Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Влияние физических нагрузок на концентрацию ростовых факторов человека

003467045

На нравах рукописи

Сахаров Дмитрий Андреевич

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗОК НА КОНЦЕНТРАЦИЮ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.51 - восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003467045

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта.

Научный руководитель:

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г.Москвы

Защита диссертации состоится «29» апреля 2009 в 13:30 на заседании диссертационного совета Д.311.002.01 при Федеральном Государственном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу:

105005, Москва, Елизаветинский пер. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта

Автореферат разослан «27» марта 2009 г.

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Тоневицкий Александр Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Абрамова Тамара Федоровна

доктор биологических наук, профессор Сонькин Валентин Дмитриевич

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., проф.

Пономарева А. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Физические нагрузки являются одним из основных стимулов активации системы гормон роста (ГР) - инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР) (Nindl В.С 2007, Sonksen Р.Н. 2007), играющей важную роль в процессах клеточного роста и развития. В крови присутствует несколько сплайс-изоформ гормона роста и инсулиноподобного фактора роста (Baumann G. 1991). Сплайсинг их пре-мРНК осуществляется в ядре клетки при участии сплайсосомы - мегадальтонного комплекса между РНК и белками. Известно, что различные стрессорные факторы оказывают влияние на функционирование сплайсосомы и могут приводить к изменению ее активности или нарушениям сплайсинга. Таким образом, исследование влияния физического стресса на процесс сплайсинга гормона роста, соотношение его изоформ в крови, а также в целом на систему ростовых факторов является современной задачей восстановительной и спортивной медицины.

Известно, что физические нагрузки разной интенсивности приводят к запуску большого количества биохимических, молекулярных и генетических механизмов, лежащих в основе адаптационных реакций организма на физиологический стресс (Hawley J.А. 2007). Процессы адаптации организма к кратковременным высокоинтенсивным физическим нагрузкам связаны как с появлением изоформ ростовых факторов, так и с активацией системы генов ранней ответа (ГРО) и привлекают все больше внимания исследователей (Connolly Р. 2004, Mooren F.C. 2007).

Начальными активаторами ГРО являются стрессорные факторы, связанные с физической нагрузкой (гипотермия, ишемия, метаболический стресс, изменение электролитного баланса и т.п.), которые могут воздействовать на экспрессию ГРО как напрямую, так и опосредованно - через гуморальную систему и ЦНС (Simon Р. 2006).

Результатом работы сигнальных каскадов ГРО является активация транскрипции большого количества генов; она является пусковым звеном в механизмах белкового неосинтеза, а также активации т.н. «поздних генов», формирующих специфический фенотипический ответ организма на стресс.

Процессы активации системы ростовых факторов и генов раннего ответа, протекающие в организме спортсмена в первые минуты интенсивной физической нагрузки, в литературе не описаны, и их изучение весьма актуально и проводится впервые.

Гипотеза:

Предполагается, что работа максимальной аэробной мощности проводит к запуску процессов срочной адаптации организма: происходят изменения концентраций ростовых факторов в крови и увеличивается экспрессия генов раннего ответа. Мониторинг концентраций ростовых факторов и экспрессии мРНК генов раннего ответа в условиях физиологических тестирований различной интенсивности представляет собой новую диагностическую технологию оценки функциональных резервов организма.

Цель исследования:

Оценка влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов человека: гормона роста и инсулиноподобного фактора роста 1, а также на экспрессию мРНК генов раннего ответа.

Задачи исследования:

1. Получение моно- и поликдональных антител против рекомбинантного гормона роста человека и разработка иммуноферментной (ИФА) тест-системы определения его концентрации в сыворотке крови человека.

2. Разработка методов и подходов к определению соотношения изоформ гормона роста в сыворотке крови человека.

3. Определение изменения концентрации гормона роста и его изоформ, инсулиноподобного фактора роста 1 и инсулиноподобного фактор роста связывающего белка 3 (ИФРСБЗ) после нагрузок максимальной аэробной мощности.

4. Анализ экспрессии мРНК генов раннего ответа в лейкоцитах крови спортсменов до и после работы максимальной аэробной мощности.

Объект исследования:

Процессы адаптации организма спортсмена высшей квалификации к нагрузкам максимальной аэробной мощности.

Предмет исследования:

Система ростовых факторов человека: гормон роста - инсулиноподобный фактор роста, и экспрессия мРНК генов раннего ответа в стрессовых условиях.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное исследование влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов и генов раннего ответа человека.

Разработана иммуноаффшшая методика определения юоформ гормона роста в сыворотке крови, а также ИФА тест-система определения его суммарной концентрации с использованием полученных моно- и поликлональных антител против рекомбинантного гормона роста (рГР).

Проанализированы образцы сывороток спортсменов после работы максимальной аэробной мощности и впервые показано, что концентрация ГР значительно увеличивается после нагрузки, а соотношение изоформ ГР остается неизменным. Концентрация ИФР1 в сыворотке выше у более подготовленных спортсменов; также наблюдается тенденция к увеличению общего содержания ИФР1 и ИФРСБЗ после нагрузки.

Впервые проведено исследование экспрессии на мРНК-чипах всех генов человека до и после нагрузки максимальной аэробной мощности и определены группы генов, вовлеченных в ранний ответ организма на физический стресс.

Теоретическая значимость:

Работа направлена на решение фундаментальных проблем адаптации организма спортсмена к нагрузкам максимальной аэробной мощности. Изучены процессы ответа организма на стресс, а также запуск механизмов активации генов ранней экспрессии. Разработанные методики определения концентрации и соотношения изоформ гормонов могут позволить детально изучить влияние физиологического стресса на систему ростовых факторов, что важно для мониторинга утомления и восстановления в современной восстановительной медицине.

Практическая значимость:

Разработанные методики определения ростовых факторов могут быть использованы для оценки подготовленности спортсмена к нагрузкам различной интенсивности и применяться в диагностике нарушений и патологий.

Используемые подходы к детектированию изоформ гормона роста могут быть применены в анализе биологических образцов на присутствие экзогенных субстанций, при допинг-контроле сложных полипептидных субстанций.

Методики оценки экспрессии мРНК генов раннего ответа необходимы при разработке новых подходов к мониторингу физического состояния спортсмена,

процессов тренировки и восстановления; проведении анализа воздействия нагрузок на организм и оценке его функциональных резервов. Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ им. М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении. Также перспективным является внедрение результатов настоящей работы в диагностических и лечебно-профилактических медицинских учреждениях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Работа максимальной аэробной мощности активирует систему ростовых. факторов и приводит к значительному увеличению содержания гормона роста в крови. У подготовленных спортсменов с более высоким максимальным потреблением кислорода концентрация гормона роста после нагрузки достоверно выше.

2. Работа максимальной аэробной мощности не является стимулом для изменения соотношения изоформ гормона роста в сыворотке крови.

3. Базальный уровень инсулиноподобного фактора роста 1 выше у более подготовленных спортсменов, что может служить критерием оценки специальной подготовленности.

4. Ранний ответ организма на стресс, вызванный работой максимальной аэробной мощности, обеспечивают гены, задействованные в процессах передачи клеточных сигналов.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 138. страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, итогового заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Последний включает 215 источников, из которых 30 опубликованы в отечественных изданиях, 185 - в иностранных. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 10 таблицами.

МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Методы исследования

В исследованиях в качестве модельной нагрузки использовали нагрузку до отказа со ступенчато повышающейся мощностью. В исследовании участвовали 52 подготовленных спортсмена (мужчины, п=52,21.2±3.6 лет, 73.2±15.6 кг, 175.7±18.7 см).

Нагрузочное тестирование проводили на велоэргометре Monak 894Е (Creative Health Products) или на беговой дорожке Venus (h/p/Cosmos).

Пульсовые показатели регистрировали с помощью монитора сердечного ритма S810 (Polar). Для анализа параметров газообмена на разных этапах исследования применяли газоанализатор Oxycon Pro (Viasis).

Концентрацию лактата определяли с использованием автоматического анализатора глюкозы и лактата CJLine (Biosen). Концентрацию биомаркеров в сыворотке (КФК, АЛТ, ACT и др.) определяли на автоматическом биохимическом анализаторе HumaStar 300 (Human).

Концентрации инсулиноподобного фактора роста 1, инсулиноподобного фактора роста связывающего белка 3 и кортизола определяли с помощью коммерческих наборов EIA 4140, EIA 3300, EIA 1887 (DRG Instruments), соответственно.

Двумерный электрофорез проводили с использованием системы изоэлектронной фокусировки ElectrophoretlQ (Proteome Systems), для разделения по второму направлению применяли камеру Proteome Systems. Иммуноблоттинг осуществляли на Semi-Dry Trans Blott cell (Bio-Rad).

Моно- и поликлональные антитела получали из сыворотки крови после иммунизизации лабораторных животных: мыши и кролика, соответственно.

Полученные в работе данные обрабатывали с использованием статистических пакетов STATISTICA 7 (StatSoft), Sigma Plot 8.0 (SPSS), а также программных пакетов Affymetrix. Для определения достоверности различий между уровнями исследуемых параметров использовали U критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0.05.

Организация исследования

Диссертационная работа состоит из пяти этапов:

1этап: Получение моноклональных антител мыши и поликлональных аффинно очищенных антител кролика против рекомбинантного гормона роста человека.

П этап: Разработка и тестирование иммуноферментной тест-системы определения гормона роста в сыворотке крови человека.

III этап: Разработка методики определения изоформ гормона роста в сыворотке крови человека.

IV этап: Проведение нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью и определение концентрации ростовых факторов: ГР и его изоформ, ИФР1, ИФРСБЗ, а также основных биохимических маркеров.

V этап: Определение уровня экспрессии мРНК ранних генов в лейкоцитах

крови в ответ на работу максимальной аэробной мощности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Антитела против рекомбинантного гормона роста

Задачей первого этапа исследования являлось получение, наработка и очистка антител против рекомбинантного гормона роста человека. Высокоактивные очищенные антитела необходимы для использования в ИФА тест-системах и в экспериментах иммуноблоттинга.

Для получения моноклональных антител мышей линии Balb/c иммунизировали рекомбинантным гормоном роста. Иммунизацию для усиления иммунного ответа проводили в присутствии адьювантов Фрейнда, затем проводили многократную стимуляцию антигенами в фосфатно солевом буфере (ФСБ).

Гибридомы получали слиянием спленоцитов иммунных мышей (Balb/c) с миеломой Sp2/0 в ПЭГ. Миелому культивировали на среде RPMI1640, первичные гибридомы отбирали на среде HAT. Супернатанты скринировали в ИФА. Отобранные гибридомы многократно клонировали методом лимитирующих разведений, и переводили сначала па среду НТ, затем на RPMI1640. Асцитные жидкости получали от мышей, которым внутрибрюшинно вводили клетки гибридом, продуцирующих антитела. Затем из асцитных жидкостей выделяли антитела против гормона роста осаждением сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

Для получения поликлональных антител кролики были иммунизированы рекомбинантным гормоном роста человека. Сыворотки после четвертой иммунизации объединяли для последующего выделения антител на аффинном сорбенте, содержащем ковалентно иммобшшзированный рекомбинантный ГР (рГР) (2.25 мг/мл). Поликлоиальные сыворотки очищали на колонке, содержащей 2 мл аффинного сорбента, антитела элюировали раствором глицина (pH 2.0) и нейтрализовали.

Для последующего использования в ИФА все антитела переводили в фосфатно-солевой буфер и биотинилировали. Для оптимизации методики ИФА были получены конъюгаты антител с пероксидазой хрена. Для этого к раствору активированной перйодатом натрия пероксидазы хрена в слабощелочной среде прибавляли раствор

антител. Образовавшееся основание Шиффа восстанавливали тетраборатом натрия. Полученный конъюгат диализовали относительно ФСБ.

Чистота всех полученных антител была проверенна на ПААГ электрофорезе, а активность - в ИФА с антигеном на плате и в растворе. Полученные антитела использовали на последующих этапах работы для создания ИФА тест-системы и методики определения изоформ гормона роста.

ИФА тест-система определения гормона роста

Определение концентрации ростовых факторов в сыворотке возможно с применением конкурентного или «сэндвич» ИФА методов. Сэндвич-ИФА используют для определения крупных антигенов, содержащих, по крайней мере, два эпитопа. При отсутствии лимитирующих факторов в сэндвич-анализе в рабочем диапазоне метода должна существовать прямая линейная зависимость между величиной сигнала и концентрацией гормона в пробе. При помощи конкурентного ИФА определяют антигены небольшой молекулярной массы с единственным эпигоном.

Анализ аминокислотной последовательности гормона роста человека показал, что в белке присутствуют несколько иммуногенных областей и вероятных эпитопов. Таким образом, для его определения целесообразно использовать сэндвич-ИФА метод.

Моно- и поликлональные антитела против гормона роста, а также биотинилированные антитела были проверены в разных комбинациях в сэндвич-ИФА методе определения гормона роста в сыворотке крови. Активность конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой хрена проверяли в ИФА с антигеном на плате и антигеном в растворе. Тигр антител был не ниже 1-10000

Наибольшей чувствительности удалось добиться с использованием сорбированных на плате аффинно очищенных поликлональных антител и биотинилированных поликлональных антител. Их применение позволяет детектировать все изоформы ГР, т.к. поликлональные антитела направлены к разным эпитопам антигена.

На тест-планшет для ИФА сорбировали аффинно очищенные поликлональные антитела кролика против рГР (2.5 мкг/мл в растворе ФСБ/Твин-20/БСА, 50 мкл в лунку). После стадий отмывки и блокирования мест неспецифичесхого связывания, на плату наносили 50 мкл исследуемых сывороток и стандарты (0 - 50 нг/мл рГР) в растворе ФСБ/Твин-20/БСА, добавляли 100 мкл биотинилированных аффинно очищенных поликлональных антител кролика против рГР (5 мкг/мл в ФСБ/Твин-20/БСА) и инкубировали в течение часа при +37°С. Затем, после отмывки, проводили

часовую инкубацию с конъюгатом стрептавидияа и пероксидазы хрена (0.1 мкг/мл в ФСБ/Твин-20/БСА). Для детектирования пероксидазной реакции использовали растворы орто-фенилендиамина/Н^Ог или тетраметилбензидина/НгОг в цитратно-фосфатном буфере. Развитие окраски останавливали через 10 мин IM H2SO4. Оптическую плотность измеряли на планшетном ИФА спектрофотометре xMark (BioRad) при длинах волн 492 и 450 нм доя срткт-фешшендаамина и тетраметилбензвдина, соответственно.

Чувствительность разработанной ИФА тест-системы позволяет определять ГР в диапазоне концентраций 0.1-50 нг/мл. Было проведено сравнение этой системы с коммерческим аналогом - ИФА тест-системой EIA 1787 (DRG Instruments). Показано, что разработанная система не уступает коммерческой в чувствительности, и ее использовали в дальнейших экспериментах.

Определение изоформ гормона роста в сыворотке крови

Для определения изоформ ГР в сыворотке крови был разработан метод, основанный на двумерном ПААГ электрофорезе и иммуноблоттинге с предварительным концентрированием образца на аффинном сорбенте.

Выделение ГР из образцов сывороток проводили на аффинном сорбенте, содержащем ковалентно иммобилизированные аффинно очищенные поликпональные антитела против рГР. Концентрацию антител варьировали от 0.1 до З.Омг/мл. Наилучшие результаты были получены при использовании сорбента с концентрацией иммобилизированных антител 0.2 мг/мл.

Исследуемую сыворотку пропускали через колонку, содержащую 1 мл данного сорбента. Неспецифически связанные белки удаляли, и ГР элюировали. После нейтрализации образец концентрировали в центрифужных пробирках Amicon UItra-4 (Millipore) до финального объема 50 мкл. Потери ГР при этом составляли не более 10% суммарного ГР.

Изоэлектронная фокусировка была проведена на 11 см геле с иммобилизированным градиентом pH 4.7-5.9 (Bio-Rad). Выбранный узкий диапазон pH на геле 4.7-5.9, позволил увеличить разрешение по первому направлению и разделять различные пост-трансляционные формы 22 кДа изоформы (изоэлектрическая точка рекомбинантного ГР 5.4).

После уравновешивания белков, разделенных по изоэлектрической точке, проводили электрофорез на гелях с градиентом плотности 8-16%, для увеличения

разрешения в области низких молекулярных масс, с последующим полусухим переносом на PVDF мембрану lmmobilon-P (Millipore).

Мембраны обрабатывали блокирующим раствором и инкубировали с аффинно очищенными поликлональными антителами кролика против рГР в течение часа. После стадий отмывки проводили инкубацию с конъюгатом пероксидазы хрена с поликлональными антителами козы против иммуноглобулинов кролика. Оптимальная концентрация антител и конъюгатов была подобрана в экспериментах дот-блоттинга. Разведения 1-3000 (0.33 мкг/мл) и 1-7500 (0.13 мкг/мл) для антител и конъюгатов, соответственно, были использованы во всех экспериментах иммуноблотгинга.

Детекцию образцов проводили с помощью хемилюминесцентного набора ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare). Длительность экспозиции варьировали от 5 до 120 сек.

С целью подтверждения линейности иммуноаффинного метода определения соотношения изоформ ГР был использован метод добавок. Для этого в сыворотку, содержащую 0.1 нг/мл ГР (по данным ИФА), добавляли 5, 15, 25 и 40 нг рГР. Сыворотки анализировали по стандартной методике (Рис. 1.1). После оцифровки изображений был построен график зависимости интенсивности сигнала от количества рГР и подтверждена линейность метода в диапазоне 5-40 нг/мл ГР (Рис. 1.11). Таким образом, данный метод возможно использовать для определения основных изоформ ГР в сыворотке крови человека.

0 -:-■-1-.-

0 10 20 30 40 50

Количество добавленного рГР, нг/мл

Рис. 1. Иммунодетекция ГР, добавленного в сыворотку в разных концентрациях (I) (1 - 5 нг, 2 - 15 нг, 3 - 25 нг, 4-40 нг), и калибровочная кривая (II) после оцифровки изображений.

Методом двумерного электрофореза и иммуноблоттинга были проанализированы сыворотки спортсменов до и после нагрузочного тестирования. На Рис. 2. представлены примеры изображений (выдержка 60 сек). Интенсивности сигналов 22 кДа и 20 кДа изоформ определяли с помощью программного пакета Quantity One (Bio-Rad). Время экспозиции подбирали таким образом, чтобы интенсивность сигнала 22 кДа изоформы не выходила за диапазон измерений.

5.0 5.5 5.0 5.5

Рис. 2. Иммунодетекция изоформ гормона роста в сыворотке крови человека до (I) и после (II) нагрузочного тестирования Концентрация ГР 1.5 и 15 нг/мл, соответственно.

Соотношение 22 кДа/20 кДа во всех проанализированных образцах составляло 10±2 как до, так и после нагрузочного тестирования и достоверных различий обнаружено не было.

Необходимо отметить, что при анализе аффинно выделенных образцов ГР не удалось детектировать 17кДа и меньшие изоформы, которые составляют до 5% циркулирующего ГР в сыворотке (Baumann G. 1991). Вероятно, для их анализа необходимо значительное увеличение чувствительности метода наряду с увеличением эффективности выделения ГР из сыворотки.

Для увеличения точности определения соотношения изоформ гормона роста был использован метод внутреннего стандарта (Рис. 3) Для этого в исследуемые сыворотки перед нанесением на аффинный сорбент добавляли известное количество лактогена (Рис. 3, пятно а).

IEF, pi

IEF, pi

Mr, kDa

/>:>': ■ . ■ v

TT

Рис. 3. Иммунодетекция изоформ гормона роста в сыворотке крови человека. Общее содержание ГР: I - 0.5 нг/мл, II - Юнг/мл, III - 0.7 нг/мл, IV - 0.1 нг/мл, (1: 22 кДа ГР, 2: 20 кДа ГР, 3: фосфорилированный 22 кДа ГР, 4: 24 кДа ГР, а: лактоген)

Изображения оцифровывали, и интенсивность пятен изоформ гормона роста нормализовали на площадь пятна лактогена. В дальнейшем сравнивали нормализованные площади пятен изоформ гормона роста. Использование внутреннего стандарта позволило увеличить точность определения изоформ гормона роста в сыворотке крови. С использованием данного метода, возможно определять ГР в случаях, когда его концентрация не превышает 0.5 нг/мл, однако достоверных различий в соотношении изоформ ГР до и после работы максимальной аэробной мощности также выявлено не было.

Таким образом, в результате работы максимальной аэробной мощности не происходит значительного перераспределения изоформ гормона роста. Вероятно, для выявления таких различий требуется еще более значительное увеличение чувствительности системы определения и накопление обширных статистических данных.

Концентрация ростовых факторов после нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью

Участники исследования, спортсмены квалификации не ниже KMC, дали письменное информированное согласие на проведение экспериментов и использование полученных результатов. Перед каждым нагрузочным тестированием проводили осмотр кардиологом и регистрацию ЭКГ.

Все участники исследования (мужчины, п=52, 21.2±3.6лет, 73.2±15.бкг, 175.7±18.7 см) подвергались нагрузочному тестированию. Работу со ступенчато повышающейся мощностью проводили на беговой дорожке или велоэргометре. В процессе упражнения измеряли показатели газообмена, давление, частоту сердечных сокращений, концентрацию лактата и рассчитывали значение максимального потребления кислорода (МПК). Тест продолжали до невозможности поддерживать спортсменом заданную скорость ленты, венозную кровь отбирали до и после тестирования.

По данным потребления кислорода и концентрации лактата рассчитывали индивидуальный порог анаэробного обмена (ПАНО) для спортсменов, а также время работы после анаэробного порога. По концентрации лактата (4 мМоль/л) определяли ПАНО и рассчитывали время работы после анаэробного порога. Среднее значение МПК составляло 64.0±7.2 мл/мин/кг.

Сыворотки всех спортсменов до и после физической нагрузки анализировали на содержание кортизола, КФК, ACT, АЛТ и других биохимических маркеров для стандартизации полученных результатов и оценки общего физического состояния спортсменов.

Известно, что КФК, ACT и АЛТ обнаруживается в сыворотке при повреждении мышечных волокон. По данным КФК, АЛТ и ACT признаков повреждения кардиомиоцитов и скелетных мышц у спортсменов до начала и после окончания тестирования не выявлено. Наблюдали лишь незначительное увеличение активности ферментов, что может свидетельствовать о минимальных повреждениях мышечных клеток. Существенных отличий между спортсменами по данным показателям во всех исследованиях не наблюдали.

Кортизол играет ключевую роль в защитных реакциях организма на стресс. Он обладает катаболическим действием и его количество в крови и слюне может служить маркером стресса организма. Концентрация кортизола в крови и слюне у спортсменов после тестирования достоверно увеличивалась. Значения других биохимических показателей спортсменов были в пределах средне-популяционных значений. Таким образом, в исследовании принимала участие гомогенная группа спортсменов.

Во всех образцах определяли концентрацию гормона роста с использованием разработанной ИФА тест-системы, а также уровень ИФР1 и ИФРСБ 3. Было найдено, что уровень ГР после нагрузки максимальной аэробной мощности значительно

увеличивается (Рис. 4). Тогда как достоверных различий в уровне ИФР1 и ИФРСБЗ обнаружено не было.

ю

а

1 1 в ь

к

I 4

I

о

Рис. 4. Концентрация ГР до и после работы максимальной аэробной мощности (Среднее значение ± стандартное отклонение, /КО,001).

На основании данных МПК/кг участники тестирования были разбиты на две группы: группа 1 - МПК/кг < 60, группа 2 - МПК/кг > 60 (Табл. 1). После распределения спортсменов в две группы были обнаружены статистически достоверные отличия во времени работы и МПК/кг. Достоверных различий в возрасте, весе и росте испытуемых не было.

Таблица 1. Участники исследования

Участники исследования Количество человек Возраст, лет Вес, кг Рост, см Время работы, мин* МПК/кг**

Группа 1 15 21.0±3.6 69.9±6.5 176.6±7.0 14:34±1:20 58.9±5.2

Группа 2 36 21.4±3.7 71.3±6.5 178.9±5.9 16:47±3:13 68.5±4.9

*р < 0.05, **р<0001

Таким образом, в исследовании были сформированы две группы спортсменов, отличающиеся друг от друга только по уровню МПК/кг

После анализа данных по концентрации ГР, ИФР1 и ИФРСБЗ в двух сформированных группах было обнаружено, что базальный уровень ГР в них одинаковый, тогда как концентрация ГР после нагрузочного тестирования достоверно

выше в группе более подготовленных спортсменов (р<0.01) (Рис. 5). Выявлена положительная корреляция уровня ИФР1 покоя и МПК/кг (р<0.01). Статистически достоверных отличий уровня ИФР1 после нагрузки обнаружено не было, однако наблюдается тенденция более высокого уровня в группе подготовленных спортсменов (Рис. 6).

8

Группа

Рис. 5. Концентрация ГР в двух группах спортсменов до и после тестирования (Среднее значение ± стандартное отклонение, отличие групп *р<0.01).

ШЗ ЙФР1 до И ИФР1 после

Группа

Рис. 6. Концентрация ИФР1 в двух группах спортсменов до и после тестирования (Среднее значение ± стандартное отклонение, отличие групп **р<0.01).

Таким образом, работа максимальной аэробной мощности является стимулом активации системы ГР-ИФР1. Секреция ГР в кровь начинается через 5-10 мин после

начала физических упражнений и достигает максимума через 15-30 мин. Нагрузочное тестирование длилось в среднем 13-20 мин, однако время работы после ПАНО у всех спортсменов составляло 3-4 мин, и, таким образом, спортсмены двух групп испытали одинаковый по интенсивности стресс. В связи с этим можно сделать предположение, что концентрация ГР была измерена во время пика секреции. Высокий разброс значений после упражнений свидетельствует об индивидуальности гормонального ответа на высокоинтенсивные упражнения.

В результате нагрузки наблюдался достоверно больший выброс ГР в кровь и повышенный базальный уровень ИФР1 у спортсменов с более высоким МПК. Вероятно, данные различия связаны с тем,.что у более подготовленных спортсменов в течение дня имеются больше стимулов активации синтеза и накопления ГР в соматотропных клетках гипофиза, в связи с чем в пик секреции ГР выбрасывается больше, что приводит к увеличению концентрации ИФР1. Стимулами активации системы ГР-ИФР1 могут служить, как и регулярные высокоинтенсивные тренировки, так и большая доля мышечной массы и, особенно, меньшая масса жира в организме, ведь известно, что тучность негативно ассоциирована с дневной продукцией ГР гипофизом.

Таким образом, уровень ростовых факторов в крови после нагрузки максимальной мощности может быть маркером оценки подготовленности спортсменов.

Экспрессия мРНК ранних генов в ответ на работу максимальной аэробной мощности

Физическая нагрузка высокой интенсивности приводит к запуску процессов экстренной адаптации организма. Ключевую роль в их регуляции играет активация системы генов раннего ответа. Основной особенностью ГРО является быстрое изменение их экспрессии в ответ на широкий ряд стрессорных факторов.

Для анализа экспрессии мРНК генов раннего ответа был выбран современный метод, основанный на гибридизации меченных олигонуклеотидов на чипе и детекции флюоресценции комплиментарных проб. Данный метод позволяет оценивать экспрессию мРНК всех генов человека и проводить широкий скрининг адаптационных процессов в организме.

Основные признаки генов раннего ответа:

1. Активация напрямую через стрессорные факторы либо через внутриклеточные сигнальные каскады.

2. Быстрое изменение экспрессии (самое раннее - через 10 мин после начала интенсивной физической нагрузки). Верхней границей временного интервала условно считаются 30 мин.

3. Регуляция экспрессии большого количества других, более «медленных» генов, определяющих специфический ответ.

4. Быстрая инактивация после окончания воздействия стрессового фактора

Исследование экспрессии мРНК генов раннего ответа проводили у 5 спортсменов (мужчины, п=5, 18.6±1.9лет, 67.4±4.6кг, 176.4±6.2 см). Для этого дополнительно до и после нагрузочного тестирования на беговой дорожке у добровольцев отбирали кровь для выделения мРНК.

Тотальную мРНК выделяли согласно протоколу производителя с использованием набора PAXgene Blood RNA Kit. Для исключения отжига праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной мРНК - RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer. Для всех образцов РНК RIN превышает 8.

Меченая кРНК была синтезирована согласно протоколу, рекомендованному Affymetrix. 100 нг тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов крови, были использованы в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной кДНК. Часть полученной кДНК была использована для синтеза биотин-меченной кРНК методом обратной транскрипции.

Полученная биотинилированная кРНК была фрагментирована на участки длиной 70-100 нуклеотидов и гибридизована на чипе HuGene 1.0 ST Array (Affymetrix) при температуре 45°С и перемешивании в течение 16 ч в гибридизационной печи. После гибридизации чипы были отмыты от несвязавшейся кРНК и окрашены стрептавидин-фикоэритрином на станции Fluidics Station 450 (Affymetrix). Окрашенные чипы сканировали на сканере GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

Оценку качества гибридизации, отмывки и окрашивания чипов производили с помощью программного пакета Gene Expression Console (Affymetrix). Все внутренние контроли на чипах соответствовали нормам, указанным производителем.

Данные сканирования, полученные с помощью Gene Expression Console (Affymetrix) и представляющие собой интенсивности проб, были отфильтрованы по двум критериям:

1) Интенсивность более чем 25% проб гена превышает 100.

2) межквартильный интервал (IQR) > 0.25

Данным условиям удовлетворяло 1109 генов. Для коррекции значений вероятности с учетом множественных сравнений была использована поправка Бенжамини-Хохберга. Сравнивали усредненные экспрессии мРНК всех 5 спортсменов в образцах до и после физической нагрузки максимальной аэробной мощности. После статистической обработки полученных данных, был сформирован список из 118 генов, экспрессия которых у всех испытуемых достоверно увеличилась или уменьшилась в 1.3 раза или более (111 генов с увеличенной экспрессией и 7 генов со сниженной) (рх0.05).

Функциональное кластерирование с помощью системы DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) показало, что большинство отобранных генов можно отнести к следующим группам: системы внутриклеточной передачи сигнала, регуляция пролиферации и апоптоза, клеточный ответ на стресс (Табл. 2). К менее многочисленным группам относятся гены, регулирующие транскрипцию, клеточную дифференциацию, иммунный ответ, а также медиаторы воспаления.

Таблица 2. Группы генов раннего ответа

Функциональная группа Количество генов

Системы внутриклеточной передачи сигналов 35

Регуляция пролиферации и апоптоза 27

Клеточный ответ на стресс 18

Физическая нагрузка максимальной аэробной мощности является комплексным стрессорным фактором, в состав которого входят такие компоненты как увеличение концентрации свободных радикалов, локальная гипертермия, изменения электролитного баланса, ацидоз, вызванный накоплением лактата в крови, повышение концентрации свободных жирных кислот. Данные факторы могут оказывать влияние на экспрессию генов раннего ответа как напрямую, так и опосредованно, через активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, в первую очередь - киназного каскада МАРК.

В эксперименте по исследованию генов раннего ответа у обследуемых при нагрузке максимальной аэробной мощности был сформирован физиологический стресс, характерный для многих видов спортивных соревнований. Длительность нагрузки у спортсменов составляла 15.0±0.5 мин. Данный интервал времени является относительно коротким, однако представляется достаточным для активации экспрессии генов раннего ответа. Кроме того, небольшая продолжительность нагрузки позволяет

отделить гены раннего ответа от генов, экспрессия которых увеличивается более чем через 30 мин после стимула.

Из 118 генов, экспрессия которых изменилась в результате нагрузки, наиболее интересны гены киназ, а также гены стресс-белков.

Киназы - DUSP1, DUSP2, РКАСВ и т.д.

Белки данной группы обладают специфической фосфорилирующей активностью (фосфорилируют белки по остаткам Ser и Thr, с затратой энергии АТФ) и являются одними из ключевых факторов, регулирующих внутриклеточную систему передачи сигнала (р38 MAP- и JNK-каскады).

Активация этих генов является необходимым звеном запуска реакции иммунной системы в ответ на большое число стрессорных факторов (в т.ч. антигены, тепловой шок, оксидативный стресс, UV и др.)

Важно заметить, что в результате физической нагрузки помимо увеличения концентрации ГР в крови происходит увеличение экспрессии генов, участвующих в передаче его сигнала к ядру клетки после связывания ГР с его рецептором.

Связывание ГР приводит к димеризации рецепторов и образованию связи во внутриклеточной области. После димеризации активируется Янус киназа 2 (JAK2), что приводит к кросс-фосфоршгарованию тирозиггав JAK2 и рецептора гормона роста. Затем происходит фосфорилирование и активация группы белков переносчиков сигналов и активации транскрипции (ПСАТ): ПСАТ1, ПСАТЗ, ПСАТ5. После того, как ПСАТ фосфорилирован, он в форме димеров и олигомеров проникает в ядро и активирует транскипцию ГР-специфичных генов. На Рис. 7 представлена модель активации транскрипции ГР-специфичных генов.

Рис. 7. Активация транскрипции ГР-специфичных генов.

Таким образом, в результате работы максимальной мощности наблюдается увеличение экспрессии мРНК генов киназ задействованных в передаче клеточных сигналов и активации транскрипции генов под действием ростовых факторов, позволяющих в дальнейшем быстро реагировать на внешние стимулы и осуществлять адаптацию к изменившимся внешним условиям.

Стресс белки - ШР40, ШР70, НБРЭО, НЗР105/110, РОЭ, А№СА1 и т.п.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия большинства генов раннего ответа направлена на обеспечение максимально быстрой реакции и перестройки работы клетки в ответ на стрессовое воздействие.

Наиболее быстро на стрессорное воздействие реагируют гены белков теплового шока- НБРШ (белок теплового шока 105/110 кДа), ЩРА1А (белок теплового шока 70кДа), ОКАЛЗ1 (гомолог белка теплового шока 40кДа) и НЗР90АА1 (белок теплового шока 90 кДа). Белки теплового шока относятся к группе молекулярных шаперонов, и являются одним из основных маркеров активации адаптивных процессов в клетке. Таким образом, благодаря разнообразию функций, белки теплового шока являются универсальным неспецифическим ответом клетки на стрессовое воздействие. Раннее увеличение экспрессии белков теплового шока свидетельствует о запуске неспецифических защитных процессов в лейкоцитах, направленных на сохранение и активацию белкового неосинтеза и предотвращение возможных нарушений синтеза и фолдинга белков под действием физиологического стресса, вызванного физической нагрузкой.

Также к группе генов, показавших немедленное увеличение экспрессии в ответ на физическую нагрузку, относятся РОБ и АМХА1. Гены семейства РОЭ кодируют регуляторные белки, имеющие в структуре домены типа «лейциновая застежка». Белки этой группы являются факторами транскрипции ДНК, регулирующими рост и нормальное развитие клетки. Ген АЫХА1 кодирует белок аннексин-1, принадлежащий к семейству Са(2+)-зависимых фосфолипид-связывающих белков, молекулярной массой около 40 кДа, локализованных преимущественно на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. Аннексин-1 обладает ингибирующей активностью в отношении фосфолипазы А2, необходимой для биосинтеза большинства медиаторов воспаления.

На заключительном этапе работы показано, что уже через несколько минут после начала физической нагрузки максимальной аэробной мощности в лейкоцитах

происходит достоверное увеличение экспрессии мРНК генов раннего ответа, которые обеспечивают адаптацию клеток к изменившимся внешним условиям.

Процессы срочной адаптации организма к работе максимальной аэробной мощности на уровне мРНК исследованы впервые и представляют большой интерес для детального изучения клеточных механизмов ответа на стресс.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоактивные моноклональные мышиные и поликлональные аффинно очищенные антитела кролика против рекомбинантного гормона роста человека, которые можно использовать в ИФА и иммуноблотгинге.

2. Разработана ИФА тест-система определения гормона роста. Чувствительность и селективность данной тест-систем позволяют использовать ее в определении концентрации гормона роста в сыворотке крови человека для мониторинга функционального состояния спортсмена па различных этапах тренировочной и соревновательной деятельности.

3. Разработан метод определения изоформ гормона роста в сыворотке крови основанный на аффинном выделении гормона роста из сыворотки крови и анализе полученного образца с использованием двумерного электрофореза и иммуноблоттинга. Метод позволяет детектировать 22 и 20 кДа изоформы для выявления нарушений сплайсинга.

4. Показано, что после нагрузок максимальной аэробной мощности абсолютное увеличение концентрации гормона роста и базальный уровень инсулиноподобного фактора роста 1 больше у спортсменов с более высоким максимальным потреблением кислорода. Доказано, что концентрация ростовых факторов до и после нагрузочного тестирования максимальной аэробной мощности может быть маркером оценки подготовленности спортсменов.

5. Выявлена группа генов, экспрессия которых в лейкоцитах периферической крови у спортсменов в результате нагрузки максимальной аэробной мощности в кратковременном периоде увеличивается. В данную группу входят гены, участвующие в передаче клеточного сигнала: кияазы и фосфатазы. Анализ экспрессии мРНК данных генов способствует, в дальнейшем, разработке новых методик мониторинга утомления и восстановления спортсмена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки специальной работоспособности спортсменов к нагрузкам максимальной аэробной мощности необходимо комплексное исследование концентрации ростовых факторов в сыворотке крови.

2. Для стимуляции системы ростовых факторов следует применять упражнения максимальной аэробной мощности.

3. При применении метода оценки экспрессии генов раннего ответа для мониторинга процессов срочной адаптации организма следует учитывать, что время нагрузки не должно превышать 30 мин.

4. При подготовке к соревнованиям следует учитывать, что базальный уровень ростовых факторов в крови и увеличение их концентрации после нагрузочного тестирования является маркером физиологического состояния спортсмена.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сахаров Д.А., Акимов Е.Б., Тоневицкий А.Г. и др. Свободный тестостерон как маркер адаптации к нагрузкам средней интенсивности. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008 -Т. 145. -№9-с.330-333

2. Сахаров Д.А., Тевис М., Тоневицкий А.Г. Анализ основных изоформ гормона роста человека до и после интенсивных физических нагрузок. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008-Т. 145. -№10 - с.446-451

3. Sakharov D., Tonevitskiy A., Thevis М. et al. Detection of recombinant growth hormone in human plasma by a 2-D PAGE method. // Electrophoresis. - 2008 - V.29. - №22 -p.4495-502.

4. Сахаров Д.А., Шкурников М.Ю., Тоневицкий А.Г. и др. Кратковременный высокоинтенсивный физиологический стресс вызывает увеличение экспрессии белка теплового шока в лейкоцитах человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009 - Т.147. - №3 - с.335-340

Подписано в печать 25.03.2009 Формат бумаги 60x90/16 Усл.печ.л. 0,8 Тираж 100

Сдано в производство 26.04.2009 Бум. офсетная Усл.-изд.л. 0,9 Заказ № "-¿/С

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха-2а, тел.250-92-06 www.postator.ru

Физические нагрузки являются одним из основных стимулов активации системы гормон роста (ГР) - инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1) (Gibney J., 2007; Nindl B.C., 2007), играющей важную роль в процессах клеточного роста и развития. В крови присутствуют несколько сплайс-изоформ гормона роста и инсулиноподобного фактора роста (Baumann G., 1991а). Сплайсинг их пре-мРНК осуществляется в ядре клетки при участии сплайсосомы - мегадальтонного комплекса между РНК и белками. Известно, что различные стрессорные факторы оказывают влияние на функционирование сплайсосомы и могут приводить к изменению ее активности или нарушениям сплайсинга. Таким образом, исследование влияния физического стресса на процесс сплайсинга гормона роста, соотношение его изоформ в крови, а также на систему ростовых факторов в целом, является современной задачей восстановительной и спортивной медицины.

Известно, что физические нагрузки разной интенсивности приводят к запуску большого количества биохимических, молекулярных и генетических механизмов, лежащих в основе адаптационных реакций организма на физиологический стресс (Coffey V.G., 2007а). Процессы адаптации организма к кратковременным высокоинтенсивным физическим нагрузкам связаны как с появлением изоформ ростовых факторов, так и с активацией системы генов раннего ответа (ГРО), и привлекают все больше внимания исследователей (Buttner Р., 2007; Connolly Р.Н, 2004).

Начальными активаторами ГРО являются стрессорные факторы, связанные с физической нагрузкой (гипотермия, ишемия, метаболический стресс, изменение электролитного баланса и т.п.), которые могут воздействовать на экспрессию ГРО как напрямую, так и опосредованно -через гуморальную систему и ЦНС (Simon Р., 2006).

Результатом работы сигнальных каскадов ГРО является активация транскрипции большого количества генов; она является пусковым звеном в механизмах белкового неосинтеза, а также активации т.н. «поздних генов», формирующих специфический фенотипический ответ организма на стресс.

Процессы активации системы ростовых факторов и генов раннего ответа, протекающие в организме спортсмена в первые минуты интенсивной физической нагрузки, в литературе не описаны, и их изучение весьма актуально и проводится впервые.

Гипотеза:

Предполагается, что работа максимальной аэробной мощности проводит к запуску процессов срочной адаптации организма: происходят изменения концентраций ростовых факторов в крови и увеличивается экспрессия генов раннего ответа. Мониторинг концентраций ростовых факторов и экспрессии мРНК генов раннего ответа в условиях физиологических тестирований различной интенсивности представляет собой новую диагностическую технологию оценки функциональных резервов организма.

Цель исследования:

Оценка влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов человека: гормона роста и инсулиноподобного фактора роста 1, а также на экспрессию мРНК генов раннего ответа.

Задачи исследования:

1. Получение моно- и поликлональных антител против рекомбинантного гормона роста человека и разработка иммуноферментной (ИФА) тест-системы определения его концентрации в сыворотке крови человека;

2. Разработка методов и подходов к определению соотношения изоформ гормона роста в сыворотке крови человека;

-63. Определение изменений концентраций гормона роста и его изоформ, инсулиноподобного фактора роста 1 и инсулиноподобного фактора роста связывающего белка 3 (ИФРСБЗ) после нагрузок максимальной аэробной мощности; 4. Анализ экспрессии мРНК генов раннего ответа в лейкоцитах крови спортсменов до и после работы максимальной аэробной мощности.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное исследование влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов и генов раннего ответа человека.

Разработана иммуноаффинная методика определения изоформ гормона роста в сыворотке крови, а также ИФА тест-система определения его суммарной концентрации с использованием полученных в работе моно- и поликлональных антител против рекомбинантного гормона роста (рГР).

Проанализированы образцы сывороток спортсменов после работы максимальной аэробной мощности и впервые показано, что концентрация ГР значительно увеличивается после нагрузки, а соотношение изоформ ГР остается неизменным. Концентрация ИФР1 в сыворотке выше у более подготовленных спортсменов; также наблюдается тенденция к увеличению общего содержания ИФР1 и ИФРСБЗ после нагрузки.

Впервые проведено исследование экспрессии на мРНК-чипах всех генов человека до и после нагрузки максимальной аэробной мощности и определены группы генов, вовлеченных в ранний ответ организма на физический стресс.

Теоретическая значимость:

Работа направлена на решение фундаментальных проблем адаптации организма спортсмена к нагрузкам максимальной аэробной мощности.

Изучены процессы ответа организма на стресс, а также запуск механизмов активации генов ранней экспрессии. Разработанные методики определения концентраций и соотношений изоформ гормонов открывают возможности для детального изучения влияния физиологического стресса на систему ростовых факторов, что важно для мониторинга утомления и восстановления в современной восстановительной медицине.

Практическая значимость:

Разработанные методики определения ростовых факторов могут быть использованы для оценки подготовленности спортсменов к нагрузкам различной интенсивности и применяться в диагностике нарушений и патологий.

Используемые подходы к детектированию изоформ гормона роста могут быть применены в анализе биологических образцов на присутствие экзогенных субстанций, при допинг-контроле сложных полипептидных субстанций.

Методики оценки экспрессии мРНК генов раннего ответа необходимы при разработке новых подходов к мониторингу физического состояния спортсменов, процессов тренировки и восстановления; при проведении анализа воздействия нагрузок на организм и оценке его функциональных резервов. Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении. Перспективным является также внедрение результатов настоящей работы в диагностических и лечебно-профилактических медицинских учреждениях.

Результаты работы опубликованы в 4 статьях.

Выводы

1. Получены высокоактивные моноклональные мышиные антитела и поликлональные аффинно очищенные антитела кролика против рекомбинантного гормона роста человека, которые можно использовать в ИФА и иммуноблоттинге.

2. Разработана ИФА тест-система определения гормона роста. Чувствительность и селективность данной тест-системы позволяют использовать ее в определении концентрации гормона роста в сыворотке крови человека для мониторинга функционального состояния спортсмена на различных этапах тренировочной и соревновательной деятельности.

3. Разработан метод определения изоформ гормона роста в сыворотке крови, основанный на аффинном выделении гормона роста и анализе полученного образца с использованием двумерного электрофореза и иммуноблоттинга. Метод позволяет детектировать 22 и 20 кДа изоформы гормона для выявления нарушений сплайсинга.

4. Показано, что после нагрузок максимальной аэробной мощности абсолютное увеличение концентрации гормона роста и базальный уровень инсулиноподобного фактора роста 1 больше у спортсменов с более высоким максимальным потреблением кислорода. Доказано, что концентрация ростовых факторов до и после нагрузочного тестирования максимальной аэробной мощности может быть маркером оценки подготовленности спортсменов.

5. Выявлена группа генов, экспрессия которых в лейкоцитах периферической крови у спортсменов в результате нагрузки максимальной аэробной мощности в кратковременном периоде увеличивается. В данную группу входят гены, участвующие в передаче клеточного сигнала: киназы и фосфатазы. Анализ экспрессии мРНК данных генов способствует в дальнейшем разработке новых методик мониторинга утомления и восстановления спортсмена.