

- на расширенном заседании НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ (Красноярск, 2002 - 2008);

на заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ и СР РФ (Красноярск, 2008);

на второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и при патологии, посвященная 80-летию со дня рождения профессора Михаила Григорьевича Колпакова (Новосибирск, 2002);

- на заседании НИИ педиатрии в лаборатории мембранологии ГУ Научный центр здоровья детей РАМН (Москва, 2003);

- на X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме (Якутск, 2003);

на XIX европейском симпозиуме по репродукции и эмбриологии человека (Мадрид: Испания, 2003);

- на XI международном симпозиуме российско-японского медицинского обмена (Ниигата: Япония, 2004).

ô

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных'работ: из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, - 3, в тезисах докладов на съездах и конференциях всероссийского и международного уровней - 3.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, Быводов, списка литературы (26 отечественных и 149 иностранных источников). Текст диссертации иллюстрирован 7 таблицами, 67 рисунками в виде фотографий, диаграмм и концептуальных схем.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач обследовано 127 пациенток с диагнозом «Бесплодие», находившихся на лечении в Красноярском Центре репродуктивной медицины (директор - к.б.н. А.В.Светлаков). В работе с больными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki (1964, 2000 ред.). Исследования были выполнены в фолликулярной жидкости (п=64) и на гранулёзных клетках (п=45) доминантных фолликулов стимулированных яичников, пунктированных у пациенток с бесплодием в лечебных циклах ЭКО.

Возраст пациенток варьировал от 20 до 44 лет и в среднем составил 32,7+ 1,5года. Длительность предшествующего бесплодия у обследованных супружеских пар составила 3 - 18 лет и в среднем - 7,6±1,5года. У половых партнеров пациенток была подтверждена нормоспермия при двухкратном исследовании эякулята.

С целью выявления причин бесплодия пациентки были обследованы согласно стандартному комплексному лабораторному протоколу, включающему общеклиническое и ультразвуковое исследование, гормональные методы

функциональной диагностики, посткоитальный тест и лапароскопическое обследование.

В соответствии с задачами исследования пациентки с изолированными формами эндокринного бесплодия были разделены на 2 группы в зависимости от формы заболевания: с функциональной гиперпролактинемией (п=23); с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза (п=15). Контрольную группу составили женщины с трубно-перитонеальной формой бесплодия (п=26). По длительности бесплодия группы были сопоставимы между собой.

Клеточно-билогические методы исследования

При стимуляции овуляции в лечебных циклах ЭКО пунктировали фолликулы яичников. Из кумушоса полученных ооцитов получали суспензию гранулёзных клеток. Кумулюс обрабатывали гиалуронидазой (80 IU на мл, 1 мин.) фирмы «Caltag» (Германия), ресуспензировали с целью получения однородной суспензии клеток. Затем отмывали дважды фосфатным буфером (PBS, рН 7.4) «ICN» (США), центрифугировали (5 мин., 3000 об/мин.). Жизнеспособность клеток гранулёзы определяли при помощи теста с витальным красителем (трипановым синим). Равные объёмы (по 5 мкл) суспензии гранулёзных клеток и 0.1 % раствора трипанового-синего смешивали и помещали каплю в камеру Горяева. Микроскопировали с помощью микроскопа «Биомед 1»; увеличение хЗОО.

Оценка апоптоза гранулёзных клеток методом TUNEL выполнялась на препаратах клеточной суспензии гранулёзных клеток согласно протоколу фирмы-производителя набором Apoptosis Mebstain Detection kit «Immunotech» (Франция), регистрировались клетки с участками специфической межнуклеосомной фрагментации ДНК.

Детекция апоптоза гранулёзных клеток методом Annexin V проводилась на препаратах клеточной суспензии гранулёзных клеток согласно протоколу фирмы-производителя набором Annexin V Apoptosis Detection Kit «Caltag» (Германия). Кроме выявления 4 популяций клеток (живые, собственно некротические, апоптотические и клетки во вторичном некрозе), в качестве дополнительных параметров использовали расчетные показатели: «общий нек-

роз» (суммирование вторичного и собственно некроза) и «общая клеточная смерть» (суммирование апоптоза и общего некроза).

Иммуноцитохимические методы исследования Определение экспрессии ПБР проводили на препаратах клеточной суспензии гранулёзных клеток согласно стандартному протоколу метода иммуноцито-химии с использованием антител к ПБР, любезно предоставленных профессором V. Papadopoulos (George Town University, USA). В качестве вторичных

антител использована система детекции Super Stain System (HRP) - DAB

j

«IDLabs Inc» (Канада).

Радиоиммунологические и иммуноферментные методы исследования

Проведение гормональных исследований осуществлялось в ООО «РЛДЦ ИХМИ» (директор - к.б.н. А.В.Светлаков) во вторую фазу (20 - 22 дни) менструального цикла. Забор крови для экспериментальной и контрольной группы проводили из локтевой вены, натощак, с 8 до 9 часов утра в соответствии с общепринятыми требованиями. В качестве материала для гормональных исследований использовали сыворотку крови.

Забор фолликулярной жидкости у женщин экспериментальных и контрольной групп осуществляли непосредственно во время пункции доминантных фолликулов (диаметр 18-28 мм) стимулированных яичников в лечебных циклах ЭКО.

Определение концентраций тестостерона (Т), прогестерона (Прог) и эстра-диола (Е2) проводилось с использованием РИА - наборов производства «CIS BIO International» (Франция). Определение содержания андростендиона (Ан) и ИФР-1 производили наборами «DSL» (США). Для определения содержания ЭФР, СЭФР, оФРФ применяли наборы реагентов фирмы «R&D» (Великобритания), определение растворимых форм FasL (sFasL) и FasR (sFasR) осуществляли наборами фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).

Исследования проводили радиоиммунологическим (РИА) и иммунофер-ментным (ИФА) методами с использованием стандартных наборов реактивов, согласно приложенным к ним инструкциям. Концентрацию гормонов Т,

Е2, Прог выражали в нмоль/л, Ан - нг/мл, sFasL, sFasR, СЭФР, ИФР-1, ЭФР, оФРФ - в пкг/мл.

Статистический аиализ

Статистический анализ полученных результатов включал методы статистического описания и проверки статистических гипотез. В пределах каждой выборки определяли среднее значение, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Исследуемые группы сравнивали с контролем, количество выражали в %. Результаты эксперимента оценивали при помощи критериев для оценки в малых выборках: Н-критерий Крускала-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни для непараметрических показателей, коэффициента ранговой корреляции Спирмена. При условии соответствия нормальному закону распределения оценку достоверности различий осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента. Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакетов прикладных программ STATISTICA v. 6.0 («StatSoft» Russia, 1999). Расчеты проведены в Институте вычислительного моделирования СО РАН (г.Красноярск) в отделе моделирования неравновесных систем (зав.отд. д.ф.-м.н. М.Г. Садовский).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование состава фолликулярного микроокружения.

Секреция стероидных гормонов гранулёзными клетками доминантных фолликулов

Хорошо известно, что ФР играют важную роль в росте и развитии доминантного фолликула. Представители семейств ФР обладают широкими метаболическими эффектами и влияют на различные фазы клеточного цикла. Наиболее значимыми факторами роста в фолликулогенезе являются ЭФР и оФРФ, о которых известно, что их содержание повышено в атретических фолликулах.

Нами были зарегистрированы изменения уровней половых гормонов в периферической крови, подтверждающие характер эндокринной патологии (табл. 1). Было показано, что как при гиперпролактинемии (ГП), так и при гиперандрогении (ГА) содержание ЭФР и оФРФ в фолликулярной жидкости

повышалось, в то время как уровень факторов выживаемости снижался по сравнению с контролем по всем изучаемым критериям (табл. 2), что может свидетельствовать о наличии процессов атрезии в фолликулах. К факторам выживаемости фолликулов были отнесены СЭФР и Ег, а также соотношения ИФР-1/ЭФР и Е2/Т.

Таблица I.

Содержание гормонов в сыворотке крови пациенток с эндокринным бесплодием перед проведением лечебных циклов ЭКО (М±о)

Показатель Контроль (п=26) ГП ' (п=23) ГА (п=23)

1 2 3 4

Пролактин, мМЕ/мл 305,1 ± 18,9 747,3 ± 1,1* 332,8 ± 33,8

Эстрадиол, нмоль/л 163,0 ± 17,9 145,1 ± 24,5 91,7 ± 18,5*

Тестостерон, нмоль/л 1,3 ±0,1 1,4 ±0,2 2,3 ±0,3*

Андростендион, нг/мл 2,4 ±0,1 9,3 ±0,5" 8,3 ±0,4 **

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем: *Р<0,05; **Р<0,02

Поскольку известно, что фолликулярное микроокружение определяет особенности реализации гибели гранулёзных клеток в антральных фолликулах, было закономерным исследовать некоторые маркеры апоптоза в фолликулярной жидкости и гранулёзных клетках при ГП и ГА.

Медиатором апоптоза соматических клеток фолликулов является система FasR. Мы обнаружили повышение соотношения растворимых форм FasR/FasL, что может свидетельствовать о наличии свободных форм FasR в фолликулярной жидкости, который, как известно, может появляться при массовой гибели клеток или указывать на высокую активность внеклеточных протеаз, отщепляющих этот рецептор с поверхности клеток.

Таблица 2.

Содержание гормонов и факторов роста в фолликулярной жидкости доминантных фолликулов стимулированных яичников пациенток с эндокринным бесплодием в лечебных циклах ЭКО (М±в)

* Показатель » ■ Контроль (п=26) ГП (п=23) ГА (п=23)

1 2 3 4

СЭФР, пкг/мл 141,1 ± 126,8 854,8 ± 8,9* 628,8 +91,7*

ИФР-1, пкг/мл 138,5+5,5 181,5 ±9,1* 129,4 ±7,4

ЭФР, пкг/мл 1,5 + 0,3 3,6 ±0,9* 2,5 ±0,8

оФРФ, пкг/мл 5,2 + 0,8 14,3 ± 1,6* 8,2 ±0,7*

Эстрадиол, нмоль/л 3636 ±45,1 3532 ± 64,7 3465 ±58,5*

Тестостерон, нмоль/л 12,3+1,3 17,3 ± 3,7 14,4 ±2,8

Прогестерон, нмоль/л 848,6 ±30,1 882,4 ±35,6 782,3 ±36,1

ИФР1/ЭФР 92 ± 3,5 50,2 ±4,8* 51,6 ±6,5 *

е2/г 295,6 ±7,5 204,1 ± 8,8* 240,6 ±6,2*

sFasL, пкг/мл 0,07±0,01 0,07 ±0,01 0,05 ± 0,01

sFasR, пкг/мл 20,4 + 0,7 27,9 ±2,1* 27,4 ± 1,5*

Пролактин, мЕд/Мл 521± 50,3 441,8 ±47,7 509,8 ±51,4

Андростендион, нг/мл 14,1 ±0,49 14,9 ±0,5 14,9 ±0,41

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем: * - Р<0,05.

Таким образом, в данном разделе работы нами выявлены закономерные изменения состава фолликулярного микроокружения, характерные для каждой формы эндокринного бесплодия. Далее прямыми методами мы оценивали состояние популяции гранулёзных клеток.

Апоптоз гранулёзных клеток доминантных фолликулов Известно, что экспрессия фосфатидилсерина на внешней стороне плазматической мембраны характеризует степень выраженности апоптоза [Billig, Н., 1993, Clavero, А, 2003]. Мы обнаружили, что в контрольной группе и в экспериментальной группе с ГП в популяции нежизнеспособных клеток доминировали клетки в состоянии апоптоза. Тогда как при ГА в популяции не-

жизнеспособных клеток равновесие было сдвинуто в сторону клеток в состоянии некроза (табл. 3). ,

Таблица 3.

Распределение гранулёзных клеток доминантных фолликулов

при окрашивании Annexin V и ПЙ (М±о), _в % от общего количества клеток_

живые Annexin-/ ПЙ", % апоптоз Annexin+, % вторичный некроз Annexin+/ ПЙ,% апоптоз и вторичный некроз, % некроз ПЙ, %

1 2 3 4 5 6

Контроль (п=20) 64,00± 12,48 14,70+ 8,87 10,15+ 4,63 24,85+ 11,08 11,15+ 4,44

ГП (п=16) 68,38± 11,95 16,81+ 9,45 6,38+ 3,81** 23,19± 9,93 8,44± 7,42

ГА (п=7) 71,00± 4,24 5,43+ 2,30** 7,57± 2,76 13+ 3,27** 16,00+ 5,00*

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем: **Р<0,02.

Считается, что гормональная стимуляция овуляции в программе ЭКО может приводить к сохранению жизнеспособности фолликулов с уже начавшейся атрезией [Wood, J. R., 2002]. На конечных этапах атрезии фолликула в гранулёзных клетках, погибших путем апоптоза, выражены явления вторичного некроза. Вторичный некроз развивается в клетках, не способных по каким-либо причинам корректно завершить программу апоптоза [Новиков, B.C., 1996, Прусакова, О. В., 2005]. Обнаружено, что в экспериментальных группах соотношение апоптоз/вторичный некроз было достоверно (р < 0.001) изменено относительно контроля: увеличено при ГП и снижено при ГА (табл. 4).

Таблица 4.

Соотношение апоптоз/вторичный некроз в гранулёзных клетках фолликулов женщин с ГП, ГА и контрольной группы (М±с)

\ апоптоз/вторичный некроз

1 2

Контроль, (п=20) 1,68 +1,40

ГП, (п=16) 3,94 ±3,65***

ГА, (п=7) 0,81 ±0,81***

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем: ***Р<0,001.

Нами обнаружено, что гранулёзные клетки вступают в программу апоптоза асинхронно и этот феномен особенно выражен в клетках с измененным гормональным статусом. При регистрации апоптоза методом Annexin-детекции большая часть соматических клеток в исследуемых фолликулах имела высокий индекс жизнеспособности, а внутрипопуляционные сдвиги были отмечены только в группе ГА. В то же время при регистрации клеточной гибели гранулёзных клеток методом TUNEL мы зарегистрировали достоверно большее количество апоптотических клеток, как при ГП, так и при ГА (табл.

Таблица 5.

оотношение Annexin+ и TUNEL+ гранулёзных клеток (М±о)

К, (п=7) ГП, (п=7) ГА, (п=7)

1 2 3 4

Annexin+ 14,70 ± 8,87 16,81 ±9,45 5,43 ±2,30

TUNEL+ 79,71 ± 12,42**** 50,86 ±35,12**** 54,00 ± 35,43**

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем и внутри группы, соответственно: *Р<0,05; **Р<0,02; #Р<0,05; ##Р<0,02.

В нашей работе показано, что в популяции нежизнеспособных гранулёзных клеток, в пределах каждой группы, преобладали процессы апоптоза (рис. 1). Достоверно высокий уровень апоптотических клеток как в состоянии начальных этапов (Annexin+) так и клеток, находящихся на стадии терминального апоптоза (TUNEL"1"), был отмечен в контрольной группе (рис. 2).

Рис. 1. Гранулёзные клетки при окрашивании Аппехт+/ПИ, а - апоптотиче-ские клетки; б - первично-некротические клетки; в - вторично-некротические клетки. Люминесцентная микроскопия, увеличение х900

При ГП мы обнаружили достоверное снижение количества клеток со вторичным некрозом относительно контроля, на основании чего можно сделать вывод о том, что реализация процессов апоптоза нарушена. В популяции гранулёзных клеток при ГА преобладали клетки, находящиеся в состоянии некроза, что может говорить о необратимой гибели клеток и, следовательно, свидетельствовать о более выраженной степени нарушений стероидогенеза в этой экспериментальной группе.

Рис. 2. Гранулёзные клетки при окрашивании FITC-УТФЛТЙ. 1) TUNEL+ гранулёзные клетки; 2) а - ИТС-УТФ-меченные фрагменты ДНК видны как зеленые гранулы (показано стрелками); б - TUNEL" гранулёзные клетки. Люминесцентная микроскопия, увеличение х900

Таким образом, в данном разделе нашей работы показано, что в популяции гранулёзных клеток при ГП, несмотря на высокую пролиферативную активность, инициация процесса апоптоза не нарушена, но заторможена его прогрессия. Тогда как, в популяции гранулёзных клеток при ГА заторможены инициация и прогрессия апоптоза, снижены процессы пролиферации и апоптоза, преобладают процессы некроза. Обнаруженные нами факты являются характерными для необратимой гибели клеток и, следовательно, могут свидетельствовать о более выраженной степени нарушений стероидогенеза в этой экспериментальной группе.

Экспрессия ПБР в гранулёзных клетках доминантных фолликулов при гипернролактинемии и гиперандрогении

Мы продемонстрировали, что ПБР экспрессируются в гранулёзных клетках антральных фолликулов, при этом в контрольной группе основную долю популяции составили стероид-продуцирующие клетки с преимущественно диффузной локализацией ПБР в цитоплазме (рис. 3). При проведении расчетов типа локализации ПБР количество ПБР-иммунопозитивного материала принималось за 100%.

пшлипттгвргпа

Рис. 3. Соотношение ПБР7ПБР+ и распределение типа локализации иммуно-позитивного материала в популяции гранулёзных клеток в контрольной группе

При ГП нами выявлено снижение общего количества стероидпродуци-рующих клеток с 74% до 47%, а также увеличение числа ПБР-позитивных клеток с преимущественной перинуклеарной локализацией с 32% до 51%. Данный факт, согласно литературным данным [Tomer, Н., 2004]. свидетельствует о редислокации митохондрий в приядерную область и говорит об определенной степени сохранности стероидогенеза в гранулёзных клетках при данной патологии (рис. 4).

пикнотиче-----

ядро; 8%

Рис. 4. Соотношение ПБР /ПБР+ и распределение типа локализации иммуно-позитивного материала в популяции гранулёзных клеток в группе ГП

При ГА количество ПБР-позитивных клеток было сравнимо с контролем, однако мы обнаружили преимущественно гранулярную локализацию ПБР-иммунопозитивного материала, что в 10 раз выше, чем в контроле (рис. 5). Данные результаты могут свидетельствовать о неэффективности стероидоге-неза, вследствие нарушения целостности цитоскелета клетки, что сопровождается перераспределением митохондрий с образованием кластеров.

пикнотиче

Рис.5. Соотношение ПБР7ПБР+ и распределение типа локализации иммуно-позитивного материала в популяции гранулёзных клеток в группе ГА

Таким образом, обнаруженные изменения в локализации ПБР могут служить маркерами пролиферативной и стероидогенной активности гранулёзных клеток, стимулированных локально продуцируемыми и действующими паракринно гормонами и ФР. На основании вышеизложенного нами разработаны патогенетические схемы дизрегуляции стероидогенеза и апоптоза при ГП и ГА, представленные на рис. 6 и рис. 7.

ядро; 1%

диффузная локализация;

29%

гранулярная локализация; 50%

перинуклеарная локализация;

21%

Рис. 6. Гипотетическая схема дизрегуляции стероидогенеза и апоптоза при гиперпролактинемии

Рис. 7. Гипотетическая, схема дизрегуляции стероидогенеза и апоптоза при гиперандрогении

ВЫВОДЫ

1. Состояния гиперпролактинемии и гиперандрогении характеризуются измененным соотношением содержания стероидных гормонов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости (отношение Е2/Т снижено на 12,5% и 7,7% в экспериментальных группах соответственно).

2. Фолликулярное микроокружение при гиперпролактинемии и гиперандрогении характеризуется измененным составом фолликулярного микроокружения с доминированием митогенных регуляторных сигналов, что определяет особенности реализации гибели гранулёзных клеток в антраль-ных фолликулах. Достоверно повышена в 2 раза концентрация ЭФР при гиперпролактинемии и 1,6 раза при гиперандрогении; достоверно повышена в 2,3 раза концентрация оФРФ при гиперпролактинемии, в 1,5 раза - при гиперандрогении.

3. Снижение количества гранулёзных клеток с признаками вторичного некроза на 37% по сравнению с контролем при гиперпролактинемии ассоциировано с эффективной реализацией программы апоптоза на начальных этапах. Преобладание патологической гибели клеток (некроза) гранулёзных клеток на 43% по сравнению с контролем при гиперандрогении препятствует реализации программы апоптоза.

4. ПБР экспрессируются в гранулёзных клетках антральных фолликулов, с преимущественной диффузной локализацией в цитоплазме (в 64 % клеток). Развитие гиперпролактинемии и гиперандрогении сопровождается изменением локализации ПБР в гранулёзных клетках.

5. Увеличение количества ПБР-иммунопозитивных гранулёзных клеток с перинуклеарной локализацией ПБР (в 1,5 раза) свидетельствует о сохранении темпов стероидогенеза, что отражается на реализации процессов апоптоза и пролиферативной активности гранулёзных клеток в пределах нормы (контроля). Увеличение (в 10 раз) количества ПБР-иммунопозитивных гранулёзных клеток с гранулярной цитоплазматической локализацией ПБР свидетельствует о выраженных нарушениях стероидоге-

неза, что сопровождается снижением процессов пролиферации на фоне развития некроза гранулёзных клеток.

Практические рекомендации

Регистрация апоптоза гранулёзных клеток по окрашиванию клеток БШИ-меченным Аппехт V и ПЙ может быть использована в качестве маркера жизнеспособности клеток гранулёзы.

Исследование экспрессии ПБР в гранулёзных клетках может применяться для оценки пролиферативной активности и эффективности стероидо-генеза в гранулёзных клетках фолликула при дифференциальной диагностике эндокринного бесплодия и при оценке фолликулярного микроокружения у женщин, проходящих лечебные циклы в протоколе ЭКО.

Полученные результаты могут быть применены в эндокринной гинекологии, патологической физиологии, клеточной и молекулярной биологии, клинической лабораторной диагностике.

Результаты исследования рекомендуется внедрять в учебные процессы кафедр фундаментальных основ клинической медицины, лабораторной диагностики, нормальной физиологии, патологической физиологии, акушерства и гинекологии ВУЗов РФ и в работу отделений гинекологической эндокринологии и репродукции медицинских учреждений.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Салмина А.Б. Влияние гуморальных изменений при некоторых формах эндокринного бесплодия женщин на апоптоз гранулёзных клеток, полученных в программе ЭКО / А.Б. Салмина, М.В. Яманова, А.В. Светлаков, Е.А. Пожиленкова и др. // Тез. докл. П научной конф. с междунар. уч. "Эндокрин. регул, физиологич. функций в норме и при патологии, посвящ. 80-летию со дня рожд. проф. М.Г. Колпакова. «Новосибирск - 2002». - Новосибирск, 2002. - С. 38.

2. Яманова М.В. Фолликулярное микроокружение ооцитов при эндокринном бесплодии / М.В. Яманова, А.В. Светлаков, Е.А. Пожиленкова и др. // Пробл. репрод. - 2004. - № 4. - С. 46.-50.

3. Яманова М.В. Апоптоз клеток гранулёзы и показатели фергилизации ооцитов у женщин с эндокринным бесплодием и эндометриозом в программе ЭКО / М.В. Яманова, А.Б. Салмина, Е.А. Пожиленкова и др. // Пробл. репрод. - № 5. - 2004. - С. 31-36.

4. Пожиленкова Е.А. Нарушения фолликулогенеза ассоциированы с изменением экспрессии периферических бензодиазепиновых рецепторов в гранулёзных клетках / Е.А.Пожиленкова, А.Б.Салмина, М.В.Яманова // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2008. - Т. 145, № 1. -С. 35-38.

5. Salmina А. В. Lack of correlation between granulosa cells apoptosis and oocyte quality / A. B. Salmina, A. V. Svetlakov, E. A. Pozhilenkova et at al. // Hum. Reprod. - 2003. -V. 18, Sup. 1 - P. xviii22.

6. Pozhilenkova E.A. Apoptosis and expression of peripheral benzodiazepin receptors in granulosa cells obteind from wimen under going IVF / E.A. Pozhilenkova, S.V. Mikhutkina, T.G. Ruksha et at al. // Abstr. 11th Intern. Simp. Depen. Japan-Russia med. exch. - Niigata (Japan). - 2004. - P. 397.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГОУ ВПО - государственное образовательное учреждение высшего профес-

сионального образования; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФР - инсулиноподобный фактор роста;

МЗ и СР РФ - министерство здравоохранения и социального развития российской федерации; оФРФ - фактор роста фибробластов основной;

ПЙ - припидия йодид;

РЛДЦ ИХМИ - региональный лабораторно - диагностический центр иммуно-

химических методов исследования; СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста;

УТФ - уридинтрифосфат;

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение;

ЭФР - эпидермальный фактор роста;

Annexin - аннексии;

FasL - Fas-лиганд;

FasR - Fas-рецептор;

FITC (ФИТЦ) - fluorescein isothiocyanate (флюоресцеинизотиоционат);

PBS - phosphate buffered saline (фосфатный буфер);

TdT - Terminal Dezoxynucleotidyl Transferase (терминальная трансфе-

раза);

TUNEL - TdT-mediated dUPT nick end labeling (метод регистрации апоп-

тоза, основанный на детекции фрагментов ДНК).