Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Исследование функциональной компетентности ооцитов при нормальном и патологическом фолликулогенезе

На правах рукописи

ТЕПЛЯШИНА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ КОМПЕТЕНТНОСТИ ООЦИТОВ ПРИ НОРМАЛЬНОМ И ПАТОЛОГИЧЕСКОМ ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗЕ

14.03.03 — патологическая физиология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК - 2014

I и МАР 2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Красноярск) ■

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Екимова Марина Викторовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, доцент

ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра акушерства и гинекологии

педиатрического факультета, доцент Якимова Анна Валентиновна

доктор биологических наук,

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН», заведующий лабораторией

молекулярной биологии клетки Усынин Иван Федорович

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Томск)

Защита состоится «22» апреля 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 Тел/факс 8(383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦКЭМ СО РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета

д. б. н.

Пальчикова Н.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Исследование молекулярно-биологических маркеров развития фолликулов в процессе фолликулогенеза - одно из наиболее перспективных и социально значимых направлений репродуктивной биологии. В настоящее время актуальность изучения проблемы оогенеза и фолликулогенеза обусловлена высоким процентом бесплодных браков, связанных с проблемами в репродуктивной сфере.

Согласно данным ВОЗ, рождаемость в России не достигает уровня, необходимого для простого воспроизводства населения [Т.Г. Сухих, Т.А. Назаренко, 2010]. Весомый вклад в демографическую проблему вносят бесплодные браки.

Эндокринное бесплодие у женщин является важнейшей составляющей многофакторной структуры бесплодного брака, где на первый план выступают овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза (ОГНГ) и функциональная гиперпролактинемия (ФГП). В основе патогенеза указанных форм эндокринного бесплодия лежит функционирование репродуктивной системы в условиях измененного гормонального статуса, что приводит к последовательному нарушению стероидо- и фолликулогенеза, овуляции и оплодотворения [В.И. Кулаков, Б.В. Леонов, 2010].

Известен ряд патофизиологических механизмов, приводящих к функциональной неполноценности женских гамет. К ним следует отнести нарушенный ангногенез, дизрегуляцию эффектов стероидных гормонов, активацию апоптоза клеток гранулезы фолликулов, изменение соотношений про- и антиапоптотиче-ских фа.--лоров и накопление цитокинов в составе фолликулярной жидкости [М.В. Яманова, А.Б. Салмина, 2009].

В связи с этим является актуальным изучение условий протекания гормонально-зависимого этапа формирования пула антральных фолликулов, регуляции их роста и селекции доминантного фолликула, а также идентификация факторов ФЖ, под влиянием которых развивающиеся ооциты при ОГНГ и ФГП становятся неполноценными.

Цель исследования состоит в исследовании функциональной компетентное™ ооцитов при некоторых вариантах эндокринного бесплодия человека и эффективности стимуляции овуляции в программах экстракорпорального оплодотворения.

Задачи исследования:

1. Исследовать уровень маркеров функциональной компетентности ооцитов (эстрадиола (Е2), тестотерона (Т), индекса эстрадиол/тестостерон (Е2/Т), Fas^nraHfl/Fas-peuenTop (sFasL/sFasR), основной фактор роста фибробластов (оФРФ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), эпидермальный фактор роста (ЭФР), индекс инсулиноподобный фактор роста-1/эпидермальный фактор роста (ИФР-1/ЭФР), трансформирующий фактор роста-131 (ТФР-Й1) в фоллику-

лярной жидкости в динамике созревания фолликулов при овариальной гипе-рандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.

2. Изучить влияние эндотелина-1 и сосудисто-эидотелиапьного фактора роста (СЭФР) в фолликулярной жидкости на развитие фолликулов при исследуемых вариантах эндокринного бесплодия.

3. Определить роль пролиферации, ангиогенеза и апоптоза в процессе созревания пула малых антральных фолликулов, их роста и селекции доминантного фолликула при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.

4. Оценить характер взаимосвязи маркеров физиологических механизмов и развития фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии.

5. Выявить маркеры фолликудогенеза, прогнозирующие исход лечебных циклов ЭКО при рассматриваемых вариантах эндокринного бесплодия.

Научная новизна

1. Выявлено патологическое изменение фолликулярного микроокружения при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии (снижение Е2/Т и накопление тестостерона) начиная с IV стадии гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза.

2. Установлено, что увеличение секреции яРачЯ в фолликулярной жидкости при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии является косвенным свидетельством готовности гранулезных клеток развивающихся фолликулов к реализации программы апоптоза или отражает запуск механизма апоптоза гранулезных клеток.

3. Обнаружено, что снижение содержания основных маркеров пролиферации (ИФР-1, ЭФР) в развивающемся доминантном фолликуле может свидетельствовать о нарушенной пролиферации гранулезных клеток при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии, начиная со стадии раннего преовуляторного фолликула.

4. Показано, что сниженная секреция основных маркеров неоангиогене-за (СЭФР, оФРФ) в растущем фолликуле позволяет судить о недостаточном кровоснабжении доминантного фолликула как одном из механизмов развития преждевременной атрезии фолликула и/или созревания ооцита со сниженным фертилизационным потенциалом. Секреция СЭФР в растущем фолликуле при изученных вариантах эндокринного бесплодия зависит от стероидного микроокружения ооцитов.

Теоретическая значимость работы

Полученные данные о характере и выраженности патологических изменений развивающихся фолликулов при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии могут быть использованы в курсах обучения физиологии и эндокринологии, при планировании экспериментальных протоколов направленных на изучение молекулярных механиз-

мов нарушения репродуктивной функции, ассоциированных с дизрегуляцией фолликулогенеза.

Практическая значимость работы

Выявленные закономерности развития фолликулов в зависимости от гуморального микроокружения целесообразно учитывать при оценке репродуктивного статуса пациенток с эндокринопатиями, а также при определении индивидуальных схем лечения в циклах вспомогательных репродуктивных технологий.

Настоящая работа представляет практический интерес в связи с выяснением прогностической роли ряда маркеров, которые могут быть использованы для оценки исходов лечебных циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемией.

Положения, выносимые на защиту

1. При нормальном фолликулогенезе молекулами, маркирующими эффективность фолликулогенеза, оплодотворения и имплантацию эмбриона, являются эстрогены, оФРФ и ЭФР; при функциональной гиперпролактинемии -тестостерон, ТФР-Р1, эндотелин-1; при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза - оФРФ, ТФР-Р1, эндотелин-1. Сниженная секреция основных маркеров неоангиогенеза в растущем фолликуле может приводит к недостаточному кровоснабжению доминантного фолликула. Имеется отрицательная корреляция между концентрацией оФРФ и степенью зрелости фолликула для пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза (г=-0,93; р=0,001).

2. Особенностью развивающихся ооцитов у пациенток с исследуемыми вариантами эндокринного бесплодия является снижение их пролиферативной активности, регистрируемой по подавлению секреции полипептидных факторов и интенсификации апоптоза вследствие дизрегуляции зРавК/вРазЬ взаимодействий на фоне нарушенного синтеза стероидных гормонов, что в результате приводит к снижению эффективности оплодотворения и имплантации эмбриона.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в научно-исследовательский процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, в диагностическую деятельность РЛДЦ ИХМИ г. Красноярска, в учебный процесс кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры патологической физиологии им. В.В. Иванова, кафедры клинико-лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования представлены и обсуждены: на V Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Москва, 2011 год); на V Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011 год); на III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011 год), на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 год); на заседаниях НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск, 2009-2011 гг.); на заседании проблемной комиссии «Фундаментальная медицина» (выписка из протокола №3 от 22 декабря 2009 года).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ: из них 5 -в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, 9 - в тезисах докладов на конгрессе и конференциях всероссийского и международного уровней, издано методическое пособие «Диагностика нарушения стероидогене-за в клетках кумулюса фолликулов яичников у женщин с эндокринным бесплодием в лечебных циклах ЭКО».

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 33 рисунками. Состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 173 источников (отечественных и иностранных).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект и методы экспериментальной части исследования. Для решения поставленных задач диссертационного исследования проанализированы образцы фолликулярной жидкости (ФЖ) (п=187) полостных фолликулов разной степени зрелости, полученных от пациенток с ОГНГ и ФГП, проходивших лечение в лечебных циклах ЭКО.

Выполнение работы одобрено локальным этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (выписка из протокола № 19 от 25 ноября 2009 года).

В исследовании соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki (1964,2000 ред.).

Образцы ФЖ были получены специалистами Красноярского Центра репродуктивной медицины (директор - к.б.н. А.В. Светлаков) и Центра гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца» (директор - С.А. Сыро-мятникова) от 140 пациенток с диагнозом «Бесплодие», находившихся там на лечении.

Возраст пациенток варьировал от 21 до 42 лет и в среднем составил 32,7 ± 1,5 года. Период предшествующего бесплодия у обследованных супружеских пар составила 3-18 лет и в среднем — 7,6 ±1,5 года. У половых партнеров пациенток была подтверждена нормоспермия при двухкратном исследовании эякулята.

С целью выявления причин бесплодия пациентки обследовались специалистами Центров репродуктивной медицины и «Три сердца» согласно стандартному комплексному клинико-лабораторному протоколу, включающему общеклиническое и ультразвуковое исследование, гормональные методы функциональной диагностики, посткоитальный тест и лапароскопическое обследование.

Образцы ФЖ от пациенток с изолированными формами эндокринного бесплодия были разделены на 2 группы в зависимости от варианта заболевания: образцы ФЖ от женщин с ФГП (п=62); образцы ФЖ от женщин с ОГНГ (п=65). Контрольную группу составили образцы ФЖ от женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия (ТПФ) (п=60). По длительности бесплодия группы были сопоставимы между собой.

Критериями для включения женщин в исследование явились: в контрольную группу - данные анамнеза, наличие двухфазного менструального цикла, отсутствие симптомов другой эндокринной патологии, инфекционной патологии и патологических изменений эндометрия; лапароскопиче-ски подтвержденный диагноз ТПФ;

в группу с ФГП - наличие нарушений менструального цикла, хроническая ановуляция, бесплодие, повышенный уровень пролактина (более 480 мМЕ/мл) в сыворотке крови при трехкратном исследовании, эутиреоз, отсутствие аденомы гипофиза при рентгенологическом исследовании гипофиза, отсутствие симптомов другой эндокринной патологии [Karaca Z., et al., 2010].

в группу с ОГНГ - наличие нарушений менструального цикла, хроническая ановуляция, бесплодие, гирсутизм, повышенные уровни яичниковых и/или надпочечниковых андрогенов в сыворотке крови, поликистозные яичники, данные гистологического исследования биоптатов ткани яичника [Franks S., 2008].

Стимуляцию овуляции во всех лечебных циклах ЭКО осуществляли по стандартному длинному или короткому протоколу с использованием препаратов агонистов ГнРГ (а-ГнРГ) (Декапептил-дейли) в сочетании с человеческим рекомбинантным гонадотропином (Пурегон). Схема стимуляции выбиралась в зависимости от возраста пациентки и состояния яичников.

Через 35-36 часов после введения овуляторной дозы ХГ (овитрель) производилась трансвагинальная пункция (ТВП) яичников в целях аспирации ооцитов. В качестве профилактики развития синдрома гиперстимуляции яичников пунктировали все фолликулы, содержащие антральную жидкость.

ТВП проводили в гинекологическом кресле под контролем ультразвуковой эхографии при разрешающей способности УЗИ-сканера > 1 мм. Для проведения трансвагинальной аспирации ооцитов непосредственно к датчику прикрепляли пункционный адаптер, что обеспечивает движение иглы строго по специальной пунктирной линии на экране монитора. После того как презерва-

тив, содержащий стерильный гель, надевали на датчик, и к нему фиксировали стерильную пункционную насадку, врач, манипулируя датчиком, обеспечивал получение оптимального эхографического изображения яичника.

После прокалывания стенки яичника и вхождения в полость фолликула включали вакуумотсос, и под давлением 130-140 мм водного столба ФЖ поступала в стерильные пробирки. Полученную ФЖ передавали эмбриологам для идентификации ооцитов, последующего их культивирования и оплодотворения.

После забора ооцитов, образцы ФЖ перемещали в стерильную пластиковую посуду и впоследствии использовали в эксперименте. Образцы анализировали по принципу: «одна пациентка - один доминантный фолликул» или «одна пациентка - 2-3 фолликула разной степени зрелости».

Объем полученной ФЖ варьировал от 10 - 15 мкл до 6 - 8 мл для фолликулов диаметром от 0,9 - 2 мм до 16 - 20 мм, соответственно.

Стадии развития фолликулов определяли в зависимости от их диаметра. Таким образом, в исследование включались фолликулы от стадии антральных до преовуляторных (IV -VIII классы) [A. Gougeon, 1996].

Внутригрупповые показатели сравнивали с таковыми в стадии антрально-го фолликула. Показатели исследуемых групп сравнивали с данными соответствующей стадии развития фолликула в контрольной группе (ТПФ).

Поскольку в естественных условиях ФЖ является средой для развития ооцита, формирует его микроокружение и является источником веществ, необходимых для его развития, исследование состава ФЖ позволяет судить о функциональной компетентности ооцитов.

Для выявления силы и характера взаимосвязей влияния гормонов и факторов роста на показатели эффективности программы ЭКО и ПЭ были использованы ранее полученные нашей исследовательской группой клинические данные [М.В. Яманова, А.Б. Салмина, 2009]: эффективность программ ВРТ оцениваюсь с использованием показателей - частота нормального оплодотворения (ЧНО), частота наступления имплантации (ЧНИ), число полученных эмбрионов (ЧПЭ), кумулятивный балл полученных эмбрионов (КБПЭ) в соответствии с классификацией Гарднера [Н.С. Щетинина и др., 2011].

Приборы и материалы

Для выполнения исследований применяли полуавтоматический иммуно-ферментный анализатор Zenith (RADIM, Италия) и автоматический иммунолю-минесцентный анализатор Immulate (DPC, США).

Исследование гормонов и факторов роста осуществлялось с использованием стандартных наборов реактивов, согласно приложенным к ним инструкциям: набор для определения тестостерона - «Immulate 1000 Total Testosterone (PILKTW-12)», набор для определения эстрадиола - «Immulate 1000 Estradiol (PILKE2-14)», набор для определения ИФР-1 - «Non-Extraction IGF-I ELISA DSL-10-2800», набор для определения эндотелина-1 - «Bl-20052 Endotelin (121)», набор для определения ЭФР - «Invitrogen Immunoassay Kit KHG0062», набор для определения СЭФР - «BMS277/2 human VEGF-A Platinum ELISA», набор для определения sFasR - «BMS245 human sAPO-l/Fas Platinum ELISA», на-

бор для определения sFasL - «BMS260/2 human sFas-L ELISA», набор для определения оФРФ - «Invitrogen ELISE Kit KHG0021», набор для определения ТФР-ßl - «BMS249/3 human TGF-ßl Platinum ELISA».

Концентрация гормонов Т, Е2, выражалась в нмоль/л, а концентрация sFasL, sFasR, СЭФР, ИФР-1, ЭФР, ТФР-ßl, эндотелина-1, оФРФ - в пкг/мл.

Расчетные коэффициенты

В качестве расчетных коэффициентов были проанализированы следующие соотношения маркеров функциональной компетентности ооцитов: Е2/Т, ИФР1/ЭФР в фолликулярной жидкости в динамике созревания фолликулов при эндокринном бесплодии, позволяющие оценить преобладание андрогенного или эстрогенного микроокружения ооцитов [J. Wu et all., 1998].

Лабораторные исследования фолликулярной жидкости проводились в ООО «РЛДЦ ИХМИ» (директор - к.б.н. A.B. Светлаков).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft, Russia). Описательные статистики для количественных признаков представлены средними значениями и стандартной ошибкой среднего (М±т). Для сравнения независимых рядов данных использовали критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Для парных сравнений зависимых рядов данных применяли критерий Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Для выявления взаимосвязей между признаками рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Взаимосвязь интегральных показателей исходов лечебных циклов ЭКО с факторами роста изучали с помощью линейно-регрессионного анализа. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равный 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Стерондогенез на разных этапах роста и созревания фолликулов при эндокринном бесплодии

Показателем созревания фолликула в цикле ВРТ служит уровень Е2 в крови. Большая часть Е2 синтезируется в гранулёзных клетках развивающегося фолликула [С.С.К. Йен, Р.Б. Джаффе, 1998]. На рис. 1 показана динамика Е2 в ФЖ в процессе фолликулогенеза в группах женщин с эндокринным бесплодием и ТПФ.

Концентрация Е2 в ФЖ контрольной группы пациенток постепенно увеличивалась с 950 пкг/мл до 1863 пкг/мл на разных этапах развития фолликулов, причем концентрация этого гормона на стадии преовуляторного фолликула (1620 мм) была достоверной (р < 0,05) по сравнению с показателями Е2 на стадии раннего антрального фолликула.

В группах пациенток с ОГНГ и ФГП уровень Е2 нарастал от стадии раннего антрального к овуляторной стадии, причем на заключительных этапах развития это увеличение было значимым (р < 0,05). В группе пациенток с ФГП выявлено повышение содержания Е2 на всех стадиях фолликулогенеза по сравнению с содержанием Е2 в аналогичных стадиях ТПФ.

Ранее было обнаружено преимущественное перинуклеарное распределение рецепторов при ФГП, прогностически наиболее благоприятное для исходов лечебных циклов ВРТ. Доминирующая перинуклеарная локализация ПБР, вероятно, свидетельствует о миграции ПБР-экспрессирующих митохондрий в ядерную область. Подобный тип распределения обеспечивает сохранность темпов стероидогенеза в гранулёзных клетках, и, тем самым, замедляет развитие апоптоза, способствуя сохранению жизнеспособности клеток даже при действии апоптогенных факторов [Е.А. Пожиленкова, 2009]. Данный факт подтверждается тем, что в группе пациенток с ФГП выявлено превышение содержания Е2 на всех стадиях фолликулогенеза по сравнению с уровнем Е2 в аналогичных стадиях пациенток с ТПФ.

4000 т

я

х 3500 -о.

3000 2500 -2000 1500 1000 500 0

£-.5

5 ч

КЗ X

е- *

Классы фолликулов, мм

Рис. 1. Концентрация эстрадиола в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ

Обозначения: здесь и на рис. 1 -4:

---функциональная гиперпролактинемия;------овариальная гиперанд-

рогения неопухолевого генеза; —— контрольная группа

Примечание: * -р< 0,05 внутри одной исследуемой группы;

# - р < 0,05 между аналогичными показателями контрольной группы и группы сравнения (непарный непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (и) с поправкой Бонферрони).

Для определения степени зрелости ооцита используют отношения Е2/Т и ИФР-1/ЭФР [I. е! а1., 1998]. Их изменение позволяет судить о развитии ооцитов в условиях андрогенного (понижение индексов), либо эстрогенного микроокружения (повышение индексов).

На рис. 2 показана динамика индекса Е2/Т в фолликулярной жидкости ан-тральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ. В группе пациенток с ТПФ наблюдалось постепенное увеличение данного индекса относительно стадии ан-трального фолликула, имеющего диаметр 0,9-2 мм, что, вероятно отражает активацию стероидогенеза по мере роста фолликулов.

Показано, что в фолликулярной жидкости пациенток с ОГНГ и ФГП наблюдалось снижение индекса Е2/Т в гормонально-зависимом этапе фолликуло-генеза по сравнению со значением индекса Е2/Т в контрольной группе.

Классы фолликулов, мм

Рис. 2. Отношение Е2/Т в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ

Вероятно, снижение индекса Е2/Т и накопление Т в образцах ФЖ пациенток с исследуемыми вариантами бесплодия, может свидетельствовать о развитии фолликулов в обеих группах в условиях андрогенного микроокружения, начиная с ранних стадий фолликулогенеза (IV класс).

Маркеры апоптоза в динамике роста фолликулов при эндокринном бесплодии

В мультиклеточных ансамблях регуляция апоптоза возможна за счет взаимодействия БразЯ и РэбЬ. В развивающемся фолликуле РаэЬ экспрессиру-

ется преимущественно на ооцитах. Система Ра5К/Аро-1/С095 выступает медиатором апоптоза соматических клеток фолликула.

Динамика секреции растворимого маркера апоптоза эРа^Я в группе пациенток с ТПФ значительно отличалась от двух групп сравнения (рис. 3). Отмечено 2 пика концентрации маркера - 17,7 пкг/мл (V класс) и 15,4 пкг/мл (VII класс), что соотносится во времени со стадией селекции доминантного фолликула и прсовуляторной стадии развития фолликула, соответственно.

В группе пациенток с ОГНГ показано достоверное увеличение (р < 0,05) эРазЯ, которое отмечалось на стадии предоминантного фолликула по сравнению с уровнем эРазЯ в стадии антрального фолликула. Отмечено сохранение первого пика маркера на стадии селекции доминантного фолликула. В группе пациенток с ФГП увеличение содержания зБазЯ отмечалось, начиная со стадии антрального и продолжалось до стадии предоминантного фолликула по сравнению с показателем яРазИ в аналогичных стадиях группы пациентов с ТПФ (р < 0,05).

Классы фолликулов, мм

Рис. 3. Концентрация вРаБЯ в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ

Следовательно, готовность фолликулов к реализации программы апоптоза обнаружена в группах пациенток с ОГНГ и ФГП, начиная с ранних этапов формирования полостного фолликула.

Вместе с тем, на развитие доминантного фолликула оказывает влияние не только равновесие про- и антиапоптотических факторов, но и факторов роста, отвечающих за циклическое формирование микроциркуляторного русла.

Маркеры ангиогенеза в динамике роста фолликулов при эндокринном бесплодии

Инициация формирования капиллярной сети в гранулезных и тека- клетках происходит под действием СЭФР, в то время как формирующаяся структурная и функциональная полноценность васкулярной системы требует скоординированного действия целого объединения факторов (СЭФР, оФРФ, эндоте-

лин-1), обеспечивающих формирование стабильного кровотока в сосудах репродуктивной системы женщины [R. Robinson, 2009].

На рис. 4 показана динамика ключевого ангиогенного маркера - СЭФР в ходе фолликулогенеза. В контроле секреция СЭФР повышалась в зависимости от стадии роста фолликула и достигала своего максимума на стадии доминантного фолликула, оставаясь на том же высоком уровне на стадии преовулятор-ного фолликула (р < 0,05).

В группе пациенток с ОГНГ подобная динамика роста секреции СЭФР сохранялась, но, начиная со стадии предоминантного фолликула, уровень СЭФР был достоверно (р < 0,05) снижен по сравнению с уровнем СЭФР в группе пациенток с ТПФ. В группе пациенток с ФГП уровень СЭФР был достоверно (р < 0,05) снижен по сравнению со значением данного показателя в контроле, начиная со стадии раннего антрального и заканчивая стадией преовуля-торного фолликула. Снижение секреции СЭФР в растущем фолликуле может свидетельствовать об отставании развития капиллярной сети сосудов и недостаточном кровоснабжении доминантного фолликула.

Классы фолликулов, мм

Рис. 4. Концентрация СЭФР в фолликулярной жидкости антральных фолликулов при ФГП, ОГНГ и ТПФ

Аномальная секреция ангиогенных факторов может быть причиной сосудистой дисфункции и, как следствие этого, развития нарушений функций яичников [Р. Lam, С. Haines, 2005].

Корреляционный анализ

Изучение силы и характера взаимосвязей между маркерами функциональной компетентности и степенью зрелости фолликулов позволили выявить ключевые молекулы-мишени патологического стероидогенеза а, соответственно, и значимые маркеры функциональной компетентности ооцитов.

В ходе исследования у пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия была выявлена сильная степень влияния ЭФР (г = -0,86; р = 0,01), оФРФ (г = -0,96; р = 0,001), эндотелина-1 (г = -0,76; р = 0,05), СЭФР (г = 0,89;

р = 0,007), ТФР-Р1 (г = 0,85; р = 0,007) и Ег (г = 0,75; р = 0,05) на рост и развитие фолликулов. Средняя степень влияния была выявлена для зРазИ. (г = -0,74; р = 0,05) и эБазЬ (г = -0,67; р = 0,01) (рис. 5).

Судя по полученным данным, для оценки физиологического фолликуло-генеза наиболее показательными являются маркеры пролиферации и ангиогене-за и, в несколько меньшей степени, апоптоза.

Идентичные зависимости между степенью зрелости фолликулов и факторами роста были обнаружены у пациенток с ОГНГ (ЭФР /г = -0,82; р = 0,014/, эндотелина-1 /г = -0,89; р = 0,007/, оФРФ /г = -0,93; р = 0,001/, ТФР-01 /г = -0,92; р = 0,03/), СЭФР /г = 0,96; р = 0,001/, Е2 (г = 0,72; р = 0,05) (рис. 6).

ЭФР г=-0,86; р=0,01

Эндотелин-1 / г=-0,76; р=0,05

оФРФ г=-0,96; р=0,001

\ ^ г=-0,67; р=0,001

зРазЯ г=-0,74; р=0,05

Рис. 5. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула в контрольной группе пациенток Обозначения на рис. 5-10:

-связь положительная;

------связь отрицательная.

ЭФР

/ г=-0,82; р=0,014

Эндотелин-1 г=-0,89; р=0,007

оФРФ г=-0,93; р=0,000

ТФР-Р1 г=-0,92; р=0,03

Рис. 6. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула у пациенток с ОГНГ

СЭФР

г=0,89; р=0,007

ТФР-Р1 Степень зрелости

г=0,85; р-0,007 фолликула

Е2

г=0,75; р=0,05

Обнаружен факт сильной положительной взаимосвязи развития фолликулов с динамикой ТФР-Р1 при трубно-перитонеальной форме бесплодия, тогда как в группе пациенток с ОГНГ выявлена инверсия данной взаимосвязи (рис. 5,6). У пациенток с ОГНГ установлены высокие значения маркеров апоптоза, не коррелирующие со стадиями развития фолликулов, что, вероятно, свидетельствует о дискоординации процессов апоптоза и пролиферации при данной форме эндокринного бесплодия.

При изучении силы и характера взаимосвязей между маркерами функциональной компетентности и степенью зрелости фолликулов у пациенток с ФГП была выявлена сильная степень влияния СЭФР (г = 0,92; р = 0,003) и Ег (г = 0,94; р = 0,003) на формирование фолликула в процессе фолликулогенеза (рис. 7).

Рис. 7. Корреляционные взаимосвязи стероидных гормонов и факторов роста со степенью зрелости фолликула у пациенток с ФГП

Выявлена более сильная связь Ег с динамикой роста фолликулов, чем в группах с трубно-перитонеальнон формой бесплодия и ОГНГ. Это может рассматриваться как механизм адаптации в условиях ФГП, поскольку хорошо известна ключевая роль Ег как антиапоптотического фактора, с одной стороны, и как пускового агента для запуска неоангиогенеза - с другой [G. Erickson, S. Shimasaki, 2001].

Дискоординация процессов пролиферации, ангиогенеза и апоптоза, определяющих рост и созревание фолликулов, характеризует патологический фол-ликулогенез при эндокринном бесплодии. Определены значимые маркеры функциональной компетентности ооцитов.

Выявление силы и направленности корреляционных взаимосвязей со стадиями роста и развития фолликулов позволяет заключить, что патологический фолликулогенез при эндокринном бесплодии, вероятно, является следствием существующей дизрегуляции взаимосвязанных процессов пролиферации, ангиогенеза и апоптоза.

Корреляционно-регрессионный анализ

Качественный состав фолликулярной жидкости определяет качество ооцита и, в какой-то мере, исход программ ВРТ [A.A. Ильина и др. 2008].

Полученные корреляционные взаимосвязи позволяют выявить и проанализировать закономерности взаимосвязи показателей, а также прийти к пониманию, какие биологические механизмы опосредуют возникновение математических зависимостей.

В контрольной группе факторами, определяющими ЧНО и ЧПЭ, являются уровни Е2 и ЭФР (рис. 8).

При анализе ключевых факторов, влияющих на эффективность ВРТ при ФГП, выявлены их отличия от аналогичных показателей контрольной группы. Так, обнаружено, что ЧНО зависит от уровней тестостерона и ИФР-1 (рис. 9), а ЧНИ - от эндотелина-1 и ТФР-01. В то время как, при ОГНГ эффективность ВРТ зависит от оФРФ, ТФР-р1, эндотелина-1 (рис. 10).

Рис. 8. Корреляционные взаимосвязи эстрадиола, ЭФР с показателями эффективности ВРТ у пациенток с контрольной группой

Рис. 9. Корреляционные взаимосвязи тестостерона, ИФР-1 с показателем эффективности ВРТ у пациенток с функциональной гиперпролактинемией

11=0.56: р=0,05

11=0.82; р=0.05

Рис. 10. Корреляционные взаимосвязи оФРФ, ТФР-р I, эндотелина-1 с показателями эффективности ЭКО у пациенток с овариальной гиперандрогенией неопухолевого генеза

Частота нормального оплодотворения, %

120

100 ф ♦ ♦ ♦

60 40 20 0

■û поле корреляции Линейная

регрессионная модель

= -0,0121х+93,755

1000 2000 3000

4000 5000 6000 7000 8«Ю Е,, Эстрадиол, нмоль/мл

Рис. И. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной регрессией парной связи «частота нормального оплодотворения - эстрадиол» в контроле

Проведенная статистическая обработка данных доказывает снижение ЧНО при ФГП вследствие воздействия тестостерона и выявляет нарастание показателя при увеличении уровня ИФР-1. Частота нормального оплодотвореппа %

160 140 ■ 120

¡00 : . , „Я- "''

ВО 60 40 20 О

H

# поле корреляции Линейная

регрессионная модель у = 0,4973s+20,134

150

200 250

ИФР-1, пкг/мл

Рис. 12. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной регрессией парной связи «частота нормального оплодотворения - ИФР-1» в группе пациенток с ФГП

Такие факторы роста как, оФРФ и эндотелии-1 принимают активное участие в трансформации эндометрия в процессе подготовки его к имплантации бластоцисты, сопровождающейся изменением проницаемости сосудистого русла [С.Е. Василевская и др., 2008]. В литературе имеются данные, оценивающие способность эндотелина-1 отвечать за регуляцию роста, созревания и деградацию эндотелиоцитов [J. Bruno et al., 2009].

Выявленное в данной работе сильное влияние эндотелина-1 на ЧНИ при ФГП (у=-0,55х + 10,19) представляется отличным от показателей контрольной группы, и вероятно, может являться доказательством изменения неоангиогенеза при ФГП, как одного из ключевых событий, влияющих на наступление имплантации.

Фактором, влияние которого на наступление имплантации оценивалось как сильное, стал ТФР-(31, определяющий распознавание имплантирующейся бластоцисты материнским организмом.

При исследовании взаимодействий, характерных для ОГНГ, интересным фактом стало выявление статистически значимой линейной зависимости критерия КБПЭ, характеризующего качество полученных эмбрионов, от оФРФ и ТФР-(31 (рис. 13,14).

Являясь ангиогенным белком, оФРФ известен также как митоген, способный накапливаться в экстрацеллюлярном матриксе и инициировать процессы ремоделирования, запуская, таким образом, неоангиогенез [J. Bruno et al., 2009]. Указанные процессы могут иметь чрезвычайно важную роль и в ходе раннего эмбриогенеза человека.

Полученные данные о тесноте линейной (корреляционной) связи между парой признаков «кумулятивный балл полученных эмбрионов - ТФР-|31» подтверждают опубликованные ранее результаты о росте секреции ТФР-(31 в раннем эмбриогенезе у млекопитающих.

Данный фактор роста, выступая регулятором клеточной пролиферации и дифференцировки, способствует формированию бластоцисты [М.М. Левиа-швили и др., 2011], а впоследствии влияет на процессы адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта [С. Tanone et al. 2008].

Кумулятивный балл полученньк мбрпонов

4 поле корреляции Лшкйная

ретркгаеннаа модель у = 0,2502.4+17,729

100 120 оФРФ, пкг/мл

140

Рис. 13. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной регрессией парной связи «кумулятивный балл полученных эмбрионов - оФРФ» в группе пациенток с ОГНГ

Кумулятивный балл полученных эмбрионов

40 ;

35 I

30 ' „ ____—

25 ¿0 15

♦ "

♦ ------

4 поле корреляции

10 ЛиНеННаЯ 5 ; регрессионная модель ...........•........._............................................................................... ...................... ...................... у = 0,0177х+ 15,803

0

800 1000 1200 ТФР4, пкг/мл

Рис. 14. Поле корреляции и аппроксимация линейной однофакторной регрессией парной связи «кумулятивный балл полученных эмбрионов - ТФР-(31» в группе пациенток с ОГНГ

Понимание процессов регуляции, вытекающие из полученных результатов проведенного диссертационного исследования, отражено на заключительных схемах (рис. 15,16).

Выявленные молекулы - маркеры (ИФР-1, тестостерон, ТФР-(31, эндоте-лин-1 при функциональной гиперпролактинемии; оФРФ, ТФР-Р1, эндотелии-1 при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза) могут использоваться для эффективной диагностики данных состояний.

выводы

1. Для овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии характерно отставание развития сосудов микро-циркуляторного русла, проявляющееся снижением уровня СЭФР (на 33 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 30% при функциональной гиперпролактинемии) и оФРФ, а также нарастанием концентрации эндоте-лина-1 (на 24,2 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 17% при функциональной гиперпролактинемии) на всем протяжении развития фолликула. Это приводит к недостаточному кровоснабжению доминантного фолликула, необходимому для последующей овуляции.

2. В развивающемся доминантном фолликуле при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза и функциональной гиперпролактинемии нарушена пролиферация гранулезных клеток. Концентрация маркеров пролиферации снижена, начиная со стадии раннего преовуляторного фолликула: ИФР-1 на 18 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 14 % при функциональной гиперпролактинемии; ЭФР на 31 % при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза, на 26 % при функциональной гиперпролактинемии.

3. Фолликулогенез на фоне избытка андрогенов в клетках теки яичников, реализуется в условиях большого количества повреждающих факторов (андро-генное микроокружение развивающихся ооцитов, повышенная готовность к апоптозу, нарушение формирования микроциркуляторного русла и ангиогене-за). Наблюдается отсутствие рекрутирования и овуляции доминантных фолликулов. Для избытка пролактина характерно изменение условий развития микроциркуляторного русла и ангиогенеза при наличии выраженного защитного эффекта эстрадиола (повышение концентрации эстрадиола на 22 % по сравнению с контролем), что, вероятно, может служить защитным фактором в отношении реализации апоптоза.

4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляторные молекулы, изменение концентрации которых исследовалось, в наибольшей степени влияют на качество формирующегося ооцита, а также на эффективность оплодотворения и имплантацию эмбриона (при трубно-перитонеальной форме бесплодия - эстрогены, оФРФ и ЭФР; при функциональной гиперпролактинемии - ИФР-1, тестостерон, ТФР-(31, эндотелин-1; при овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза - оФРФ, ТФР-pl, эндотелин-1). Указанные молекулы могут использоваться для прогноза исходов лечебных циклов ЭКО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Екимова, М.В. Гуморальные факторы микроокружения ооцитов на разных стадиях роста фолликулов при эндокринном бесплодии / М.В. Екимова, Е.А. Тепляшина, Е.А. Пожиленкова и др. // Проблемы репродукции. - 2011. -№4. -С. 19-22.

2. Тепляшина, Е.А. Роль эндотелина и сосудисто-эндотелиального фактора роста в процессе фолликулогенеза / Е.А. Тепляшина, Е.А. Пожиленкова, М.В. Екимова и др. //Рос. вестн. акуш.-гин. -2011. -№ 3. - Т.П. - С. 4-9.

3. Тепляшина, Е.А. Маркеры формирования патологического фолликулогенеза при гиперандрогении / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова, Е.А. Пожиленкова и др.//Врач-аспирант.-2012.-№4.1 (53).-С. 223-230.

4. Тепляшина, Е.А. Молекулярные маркеры гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза при эндокринном бесплодии / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова, Е.А. Пожиленкова и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2012. - № 5. - Т. 32. -С. 75-79.

5. Тепляшина, Е.А. Факторы роста, определяющие особенности фолликулогенеза при эндокринном бесплодии / Е.А. Тепляшина, Е.А. Пожиленкова, М.В. Екимова и др. // Сиб. мед. обозрение - 2012. - № 6. - С. 14-17.

6. Тепляшина, Е.А. Прогностические маркеры функциональной зрелости ооцитов в динамике созревания фолликулов при некоторых формах эндокринного бесплодия / Е.А. Тепляшина // Вестник Российского Государственного медицинского университета. - 2011. - № 2. Специальный выпуск. - С. 187.

Методическое пособие

7. Пожиленкова, Е.А. Диагностика нарушения стероидогенеза в клетках кумулюса фолликулов яичников у женщин с эндокринным бесплодием в лечебных циклах ЭКО / Е.А. Пожиленкова, М.В. Екимова, А. Б. Салмина, Е.А. Тепляшина - Красноярск, 2011. - 18 с.

Публикации в иных изданиях

8. Тепляшина, Е.А. Маркеры функциональной компетентности развивающихся фолликулов при некоторых формах эндокринного бесплодия / Е. А. Тепляшина, Е.А. Пожиленкова // Медицинский академический журнал. - 2010. -Т. 10,- №5. -С. 33-34.

9. Пожиленкова, Е.А. Новые молекулярные маркеры для эффективной диагностики эндокринного бесплодия у женщин / Е.А. Пожиленкова, Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова и др. // Проблемы репродукции (по материалам V Международного конгресса по репродуктивной медицине). — 2011 — Специальный выпуск.-С. 113-114.

10. Екимова, М.В. Маркеры апоптоза и ангиогенеза в физиологическом процессе созревания фолликулов: норма и патология репродуктивной функции / М.В. Екимова, Е.А. Тепляшина, Е.А. Пожиленкова и др. // Научные труды III Съезда физиологов СНГ / под ред. А.И. Григорьева, O.A. Крышталя, Ю.В. Наточина, Р.И. Сепиашвили.-М.: Медицина-Здоровье. -2011. - С. 179.

11. Тепляшина, Е.А. Сосудисто-эндотелиальный маркер микроокружения ооцитов на разных стадиях роста фолликулов при эндокринном бесплодии / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова // Современные тенденции в науке: новый взгляд: сборник научных трудов по материалам Международной заочной научно-практической конференции. - Ч. 4. - Тамбов: Бизнес-Наука-Общество. -2011.-С. 124-125.

12. Тепляшина, Е.А. Роль инсулиноподобного фактора роста-1 и тестостерона в патологическом фолликулогенезе при гиперандрогении / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова, Е.А. Пожиленкова и др. // Теоретические и практические аспекты развития современной науки: материалы II международной научно-практической конференции. - М.: Спецкнига. - 2011. - С. 309-311.

13. Тепляшина, Е.А. Маркеры микроокружения ооцитов в гормонально-зависимом этапе развития фолликулов при эндокринном бесплодии / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова, Е.А. Пожиленкова и др. // Интеграция науки и практики как механизм эффективного развития современного общества: материалы II Международной научно-практ. конф. - М.: Спецкнига. - 2011. - С. 224-227.

14. Тепляшина, Е.А. Особенности стероидогенеза гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза в норме и патологии репродуктивной функции / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова, Е.А. Пожиленкова и др. // VII Сибирский съезд физиологов: материалы съезда физиологов с международным участием. -Красноярск, 2012. - С. 520-521.

15. Тепляшина, Е.А. Показатели качества ооцитов гормонально-зависимого этапа фолликулогенеза при некоторых формах эндокринного бесплодия / Е.А. Тепляшина, М.В. Екимова // Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы: сборник научных трудов по материалам Международной заочной научно-практической конференции. - Тамбов: Бизнес-Наука-Общество, 2012. - С. 147-149.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии; Е2 - эстрадиол;

ИФА - иммуноферментный метод анализа;

ИФР - инсулиноподобный фактор роста;

ОГНГ - овариальная гиперандрогения неопухолевого генеза;

оФРФ - фактор роста фибробластов основной;

ПБР - периферический бензодиазепиновый рецептор;

РЛДЦ ИХМИ - региональный лабораторно - диагностический центр иммуно-

химических методов исследования;

СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста;

Т - тестостерон;

ФГП - функциональная гиперпролактинемия;

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение;

ЭФР - эпидермальный фактор роста;

ЧНО - частота нормального оплодотворения;

ЧНИ - частота наступления имплантации;

ЧПЭ - число полученных эмбрионов;

КБПЭ - кумулятивный балл полученных эмбрионов;

РаБЬ - Раз-лиганд;

БазЯ - Раэ-рецептор;

ТФР-р! - трансформирующий фактор роста-р].

Соискатель Ь ЧУЕ.А. Тепляшина

Рис. 15. Предполагаемая схема формирования патологического фолликулогенеза при ОГНГ

Рис. 16. Предполагаемая схема формирования патологического фолликулогенеза при ФГП

Подписано в печать 26.02.2014 Бумага офсетная 80г/м2 П.л. - 1,0 Способ печати - оперативный Заказ 1328, тираж 100

Отпечатано ИП Шнайдер А.Р. г. Красноярск, ул. Хабаровская, 3 «А», т. 290 32 27