Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Влияние этанола на ультраструктуру огранотилической культуры коры головного мозга

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК . ТОШШ НАУЧНЬЯ ЦЕНТР • НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ

Ка правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА4 Татьяна Николаевна

ВЛИЯНИЕ ЭТАНОЛА НА УЛЬТР/СГРУКТУРУ ОРГАНОТИШЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА

• АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.00.46 - Наркология

14.00.23 - Гистология, цитология и эмбриология

Томск - 1993

Работа выполнена б лаборатории пагоморфологии мозга , НИ! психического здоровья Томского научного ■ центра РАМН, лаборатории нейромэдиаторкых систем Института биофизики АН (Пущино) \ лаборатории клинической нейроморфологии НЦ психического вдоровья РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, • член-корреспондент РАШ Б. Я. Семке доктор медицинских наук, профессор. Г. & Коновалов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В. Б. Миневич кандидат медицинских наук С. Е Логвинов

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт общей и судебной психиатрии им. проф. В., П. Сербского,

Зашита диссертации состоится "!г " ■уггЛ^ъ1993. г.. в

__часов на заседании специализированного совета Ц 001.32. 01 по

присуждению степени кандидата медицинских наук НИИ психического здоровья Томского научного центра РАМН (634014, г.Томск, пос.. Соеношй бор). • •

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ психического здоровья Томского научного центра РАШ.

Автореферат разослан "/Г" 1~з 1993 г.

Учений секретарь спецсовета , кандидат медицинскчх-наук . Ч'

Л. Д. Рахмазова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Б рамках общей проблемы алкоголизма 'бое место занимает влияние алкоголя на развитие и дифференци-iKy нервной ткани и.мозга в целом, что в большей мере обуслов-[0 возможностью развития под влиянием алкоголя при алкоголизме !енщин алкогольного синдрома плода, характеризующегося в пост-■альном развитии потомства задержкой общего и психического 1ВИТИЯ (Peiffer J.1979; Taylor A.N. ,1983: Abel E. L. , 1987; Ба-1ЯН JL 0. ,1986; Моховиков А. E , 1986; Таболин В. А. , 1986; Гар-юва ЕЛ, 1988). Проведенные> в последние годы соответствующие шические и экспериментальные исследования позволили выявить' !рохимические и структурные изменения в развивающейся нервной ¡теме. (Jones К. L. ,1973; Clarren S. К. , 197.°- Visniewski К. К. , ¡3; Pratt 0. U. , 1984 ; Schenker S,i990). Установлено, что эта-I замедляет и продлевает период генерации нейронов, вызывает тушение пролиферации нейронов, уменьшая их общее число в зре-1 коре, нарушает нейрональную миграцию, созревание нейронов, и )мирование нейрональной сети (Levis P.D. ,1985, Miller I ,1988; 1990). При этом наиболее выраженные изменения наблю-тгся в филогенетически более молодых структурах, в которых шчательное созревание завершается несколько позднее. Следует 1елить работы, выполненные на эмбриональном мозге' человека жовалов Г. В. , 1988; Ковецкий Н. С. ,1991), в которых было пока-¡о, что под влиянием алкоголя имеет место нарушение формообра-зательных процессов в мозге и' существенные изменения в улъ-»структурной дифференцировке клеточных элементов мозговой ши. Одновременно эти работы выдвинули ряд Еопросов, требующих юлнительного решения. Одним из них является разделение влия-! собственно алкоголя и факторов материнского организма. Ссот-гствуюшую возможность даег использование метода культуры нерв-1 ткани, как объекта, позволяющего наблюдать развитие и №-ренцировку составляющих ее клеточных элементов.

Морфологических исследований с этанолом,'выполненных на яьтурах нервной ткани, относительно немного ( G.Lindner , 3rosse, 1976.1989; I.Seil ,1977; A. I. Yool, 1987; Davies D.1991).

- 4 - ,

.Основную часть составляют нейрохимически^ и нейрофизиолог ически! исследования (Руднев Ю. А. ,1984; Чубаков А. Р., 1984;. Gruol D. L. 1982; Charness М.,1984; Hansson Е. ,1987; Rohnback L. ,1987,1988 Морфологические методы использовались в основном для контроля з, состоянием культур, без детального анализа возникающих структур ных изменений. Поэтому соответствующие нейроморфологические дан ные весьма разрозненны, неполны и достаточно противоречивы, одной стороны, отмечалось отсутствие каких-либо структурных из менений ( Davies D.1984; Yool А. I. ,1987) , а с другой - как ус корение скорости образования нейритов (Messing R.0. ,1991), так нарушение морфологической дифференцировки при наличии в культу ральной среде высоких доз этанола ( Vaziri R. ,1981; Hassle I.A. ,1986). ,

Использование краткосрочного культивирования эксплантате дифференцированной нервной ткани, являющейся более упрощение моделью, позволит оценить нейротоксический эффект сывороть крови больных алкоголизмом.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния различи! концентраций этанола на процессы роста и морфо-функдионадьи дифференцировки нервных элементов и становление • межнейрональн] контактов в органотипической культуре коры больших полушарий.

В связи с этим были поставлены, следующие задачи: •

1. Изучить рост и цитодифференцировку культур: коры годовН' го - мозга новорожденных крыс при действии -различных концентрац этанола ( 0.5Х и 1Z ).

Проьести цито - и кариометрию нейронов коры головно моэга, развивающихся в присутствии 0,5% этанола в среде культ вировашя.

3. Определить ультраструктурные особенности культивируем клеток в присутствии различных концентраций этанола "(0,5% и IX

4. Провести морфометрический анализ синаптических параме ров культур ( 0,5% и 1%).

5. Оценить воамокность использования метода краткосрочно культивирования нервной ткани для количественной оценки рад!:

метрическим методом токсических свойств сыворотки крови больных хроническим алкоголизмом.

Положения, выносимь» на заярггу.

1. Присутствие этанола в среде культивирования вызывает нарушение нейроонтогенеза сенсомоторной коры. Если на ранних этапах можно отметить ускорение дифференцировки клеток , то динамика последующих изменений находится в зав оимости от силы и продолжительности действия этанола. Состояние повышенной функциональной активности культур, содержащих 0,57. этанола, сменяется при длительном действии повреждавшим эффектом. Введение 17. этанола вызывает более раннее развитие патологических изменений.

2. Воздействие этанола в период быстрого развития мозга приводит к нарушению ультраструктуры дендритов. Появление в дендроплазме различных концентрических мембранных комплексов препятствует : тановлению нормальных межнейрональных синаптичес-ких связей и приводит к усложнению геометрии синаптических контактов, и изменению, эффективности синаптическоЯ передачи.

3. Длительное применение сенсибилизирующей терапии вызывает усиление нейротоксической активности сыворотки крови больных алкоголизмом.

Научная новизна исследования. В работе впервые дана развернутая картина ультраструктурных изменений клеточных .элементов коры головного мозга в условиях органотипического культивирования при содержании различных концентраций этанола в.среде культивирования. Прямое ■ действие этанола приводит к'нарушению роста и цитодифференцировки нервной ткани и наблюдаемые изменения' в значительной степени определяются используемой концентрацией этанола. Показано, что присутствие 0,5% этанола в культуральной среде сопровождается активацией цитоплазматических органелл (митохондрий, эндоплазмагического ретикулума, пластинчатого комплекса) , направленной на поддержание функциональной активности ткани, что можно определить как пролиферативно-гиперпластические изменения,, однако продолжительное воздействие данной концентрации этанола приводит к появлению отдельных элементов деструкции. Присутствие в культуральной среде 17. этанола оказывает нейроток-сическое действие и проявляется в более ранние сроки культивиро-

вания .

Дистрофические и деструктивные изменения структуры дендр*

тов, а также появление.,в них различных концентрических мембран

1'

ных структур, препятствуют образованию мегкнейрональных синалт* ческих связей. Установлено, что в присутствии этанола происходи увеличение размеров аксональных терминалей, длины активной зои контакта, уменьшение числа синаптических пузырьков, приходящихс на единицу длины активной зоны контакта. Представленные показа тели свидетельствуют об изменении эффективности синаптическс передачи.

Теоретическое и практическое аначешю работы. Представлен ные в работе результаты свидетельствуют о возможности применени органо.типическк.. культур нервной ткани в качестве модели . дл дальнейшего изучения • механизма повреждающего действия этанола Полученные данные могут быть использованы для исследования раз личных фармакологических препаратов, предотвращающих развити .патологических изменений в ткани мозга.

Материалы диссертации могут быть использованы в учебных за ведениях медицинского и биологического профиля по соответствую щим разделам цитологии. В процессе выполнения работы оформлен два рацпредложения. '. ,

Апробация материалов диссертации.. Основные результаты исс ледования доложены на конференциях молодых ученых НИИ психичес кого здоровья ТЩ АМН СССР (То,«ок, 1987,1988), III отчетной сес сии НИИ психического здоровья ТЩ АМН СССР (Томск,1989), Второ Всесоюзном симпозиуме " Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пу . щино, 1989), на научно-практической конференции с международны участ"9м " Психическое здоровье - региональные аспекты" ( Влади восток, 1992).

Публикации По теме диссертации опубликовано 10 печатны .работ..

Структура и обьем работы Диссертация состоит 'из введения обзора литературы, материалов и методов исследования, Б гла собственных исследований, обсуждения полученных результатов, вы водов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 166 страницах и включает 9 таблиц и 45 иллюстрации ( электронные

мкрофотографии). .Библиографический указатель литературы вшпоча-тЙОЗисточника (101 отечественных и 102 иностранных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕД0ВА1ШЯ Метод органотипического культивирования нервной ткани *

культивирование эксплантатов из сенсомоторной коры больших полу-¡арий головного мозга новорожденных крыс проводили методом летаниях стекол во вращающихся пробирках на покрытых коллагеном пок-ювных стеклах. Среда культивирования состояла из стандартной [игательной среды Игла (50 X общего объема). эмбриональной сыво-ютки теленка (30'%) и раствора Хенкса (20%), с добавлением глю-;озы (600 мг£), инсулина (0,5 ед/мл) и пенициллина (100 ед/ мл).'

■ При эксплантации все культуры были разделены на контрольную I опытные группы. С первого дня культивирования в питательную ¡реду опытных культур добавляли этанол, концентрация последнего ¡оставляла 0,5% и 1%. В процессе культивирования анализ эксплантатов проводили на 5-й,10-й,15-й и 20-й дни развития.

Морфологические методы исследования. Для'общей оценки сос-:ояния культур, выявления различных типов нейронов и глиальных меток использовали метод суправитальной окраски метиленовым сигом на термостатируемом столике (А. Р. Чубаков, 19S7). Для электронной микроскопии культуры фиксировали в охлажденном до 4'С !,5 % растворе глутаральдегида, приготовленном на 0, 2 М фосфат-юм или какодилатном буфере (рН7,4), дофиксировали в 2% раство-зе четырехокиси осмия на том же буфере. Затем кусочки отмывали, збезвоживали-в спиртах восходящей концентрации и заключали шгас-сопараллельным способом в аралдит или смесь эпонов. Болутонкие' ! 1мкм ) и ультратонкие срезы ( 50-70 нм ) получали на ультрато-из фирмы "Reichert". Ультратонкие срезы контрастировали на се; точках, методом двойного окрашивания.

Препараты просматривали в электронных микроскопах JElflOO В i JEM-100CX фирмы "Joel" (Япония) и электронном микроскопе ЕМ201 Ейрмы " Philips" (Голландия).

Для цито- и картометрии нейронов использовали полутонкие * Этот фрагмент работы выполнен в лаборатории нейроме."нагарных систем ( руководитель - докт. мед. наук А. Р. Чубаков) Инс-гитута биофизики АН СССР (г. Душно).

срезы, окрашенные метиленовым синим. На препаратах, культур с 0,5.Х этанола и в контроле проводили измерение наибольшего и наименьшего размера ядер и тел нейронов с помощью винтового окуляр-микрометра на 5-й,10-й,15-й и 20-й день. Обьем тел и ядер нейронов вычисляли, используя формулу эллипса

* Морфометрическое «следование основных характеристик синапсов проводи;..: с помощью полуавтоматического анализатора изображения MOP-Videoplan фирмы "Reichert" (Австрия). Промеры проводили на негативах, полученных при увеличении х19. ООО.

Было исследовано 363 синапса в.контрольных культурах, 261 в культурах, содержащих 0,5% этанола и 379 в культурах с 1% этанолом на 20-й день культивирования. Для морфометрической оценки использовали следующие показатели: 1) пловдь пресинаптической терминали, 2) периметр пресинаптической терминали, 3) длину активной зоны контакта, 4) суммарная площадь сечения митохондрий и их число в пресинаптической термиг-ли, 5) количество синапти-ческих пузырьков, находящихся в контакте с активной зоной, 6) расчитывали отношение между числом таких синаптических пузырьков и длиной соответствующего постсинаптического уплотнения.

В настоящем исследовании было выполнено 8 экспериментальных серий. В каждой серии культивировали по 30 покровных стекол, на которых размещали в среднем по 2 эксплантата Нормальное развитие нервной ткани in vitro наблюдали в 707. случаев. Для свегооп-тического и электронно-микроскопического исследования использовано 388 эксплантатов, из - них 130 контрольных и 258 опытных, взятых из различных групп.

Радиометрический метод оценки нейротоксических свойств сы-ьороткм крови основан на подавлении испытуемой сывороткой включения 7,8 Н **-холестерина в дифференцированную нервную ткань в условиях краткосрочного культивирования (Леревозчикова М. Ф. , Назаров IL Г. ,1у81).

Исследовали сыворотку крови 26 больных алкоголизмом, проходивших .курс стационарной антиалкогольной терапии в отделении * Эта часть исследования была выполнена в лаборатории клинической нейроморфологии ( руководитель- проф. Д. Д. Орловская) НИИ клинической психиатрии ВЩ психического здоровья РАЖ

клинической и профилактической наркологии НИИ Ш ТНЦ РАШ и 20 больных алкоголизмом, находившихся на лечении в Томской областной психиатрической больнице в 1985-1986 гг, в возрасте от 20 до 56 лет. Контрольная группа включала 12 психически и соматически здоровых доноров. ;

Для оценки действия испытуемой сыворотки вычисляли нейротоксический индекс ( НТЮ, отражающий, отношение радиоактивности в опытной культуре к контролю. Результаты исследования представлены в процентах, подавления или стимуляции включения меченого холестерина.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета статистических программ Statgгaf, применяя Ь-' • критерий Стьюдента и критерий знаков г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

На основ;: ии проведенного экспериментального исследования установлено, что присутствие в питательной среде этанола, оказывает ■заметное влияние на процессы клеточной дифференцировки. Порученные результаты свидетельствуют о довольно сложной картине морфологических изменений нейронов.

Определенные различия мелзду контрольными и опытными культурами отмечены с первых дней культивирования. Лучшая прикрепляв-мость и распластываний эксплантатов наблюдались в культурах, со. держащих 0,57. этанола. Анализ полут'онких срезов опытных культур выявил в первые дни культивирования присутствие меньшего числа фагоцитоподобньх клеток, являющихся одним из показателей состояния культур. $ последующие дни культивирования на световом уровне не было выявлено существенных отличий в росте контрольных и опытных эксплантатов. Следует только отметить, что' в культурах, содержащих 0,6 X этанола, наблюдается пролиферация глиальных элементов, преимущественно астроцитов, а в эксплантатах, содержащих 1% этанола, сохраняется до 20 дня культивирования тесное1 прилежание нескольких нейронов.

Учитывая полученные результаты, можно выделить на начальных этапах культивирования адаптивный эффект', оказываемый этанолом. ■ Это находит подтверждение и при морфометрии нейронов. Размеры ядер и тел нейробластов в опытной группе, содержащей 0,5£ этано-

ла хат к и статистически недостоверно, пр зышали контрольные значения на 5-й день культивирования, а на 10-3 день наблюдалос! достоверное увеличение размеров перикариона нейронов . Однакс при -удлинении времени воздействия, происходит значительное уменьшение как величины перикариона, так и ядер нервных клеток, соответственно в 1,7 и 2 раза на 20-й день культивирования, чтс позволяет выделить в действии этанола как бы двухфазный эффект.

На ультраструктурном уровне на 5-й день культивирования также отмечена большая степень дифференцированности нейробластоЕ в опытных культурах. Длительное присутствие в культуральной среде этанола приводит к появлению различного рода нарушений, интенсивность проявления которых зависела от величины используемой концентрации.

Наиболее выраженные ультраструктурные изменения внутриклеточных орг^елл отмечены на 15-й день культивирования, и среди наиболее ранних реакций - изменение эндоплазматической сети .

Эндоллазмагический ретакулуы. В культурах, содержащих 0,5У. этанола в питательной среде, происходит увеличение размеров эндоплазматической сети по сравнению с контрольными культурами. В таких нейронах элементы эндоплазматической сети приобретают более упорядоченное расположение цистерн и занимают значительную часть цитоплазмы нейронов. Подобные изменения свидетельствуют об усилении протекающих в клетках синтетических' процессов.' В присутствии 1%■ этанола наблюдается дезорганизация элементов гранулярного ретикулума, уменьшение ' количества цистерй на фоне хро-матолитически измененных нейронов. Цистерны имели небольшие размеры, отмечено их набухание и образование вакуолеподобных:структур. "злобные изменения в большей степени соответствуют пониженному уровню метаболизма белкоЕ, наблюдаемому в большинстве, биохимических исследований.

Следует особо отметить присутствие в эксплантатах измененной формы эндоплазматического ретикулума, состоящего из концентрически расположенных мембран. На злектроннограммах можно было проследить различные этапы его формирования. Данная форма-встречалась как в контрольных культурах, так и в.культурах, содержащих в питательной среде этанол, однако в последних частота

- 11 .встречаемости была выше. Появление эндоплазматического ретикулу-ма.в виде спиралей и концентрических окружностей не является характерным только для алкогольного воздействия, они встречаются и в норме, однако частота их появления возрастает при патологических состояниях ( Н1гапо А. ,1983). Окончательно не ясно, в отростках каких клеток происходит их образование. Вероятно., такие изменения эндоплазматического ретикулума выявляются как в нейронах, так и в клетках глии.

Появление измененного эндоплазматического ретикулума отмечено в клетках, с усиленно протекающими метаболическими процессами С Меркулова О. С. ,1982). Исходя из этого можно предположить,' что' состояние функционального напряжения нейронов в присутствии 0,5% этанола сопровождается повышением синтетической деятельности и вызывает пролиферацию мембранных структур гранулярного ретикулума.

В-культурах, содержащих 1% этанола, также встречается эн-доплазматический ретикулум концентрической формы, однако на поверхности мембран содержатся лишь единичные ркбосомы, что соот ветствует' пониженному уровню метаболический активности в данной группе культур.

Комплекс Гольдки находится в тесной взаимодействии с протекавшими в клетке синтетическими реакциями, участвуя в процессах дезинтоксикации. В нейронах культур, содерзкащ/х 0,5% этанола, отмечена значительная пролиферация элементов комплекса Гольджи. Увеличение его размеров происходит в основном за счет везикулярных компонентов.^ В культурах, содержащих 1% этанола,' изменения пластинчатого комплекса определялись функциональным состоянием нейронов. В клетках с явлениями хроматолиза отмечено набухание и вакуолизация цистерн, а в более сохранных нейронах происходило увеличение размеров и изменение формы аппарата Гольджи.

Продолжительное воздействие этанола приводит к срыву .внутриклеточного гомеостаза в отдельных нейронах на 20-й день культивирования. На фоне пролиферчтивно-гиперпластических изменений выявляются элементы деструкции, г, порьуго счередь злеы-лиср. комплекса Гольджи. Наблюдается набухание и деформация цистерн, с последующей их фрагментацией. Поблизости от таких, измененных

комплексов располагались лизосомы, мультивезиКулярные тельца и. отдельные осмиофильные включения.

Митохондрии. Присутствие в культуральной среде 0,5% этанола приводит к значительному увеличению размеров большинства митохондрий и некоторому увеличению их числа. Обращает на себя внимание присутствие в нейронах гигантских митохондрий атипичной формы. Они име..л неровный, изрезанный край, образующий глубокие инвагинации митохондриальной оболочки в глубь матрикса. Такие митохондрии содержат хорошо сохранные мембраны и выраженные крисгы, что указывает на повышение окислительного и энергетического обмена в этих клетках. Следует подчеркнуть, что в нейронах, отой группы не встречалось отечных, лишенных крист митохондрий.

На 20-й день развития в части нейронах происходит повредде-. нке ультраструктуры митохондрий, чаще всего отмечено 'нарушение целостности наружной мембраны, а в отдельных случаях и фрагментация крист. ...

Совершенно иной эффект отмечен в культурах, содержащих . IX . этанола, и в значительнрой степени зависел от степени повреждения нейронов. В хроматолйтически измененных нейронах выявлялись набухшие, светлые митохондрии, с разрушенной структурой крист ухе на 10-й день. В клетках,'.имеющих сохранную структуру,отмече- . но присутствие митохондрий с электронно-плотным ыатриксом и сохранными кристами. Иногда такие митохондрий располагались небольшими группами в отдельных нейронах или' дендритных профилях. В данном случае наличие как набухших, так и темных митохондрий отражает сниженные показатели обмена и, соответственно, уменьшение синтеза АТФ ( Митюшин R Ы., 1978).

Появление крупных митохондрий при хронической алкогольной интоксикации отмечено в различных органах, таких, как печень,-м-лщы и мозг, и сходные ' изменения были обнаружены как у людей, так и у экспериментальных животных • (Karwacka Н. ,1980; Buruah J. К. , 1987; Пауков В. С. ,1985).

Можно заключить, что наличие, в культуре нервной ткани гигантских митохондрий вызвано повышенной этанольной нагрузкой и, по-видимому, отражает специфичность действия этанола на ткань, обусловленную его дальнейшим метаболизмом, поскольку образование

мегамитохондрий служит одним из наиболее надежных морфологических критериев алкогольного поражения печени ( Казачук С. КХ , 1983).

Дендрита Наряду с изменениями ультраструктуры перикариона нейронов, дистрофические и деструктивные изменения отмечены и в дендритах, играющих важную роль в обеспечении интсгративной дея- • тельности мозга. Набухание дендритов, уменьше-ие в них количества микротрубочек и различных органелл наиболее выражено и затрагивает большее число отростков в культурах, содержащих 1% этанола. В отдельных дендритных профилях отмечено присутствие как единичных мембранных комплексов, так и множественных осмиофиль-ных включения и мембранных миелиноподобньгх структур, полностью заполняющих весь просвет отростка Наряду с подобными изменениями, в отдельных профилях были представлены крупные концентрические мембргчные структуры, занимающие весь обьем. Считается, что мембранные комплексы появляются в цитоплазме нейронов в результате нарушения липидного обмена и довольно часто являются проявлением токсического действия веществ (Морозов Г.Е, Боголе-пов К Н. ,1984).

Нарушение структуры дендритов может привести к нарушению механизма афферентного синтеза и в целом отразиться на функциональной деятельности мозга. В этой связи большой интерес представляет вызванная этанолом перестройка межнейрональных контактов.

Мекнейрональные контакт Преобладающим типом синапсов, наблюдаемым 20-й день культивирования во всех эксперименталь-' ных группах культур, являются аксо-дендритические контакты асимметричного типа. Процент выявленных асимметричных синаптических контактов значительно не различался во всех • группах культур и составил 82- 86Х. В эксплантатах было представлено довольно мало аксо-шипиковых синапсов, содержащих развитый шипиковый аппарат, поэтому при анализе их не выделяли в отдельную группу. Следует отметить, что синаптические контакты во всех исследованных' группах не достигают окончательной морфологической зрелости на 20-й день культивирования и в большинстве случаев имзют недостаточно сформированное постсшаптическо? уплотнение, а в преспнап

-14-

0.25

У® 1

Csntr.

Mo. 0,5%

Ho.1%

ConV. AI 0.0,5^ . i4o.I$5

Rio. I Количественные параметры синапсов: I- длина активной зоны контакта; 2- периметр аксональной термина-ли; 3- площадь аксонадьной термшали.«- достоверные различия по сравнению с контролем р<0,05.

тических терминалах наряду с- небольшими синаптическими пузырьками сохраняются и более крупные ростовые везикулы. •

В опытных культурах можно отметить извилистость контура пресинаптических терминалей и уменьшение числа синаптических пузырьков, осббенно в культурах, содержащих 17. этанола. Отдельные аксональные окончания в культурах, содержащих 0,5% этанола, имели увеличенное число синаптических пузырьков .

Наблюдается усложнение . геометрии синаптических контактов, увеличение числа перфорированных синапсов, а также конвергентных и дивергентных синапсов. Изменение нормальной структуры дендри-тов в культурах; содержащих этанол', по-видимому, сопряжено с ком- ' пенсаторным увеличением числа конвергентных, сходящихся синапсов, 'образованных несколькими аксональными терминалями на одном поетсинаптическом окончании.

При морфометрическом анализе большого числа синапсов удалось установить ряд достоверных изменений синаптических контактов (Рис.1). Результаты измерений площади, периметра сечения ак-сональных терминалей и длины-активной зоны контакта свидетель стуют о дозозависиыом увеличение размера пресинаптических терминалей в опытных группах культур. Статистически значимые различия отмечены в группе, содержащей 1% этанола в среде культивирования, как по сравнению с контролем, так и с группой культур, содержащих 0,5% этанола.

Присутствие 1% этанола-приводит к увеличению на 17% (р<0,05) площади пресинаптических терминалей- по сравнению с .контрольными культурами и на 10,57. по сравнению группой, содержащей' 0,5% эта-' , нола. В меньшей степени происходит увеличение периметра пресинаптических терминалей, на 77. и 4,2% . Увеличение размеров сопровождается удлинением активной зоны контакта на 15,2% (р<0,05). по сравнению с контролем и на 9,4% (р<0,05), по сравнению с предыдущей группой. Увеличение протяженности активной зоны- контакта связывают с большей информативностью синапсов (Боголепов Е Н. ,1975), а число синаптических пузырьков, приходящихся на единицу длины активной зоны,рассматривают в качестве морфологического эквивалента синалтической эффективности (Клинцова А. Е , Уранова Е А. ,1989). Последний показатель достоверно снижается

при увеличении концентрации этанола и свидетельствует об усилении синаптической передачи, сопоовождаемой освобождением медиатора.

Следует отметить, что число синаптических пузырьков, кон-тактирувдих с активной зоной контакта, практически одинаковое.во всех экспериментальных группах. Также не различается и количество терминалей, -¿держащих митохондрии, и составило 25-27Т. .

Сопоставляя эти данные с изменениями ультраструктуры синапсов в культурах, содержащих 0,5% этанола, а также учитывая, что . в этой группе отмечено увеличение на 7,ЗУ. числа функционально активных, положительно искривленных синапсов по сравнению с • контролем и небольшое снижение прямых, резервных синапсов, можно •предположить, что наблюдается адаптивное повышение синаптической передачи, о чем свидетельствует и увеличение на 34,8% ( р< 0,05) площади, занятой митохондриями в пресинаптических термина-лях.

Более значительное увеличение размеров аксональных терминалей и длины активной зоны контакта в культурах, содержащих IX этанола, свидетельствует скорее всего об истощении.компенсаторных резервов, т.к. в этой группе значительно чаще встречаются измененные " по светлому" типу синапсы," имеющие небольшое число синаптических пузырьков, локализованных только у активной боны контакта. Увеличение числа позитивно искривленных контактов, являющихся функционально активными, выше, чем в контрольной группе, но уже меньше, чем в культурах, содержащих 0,5% этанола. В то же время и плошддь занятая митохондриями на 14,7% (р <0,05) меньше, чем во второй опытной группе. Следует также отметить ьаллчие в эксплантатах "спаренных" нейронов, контактирующих между собой клеточными мембранами и активацией обменных процессов в местах контакта.

Таким образом, в эксплантатах, содержащих в культуральной среде этанол, выявляется значительная перестройка синапсоархи-текгоники. Оценивая полученные данные в целом, можно отметить, что наблюдаемые изменения, по-видимому, приводят к нарушению си-наптического проведения и могут являться структурной основой для выявляемых при алкогольном синдроме нарушений когнитивных функ-

■ Таблица 1.

Количественная оценка влияния сыворотки крови больных алкоголизмом, определяемая по включению Н -холестерина

Условия Эффект действия, 7.

исследования п подавление>10% без изменений стимуляция>10Х

при поступлении 46 25,6% 53,5Х ' 20,97.

на 45-47 день 22 33,3% 41, 77. 257.

перед выпиской, 25 67% * 19 7. 147.

на 90-110 день

Примечание: * - отмечены достоверные отличия (р<0,05).

ций мозга. .

Для оценки токсического действия сыворотки больных алкоголизмом использовали краткосрочную органную культуру дифференту рованной нервной ткани.' Анализ зависимисти индекса нейротоксич-ности от клинических показателей . (возраста больного, давности заболевания и длительности существования абстинентных, расстройств, состояния больного в момент поступления, наличия психотических форм и соматических заболеваний) позволил выделить значительное влияние на данный показатель проводимых терапевтических мероприятий.

Исследование 1ГТИ в первые три дня после стационирования больного выявило прямую зависимость снижения включения меченого, холестерина в тех случаях, когда больной поступал после длительного потребления алкоголя в состоянии алкогольного опьянения или абстинентном состоянии. Особую группу составили больные с алкогольным делирием. В этих случаях для купирования психотического состояния проводилась многопрофильная интенсивная инфузионная терапия и, соответственно, происходила стимуляция-включения меченого холестерина.

Динамическое наблюдение НТИ в процессе проводимой противоалкогольной терапии представлено в Таблице 1. При проведении второго- исследования, на 45-47 день стационирования, выявлена

неодноь.^члость данного показателя, пг ^исходит как увеличение стимуляции включения меченого холестерина тканью, так и его угнетение. Однако перед выпиской, на 90-110 день отмечено достоверное снижение НТИ в 677, случаев. Такой эффект можно объяснить. . в значительной степени отрицательным действием длительного применения тетурама.

■ В биологических исследованиях последних лет при продолжи- ' тельном использовании сенсибилизирующих средств было установлено, что образующийся метаболит дисульфирама обладает, нейротокси- ' ческим действием. В нашем исследовании мы также получили данные, подтверждающие такой эффект дисульфирама, что дает основание ре-комендовагь осторожное.применение сенсибилизирующей терапии.

ВЫВОДЫ.

1. Пом влиянием этанола в органотипической культуре нервной ткани коры головного мозга возникает достаточно сложный комплекс изменений, отражающий как ускорение развития клеточных элементов, так и адаптивные, и деструктивные процессы, в ней.

2. Действие этанола на органотипическую культуру нервной ткани характеризуется выраженным дозоэависимым эффектом, который проявляется в небольшом диапазоне его концентраций в культураль- . ной среде.

3. Основной особенностью дозозависиморо эффекта этанола в культуре нервной ткани являете* быстрота перехода от стимулирующего развитие культуры эффекта до его повреждающего! влияния на клеточные элементы ткани и развитие культуры в целом. Указанные эффекты не имеют абсолютной границы, доза алкоголя и время его , возде'" 1теия определяли возможность появления сметанных и переходных комплексов морфологических изменений.

4. Стимулирующий эффект 0,5% этанола в культуральной среде проявляется пролиферативно-гиперпластическим процессом, с увеличением числа, размеров и изменением внутренней структуры митохондрий ( вплоть до образования гигантских форм), гипертрофией везикулярных элементов пластинчатого комплекса Гольдки и значительным развитием шероховатого ретикулума с избыточностью образования внутрицитоплазматических мембран и формированием много-

- 19 .численных концентрических структур на фоне общей • хорошей сохранности всех клеточных элементов культуры и ускоренного их развития. ■ Однако при удлинении времени воздействия этанола выявляются нарушения структуры отдельных органелл: набухание и ' фрагментаций цистерн пластинчатого комплекса Гольджи, нарушение целостности мембран митохондрий, появление больсего числа лизо-сом. .

5.. Присутствие в культуральной среде IX этанола вызывает более ранние дистрофические изменения нейронов, проявляющиеся в уменьшении числа цитоплазматических органелл, дезорганизации элементов эндоплазматического ретикулума, уменьшении количества' рибосом, набухании митохондрий и элементов пластинчатого комплекса.' На 20-й день развития в эксплантатах встречаются нейроны с незначительной степенью дифференцировки, а также сохраняется компактное расположение нервных клеток .

6. Нарушения структуры дендритов в опытных культурах . появление в них крупных концентрических мембранных структур, занимающих весь просвет отростка , а также многочисленных осмиофиль ных включений и комплексов мембран, препятствуют формированию межнейрональных контактов .

7. Этанол изменяет эффективность синаптической передачи, вызывая дозозависимое увеличение площади и периметра аксональных терминалей , а также длины активной зоны контакта, и. уменьшая количество синаптических пузырьков приходящихся на единицу длины активной зоны контакта. .

■ 8. Изменения, возникающие под влиянием этанола в.' органоти-' . пической культуре коры головного мозга, имеют ряд общих особенностей с действием алкоголя на целый мозг, в том числе и на эмбриональный мозг человека. Наблюдаемые в культуре изменения являются отражением не столько сгимулируюш/эго действия алкоголя, но проявлением защитных, компенсаторных процессов в нервных клетках, направленных на поддержание их жизнеспособности и возможности к развитию.

9. Использование радиометрического метода оценки нейроток-сичности сыворотки больных алкоголизмом позволяет оценить степень интоксикации организма, причем нейрстоксически!* эффект сы-

воротки в значительной мере определяется длительностью предшествующей алкоголизации и состоянием больного при поступлении; длительный курс сенсибилизиругацеи терапии приводит к увеличению нейротоксичности сыворотки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние этанола на культуру центральной нервной системы // Актуальные е опросы психиатрии. - Томск, 1987.-Вып. 3. - С. 168169. ' .

2. Структурно- метаболические проявления алкогольной эмбрионами мозга // utero дол. теорет. и. метод, аспекты соврем, морфологии: Сб. науч. трудов. - М. , 1987. - С. 104 ( в соавт. с Л. И. Муравьевой, Е С. Ковецким, А. В, Солонским, Л. И. Дорофеевой, Т. В. Щуш-• Пановой ).

3. Некоторые итоги'изучения алкогольной змбриопатии мозга человека // Мед. аспекты охраны психического вдоровья населения Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1988.-. С.28-29 (в соавт.. с Г. В. Коноваловым, Н С. Ковецким, А. В. Солонским, Т. В, Шушпановой).

4. Морфологическая характеристика развития головного мозга крыс под влиянием этанола в процессе культивирования // Проблемы алкоголизма и наркомания Хабаровск, 1988,- С. 114 ( в соавт. с С. А. Верхотуровой).

Б. ультраструктурные особенности коры головного мозга крыс , при длительном действии этанола в процессе культивирования // Актуальные вопросы психиатрии.- Томск, 1989.- Вып. 4,- С. 192-194.

6. Влияние этанола на морфологическую характерестику культуры коры головного мозга // Журн. невропатологии и психиатрии. -

•1989.- Вып. 7. - С. 49-52 ( в соавт. о Г, Е Коноваловым). '

7. Изучение хронического влияния этанола на модели органо- 1 типической культуры нервной ткани // Кликико-социальные и биоло-п. зские аспекты адаптации при нервно-психических и наркологических заболеваниях.- Красноярск, 1990,- и. 34-36.

8. Ультраструктура нейронов органотипической культуры коры головного мозга при действии этанола // Возбудимые клетки в культуре ткани: Материалы 11 Всесоюзного. симпозиума. - Пущ-Но, 1990. - С. 119-122.

9. Изменение ультраструктуры митохондрий нейронов при дейс-

твии различных концентраций этанола// Медико-социальные аспекты психического злоровья. - Томск, 1991. - С. 193-194.

.10. Пролиферативные процессы в культуре нервной ткани при действии этанола // Журн. невропатологии и психиатрии.- 1991,-Вып. 7. - С. 82-84. ( в соавт. с Г. В. Коноваловым, А. Р. Чубаковым).