Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Свойства бензодиазепиновых рецепторов головного мозга человека и крысы в норме и под влиянием алкоголизации

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ТОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПСИХИЧЕСКОГО ЗЛОРОВЬЯ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

УДК 616.89-008.441.13-092.9

ШУШПАНОВД ТАМАРА ВЛАДИМИРОВНА

СВОЙСТВА БЕНЗОДИАЗЕПЙНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕК А И К РЫСЫ В НОРМЕ И ПОД ВЛИЯНИЕМ АЛК ОГОЛИЗА11ИИ

НАРКОЛОГИЯ - 14.0р.4 5 БИОХИМИЯ - 03. ОСЬ 04

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМСК - 19«з

Работа выполнена в лаборатории потоморфологии мозга НИИ . психического здоровья Томского научного центра РАМН и лабора- . тории молекулярной нейрофармакологии НЦПЗ РАМН.

Научные руководители: член-лорреспондент РАМН, профессор В.Я.Семке

кандидат биологических наук А. Г. Мухин _

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, • профессор Л. <Р. Панченко •

доктор медицинских наук, профессор Ю. <Р. Приленский

Ведущая учреждение - Московский научно-исследовательский институт Минздрава России

Защита состоится " 16 " февраля 1993 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 001.32.01 при НИИ психического здоровья Томского научного центра РАМН

Адрес: 634014, г.Томск, пос. Сосновый Бор

С'диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ психичер-кого здоровья ТНЦ РАМН. : '

Автореферат разослан " 14 " января 1993 года.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат медицинских наук с^с!. /_. Л. Д. Рахмазова.

L i «С J---' 1 ÖE|W ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ" -—-!

Актуальность работы. Алкоголизм относится |более распространенным заболеваниям человека, отягощает или !тся основой различных психосоматических заболеваний. По дан-103, он как причина смерти занимает по частоте третье место, 1ая только сердечно-сосудистым заболеваниям и злокачествен-швообразованиям.

Проведенные в последние 10-15 лет клинико-генетические ис-¡вания алкоголизма, включающие изучение близнецов и приемных i, а также экспериментальные работы свидетельствуют о нали--енетических детерминант ряда поведенческих, физиологических зхижческих ответов на этанол, которые имеют потенциальную физиологическую значимость. Результаты современных клиничес-клинико-генетических исследований алкоголизма и фундамен-■шх . исследований о полигенных заболеваниях показывают, что -олизм относится к мультифакторным болезням, степень прояв-з которых зависит от экзогенных факторов и генотипических знностей (Анохина И.П.,1976; Морозов Г. В., Иванец H.H., 1981; зовГ.В., Анохина И. П. ,1983; Полтавец В. И., 1985; Иванец H.H., МоскаленкоВ. Д. , 1987; Врублееский А. Г., 1988; Семке В. Я., 1988; гнко А. 9., 1989; Erwin Y.G. ,1976;Bohman М., 1978;Kissin В. , 1983; iy R. М. ,1903; Goodwin D., 1984;Eriksson С. J. P., 1984; Alpern H.P., Moskalenkö V.O. ,1990 и др.)

В экспериментах установлено, что среди общей популяции бе-срыс имеются особи, предпочитающие раствор этилового спирта или отвергающие его при свободном выборе с высокой и низкой зантностью к этанолу (Кампов-Полевой А. Б., 1982; Буров.О. В., рникова Н.М. ,1985). Клинические наблюдения показывают, что еренцирован»/ое отношение и реакции на алкоголь отмечаится и ковека. При систематическом употреблении алкоголя риск фор-вания алкоголизма, его тип, тяжесть и прогредиентность, а з прогноз при лечении различны и в значительной степени эа-т от типологических особенностей личности (Иванец H.H., Иго-Д. Л. 1983; Полтавец В. И. ,1987). Злоупотребление родителей тными напитками достаточно часто вызывает у потомства комп-определенных физических уродств, а также других нарушений, чая поведенческие, которые являются результатом пренатально-ействия "этилового спирта и составляют так называемый феталь-

ный алкогольный синдром (Кирющенков А. П. , 1987;- Jones К. L., Sm 0. H., 1973).

Однако нейрохимические аспекты действия алкоголя, моле лярно-биологические процессы, протекающие в структурных эдеме тах мозга под влиянием этанола или продуктов его метаболизма также предрасполагающие к потреблении этанола исследованы нед таточно. В еще меньшей мере исследовано, в какой степени мол лярные изменения нейрональных элементов мозга связаны с фарма: логической коррекцией повреждающих факторов. Фармакологичеа коррекция основного симптомокомплекса алкоголизма - синдрома i мены - проводится с использованием производных гамма-аминомас, ной кислоты (ГАЖ) и бензодиазепиноа с 1965 r.(Sereny G. , Kai ai 1965; Ka 1m S. С. et. al., 1369; Sellers E.M.,Kalant H. ,1976; Se"} 11 E. M. et. al., 1983; 0 Brien J.E. et. al.',1983; Moskowitz G, et. al. 1983 и др. ).

Сам этанол, являясь-депрессантом центральной нервной сис мы по своим фармакологическим эффектам подобен транквилизатор: Имеются аргументированные свидетельства того, что именно анка литический эффект этанола имеет очень важное значение в разви' привыкания и алкогольной зависимости (Кампов-Полевой А.Б. ,191 Роханеи В.В.,1988; Goldstein O.B.,197В; Snyder S,,Keeler M.,Ii Tal Imán J. F. et. al., 1986; Deltrich R. A., 1989 и др.).

Успехи в изучении роли ГАМК в центральной нервной систем! е-действии бензодиаэепиновых транквилизаторов (БЗД) а также э' нола привели к установлений связи ТАМКа- и БЗД^эргической сиа a также действием этанола и функционированием ГАМКа-бензодиаз! нового рецепторного комплекса (Sraestrup С.M.et.al., 1977; Mohl H. et. al. , 1978; Costa "E. et. al., 1979; Olsen R. W., 1982; Tlcku M. I 1983; Rastogy S.K. et. al. ,1986; Allan A.M., Harris R.A.,1986; ! dak P.O.et. al., 1986; Prltchett D.et.al.,1938; Tlcku M.K., 19Í Freund G., Ballinger W. E. ,1989; Buck К. J., Harris R. К , 1990; Aguayo l. G., 199Ó;Karp l. et. al., 1991; Korpí E. R. et. al., 1992 и ¡ Однако характер этой связи остается малоизученным.

Исследования ряда авторов (Hemmingsen R.,Braestrup С.,19í Mbatre M. et. al., 1988; Ticku M.K., Kulkarni S.K.,1988; Buck K.v Harris R. A. ,1990) показали специфические изменения ГАМКа- и Б: рецепторов у чувствительных к алкогол» крыс. В работах 'други) исследователей (Liljequist S. .Tabakoff 8. , 1985; Rottenberg H.,

1985; Rastogy S.K, et. al. ,1986; de Vries 0. 0. et. al., 1987;) не выявлено изменений свойств центральных БЗДР при хроническом потреблении этанола.

Исследования влияния этанола и ГАМКа-антагонистов, а также обратных агонистов к бензодиазепиновым рецепторам на поведение мышей с различной чувствительность!« к этанолу указывает на возможную роль генетических различий в регуляции хлорного канала, сопряженного с ГАМКа/бЗДР-рецепторным комплексом, в формировании различной чувствительности к этанолу и скорости развития толерантности (Москаленко В. Д. , 1987; McClearn G. , Kakihana R., 1981; Uusi-0ukar1M. ,Korp1 E. R. ,1991 и др.).

Единичные исследования свойств 63ДР в аутопсийной ткани мозга больных алкоголизмом, не выявили значительных изменений аффинности и плотности бензодиаз-епиновых мест связывания цент- . рального типа по сравнение с контрольной группой, но выявили изменение-плотности мест специфического связывания ЗН-РК 11195 -лиганда к периферическим БЗДР - в мозжечке, фронтальной коре ( Tran V.T. et.al., 1981; Freund G., Ballinger W.E. ,1988; 1989; Korpi E.R. et.al., 1 992).

В связи с этим представляется актуальным дальнейшее изучение механизма действия этанола, формирования влечения к нему на уровне- бензодиазепиноаых рецепторов центрального и периферического типов в центральной нервней системе человека и крысы, что может способствовать дальнейшему выяснению патогенеза этого заболевания, дать клкч к поиску новых перспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма.

В настоящей работе приведены результаты оригинальных экспериментальных исследований свойств бензодиазепиновых рецепторов головного мозга у крыс с различной степенью предпочтения к этанолу, у потомства 'крыс, перенесших алкогольную интоксикацию во внутриутробном периоде развития, а также в аутопсийной ткани различных областей головного мозга пациентов, хронически алкоголиэиро-вавшихся при жизни (по данным анамнеза), с попыткой раскрыть возможные механизмы действия алкоголя.

Учитывая определенные недостатки проведенных в этом направ лении экспериментальных исследований - небольшой период хронического воздействия этанола, исследование рецепторов только одного подтипа, работа с общей популяцией крыс без учета предпочтения к

этанолу, недостаточное исследование аутопсийного материала мозга человека - в настоящем исследовании были использованы следующие основные подходы: 1) использование экспериментальной модели хронического воздействия алкоголя на крыс, учитывающей генетические факторы предрасположенности к.развитию влечения и зависимости от этанола; 2} длительность воздействия этанола (в течение 6 мес.) - фактор, приближающий экспериментальную модель развития алкоголизма у животных к течению алкоголизма у человека; 3) сравнительное исследование свойств БДР в мозгу крыс с различной предрасположенностью к алкоголю; 4) изучение эффектов хронического воздействия этанола на взрослый мозг крысы и развивающийся.мозг потомства крыс; 5) исследование БДР различных подтипов - "центрального" и "периферического" в различных субклеточных фракциях: синаптосомах и митохондриях соответственно; 6) изучение влияния алкоголизации на свойства БДР в различных структурах мозга человека.

ЦЕЛЬ и основные задачи исследования.'

Целью настоящей работы явилось исследование свойств бензодиазе- • Пиновых рецепторов центрального и периферического типов в центральной нервной системе человека и крысы в норме и под влиянием алкоголизации. >

В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:-

1) изучить свойства 63ДР в коре головного мозга у крыс, предпочитающих этанол и отвергающих его;

2) исследовать влияь..е хронического воздействия этанола на свойства БЗДР в коре головного мозга у крыс, предпочитающих этанол;

3) изучить свойства БЗДР в различных областях головного мозга потомства крыс в норме й под влиянием этанола в пре- и постна-тальный период развития;

. 4) оценить состояние БЗДР в различных структурах головного , мозга человека постмортально в контроле и вследствие алкоголизации;

5) дать сравнительную оценку действия этанола на бензодиа-зепиновые рецепторы головного мозга человека ^ крысы;

6) рекомендовать использование новых данных в. поиске перспективных препаратов для профилактики, и лечения алкоголизма.

Научная' новизла исследования.

Впервые показано, что свойства бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов в коре головного мозга крыс, предпочитающих этанол, отличны от свойств БЗДР у крыс, отвергающих этанол. Установлено, что хроническое воздействие этанола приводит к значительному снижению аффинитета БЗДР, центрального й периферического типов и увеличений числа мест специфического связывания периферического типа у "многопьющих" <рыс. Выявлены изменения в свойствах БЗДР головного мозга у потомства крыс, подверженных воздействию этанола в пре- и постна-гальный период развития по сравнению с контролем. Показано на (утопсийном материале мозга, человека, что вследствие алкоголиза-1ии изменяются свойства БДР обоих типов в различных областях юзга. Установлено, что изменения свойств БДР головного мозга ¡еловека и крысы под влиянием алкоголизации однонаправлены, что южет свидетельствовать об общности механизмов биологического .ействия этанола.

аучно - практическая значимость работы.

Выявленные изменения свойств бензодиазепиновых рецепторов в оловном мозге человека и крысы под влиянием алкоголизации, а акже особенности БЗДР мозга крыс, предрасположенных к потребле-аю }танола, позволяют рассматривать их участие в формировали алкогольной мотивации, развитии алкоголизма, вовлечение их в 1,Мн из основных механизмов Действия этанола, реализации его эф-гктов.

В связи с этим.возможно использование новых данных в поиске ■рспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма, характеристик радиолигандного связывания в качестве- одного из 1казателей в системе поиска и отбора химических соединений ан-¡алкогольного профиля.

Основные положения, выносимые на защиту:

свойства бензодиазепиновых рецепторов головного мозга крыс, аметрально различающихся между собой по степени предпочтения анола на предпочитающих и отвергающих этанол, различны;

хроническое воздействие этанола вызывает изменение Свойств

. бензодиаэепиновых рецепторов центрального и периферического типов в головном мозгу человека и крысы;

влияние этанола о пре- и постнатальный период развития потомства крыс приводит к значительным изменениям свойств БЗДР в различных структурах головного мозга крысят;

свойства бенэодиазепиноеых рецепторов в различных структурах головного мозга человека и крысы различны;

изменения свойств бензодиазепиновых рецепторов головного мозга человека и крысы однонаправлены;

возможность участий БЗДР в формировании алкогольной мотива ции, вовлечения е один из механизмов действия этанола, реализации его эффектов.

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертации доложены на научных отчетных сессиях НИИ ПЗ ТНЦ СО РАЖ (Томск, 1986, 1988 гг.), на Всесоюзной конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты психического здоровья" (Томск, 1990 г.), на научно-практических конференциях НИИ ПЗ ТНЦ СО РАЖ (Томск, 1988, 1991 гг.), на Всесоюзной с международным участием научно-практической конференции "Психическое здоровье -региональные аспекты" (Владивосток, 1992), на Симпозиуме с меж -дународным участием "Современные проблемы клинической и экспериментальной психоней'роиммунологми" (Томск, 1992)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, список которых приводится в конце автореферата; 6 рационализаторских предложений.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах, иллюстративный материал содержит( таблиц и рисунков. Диссертация состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждения), выводов и приложения.

Список литературы включает источников отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '

Исследования свойств бензодиазепиновых рецепторов: максимально выявляемую плотность и аффинность мест специфического свя-1ывания селективных лигандов проводили в ткани головного мозга экспериментальных животных - крыс линии Вистар и в аутопсийном материале мозга человека, полученного при срочном вскрытии по-гмертно вследствие острой сердечной недостаточности в НИИ кардиологии ТНЦ АМН СССР, Всего было исследовано 42 образца ткани головного мозга человека и 212 образцоо мозга крыс. ■

Методической основой изучения роли бензодиаэепиноеой рецеп-торной системы мозга в развитии алкоголизма в эксперименте послужила модель, учитывающая как стадийность в развитии болезни, так и генетические факторы предрасположенности к развитию влечения и зависимости от этанола. Модель разработана О. В. Буровым и соавт. в 1960 г. в НИИ фармакологии РАМН (г.Москва).

Для определения храктеристик бензодизепиновых мест связывания в ткани головного мозга крыс в различных группах по окончании экспериментального периода крыс декапитировали и мозг извлекали немедленно. Кору головного мозга и другие структуры (мозжечок, свол, передний мозг у крысят) отделяли и заморажиэали в жидком азоте, образцы хранили при температуре - 80 С. Грубую фракцию синаптосомальных мембран получали из образцов тканей головного мозга взрослых крыс и потомства крыс.

Препараты мембран хранили при t * - 80 С. Связывание ЗН-флв-нитразепама (84 Ки/ммоль,"Амершам", Англия) проводили при t » О С в.течение 60 мин. по методу, описанному Monier et.al., 1978 а нашей модификации (Кладницкий А.В.,Мухин А.Г. ,1984 и др.)

Неспецифическое связывание определяли в присутствии нерадиоактивного диазепама в концентрации 10 мкМ. Связанный лиганд отделяли фильтрацией через GF/8 фильтры ("Whatman", Англия).

Для исследования свойств субпопуляции БЗДР головного иозга дифференцированно выделяли и изучали БЗДР центрального и периферического типа коры головного мозга крыс в исследуемых группах. Изучение характеристик связывания бензодиазепиновых рецепторов в коре головного мозга крыс центрального и периферического типов проводили в синаптосомальной и митох»ндриальной фракциях соот- • аетстаенио. Препаративное разделение на фракции проводили ме-

■ годом центрифугирования с использованием комбинированного флота-ционно-седиментациониого градиента плотности" (по 0.Н.Jones и A. I.Matus, 1974) в нашей модификации, направленной на оптимизаций условий лиганд-рецепторного связывания : связывания селективных лигандоэ.к бензодиазепиновьм рецепторам с синаптосомальными . и митохондриальными мембранами ткани головного мозга.

После центрифугирования материал распределялся в качестве осадка на границе каждой фазы: верхний слой - миелин, средний слой - синаптосомальные мембраны и нижний слой - митохондриальные мембраны. Фракции отбирали, замора*"вали и хранили при t - - 80 С.

Изучение свойств центральных мест связывания бензодиаэепи-нов проводили используя селективный лиганд ЗН-флюнитразепам (85 Ки/ммоль, "Амершам", Англия) в синапсотомальной фрахции мембран.

Изучение свойств периферических мест связывания бензодиа-^епинов проводили в митохондриальной фракции мембран коры головного мозга крыс с использованием селективного лиганда 3H-Ro 5-4864 (90 Ки/ммоль, NEN, США).

Изучение характеристик бензодиазепиновых мест связывания центрального и периферического типов в синаптосомальной и митохондриальной фракциях некоторых структур мозга человека (кора больших полушарий, кора мозжечка, головка хвостатого ядра) проводили с использованием селективных лигандов: ЗН-флюнитразепама (85 Ки/ммоль,"Амершам", Англия) и ЗН-РК 11195 (83,7 Ки/ммоль, "HEN", США) соответственно. .

Образцы указанных структур головного мозга человека бмли' взяты посмертно не позднее, чем в течение 6 часов после наступления смерти вследствие острой сердечной недостаточности, затем их немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре- » - 80 С. Соответствующие фракции синаптосом и митохондрий получали методом препаративного центрифугирования исследуемых образцов в градиенте сахарозы, указанному выше;

Белок определяли по методу Brandford (1976).

здмоактивный анализ количества св^анного лиганда проводили в сцинтилляционном бета-счетчике "Rak-beta" (LK&, Швеция).

Константу диссоциации (Kd) и максимально выявляемое число мест специфического связывания (Б макс) определяли методом ана-

лиза кривых насыщения в координатах Скзтчарда. Первый показатель выражали в нН, второй в фмоль/мг Белка. Статистичская достоверность изменений изученных показателей вычислялась по критерию КолмаГорова-Смирнова и ^критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методической основой изучения роли 53ДР в формировании влечения к алкоголю и развитии алкоголизма в эксперименте послужила модель, учитывающая как. стадийность в развитии болезни, так и генетические факторы предрасположенности к развитию влечения, и зависимости от этанола. Предрасположенность к потреблению алкоголя оценивали по результатам индивидуального тестирования крыс,

Крыс-самцов линии Вистар-содержали на свободном доступе в условиях свободного выбора к воде и 15%-'ному раствору этанола в течение 10-дней. Животные получали стандартную диету - брикетированный корм. Количество выпитой хидкости регистрировали'в мл за сутки в обеих бюретках с раствором 15%-ного этанола и водой.

По результатам тестирований крыс разделяли на группы:

1 - отвергающих этанол, сюда относили животных, уровень потребления 15%-ного этанола у которых составил менее 1 мл за сутки и

2 - предпочитающих этанол - относили крыс, уровень потребления 1554-ного этанола у которых составил в среднем 35+8'мл на крысу в сутки - " многопьвдие" (МП). Животных, не покамвйих выраженного отношения к этанолу по результатам тестирования, в эксперименте не использовали.

Для выяснения особеностей свойств ВЗДР в ЦНС у крыс с раэ-мчным предпочтением к этанолу мы изучали связывание ЗН-флунит-мэепама с синаптосомальными мембранами,а грубом гомогенате коры ■олоеного мозга крыс в следующих группах; у крыс, предпочитавших алкоголь и по условиям эксперимента находившихся без доступа к этанолу весь период, у крыс, отвергавших этанол, содержавшихся зез доступа к этанолу и у крыс, ' предпочитавших этанол и находившихся в' условиях свободного доступа кэтанолу и воде а течете эксперимента. Из последней группы выделили часть крыс, кото->ых подвергли 24-часовой отмене этанола с целью исследования' >лияния этанола и его отмены на БЗДР мозга у МП крыс.

Продолжительность экспериментального периода составила 3 мес.

Для- определения характеристик бензодиазепиновых мест связывания в ткани головного мозга крыс в различных группах по окончании экспериментального периода крыс декапитировали, головной мозг немедленно извлекали, кору отделяли и замораживали в жидком азоте. Полученные препараты грубой фракции синаптосомальных мембран связывали с радиоактивным флунитразепамом, меченным по тритию. Константу диссоциации (Кд) и максимальное число мест специфического связывания (Вмахс.) определяли методом анализа кривых насыщения а координатах Скэтчарда. Первый.показатель выражали в нМ, вт.орой в ?моль/мг белка.

Во всех обследованных группах животных значимых различий по числу мест специфического связывания ЗН-флунитразвпама (Вмакс.) не было. Сродство рецепторов к данному лиганду.достоверно снижено у крыс, предпочитвиш алкоголь по сравнения с отвергавшими ' его (значения Кд * 4, 34±0," 75 нМ и 3,13*0,18 нМ соответственно р < 0,01 ).

В группе "многопьющих" животных, потреблявших этаиол в течение всего экспериментального периода без отмены алкоголя и с 24-часовой его отменой, на? лается тенденция снижения аффинности БЗДР к данному лиганду.

Таким образом, сравнительный анализ двух основных выборок, диаметрально различающихся между собой - предпочитающих этанол животных ("многопьющих"), и непредпочитающих его (отвергающих) . отражает общую тенденцию снижения сродства БДР центрального типа . к ЗН- флунитразепаму в коре головного мозга крыс, предпочитающих этанол по сравнений с отвергающими его.

В связи с выявленными изменениями свойств БЗДР в грубом го-могенате коры головного мозга у крыс, предпочитающих алкоголь, .представляется актуальным более дифференцированное изучение; свойств различных субклассов БЗДР "центрального" и "периферического" типов в с'инаптосомальной и митохондриальной фракциях коры головного мозга у крыс с различным предпочтением к этанолу.

С целью отбора животных, предпочитавших и отвергавших этанол, было также проведено тестирование крыс как указывалось ранее. Крысы, предпочитавшие этанол, были также разделены на две группы, животных одной из которой содержали без доступа к этанолу весь период, а животные другой группы получали в течение 6

- 11 -

■f

ее. 15% -ный раствор этанола в качестве единственного источника нтья. Крысы, отвергавшие этанол, находились без доступа к алко-5Л» весь период.

С целью более строгого отбора опытной выборки у МП животах был проведен повторный скрининг на предпочтение к алкоголю, уяснилось, что в результате хронического воздействия этанола у 1сти крыс предпочтение к алкоголю изменилось на предпочтение к зде.

Во всех экспериментальных группах крыс: 1) отвергающих эта->л, 2)предпочитающих алкоголь, но не подвергавшихся его влиянию, [предпочитающих, подверженных хроническому воздействию алкого-я, не изменивших своего предпочтения и 4}иэменивиих предпочте-<е-к этанолу были" проведены исследования свойств БЗД рецепторов дентрального'-' и "периферического" типа в синаптосомальной и ми-¡хондриальной фракциях, полученных из коры головне т мозга.

Свойства МСС бензодиаэепинов центрального типа исследовали результате связывания ЗН-флкжитразепама с синаптическими мембрв-1ми коры головного • мозга крысы, МСС "периферического типа" -результате связывания ЗН-Ро 5-4864 с митохондриальными мембра-

1МИ,

Обнаружено, что во всех обследованных группах животных зна- • !мых различий по числу мест специфического связывания БД цент-1ЛЬНого типа (Вмакс. ) выявлено не было. Однако, мохно отметить ¡которую тенденцию возрастания плотности рецепторов у крыс, >едпочитавших алкоголь и подвергавшихся хроническому воздействие гоголя в течение-б мес. по сравнению с животными, отвергавшими •анол и предпочитавшими этанйЛ, но содержавшихся без доступа к анолу весь,экспериментальный период (см.рис. 1)

Сродства рецепторов к указанному лиганду (1/Кд) достоверно 1ижено во всех трех группах - у крыс, предпочитавших алкоголь: тверженных и не'подверженных хроническому воздействие алкоголя ''сравнению с контрольной группой животных - отвергавших.этанол' не имевших к нему доступа_в течение всего-экспериментального риода (см. рис. 2). ' Следовательно, можно-сделать предположение сниженной изначально аффинности БЗДР центрального типа в коре.' ловного мозга крыс, предпочитавших этанол по.сравнению с кры-ми, отвергавшими его.

При сравнении параметров связывания-ЗН-флуиитразепама у

Распределение плотности бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов коры головного мозга крыс в различных группах

В тах

1 - отвергавшие этанол - ' -

2 - "многопьющие", подвергавшиеся хронической алкоголизации

3 - изменившие предпочтение к этанолу

4- предпочитавшие этанол, не .подвергавшиеся хронической алкоголизации

Примечание: на диаграмме представлены показатели плотности : центральных и периферических мест специфического связывания в коре голе юго мозга крыс в различных групп; попарно в сравнении ' . показатели даны в фмоль/мг белка,б <0 02

■ - п -

Распределение аффинности бензодиаэелиновых рецепторов центрального и периферического типов коры головного мозга крыс в различных группах

Кс1

Рис. г

1 - отвергавшие этанол

2 - "многопыошие", подвергавшиеся"хронической алкоголизации - изменившие предпочтение к этанолу

4 - предпочитавшие этанол, не подвергавшиеся хронической ал -коголизации

Примечание: на диаграмме предстзвлены показатели аффинности центральных и периферических мест специфического связывания в коре головного мозга крыс в исследуемых группах попарно в сравнении . показатели даны в нМ, р<0,02

- и -

крыс, не изменивших своего предпочтения к алкоголю в результате его хронического воздействия и изменивших предпочтение, следует отметить,что они близки между собой по значениям ( см. рис.1 и рис.2). Следовательно, в обеих группах крыс свойства исследуемых рецепторов одинаковы, несмотря на то, что после длительного воздействия (в течение 6 мес.) этанола предпочтение у части крыс изменилось.

Следовательно, можно сделать предположение об индивидуальной биологической переносимости этанола. Животные, длительно подвергавшиеся хроническому воздействиюэтанола, получившие свободный доступ к. воде, изменили свое предпочтение 'к алкоголю по-видимому в связи с возникшей вследствие длительного употребления биологической непереносимостью этанола. Это согласуется с данными поведенческих реакций на алкоголь.других исследователей.

Исследование свойств БЗДР периферического типа показало увеличение специфического связывания ЗН-Ро 5-4864 (Вмакс.) в митохондриях коры головного мозга крыс, предпочитавших алкоголь и подверженных в течение 6 мес. его влиянию по сравнению с отвергавшими его. на 54,8-59,4% соответственно (см. рис, 1).

В то же время нами выявлено увеличение значений константы диссоциации лиганд-рецепторного комплекса (Кд) у первых относительно вторых (см. рис. 2), что свидетельствует о снижении аффинности ис-следуемых рецепторов к данному лиганду.

При сопоставлении значений Кд и Вмакс, в коре головного мозга у крыс, отвергавших этанол и предпочитавших его без воздействия этанола, выявлено, что данные статистических различий не имеют, однако можно отметить тенденцию снижения сродства рецепторов и увеличения их числа у крыс, предпочитавших этанол.

Анализ полученных данных в группах крыс, предпочитавших, этанол, но по условиям эксперимента ' составивших разные группы, показал, что аффинность рецепторов у МП крыс, подверженных хронической алкоголизации и не изменивших предпочтения,к.алкоголю (по результатам повторного тестирования) достоверно снижена относительно МП крыс, находившихся без доступа к этанолу по условиям эксперимента. .

Таким образом, при изучении свойств 6ЭДР центрального и периферического типов в синаптосомальной и митохондриальной фрак-

циях головного мозга с', различным предпочтением к этанолу в норме и под влиянием.хронического воздействия этанола, установлено: 1) снижение аффинности БЗДР центрального типа (достоверно) и отмечена тенденция" снижения БЗДР периферического типа с увеличением .числа мест связывания•ПБЗДР у крыс, предпочитавших алкоголь по сравнению с отвергавшими его; 2) снижение аффинности БЗДР обоих типов с увеличением числа мест связывания ПБЗДР у МП крыс, подверженных з течение б мес. хроническому воздействий этанола по сравнению с НП крысами; 3) снижение аффинности БЗДР обоих типоа и увеличение числа мест связывания ПБЗДР у МП крыс, подверженных хроническому воздействию этанола по сравнению с НП крысами, не подверженных влиянию алкоголя; 4) более выраженные изменения свойств БЗДР периферического типа у ИП крыс, не изменивших своего предпочтения в ходе эксперимента по сравнение с МП крысами, изменивших свое предпочтение; 5) более выражен ые изменения БЗДР периферического типа по сравнению с БЗДР центрального типа в исследуемых группах, что находит подтверждение в ряде работ (Freund G., 1980; Rottenberg Н. ,1985; Mhatre М. et. al., 1983;Ticku М. К., Kulkarni S. К., 1 988; Bück K.J., Harris R. A., 1990).

Для выяснения влияния этанола на БЗДР головного мозга по- ' томства длительно алкоголизированных крыс в пре- и постнатальный период развития нами было проведено сравнительное исследование свойств мест специфического связывания ЗН-<рлунитразепама с препаратами мембран грубой синаптосомальной фракции из различных областей головного- мозга у 30-дневных крысят-потомков крыс, предпочитавших этанол и подверженных ■ хроническому воздействию— этанола в период беременности и лактации и у крысят-потомков • срыс, отвергавших этанол и не подверженных его влиянию. ИсследУ->мые- структуры были: "кора больших, полушарий, передний мозг, :твол, мозжечок. Дифференциальное изучение св'ойств БЗДР центрально и периферического типа проведено не было из-за малого количества исследуемой ткани. Изучение свойств рецепторов проводи-,и для каждого животного индивидуально, образцы тканей не бъединяли..

Как показали исследования, свойства БЗДР неоднородны а раз-ичиых областях мозга. Наибольшая аффинность к данному, лиганду меньшие значения Кд) выявлена у БЗДР в коре головного нозга,

*

в структурах переднего мозга и стволовой части головного мозга, менее аффинными оказались рецепторы мозжечка. Наибольшее число мест связывания ЗН-флунитразепама выявлено в коре головного мозга, в меньшем количестве они представлены в структурах переднего мозга, стволовой части и мозжечке у крысят обеих исследуемых групп (см. рис. 3 и рис.4).

При проведении сравнительного анализа параметров связывания ЗН-флунитразепама в различных структурах мозга потомства крыс в обеих исследованных группах нами обнаружено возрастание плотности мест специфического связывания ЗН-флунитразепама (Вмакс.) и •снижение аффинности этих рецептора (увеличение значений Кд) в коре головного мозга потомства предпочитавших алкоголь, длительно алкоголизированных крыс по сравнению с потомством крыс, от- ' вергаважх алкоголь и не подверженных его влиянию.(см. рис.3 и 4), что соответствует данным (ЖулинВ. 8., ¡988; Simmons R. D. et. al., 1984; Gavish M. et.al., 1985 и др.) о специфических изменениях бензодиа-зепиновой рецепторной системы мозгл,

В других исследуемых структурах достоверно значимых различий параметров связывания данного лиганда не выявлено. Следов»-, тельмо, можно предположить, что наиболее чувствительными к длительному воздействию алкоголя а пре- и постнатальный период развития среди исследованных структур развивающегося мозга крысят являются бензодиазепиноаые рецепторы коры головного мозга. Снижение аффинности БЗДР у потомства крыс, предпочитавших алкоголь и подверженных длительной алкоголизации, может свидетельст- j вовать об изменении ' функционирования ГАМКа/бвнзодиазепинового рецепторного комплекса, сопряженного с хлорным нонофором. Вполне вероятно, что повышение числа мест специфического связывания бвнзодиазепиноа можнв рассматривать как компенсаторный механизм развивающегося мозга крысы, связанный,со снижением аффинитета БЗДР вследствие влияния алкоголя. Реципрокность между аффинитетом рецептора к лиганду и числом мест его специфического связывания на -мбранв может свидетельствовать с г шествовании гомослецифи- , ческой регуляции (Сергеев П.8., римановский П. Л., .198J) для БЗД рецепторов коры головного мозга, что может компенсировать их физиологический ответ, на избыток лиганда.

Проведенные исследования показывают, что у потомков крыс, подвергнутых хронической алкогольной интоксикации, выявляются осо-

Плотность мест связывания Н-флунитразепама с мембранами различных структур мозга крысят в исследуемых группах

В тах

Рис. 3

- кора больших полушарий

2 - структуры переднего мозга

3 - ствол ' ...

4 - мозжечок

Примечание: на диаграмме показатели контрольной и опытной .< групп представлены попарно для каждой структуры показатели даны в фмоль/мг белка, р<0,02

Аффинность мест связывания Н-флунитразепама с мембранами различных структур мозга крысят в исследуемых группах •

К<1

.Рис. 4

1 - кора больших полушарий

2 - структуры переднего мозга

3 - ствол

4 - мозжечок

Примечение: на диаграмме показатели контрольной и опытной групп представлены попарно для каждой структуры показатели даны в нМ,р<0,02

бенности свойств БЗДР, которые соответствуют характеристика БЗДР у взрослых животных, предпочитающих'алкоголь (Анохина И. П. ,1989).

8 результате экспериментальных исследований мы получили фактический материал, подкрепляющий гипотезу о биологической детерминированности свойств бензодиазепиновых рецепторов в коре головного мозга крыс с различным предпочтением к этанолу и однонаправленном изменении их под влиянием'хронической алкоголизации.

Следующее направление исследования заключалось в изучении свойств бензодиазепиновых рецепторов в различных структурах го- . ловного мозга человека постмортально в норме и вследствие алкоголизации. Аутопсийный материал для исследования был получен на ранних вскрытиях (не позднее 6 часов после наступления cwepTiJ с помощью врача-патологоанатома C.B.Тараноаа*

Для исследования брали биопсию фронтальной коры, коры мозжечка, головки хвостатого ядра. Разделение ткани четного мозга на синаптосомальную'и митохондриальнуи фракции проводили с помощью препаративного ультрацентри^угирования. Характеристики связывания бензодиазепиновых рецепторов центрального типа изучали в синаптосомальной фракции тканей указанных структур головно-"о мозга с использованием в качестве лиганда ЗН-флвнитраэепама, терифэрического типа - .в мито'хондриальной фракции исследуемых :труктур с использованием в качестве лиганда ЗН-РК 11195.

Выявлено, что свойства БЗДР также неодинаковы в различных збластях головного мозга человека. Наиболее аффинными являются 53ДР головки хвостатого ядра среди исследованных структур мозга, <то показано для рецепторов и центрального и периферического ти-юв. Менее аффинны рецепторм'коры мозга и коры мозжечка, причем »то более выражено для рецепторов периферического типа. Наиболь- ' jee число рецепторов центрального типа обнаружено в хвостатом |дре и коре головного мозга, в меньшей степени - в коре мозжеч-;а. Максимальное количество БДР периферического типа выявлено в ope головного мозга, ' в меньшем количестве они представлены в ope мозжечка и хвостатом ядре. Таким образом, .полученные данные видетельствуют о гетерогенности бензодиазепиновых рецепторов ентрального и периферического типов- в различных стоуктурах мйз-а человека в обеих исследованных группах (см. рис. 5, 6).

* Выражаем благодарность Таранову С. В.-зав. отделением патоанато-ии НИИ кардиологии ТНЦ РАКИ за оказание помощи в выполнении работы.

Распределение плотности бензодиазепиновых рецепторов , центрального и периферического типов в различных структурах мозга человека в норме и под влиянием алкоголизации

В тах

Рис. 5

•1 - кора, больших полушарий . . - '

2 - головка хвостатого ядра

3 - кора мозжечка .

Примечание: на диаграмме представлены показатели плотности центральных и периферических мест связывания в различных структурах головного мозга человека контрольной и опытной группы в сравнении .юпарно и тетрамерной структурой

показатели даны в фмоль/мг белха р<0,02

Распределение' аффинности бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов в различных структурах мозга человека в норме и под влиянием алкоголизации

Кй

Рис. 6

1 - кора' больших полушарий

2 - голоска хвостатого ядра

3 - кора мозжечка

Примечание: на диаграмме представлены показатели аффинности • центральных и периферических мест связывания в различных структурах мозга человека контрольной и опытной группы в сравнении попарно и' тетрамерной структурой

показатели даны в н,М, р<0,02

Сравнительный анализ параметров'связывания ЗК-флунитразепа и ЗН-РК 11195 с синаптосомальнымк и митохондриальными мембранам соответственное различных структурах головного мозга- человек выявляет достоверное увеличение Кд для указанных лигандов, что свидетельствует о снижении аффинитета БЗД рецепторов центрально и периферического типов на фоне возрастания числа мест связыва ния в исследуемых структурах мозга у пациентов, имевших алкоголизм в анамнезе по сравнению с пациентами, не имевших такого ан мнеэа. Причем следует отметить разную степень выраженности этих ^изменений: наибольшие изменения для БЗДР центрального типа отме чаются в коре головного мозга и хвостатом ядре, для БЗДР Периферического типа - в хвостатом ядре и коре мозжечка. Полученные результаты свидетельствуют о неоднородном изменении свойств' мест связывания (аффинитета и числа мест .связывания) селективны: лигандов под влиянием алкоголизации,, что подтверждает гипотез; гетерогенности физиологического ответа ' в различных структура: мозга на воздействие этанола, что согласуется с данными КиЧопеп Е.,1983; Freund G.,Ball inger W.E,, 1989; Korpi E.R. et.al.,1992.

' В результате.проведенных исследований выявлено, что изменения свойств бензодиазепиновых рецепторов (плотности и аффинности мест специфического связывания селективных лигандов) головного мозга человека и крысы под влиянием алкоголизации однонаправлень что выражается в снижении аффинности специфических мест связывания к селективным лигандам и увеличению числа мест связывания данных лигандов, что может свидетельствовать об общности бмоло-' гического механизма действия этанола. .Кроме того.показано, что свойства БЗДР достоверно различны у крыс, предпочитавших этанол но не имевших влияния этанала, и отвергавших его, что подтверждав гипотезу о генетической детерминированности биохимической и физи логической реакции мозга на воздействие этанола (Москаленко В. Д. 1987; Uus1-Oukari И.,Korpi E.R. ,1992).

Таким образом, выявленные изменения свойств бензодиазепино-аых рецепторов головного мозга человека и крысы а норме И под влия.ием алкоголизации позволяют рассм^.ривать их участие в формировании алкогольной мотивации, развитии алкоголизма, вовлечения их в один из основных механизмов действия этанола, реализации его эффектов.

В связи с этим возможно использование новых данных- в поиске

перспективных препаратов для профилактики и лечения алкоголизма, и характеристик радиолигандного связывания в качестве одного из показателей в системе поиска и отбора химических соединений антиалкогольного профиля.

ВЫВОДЫ

1. Свойства бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов в коре головного мозга крыс, предпочитающих этанол, отличаются от свойств БЗДР у крыс, отвергающих этанол, что выражается а снижении сродства рецепторов к селективным лигандам.

2. Хроническое воздействие этанола приводит к значительному снижению аффинности БЗДР центрального и периферического типов и увеличению числа мест специфического связывания периферического типа в коре головного мозга "многопьющих" крыс.

3. Свойства бензодиазепиновых рецепторов в различных областях головного мозга потомства крыс под влиянием этанола в пре- и постнатальный период развития изменяются, Что выражается в снижении сродства рецепторов и увеличению числа мест связывания в исследуемых структурах по сравнению с контролем.

4. Радиорецепторным методом исследования характеристик связывания БЗДР обоих типов в различных областях головного мозга человека и крысы в норме и под влиянием, этанола выявляется гетерогенность БЗДР в исследованных структурах, что выражается.в различии аффинности и плотности мест специфического связывания селективных • лигандов. .•

5. Влияние алкоголизации «а свойства БДР в исследованных структурах головного мозга человека приводит к снижению аффинности этих рецепторов со значительным увеличением числа мест специфического связывания селективных лигандов,

6. Изменения свойств бенэодиазепиновых рецепторов головного мозга человека и крысы под влиянием алкоголизации однонаправлены, чго может свидетельствовать сб общности механизмов действия 'этанола.

7. • Выявленные изменения свойств бензодиазепиновых рецепторов го- • ловного мозга позволяют рассматривать их участие в формировании алкогольной мотивации, развитии алкоголизма, вовлечение этой системы в один из основных механизмов действия этанола.

п и с о к научных работ, опубликованных по.тема диссертации

1. Влияние длительной алкогольной интоксикации на свойства нэодиаэепиновых рецепторов нервной ткани у потомства крыс // туальные вопросы психиатрии. - Томск, 1987.- С. 192-194.

2. Структурно-метаболические проявления алкогольной змбрио-тии мозга// Методол. теорет. и метод, аспекты современной кейро-рфологии: Сб. научи, трудов. - М., 1987. - С.104. (В соавт. с (1, Муравьевой, А. В. Солонским, Н. С. Ковецким, Л.И.Дорофеевой).

3. Некоторые итоги изучения алкогольной эмбриопатии мозга ловека// Мед. аспекты охраны психического здоровья населения 5ири и Дальнего Востока. - Томск, 1988. - С. 28-29. (В соавт.

г, В. Коноваловым, А. В. Солонским, Н. С. Ковецким, Т. Н.Мельниковой). '

4. Свойства бензодиазепиновых рецепторов ко"-! головного зга крыс с разной степень» предпочтения к этанолу // Хурн. неврологии и психиатрии. - 1989. - Вып. 2.-С. 122-125.

5. Бензодиазепиновые рецепторы центрального и периферичес-"о типов коры головного мозга крыс с различным отношением к шолу // Медико-биологические аспекты охраны психического здо-1ья : Тез. докл. Всес. конф. с междун. участ. - Томск, 1990.161.'

6. Роль бензодиазепиновых рецепторов периферического типа в •уляции синтеза стероидов // Международное общество для пато-шологов: Сб. научн. трудов. - М., 1991,- С. 347. (8 соавт. с '. Мухиным и др,)

7. Влияний употребления этанола на свойства бензодиазепино-: рецепторов центрального и периферического типов в различных ¡уктурах головного мозга человека // Психическое здоровье -иональные аспекты: Тез. докл. Всес. конф. с междун. участ. - ' дивосток, 1992.- С. 279. (В соавт. с С. В. Тарановым).

8. Влияние алкоголизации на бензодиазепиновые рецепторы пе-1ерического типа в различных структурах головного мозга и лимитов человека // Современные проблемы клинической и экспери-тальной психонейроиммунологии: Тез. докл. Симпозиума с междун. ст. - Томск, 1992.-С. 133. (В соавт. с С. В.Таранов и В.Я.Семке)