Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Влияние физических нагрузок на регуляцию сплайсинга

На правах рукописи

□03473946

Тоневицкий Евгений Александрович

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗОК НА РЕГУЛЯЦИЮ СПЛАЙСИНГА

14.00.51 - восстановительная медицина, лечебная физкультура н спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о;;;о:-] ?ооо

Москва-2009

003473946

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта (ФГУ ВНИИФК)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, доцент Малюченко Наталия Валериевна

доктор биологических наук, профессор Абрамова Тамара Федоровна

кандидат биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Российский государственный университет физической культуры, спорта и туризма (РГУФКСиТ)

Защита диссертации состоится «01» июля 2009 в 15:00 на заседании диссертационного совета Д.311.002.01 при Федеральном Государственном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу: 105005, Москва, Елизаветинский пер. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта

Автореферат разослан «29» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., проф.

Пономарева А. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Одной из важнейших задач современной спортивной медицины является изучение адаптации организма к физическим нагрузкам. Физическая активность является комплексным стрессорным фактором и вызывает широкий спектр биофизических и биохимических процессов, таких как увеличение концентрации свободных радикалов, локальную гипертермию, изменение электролитного баланса, повышение концентрации свободных жирных кислот и лактата, изменение уровня гормонов, цитокинов и катехоламинов (Radom-Aizik S. 2008).

Главную роль в активации фенотипической адаптации организма спортсмена на физические нагрузки играют, так называемые, гены раннего ответа (ГРО), основной характеристикой которых является быстрое, кратковременное изменение транскрипции в ответ на стимуляцию. Было показано, что экспрессия ГРО - ключевой фактор, запускающий процессы белкового неосинтеза и последующую экспрессию генов позднего ответа (Buttner Р. 2007, Сахаров Д. 2009).

Известно, что большинство эукариотических генов транскрибируются в виде пре-иРНК, которая затем сплайсируется в иРНК. Сплайсинг — это двухстадийный процесс, в ходе которого путем последовательных трансэтерефикационных реакций некодирукяцие последовательности — интроны, вырезаются, а кодирующие — экзоны, соединяются вместе. Сплайсосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, в состав которого на разных этапах входят 5 мяРНК, около 70 белков мяРНП комплексов и более 100 прочих белков. Важным механизмом регуляции всех взаимодействий внутри сплайсосомы является фосфорилирование (Wahl М., 2009).

Значимость пре-иРНК сплайсинга была недавно подтверждена результатами исследований по секвенированию генома человека, которые показали, что более 90% генов сплайсируются, из них 80% - альтернативно, образуя несколько сплайсформ, что и объясняет то, как при таком сравнительно небольшом числе генов формируется такое белковое разнообразие.

В ходе последних изучений было обнаружено, что более 50% заболеваний, связанных с мутациями, вызываются нарушениями альтернативного сплайсинга, классические примеры - это спинная мышечная атрофия, таупатия, миотоническая дистрофия и рак (Orengo J. 2008).

Однако, несмотря на глобальную вовлеченность сплайсинга в процессы жизнедеятельности организма, исследования влияния интенсивных физических нагрузок на функционирование и регуляцию сплайсинга до сих пор не были проведены. Лучшее понимание приспособительных механизмов организма, связанных с ответом на физическую нагрузку может обеспечить основу для предотвращения перетренированности, синдрома хронической усталости, для варьирования тренировочного режима в соответствии с индивидуальными особенностями организма спортсмена.

Гипотеза:

Предполагается, что интенсивные физические нагрузки приводят к запуску процессов срочной адаптации организма спортсмена - происходит увеличение экспрессии генов раннего ответа. Как следствие, возрастает активность сплайсинга: меняется профиль экспрессии генов сплайсосомальных белков и происходит изменение регуляции сплайсинга. Определение экспрессии иРНК и профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков позволит оценивать эффекты физических нагрузок на генном уровне.

Цель исследования:

Оценка влияния физических нагрузок максимальной аэробной мощности на изменение экспрессии иРНК генов регуляторов сплайсинга, а также на возможные изменения профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков в процессах срочной адаптации.

Задачи исследования:

1. Исследовать изменение экспрессии иРНК генов раннего ответа у высококвалифицированных спортсменов в ответ на работу максимальной аэробной мощности;

2. Изучить влияние работы максимальной аэробной мощности на экспрессию иРНК генов регуляторов сплайсинга, белков мяРНП и сплайсосомальных комплексов в лейкоцитах крови спортсменов;

3. Разработать методику предсказания потенциальных эпитопов в сплайсосомальных белках, получить полшслональные антитела против предсказанных пептидов;

4. Проанализировать изменения в фосфоршшровании сплайсосомального белка 8РЗЫ55 у спортсменов до и после нагрузочного тестирования.

Объект исследования:

Молекулярно-биологические механизмы адаптации высококвалифицированных спортсменов к работе максимальной аэробной мощности.

Предмет исследования:

Комплекс структурных и регуляторных белков сплайсосомы человека и экспрессия иРНК при физических нагрузках.

Научная новизна:

Впервые у спортсменов высшей квалификации, до и после работы максимальной аэробной мощности было проведено исследование экспрессии иРНК генов белков, вовлеченных в сплайсинг. Выявлены потенциальные регуляторы процессов адаптации сплайсосомы при физических нагрузках, которые принимают участие в начальной стадии сборки сплайсосомы, при распознавании интронов и при переходе от пре-каталитической к активированной форме.

Впервые показано, что ускорение сборки сплайсосомы и/или переход к альтернативным сплайс-сайтам являются основными путями раннего приспособления организма к физическим нагрузкам.

Разработан новый алгоритм предсказания линейных В-клеточных эпитопов, основанный на частоте встречаемости аминокислотных пар, не уступающий описанным в литературе методам.

Впервые произведен анализ изменения в профиле фосфоршгарования сплайсосомы в зависимости от физических нагрузок. Впервые было показано, что в ответ на работу максимальной мощности происходит резкое увеличение соотношения фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка 8РЗЫ55, являющегося маркером каталитически активной сплайсосомы.

Теоретическая значимость:

Данная работа направлена на изучение фундаментальных основ процессов клеточной жизнедеятельности, функционирования первичных механизмов приспособления клеток человека к физиологическому стрессу, вызванному кратковременными высокоинтенсивными физическими нагрузками. В условиях нагрузочного тестирования выявлены потенциально ключевые факторы регуляции инициации сплайсинга. Предложена модель, отражающая их участие в адаптации сплайсосомы к стрессу, вызванному нагрузками.

Разработанные методики анализа фосфорилирования сплайсосомальных белков позволят понять механизмы воздействия физиологического стресса на процессы сплайсирования, создать системы компенсаций его негативных последствий на самом раннем этапе их проявления, что в свою очередь востребовано в рамках современной восстановительной медицины.

Практическав значимость:

Практическая значимость работы заключается в разработке высокочувствительного метода оценки развития клеточного стресса в результате нагрузки высокой интенсивности. Метод основан на измерении соотношения фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка SF3bl55 в экстракте лейкоцитов крови спортсменов до и после нагрузочного тестирования.

Разработанный метод предсказания линейных эпитопов может бьггь использован в дальнейшем для разработки тест-систем определения биомаркеров утомления и физиологического стресса.

Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова, что подтверждено актами внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Работа максимальной аэробной мощности приводит к увеличению экспрессии иРНК генов сплайсосомальных белков в лейкоцитах крови у спортсменов высшей квалификации;

2. В условиях высокоинтенсивных физических нагрузок максимальное изменение экспрессии происходит у генов регуляторов инициаторной стадии сплайсинга;

3. После нагрузочного тестирования у спортсменов соотношение фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка SF3b155 в крови увеличивается, что может служить высокочуствительным ранним маркером стресса.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 111 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, итогового заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Последний включает 120 источников. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Методы исследования

В качестве модельной нагрузки использовали нагрузку до отказа со ступенчато повышающейся мощностью. В исследованиях принимали участие 11 спортсменов циклических видов спорта, квалификации не ниже KMC (мужчины, п=11, 21.0±12.3 лет, 73.0±5.2 кг, 178.0±5.8 см, МПК/кг 59.4±3.3). Испытуемые выполняли нагрузочное тестирование на беговой дорожке Venus 200-75 (Н-Р Cosmos, Германия). Начальная скорость ленты - 3 м/с, дискретность изменения скорости - 0.5 м/с, длительность нагрузочной ступени - 3 мин, угол наклона ленты - 1 градус. Показатели газообмена оценивали с помощью газоанализатора Oxycon Pro (Viasys, Германия). Частоту сердечных сокращений регистрировали с помощью монитора сердечного ритма S810 (Polar, Финляндия). Концентрацию лактата и глюкозы определяли с использованием автоматического анализатора C_Line (Biosen, Германия). Концентрацию биомаркеров в сыворотке определяли на автоматическом биохимическом анализаторе HumaStar 300 (Human, Германия). Все участники эксперимента подписали информированное согласие. Протокол эксперимента был одобрен этическим комитетом ВНИИФК.

Забор крови и выделение иРНК осуществляли с помощью коммерческого набора PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX, Qiagen, Германия). Меченая фрагментированная кРНК, была синтезирована согласно протоколу, рекомендованному Affymetrix с использованием в качестве матрицы выделенной из лейкоцитов крови тотальной иРНК (100 нг). Сканирование чипов производили в соответствии с рекомендациями Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual. Значения интенсивностей проб были получены с помощью Affymetrix Command Console. Контроль качества осуществлялся с помощью Affymetrix Gene Expression Console. Коррекция фона, суммирование, нормализация данных и статистические рассчеты проводились в среде R с использованием библиотек xps и limma.

Поликлональные антитела выделяли из антисыворотки кроликов после четвертой иммунизации на аффинном сорбенте. Для иммунизации использовали коньюгаты пептидов с белками-носителями. Очистку антител проводили с использованием коммерческого набора Sulfolink Immobilization Kit (Pierce, США). Чистоту и активность полученных антител оценивали с помощью полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ) и иммуноферментного анализа (ИФА).

Белковый форез в полиакриламидном геле ставили по системе Лэмли в денатурирующих условиях в аппарате Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, США). ИФА

проводили в 96-луночиых иммунологических платах (Costar, Германия) по стандартным протоколам.

Полусухой перенос образцов из геля на мембрану из нитроцеллюлозы (Bio-Rad, США) или поливиниледенфторида Immobilon-P (Millipore, Германия) проводили с использованием Semi Dry Trans-Blot Cell (Bio-Rad, США). После переноса проводили инкубации с антителами или антисыворотками и конъюгатами антител с пероксидазой хрена, разведения которых подбирали в экспериментах дот-блоттинга. Хемшпоминисцентную реакцию осуществляли с помощью набора SuperSignal West Pico Substrate (Pierce, США), детекцию проводили на приборе ChemiDoc XRS (Bio-Rad, США).

Организация исследования

Исследования проходили в четыре этапа:

I этап: Проведение нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью и определение уровня экспрессии иРНК генов раннего ответа в лейкоцитах крови, а также основных биохимических маркеров;

II этап: Поиск и анализ иРНК генов сплайсинга, уровень экспрессии которых у спортсменов изменился в ответ на физические нагрузки;

III этап: Предсказание потенциальных эпитопов и получение поликлональных аффинно очищенных антител кролика против пептидов из сплайсосомальных белков;

IV этап: Анализ изменений в фосфорилировании сплайсосмальных белков в экстракте лейкоцитов крови спортсменов в ответ на работу максимальной аэробной мощности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия иРНК генов белков сплайсинга у спортсменов высшей квалификации

Многоступенчатый генный ответ в лейкоцитах крови на физическую нагрузку зависит от типа, интенсивности, продолжительности нагрузки, тренировочного статуса испытуемых, внешних условий.

Изменение экспрессии иРНК в ответ на работу максимальной аэробной мощности генов изучали у 11 спортсменов. В исследование были вовлечены только мужчины, поскольку по литературным данным известно, что существует различие в метаболическом и стрессовом ответах в зависимости от пола, что может привести к

ошибкам при оценке полученных результатов. В качестве исключающего критерия также выступал анализ анамнеза и любые хронические медицинские особенности организма испытуемых, использование медицинских средств и условия тренировки.

Отличительной особенностью исследования является привлечение высококвалифицированных спортсменов. Исследуемая выборка была гомогенна по максимальному потреблению кислорода (МПК) и антропометрическим показателям, что позволяет точнее определять изменения, индуцированные в ходе эксперимента и минимизировать влияние индивидуальных особенностей испытуемых.

Испытуемые выполняли нагрузочное тестирование на беговой дорожке "до отказа", время тестирования составляло 13-16 мин, что достаточно для активации системы генов раннего ответа (10 мин), соизмеримо с известной кинетикой сплайсинг реакции in vitro (6-8 мин инициация, формирование пре-каталитической сплайсосомы, 10-15 мин образование продукта), однако не достаточно для запуска вторичных адаптационных механизмов, которые могли бы повлиять на результаты исследования.

В образцах крови спортсменов определяли следующие биохимические показатели: общий белок, альбумин, общий холестерин, триглицериды, мочевина, креатинин, мочевая кислота, креатинфосфокиназа (КФК), аланинаминотрансфераза (AJ1T), аспартатаминотрансфераза (ACT) и глюкоза.

Известно, что при обезвоживании повышается концентрация как общего белка, так и альбумина. Нагрузочное тестирование не вызвало значимой потери жидкости в результате потоотделения, что подтверждается отсутствием значимых различий между уровнями этих показателей до и после нагрузки.

Уровни мочевины, креатинина и мочевой кислоты говорят об отсутствии активных катаболических процессов в организме спортсменов. Активность цитоплазматических ферментов (АЛТ, ACT) находилась в пределах среднефизиологических значений до нагрузки, что говорит об отсутствии повреждений мышечных волокон (скелетная мускулатура и миокард) и гепатоцитов. Тестовая нагрузка вызвала изменение проницаемости мембран миоциов, что повлекло за собой значимое повышение активности КФК в сыворотке (р<0.5). Тем не менее, уровень КФК 225.0±66.3 ед/л находится в пределах среднестатистических значений и не позволяет говорить о наличии повреждений скелетной мускулатуры.

Концентрация холестерина и триглицеридов не изменялась в ответ на нагрузку и находилась в пределах нормы. Концентрация глюкозы перед нагрузкой находилась на уровне 5.0±1.3 ммоль/л и незначительно повышалась в ответ на нагрузку.

Необходимо также отметить, что сплайсинг - это фундаментальный процесс, проходящий во всех клетках организма, что в рамках данного исследования позволяет пренебречь возможными тканеспецифичными эффектами и считать изменения экспрессии в лейкоцитах достоверными.

Изменение экспрессии иРНК анализировали с помощью метода микрочипов. Принцип метода заключается в том, что на подложке чипа находятся множество упорядоченных олигонуклеотидов длиной от 6 до 100 оснований таким образом, чтобы каждый из 28000 генов был представлен нескольким олигонуклеотидами. На чип наносят образцы меченных кРНК, которые взаимодействуют с комплиментарными партнерами, после чего детектируют флуоресцентный сигнал, интенсивность которого пропорциональна количеству транскрипта. Метод позволяет проводить одновременный широкий генетический скрининг множества образцов, полученных при разных условиях и/или из разных тканей.

Спортсмены, участвующие в нагрузочном тестировании, для получения более достоверных результатов были разделены на две группы (Таб. 1).

Таблица 1. Участники исследования

Объем Возраст, лет Вес, кг Рост, см МПК/кг

выборки Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD

Группа 1 4 42.8 6.5 74.5 4.2 174.5 2.9 56.3 4.1

Группа 2 7 19.7 2.6 69.3 5.0 178.9 6.6 59.4 2.4

Итого 11 21.0 12.3 73.0 5.2 178.0 5.8 59.4 3.3

Образцы иРНК спортсменов первой группы (4 чел) в целях оценки воспроизводимости результатов были проанализированы в двух повторениях. Полученные результаты использовали для отбора дифференциально экспрессируемых генов-кандидатов.

Полученные с помощью Affymetrix Command Console интенсивности проб были импортированы в среду R и обработаны с помощью библиотеки xps. Экспрессия иРНК была рассчитана с помощью реализованного в xps алгоритма суммирования RMA с использованием квантильной нормализации и преобразована в логарифмический масштаб. Используя информацию из записи G0:0000398 базы данных Gene Ontology (145 генов) и данные литературы (271 ген), был сформирован список из 303 связанных со сплайсингом генов, присутствующих на чипе.

Данные по образцам были использованы для расчета моделируемой парной t-статистики по выбранным 303 генам. Расчет проводился в среде R с помощью

библиотеки Птта. Дашше с дублирующихся чипов были представлены как технические копии. При выбранном уровне достоверности р<0.05 было получено 26 генов-кандидатов.

Образцы иРНК второй группы спортсменов (7 чел, Таб. 1) анализировали - и результаты использовали для верификации дифференциальной экспрессии полученных генов-кандидатов.

Используя данные образцов из второй группы, значения "до" и "после" каждого из 26 генов сравнивались парным критерием Вилкоксона. Значения вероятностей были скорректированы поправкой Хоммеля. При р<0.05 было получено 5 генов со статистически значимым изменением экспрессии (Рис. 1).

00X17 00X46 НГ-гаРЯ РЙРГ4В БЙРК2

Рис. 1. Изменение экспрессии. На диаграмме обозначена медиана, верхний и нижний квартили, максимальное и минимальное значения в пределах 1,5 1(211, выбросы.

Таким образом, в результате первых двух этапов работы были найдены гены сплайсосомальных белков, экспрессия которых достоверно увеличивается в результате физической нагрузки максимальной аэробной мощности. Для повышения достоверности полученных результатов были проанализированы образцы двух групп спортсменов с повторениями.

Для выявления функции найденных сплайсосомальных белков в функционировании сплайсосомы был предложен и детально проанализирован механизм пре-иРНК сплайсинга.

Механизм пре-иРНК сплайсинга

В формировании пре-каталитической сллайсосомы принимают участие все 5 мяРНП, а также множество отдельных белковых факторов, действующих как независимо, так и кооперативно, которые можно разбить на несколько групп (Рис. 2). Кратко, Ш мяРНП распознает и связывает 5' сплайс сайт, взаимодействуя с ЭЯ белками и таким образом вовлечен в распознавание экзонов. Ш мяРНП образует стабильную связь с точкой ветвления во время образования А-комплекса. Участвует в формировании каталитического центра вместе с Ш. Ш/иб.Ш три-мяРНП стабильно связывается со сплайсосомой, образуя В-комплекс. Ш мяРНП кратковременно взаимодействует со сплайсосомой, интегрируя в нее иб в каталитически неактивной форме. 115 мяРНП взаимодействует с пре-иРНК, координируя экзоны для протекания химических реакций. Белковые компоненты Ш участвуют в формировании активного центра в качестве кофакторов.

Рис. 2. Схема сплайсинга. Серые прямоугольники - экзоны. 111-6 - мяРНП, жирным указаны белки, экспрессия иРНК которых изменилась в результате физической нагрузки максимальной аэробной мощности.

Также необходимо выделить 2 больших семейства белков: гяРНП -разнообразные РНК связывающие белки, не обладающие КЗ доменом, взаимодействующие с появляющимся транскриптом и регулирующие (положительно или отрицательно) инициацию сборки сплайсосомы. вЯ белки участвуют в выборе

5'СС ТВ З'СС

Зрелая мРНК

экзонов, связываясь с Ш мяРНП и ШАЕ35, ЯЭ домены формируют серию последовательных контактов с точкой ветвления и 5' сплайс-сайтом во время сборки сплайсосомы.

Интересно отметить, что в данной работе в ответ на работу максимальной аэробной мощности были найдены гены, кодирующие белки (00X17,. ООХ46, НЬПШРИ, РИРР4В, 5ЯРК2), которые относятся или взаимодействуют с белками практически всех основных групп сплайсосомы.

Так, ЬпКЫР-Я относится к белкам гяРНП семейства. Было показано, что он взаимодействует с белком БРЗабб, таким образом, возможно участвуя в формировании БРЗа комплекса/и2 мяРНП. В свою очередь Ргр5р (00X46) белок, относящийся к хеликхазам ЭЕхН/О группы, образует мостик между II1 и Ш мяРНП, формируя пре-сплайсосому. Одновременно, благодаря своей АТФазной активности, он участвует в формировании стабильной связи между Ш мяРНК и пре-иРНК в точке ветвления, таким образом влияя на выбор альтернативных путей сплайсинга. Для образования пре-каталитической сплайсосомы пре-сплайсосома должна связаться с три-мяРНП. Ключевым шагом на этом этапе является фосфорилирование и5-100 (Ргр28) белка, также относящегося к хеликазам ОЕхН/О группы. Фосфорилирование этого белка является абсолютно необходимым этапом для интеграции три-мяРНП, оно осуществляется серин/аргининовой 8ЯРК2 киназой.

Другим ферментом, принимающим участие в формировании активного три-мяРНП является Ргр4к (РЯРЕ4В) серин/треониновая киназа. Специфично связываясь с 115 мяРНП, она фосфорилирует Ргрб, который образует мостик между Ш/Ш и 1)5 мяРНП. Также на дрожжевых моделях было показано, что она может взаимодействовать с Ргр5р.

На стадии активации сплайсосомы важную роль играет Ргр28, который благодаря своей атфазной активности может вытеснять Ш мяРНП и связывать 5' сплайс-сайт с АСАвАО мотивом 116 мяРНК для формирования каталитического центра. Также можно предположить, что в этом процессе свою роль играет р72 (ООХ17) ОЕхН/О хеликаза. Она обладает значительной гомологией с р68 (90%), с которым образует гетеродимеры в клетке. Хотя функции белка малоизученны, было показано что р72 выделяется совместно с Ш мяРНП. В свою очередь, для р68 ранее было показано, что он также взаимодействует с Ш мяРНК и 5' сплайс-сайтом дуплексом, разрушая его. Можно предложить, что р68/р72 вместе с Ргр28 участвуют в инициации формирования активной сплайсосомы.

Таким образом, в работе показано, что все найденные белки, экспрессия иРНК которых у спортсменов увеличивается в результате нагрузки, участвуют в сборке сплайсосомы и регулируют ее активность, позволяя, вероятно, нивелировать негативные последствия физиологического стресса.

Следует отметить, что в регуляции альтернативного сплайсинга также принимают участие белки, взаимодействующие с некодирующими последовательностями пре-иРНК. Так, в работе была предложена модель нарушения сплайсинга инсулинового рецептора при миотонической дистрофии.

РМРК мРНК

Рис. 3. Механизм альтернативного сплайсинга экзона И гена инсулинового рецептора. На схеме норма показана пунктирными линиями, патология — сплошными

Известно, что миотоническая дистрофия первого типа вызывается увеличением числа нестабильных СТО повторов в З'-нетранслируемой области гена БМРК в хромосоме 19я13.3.11, которые приводят к тому, что у взрослых активизируется сплайсинг "зародышевых" экзонов, характерных для эмбрионального и раннего натального развития. По всей видимости, в случае инсулинового рецептора РНК с СиО-повторами образует скопления в ядре, присоединяя двухнитиевые С1ГС-связывающие белки, такие как МВШЛ. Снижение концентрации МВМ- вызывает повышение уровня свободного белка ЬлКЫР Н. Присоединение этих белков к ШЗ-мотивам регуляторных последовательностей и приводит к переключению сплайсинга по типу эмбриональных тканей.

Таким образом, в работе на первых двух этапах был детально изучен механизм пре-иРНК сплайсинга. И показано, что в ответ на нагрузку максимальной аэробной мощности происходит увеличение экспрессии генов белков сплайсинга, вовлеченных в формировании мяРНП и пре-каталитической сплайсосомы.

Для подтверждения важной роли пре-иРНК сплайсинга в развитии раннего ответа организма спортсмена на физические нагрузки максимальной аэробной мощности на последующих этапах были проведены исследования фосфорилирования регуляторов сплайсинга.

Антитела против белков сплайсосомы

Важную роль в регуляции сборки сплайсосомы и каталитической активации играют посттрансляционные модификации сплайсосомальных белков, в частности убиквитинилирование, ацетилирование и обратимое фосфорилировапие, в котором принимают участие, как минимум 4 киназы (SRPK1.2; Ргр4 и Clk/Sty киназа). Наиболее изучено влияние фосфорилирования таких белков, как U1-70K, Prp28, Cdc51 и в особенности SF3bl55. Было показано, что его пшерфосфорилирование происходит специфически перед или во время первого шага и является обязательным для протекания второго шага, после которого белок дефосфорилируется РР1/РР2А фосфатазами. По всей видимости, фосфорилирование SF3bl55 приводит к его конформационным изменениям, вызывающими в свою очередь перестройку 3' сплайс-сайта, подготавливая его ко второму шагу.

Таким образом, фосфорилированная форма белка является маркером каталитически активной сплайсосомы и может использоваться для мониторинга С-комплекса и активности сплайсосомы in vivo и in vitro. В ходе широкого скрининга, выполненного в первой части работы, было обнаружено, что экспрессия иРНК SF3bl55 гена увеличивается, однако недостаточно сильно.

Во второй части данной работы была поставлена задача изучить влияние физических нагрузок на фосфорилирование SF3bl55 с помощью поликлональных антител. Также были выбраны 2 дополнительных белка: Cdc51 - белок, который фосфорилируется митоген-зависимым образом и является одним из важных регуляторов G2/M перехода, а также взаимодействуя со сплайсосомой, облегчает протекание второго шага; Snull4 - U5 мяРНП белок, единственная ГТФаза, которая входит в состав, так называемого "устойчивого к соли" ядра сплайсосомы и присутствует в нем на всех этапах каталитической активности.

Хотя гетерологические системы экспрессии белков и являются наиболее распространенными и единственными применимыми в тех случаях, когда надо получать большие количества высокочистого белка, они исключительно трудоемки и обладают рядом недостатков для решения иммунохимических задач. Зачастую белок не экспрессируется или является токсичным для организма-хозяина, многие белки

экспрессируются в нерастворимой форме, тельцах включения. При иммунизации полным белком невозможно предсказать места будущих эпитопов, зачастую они оказываются в последствии недоступны для связывания in vivo. Поэтому более перспективным представляется получение антител к коротким (10-30 аминокислот) фрагментам белка, для чего животных иммунизируют коньюгатом белка с большим молекулярным весом и интересующим пептидом.

Разработка метода определения иммуногеиности пептидов

Для выбора потенциальных эпитопов на третьем этапе был разработан новый метод предсказания, на основе метода машинного обучения. В процессе предсказания выделяют четыре случая: истинно положительные - правильно предсказанные эпитопы, истинно отрицательные - правильно предсказанные неэпитопы, ложно отрицательные - эпитопы, классифицированные как неэпитопы и ложно положительные - неэпитопы, классифицированные, как эпитопы.

Основной характеристикой качества предсказания различных алгоритмов является операционная характеристика приемника (ROC-кривая) (Рис. 4).

Рис. 4. ЯОС-кривая для различных методов предсказания эпитопов 1ЮС-кривая строится относительно осей ДИП (доля истинно положительных) и ДЛП (доля ложно положительных), а каждая точка кривой определяется значениями ДИП и ДЛП при различных значениях порога.

Алгоритм был основан на частоте встречаемости аминокислотных пар с использованием метода опорных векторов. Проведенный ранее анализ уже известных эпитопов показал, что некоторые пары имеют существенно различающиеся частоты встречаемости в эпитопных и неэпитопных наборах пептидов, что легло в основу метода. В качестве исходных данных метод использует частоты встречаемости аминокислотных пар и классические шкалы гибкости и гидрофильности (ВЭЖХ) аминокислотных остатков.

Предложенный в работе алгоритм теоретического предсказания эпитопов превосходит как классические, так и более современные - статистические методы по точности предсказания. На Рис. 4 представлены предсказания: случайное, на основе гибкости, гидрофильности (ВЭЖХ), метода опорных векторов.

Получение аффинно очнщеных поликлональных антител против белков сплайсинга

С помощью разработанного метода были предсказаны потенциально наиболее иммуногенные пептиды длиной в 15-20 аминокислот в трех сплайсосомальных белках -ЭтЛ 14, С<1с51, 8РЗЫ55 (на С-конец каждого пептида был добавлен цистеин, сульфгидрильнаягруппа которого была использована для конъюгирования). Типичная кривая антигенности представлена на Рис. 5.

Рис. 5. Кривая антигенности белка Бпи! 14. Выбранный пептид выделен жирным

Предсказанные пептиды (Таб. 2) были синтезированы и коньюгированны с белками-носителями: гемоцианином брюхоного моллюска и бычьим сывороточным

альбумином. Коньюгаты были получены с помощью бифункционального сшивающего реагента МБС. К раствору ГБМ (бмг/мл) добавляли 70-кратный молярный избыток МБС и перемешивали при комнатной температуре 30 мин. Активированный ГБМ очищали от исходных реагентов гельфильтрацией на колонке РБ-10 (АтегеИат, Германия). Фракции, содержащие активированный ГБМ, объединяли и добавляли к ним раствор пептида в эквимиллиграмовых количествах из расчета 1мг пептида на 1 мг исходного ГБМ (50-100 -кратный молярный избыток). Конъюгирование проводили в течение 3 часов при интенсивном перемешивании при комнатной температуре. Для одной иммунизации одного кролика использовали 0.5 мг коньюгата пептида с гемоцианином моллюска, с концентрацией белка носителя 1 мг/мл.

Таблица 2. Иммуногенные пептиды

Белок Номера а.к. Последовательность

БпиШ 75-95 ЕУЕГОЧ}ЕЕОТдР1Л"ЕР11КС

Сс1с51 105-124 КАА0М)МЕЕЕГГОВР11КЬКС

8РЗЫ55 98-113 Е(}ТОРРАЕНКРРК1АС

Каждым пептидом иммунизировали двух кроликов. Первую иммунизацию проводили в полном адьюванте Фрейнда, последующие в неполном адъюванте Фрейнда с трехнедельным интервалом. Концентрация специфических антител в сыворотке была высокой и составляла после четвертой иммунизации в среднем от 0.5 до 2 мг/мл.

Для получения матрикса, использовавшегося для выделения антител из сыворотки, пептид наносили на шарики из 6% химически-модифицированной агарозы, несущие на себе активированные иодоацетильные группы, которые в свою очередь реагировали с сульфгидрильной группой цистеина на С-конце пептида с образованием тиоэфирной связи. Сыворотку после четвертой иммунизации наносили на колонку с матриксом, несущим ковалентно иммобилизованный пептид. Связавшиеся антитела элюировали 0.1М глицином (рН 2.0), нейтрализовывали 1М трис(гидроксиметил)аминометаном (ТРИС) (рН 8.0).

Для определения фракций, содержащих антитела, а также их активности, аликвоты каждой фракции проверяли в непрямой ИФА. В качестве антигена на иммунологическую плату сорбировали коньюгат пептида с БСА. Фракции, содержащие очищенные антитела (Рис. 6), объединяли и диализовали против фосфатно-солевого буфера.

Рис. 6. ИФА фракций, содержащих антитела после аффинной очистки

Специфичность антител проверяли методом иммуноблоттинга. На денатурирующий ПААГ наносили образец ядерного экстракта клеток линии НеЬа (образцы экстракта были предоставлены профессором Б. Кастнером, Макс Планк институт биофизической химии, Геггинген). После переноса на ПВДФ мембрану и блокирования мест неспецифического связывания мембрану делили на несколько частей и инкубировали соответственно с неочищенной сывороткой, аффинно очищенными антителами или проскоком с аффинной колонки, затем с коньюгатом антител козы против антител кролика с пероксидазой хрена и проявляли (Рис. 7).

На представленных изображениях видно, что во всех трех сыворотках присутствуют сигналы в районах миграции соответствующих белков, а также минорные неспецифические сигналы. После очистки в случае 8РЗЫ 55 и Сёс51 на блоте остаются 2 полосы, соответствующие белку и его фосфоршшрованной форме, а в случае йпи!14 - одна полоса.

aSF3b155 aCdc5l gSnut14

250

ISO ^

**Sf

In

100 i А Ш Л

t

50

f t

• I «

m

I t

* ** .

Рис. 7. Проверка антисыворогок и аффинно очищенных антител на образцах

ядерного экстракта из клеток HeLa. Разведение всех сывороток 1:1000, очищенных антител 1 мкг/мл. Первая дорожка - фрагмент мембраны, окрашенный Понсо С

Таким образом, можно заключить, что нам удалось получить высокоспецифичные антитела, реагирующие как с нормальной, так и с фосфорилированной формами интересующих нас белков. Данные антитела возможно использовать в дальнейших экспериментах по определению профиля фосфорилирования белков сплайсинга.

Определение профиля фосфорилирования белков сплайсинга после работы максимальной аэробной мощности

Для изучения изменения профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков в ответ на работу максимальной аэробной мощности у испытуемых отбирали кровь до и после нагрузок, выделяли из нее мононуклеары и лизировали их. Для этого кровь наслаивали на слой фиколла (примерно четверть от объема крови), центрифугировали, затем собирали слой мононуклеаров и промывали их фосфатно-солевым буфером. Затем осаждали, промывали осадок, добавляли ингибиторы протеаз. Раствор испаряли в вакууме с помощью SpeedVac (Eppendorf, США) до примерно 10 мкл. Затем добавляли 50 мкл 8М мочевины и 20 мкл 4-х кратного буфера для нанесения образцов,

содержащий меркаптоэтанол. Образец кипятили при 97°С 10 мин, затем откручивали I мин при 7000 об/мин. Супернатант наносили на ПААГ электрофорез. Затем делали иммуноблоттинг аналогично контрольным экспериментам с ядерным экстрактом.

до

250

150

100

75

50

I

1. 5РЗЫ55, нефосфорилированный

2. 5ВЫ55, фосфорилированный

Рис. 8. Иммунодетекция белков ЭРЗЫ 55, С6с51, 8пи114 и их фосфоршшрованных форм в экстракте лейкоцитов из крови спортсменов до и после нагрузок. Концентрация всех антител 1 мкг/мл

На Рис. 8 видно, что в случае анти-БпиШ антител в обоих случаях мы видим сигналы примерно одинаковой интенсивности, это подтверждает, что мы нанесли на ПААГ соизмеримое количество белка в составе тотального лизата. В случае же анти-ЭРЗЫ 55 антител распределение полос и соотношение фософорилированных и нефосфорилированых форм белка ЭРЗЫ 55 меняется.

В образце, полученном после физической нагрузки максимальной аэробной мощности, большинство 5РЗЫ55 представлено в фосфорилированной форме (сигнал от немодифицированного белка выделен на рисунке). По всей видимости, это объясняется резко возросшей активностью сплайсинга после начала физических нагрузок.

Увеличившаяся скорость инициации приводит к тому, что в первые минуты развития стресса практически весь имеющийся в клетках белок включается в состав каталитически-активных сплайсосом. Это также подтверждает гипотезу, что возрастающая активность сплайсинга является одним из необходимых механизмов приспособления к работе максимальной аэробной мощности.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в результате нагрузок максимальной аэробной мощности у спортсменов высшей квалификации происходит увеличение экспрессии генов раннего ответа в лейкоцитах периферической крови;

2. Выявлены 5 генов, вовлеченных в процесс пре-иРНК сплайсинга: 00X17, 00X46, Н№ШРЯ, РЮТ4В, БЯРКЗ. Предложена модель участия белков, кодируемых этими генами в каталитическом цикле пре-иРНК сплайсинга;

3. Разработана методика предсказания линейных эпитопов и получены высокоактивные аффинно очищенные антитела против белков, участвующих в сплайсинге: Зпи114, Сс1с51 и 8РЗЫ55. С использованием полученных в работе аффинно очищенных антител против сплайсосомального белка 8РЗЫ55, разработана тест-система фосфорюшрования/дефосфорилирования;

4. На основе анализа образцов мононуклеарных клеток крови спортсменов до и после работы максимальной аэробной мощности показано, что происходит изменение фосфорилирования сплайсосомального белка 8РЗЫ55, что объясняется запуском процессов клеточной адаптации к физической нагрузке.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для детального понимания адаптационных процессов, протекающих в организме спортсменов в результате физических нагрузок высокой интенсивности, следует определять экспрессию иРНК генов раннего ответа;

2. Для оценки комплексной подготовленности спортсменов высшей квалификации к физическим нагрузкам максимальной аэробной мощности на геномном уровне необходимо использовать тест-систему определения сплайсосомальных белков.

3. Для определения уровня подготовленности спортсмена высшей квалификации к нагрузкам максимальной аэробной мощности можно использовать новые высокочувствительные маркеры стресса.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тоневицкий Е.А., Малюченко Н.В., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Мойсенович М.М., Савватеев М.Н., Быков В.А., Кирпичников М.П. Выявление иммунных комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии // Биофизика. -2004 -Т.49. -№6 - С.1008-1014.

2. Тоневицкий Е.А., Малюченко Н.В., Агапов И.И., Певзнер И.Б., Быков В.А., Кирпичников М.П., Тоневицкий А.Г. Исследование рибосом Е. coli и Т. maritima с помощью атомно-силовой микроскопии // Биофизика. - 2006 - Т.51. - №3 - С.440-445.

3. Тоневицкий Е.А., Давыдов Я.И., Розов A.C., Валь М.К., Тоневицкий А.Г. Происхождение эубактерий с тремя димерами белка L7/L12 в рибосоме // Доклады Академии Наук. -2008 -Т.422. -№1 -С.121-125.

4. Тоневицкий Е.А., Гребешок Е.С., Докрунова A.A., Давыдов Я.И., Тоневицкий А.Г. Анализ копийности рибосомального белка L7/L12 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2009-Т. 147. -№5 - С.516-520.

5. Тоневицкий Е.А., Лелянова В.Г., Томпсон Д., Рибчестер P.P., Ушкарев Ю.А. Активация рецепторов а-латротоксина в нервно-мышечных окончаниях приводит к продолжительному всплесковому выбросу ацетилхолина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009 - Т. 147. - №6 - С.639-641.

6. Тоневицкий Е.А., Трушкин Е.В., Шкурников М.Ю., Акимов Е.Б., Сахаров Д.А. Изменение профиля экспрессии генов регуляторов сплайсинга в ответ на физические нагрузки И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009 -Т.147. -№6 - С.674-678.

7. Тоневицкий Е.А., Трушкин Е.В. Модель альтернативного сплайсинга инсулипового рецептора при миотонической дистрофии первого типа // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009 - Т. 147. - №6 - С.716-720.

Подписано в печать 28.05.09 Сдано в производство 28.05.09

Формат бумаги 60x90/16 Бум. Офсетная

Усл.печ.л. 0,8 Усл.-изд.л. 0,9

Тираж 100 Заказ № f

Одной из важнейших задач современной спортивной медицины является изучение адаптации организма к физическим нагрузкам. Физическая активность является комплексным стрессорным фактором и вызывает широкий спектр биофизических и биохимических процессов, таких как увеличение концентрации свободных радикалов, локальную гипертермию, изменение электролитного баланса, повышение концентрации свободных жирных кислот и лактата, изменение уровня гормонов, цитокинов и катехоламинов (Radom-Aizik S., 2008).

Главную роль в активации фенотипической адаптации организма спортсмена на физические нагрузки играют, так называемые, гены раннего ответа (ГРО), основной характеристикой которых является быстрое, кратковременное изменение транскрипции в ответ на стимуляцию. Было показано, что экспрессия ГРО - ключевой фактор, запускающий процессы белкового неосинтеза и последующую экспрессию генов позднего ответа (Buttner Р., 2007), Сахаров Д. 2009).

Известно, что большинство эукариотических генов транскрибируются в виде пре-мРНК, которая затем сплайсируется в мРНК. Сплайсинг — это двухстадийный процесс, в ходе которого путем последовательных трансэтерефикационных реакций некодирующие последовательности — интроны, вырезаются, а кодирующие — экзоны, соединяются вместе. Сплайсосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, в состав которого на разных этапах входят 5 малых ядерных РНК (мяРНК), около 70 белков малых ядерных рибонуклеопротеидных комплексов мяРНП) и более 100 прочих белков. Важным механизмом регуляции всех взаимодействий внутри сплайсосомы является фосфорилирование (Wahl М.С., 2009).

Значимость пре-мРНК сплайсинга была недавно подтверждена результатами исследований по секвенированию генома человека, которые показали, что более 90% генов сплайсируются, из них 80% -альтернативно, образуя несколько сплайсформ, что и объясняет то, как при таком сравнительно небольшом числе генов формируется такое белковое разнообразие.

В ходе последних изучений было обнаружено, что более 50% заболеваний, связанных с мутациями, вызываются нарушениями альтернативного сплайсинга, классические примеры - это спинная мышечная атрофия, таупатия, миотоническая дистрофия и рак (Orengo J.P., 2008).

Однако, несмотря на глобальную вовлеченность сплайсинга в процессы жизнедеятельности организма, исследования влияния интенсивных физических нагрузок на функционирование и регуляцию сплайсинга до сих пор не были проведены. Лучшее понимание приспособительных механизмов организма, связанных с ответом на физическую нагрузку может обеспечить основу для предотвращения перетренированности, синдрома хронической усталости, для варьирования тренировочного режима в соответствии с индивидуальными особенностями организма спортсмена.

Гипотеза:

Предполагается, что интенсивные физические нагрузки приводят к запуску процессов срочной адаптации организма спортсмена — происходит увеличение экспрессии генов раннего ответа. Как следствие, возрастает активность сплайсинга: меняется профиль экспрессии генов сплайсосомальных белков и происходит изменение регуляции сплайсинга. Определение экспрессии мРНК и профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков позволит оценивать эффекты физических нагрузок на генном уровне.

Цель исследования:

Оценка влияния физических нагрузок максимальной аэробной мощности на изменение экспрессии мРНК генов регуляторов сплайсинга, а также на возможные изменения профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков в процессах срочной адаптации.

Задачи исследования:

1. Исследовать изменение экспрессии мРНК генов раннего ответа у высококвалифицированных спортсменов в ответ на работу максимальной аэробной мощности;

2. Изучить влияние работы максимальной аэробной мощности на экспрессию мРНК генов регуляторов сплайсинга, белков мяРНП и сплайсосомальных комплексов в лейкоцитах крови спортсменов;

3. Разработать методику предсказания потенциальных эпитопов в сплайсосомальных белках, получить поликлональные антитела против предсказанных пептидов;

4. Проанализировать изменения в фосфорилировании сплайсосомального белка 8РЗЬ155 у спортсменов до и после нагрузочного тестирования.

Объект исследования:

Молекулярно-биологические механизмы адаптации высококвалифицированных спортсменов к работе максимальной аэробной мощности.

Предмет исследования:

Комплекс структурных и регуляторных белков сплайсосомы человека и экспрессия их мРНК при физических нагрузках.

Научная новизна:

Впервые у спортсменов высшей квалификации, до и после работы максимальной аэробной мощности было проведено исследование экспрессии мРНК генов белков, вовлеченных в сплайсинг. Выявлены потенциальные регуляторы процессов адаптации сплайсосомы при физических нагрузках, которые принимают участие в начальной стадии сборки сплайсосомы, при распознавании интронов и при переходе от пре-каталитической к активированной форме.

Впервые показано, что ускорение сборки сплайсосомы и/или переход к альтернативным сплайс-сайтам являются основными путями раннего приспособления организма к физическим нагрузкам.

Разработан новый алгоритм предсказания линейных В-клеточных эпитопов, основанный на частоте встречаемости аминокислотных пар, не уступающий описанным в литературе методам.

Впервые произведен анализ изменения в профиле фосфорилирования сплайсосомы в зависимости от физических нагрузок. Было показано, что в ответ на работу максимальной мощности происходит резкое увеличение соотношения фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка 8РЗЬ155, являющегося маркером каталитически активной сплайсосомы.

Теоретическая значимость:

Данная работа направлена на изучение фундаментальных основ процессов клеточной жизнедеятельности, функционирования первичных механизмов приспособления клеток человека к физиологическому стрессу, вызванному кратковременными высокоинтенсивными физическими нагрузками.

В условиях нагрузочного тестирования выявлены потенциально ключевые факторы регуляции инициации сплайсинга. Предложена модель, отражающая их участие в адаптации сплайсосомы к стрессу, вызванному физическими нагрузками.

Разработанные методики анализа фосфорилирования сплайсосомальных белков позволят понять механизмы воздействия физического стресса на процессы сплайсирования, разработать системы компенсаций его негативных последствий на самом раннем этапе их проявления, что в свою очередь востребовано в рамках современной восстановительной медицины.

Практическая значимость:

Практическая значимость работы заключается в разработке высокочувствительного метода оценки развития клеточного стресса в результате нагрузки высокой интенсивности. Метод основан на измерении соотношения фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка 8РЗЬ155 в экстракте лейкоцитов крови спортсменов до и после нагрузочного тестирования.

Разработанный метод предсказания линейных эпитопов может быть использован в дальнейшем для разработки тест-систем определения биомаркеров утомления и физиологического стресса.

Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова, что подтверждено актами внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Работа максимальной аэробной мощности приводит к увеличению экспрессии иРНК генов сплайсосомальных белков в лейкоцитах крови у спортсменов высшей квалификации;

2. В условиях высокоинтенсивных физических нагрузок максимальное изменение экспрессии происходит у генов регуляторов инициаторной стадии сплайсинга;

3. После нагрузочного тестирования у спортсменов соотношение фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка 8РЗЫ55 в крови увеличивается, что может служить высокочуствительным ранним маркером стресса.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, итогового заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Последний включает 120 источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 9 таблицами.

Выводы

1. Выявлена группа генов регуляторов сплайсинга, экспрессия мРНК которых увеличивается в лейкоцитах периферической крови у спортсменов в ответ на работу максимальной аэробной мощности. Все гены относятся к белкам, принимающим участие на начальных стадиях сборки сплайсосомы.

2. Разработан новый метод предсказания антигенности белков, основанный на анализе частоты встречаемости аминокислотных пар в эпитопах и неэпитопах.

3. Получены, аффиноочищены и охарактеризованы высокоактивные специфические антитела против сплайсосомальных белков 8РЗЫ55, 8пи114, Сс1с51. Они могут применяться в ИФА, иммуноблотинге и иммуноф лу оресценции.

4. С помщью полученных антител проанализировано соотношение фосфорилированной и нефосфорилированной форм белка 8РЗЫ55 в лейкоцитах подготовленных спортменов до и после работы максимальной аэробной мощности.

5. Представлена математическая модель, описывающая нарушения альтернативного сплайсинга экзона 11 инсулинового рецептора при миотонической дистрофии первого типа.

Практические рекомендации

1. Для детального понимания адаптационных процессов, протекающих в организме спортсменов в результате физических нагрузок высокой интенсивности, следует определять экспрессию мРНК генов раннего ответа;

2. Для оценки комплексной подготовленности спортсменов высшей квалификации к физическим нагрузкам максимальной аэробной мощности на геномном уровне необходимо использовать тест-систему определения сплайсосомальных белков.

3. Для определения уровня подготовленности спортсмена высшей квалификации к нагрузкам максимальной аэробной мощности можно использовать новые высокочувствительные маркеры стресса.