Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Гепатопротективные свойства полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской

0046

На правах рукописи

256

Ратькин Евгений Валентинович

ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ МААКИИ АМУРСКОЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ 2010

Томск-2010

004611256

Работа выполнена на кафедре фармацевтической технологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук Чучалин

Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Плотников

профессор, заслуженный Марк Борисович

деятель науки РФ

доктор биологических наук Новожеева

Татьяна Петровна

Ведущая организации: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «__»____2010 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д.001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр Ленина, 3)

Автореферат разослан «_» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ^---Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. ■ .

В последние десятилетия возрос и имеет дальнейшую тенденцию к распространению удельный вес заболеваний гастроэнтерологической патологии, около половины которой составляют заболевания печени. Поиск новых источников субстанций для получения лекарственных средств, способных усиливать регенераторные процессы в печени, внедрение их в широкую медицинскую практику, является важнейшей задачей, решение которой позволит удовлетворить в полном объеме запросы здравоохранения (Ивашкин В.Т., 2002; Подымова С.Д., 2005; Шульпекова Ю.О., 2006).

Более 50 % количества гепатолротекторов относятся к средствам растительного происхождения (Ушкаловй Е.А., 2004; Горяйнова Ю., 2002)!' Вместе с тем, ресурсы природной флоры ограничены и не способны обеспечить все возрастающие потребности фармакотерапии. Лекарственное растительное сырье характеризуется сезонным характером заготовки. Специфика воспроизводства растений ограничивает возможность их полного и ежегодного использования; накопление биологически активных веществ (БАВ) идет медленно, что уменьшает эксплуатационные возможности природных ресурсов. Технология каллусных культур, напротив, не зависит от указанных факторов. Культуры клеток могут продуцировать вещества, несвойственные исходным растениям. Стоимость культуры тканей относительно невелика, и при переходе на производственные масштабы цена препаратов может быть сопоставима с той, которая характерна для лекарственных средств из традиционного растительного сырья. Следовательно, при усовершенствовании этого метода промышленность может получить практически неиссякаемый источник сырья для получения фармацевтических продуктов (Булгаков, В.П. исоавг.,2004).

Все это определяет целесообразность исследований по получению культур растительных тканей и клеток растений - продуцентов БАВ в качестве альтернативного источника сырья для производства лекарственных препаратов.

Весьма перспективным • гёпатопротективным средством является оригинальный препарат максар, разработанный в Тихоокеанском институте биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН совместно с кафедрами фармацевтической технологии и фармакологии Сибирского государственного медицинского университета. Препарат представляет собой полифенольный комплекс ядровой древесины маакии амурской (Maakia amurensis Rupr. Et Maxim, сем. Fabaceae) - единственного древесного представителя сем. Бобовые (Fabaceae) во флоре российского Дальнего Востока. На различных моделях острого токсического гепатита максар был оценен как высокоэффективный гепатопротектор для патогенетической фармакотерапии заболеваний печени, не уступающий по эффективности широко используемым импортным гепатотропным средствам (эссенциале форте, гептрал) (Саратиков A.C. и соавт., 2000). Сырьевой источник получения максара -маакия амурская, является крайне эндемичным растением, естественные запасы которого

3

невелики и весьма медленно самовозобновляются. В Амурской области дерево занесено в «Красную книгу растений Амурской области». В связи с этим представляет интерес определить перспективы использования в качестве сырья для получения максара альтернативного источника - клеточной культуры маакии амурской.

Цель исследования. Изучение фармакологических свойств полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской в качестве потенциального источника сырья для получения гепатопротективных препаратов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку влияния полифеиолыюго комплекса клеточной культуры маакии амурской и максара на метаболические и морфологические нарушения печени крыс при гепатите, вызванном тетрахлорметаном.

2. Изучить гепатопротективные свойства отдельных групп биологически активных веществ полифеиолыюго комплекса клеточной культуры маакии амурской при экспериментальном ССЦ-гепатите.

3. Оценить влияние мономерных и димерных стильбенов на метаболические и морфологические нарушения печени при интоксикации тетрахлорметаном.

4. Уточнить роль отдельных биологически активных веществ полифенольного комплекса маакии амурской и ее клеточной культуры в реализации гепатопротективпого эффекта.

Научная новизна. Впервые экспериментально изучена гепатопротективная активность полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской (ПКМА). Установлено, что выраженность фармакотерапевтического эффекта ПКМА при экспериментальной гепатопатии, вызванной тетрахлорметаном, не уступает активности оригинального гепатопротектора максара.

Установлена роль отдельных биологически активных компонентов маакии амурской в обеспечении гепатопротективпого эффекта ПКМА.

Впервые, метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) применен для оценки эффективности терапии гепатопротекторами поражения печени крыс при интоксикации тетрахлорметаном.

Научно-практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность внедрения ПКМА в качестве профилактического и лечебного средства при патологии гепатобилиарной системы.

Показана перспектива использования клеточной культуры маакии амурской и полифенольного комплекса на ее основе в качестве источника сырья для производства гепатопротективного препарата.

Основные положения, выносимые на защиту:

Результаты исследования фармакологических свойств ПКМА и ее компонентов:

1. Терапия ПКМА в течение 4 дней, на фоне интоксикации тетрахлорметаном, ослабляет развитие гиперферментемии, улучшает экскреторную функцию печени, норма-

4

лизует углеводный, белковый обмен, улучшает показатели липидного обмена, препятствует развитию жировой дистрофии и ограничивает развитие морфологических нарушений в печени.

2. Способность ПКМА препятствовать развитию метаболических и структурных нарушений печени при экспериментальном ССЦ-гепатите не уступает гепатопротектив-ному эффекту максара.

3. Гепатопротективные свойства ПКМА основаны на способности общего комплекса полифенольпых соединений, входящих в состав препарата стимулировать экскреторную и антитоксическую функции печени, стабилизировать мембраны гепато-цитов, нормализовать показатели жирового, углеводного, белкового обменов и томографические характеристики печени.

4. Мономерные и димерные стильбены не оказывают существенного влияния на способность максара препятствовать метаболическим и структурным нарушением печени при экспериментальной гепатопатии, вызванной тетрахлорметаном. Их гепато-протективная активность ограничивается нормализацией показателей липидного и белкового обмена.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с научно-исследовательским планом кафедры фармацевтической технологии ГОУ ВГ10 СибГМУ Росздрава и в рамках комплексной целевой программы СО АМН «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос. Регистрации 01.9.1002479). Часть исследований проведена в рамках реализации гранта РФФИ р-офи №09-04-99130 «Идентификация механизмов цитопротективного действия фенольных соединений клеточной культуры маакии амурской».

Апробация работы.

Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005), XI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005), всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (г. Екатеринбург, 2009), международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (г. Шимкент, 2009).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 112 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 147 источников, из них-69 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены в зимне-весенний период на 420 белых беспородных крысах-самцах массой 160-280 г, полученных из питомника «Рассвет» НПО «Вирион» г. Томска (сертификат имеется). Животные находились в стандартных условиях содержания на естественном световом режиме, при свободном доступе к воде и пище (температура воздуха в виварии 20-22°С, влажность - не более 50 %, световой режим (день/ночь) - 1/1. Кормление животных осуществляли дважды в день. Корм - специальные гранулы с минеральными и витаминными добавками. Содержание животных соответствует правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, декапитацшо) осуществляли с 9 до 12 ч с целью исключения суточных влияний на метаболизм. Опыты выполняли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством Здравоохранения Российской Федерации. Для проведения опытов формировались группы из 810 крыс методом случайной выборки из особей, имеющих близкую массу, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррекции количества вводимых препаратов.

В работе использовали:

Максар - полифенольная фракция ядровой древесины маакии амурской. Получен в ТИБОХ ДВО РАН. Представляет собой сумму изофлавоноидов, мономерных и димерных стильбенов (Саратиков A.C. и соавт., 2000; Федореев С.А. и соавт., 2004). На основании результатов клинической апробации Фармакологический государственный комитет МЗ РФ рекомендовал максар в качестве гепатопротектора для медицинского применения и промышленного выпуска. Регистрационное удостоверение «Максар" таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» № 003294/01 от 12.04.2004 г. (ФСП 42-0170-390503). В исследованиях использовали субстанцию сухого экстракта маакии амурской, содержащую 21,59 % полифенолов: стильбены - 8,92 %, изофлавоноиды - 12,67 %.

ПКМА - получен из клеточной культуры маакии амурской экстракцией 95 % этанолом. Клеточная культура Maackia amurensis (штамм А-18) и экстракт на ее основе содержат 20 изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно-, ди-, и малонилглюкозиды. В отличие ог нативиого растения не содержит мономерные и димерные стильбены (Fedoreyev S.A. et al., 2000).

Наряду с ПКМА, для исследования использованы его отдельные фракции, полученные путем экстракции БАВ из данного образца спиртом этиловым или этилацетатом. Состав полифенолов в каждой из фракций был определен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фракция ПКМА растворимая в этилацетате (ФР) - этилацетатное извлечение из ПКМА. Химический состав: малатгликозид генистеина, даидзеин, 7,4'-дигидрокси-3'-метоксиизофлавон, ретузин, малатгликозид формононетина, генистеин, малатгликозид

маакиаина, изоликвиритигешш, формононетин, маакиаин, медикарпин. Содержание изофлавоноидов 27,02 %.

Фракция ПКМА нерастворимая в этнлацстате (ФН) — комплекс полифенолов не извлеченный этилацетатом. Состав ФН представлен малатгликозидом генистеина, даидзеином, ретузином, малатгликозидом формононетина и малатгликозидом маакиаина. Содержание изофлавоноидов 17,71 %.

Мономсрпые стильбсны - извлечение из полифенольного комплекса древесины маакии амурской, полученное методом препоративной колоночной хроматографии на силикагеле, содержащее сумму идентифицированных мономерных стильбенов и минорное количество изофлавоноидов. Химический состав: пицеатаннол, ликвиритиге-нин, резвератрол, 3-гидроксивеститол, диадзеин, оробол, 7,4-дигидрокси-З-метоксиизофлавоп, ретузин, 3,7-дигидрокси-4-метоксифлавон, генистеин, текторигенин, изоликвиритигенин, формононетин, веститол, маакиаин, медикарпин (Кулеш Н.И. и соавт., 1998). Содержание мономерных стильбенов 33,56 %.

Димсрпые стильбсны - извлечение из полифенольного комплекса древесины маакии амурской, полученное методом препоративной колоночной хроматографии на силикагеле и содержащее сумму идентифицированных димерных стильбенов. Химический состав: мааколин, маакин А, сципрусин А, сципрусин В, маакии, маакиазин (Кулеш Н.И. и соавт., 1998). Содержание димерных стильбенов 50 %.

В качестве экспериментальной модели для моделирования токсических поражений печени использовали масляный раствор тетрахлорметана (Владимиров Ю.А. и соавт., 1998). Экспериментальные группы животных и режим назначения препаратов представлены в таблице 1. Схема введения препаратов исключала прямое взаимодействие на уровне желудочно-кишечного тракта. Тетрахлорметан вводили внутрижелудочно из расчета 1,25 мл/кг массы животного (в 50 % масляном растворе) (Владимиров Ю.А. и соавт., 1998). Исследуемые препараты вводили в желудок с помощью зонда в наиболее эффективных терапевтических дозах, отобранных на этапе скрининга соответствующих препаратов (Власова Т.В., 1991; Саратиков A.C., 2001): ПКМА и максар - в виде суспензии на 1 % растворе крахмальной слизи в дозе 200 мг/кг (по 100 мг/кг за 2 часа до введения тетрахлорметана и спустя 2 часа после введения гепатотоксина), ФР и ФН - в виде суспензии на 1 % растворе крахмальной слизи в дозе 95 и 145 мг/кг соответственно (по 47,5 и 72,5 мг/кг соответственно, за 2 часа до введения тетрахлорметана и спустя 2 часа после введения гепатотоксина), мономерные стильбены - в виде суспензии на 1 % растворе крахмальной слизи в дозе 50 мг/кг (по 25 мг/кг за 2 часа до введения тетрахлорметана и спустя 2 часа после введения гепатотоксина), димерные стильбены - в виде суспензии на 1 % растворе крахмальной слизи в дозе 35 мг/кг (по 17,5 мг/кг за 2 часа до введения тетрахлорметана и спустя 2 часа после введения гепатотоксина). Дозировки исследуемых фракций были рассчитаны исходя из содержания соответствующих групп веществ в максаре.

7

Таблица 1 - Распределение животных по экспериментальным группам

Экспериментальные группы Режим назначения препаратов

1. Фармакотерапия ПКМА и максаром поражения печени при экспериментальном СС14-гепатите

Контрольные животные Растворители препаратов

СС14-гепатит ССЦ + растворители препаратов ежедневно в течение 4 дней

Максар + ССЦ ССЦ + максар ежедневно в течение 4 дней

ПКМА + СО, ССЦ + ПКМА ежедневно в течение 4 дней

2. Фармакотерапия ФР и ФН поражения печени при экспериментальном СС14-гепатите

Контрольные животные Растворители препаратов

СС14-гепатит ССЦ + растворители препаратов ежедневно в течение 4 дней

Максар + ССЦ ССЦ + максар ежедневно в течение 4 дней

ФР + СС14 ССЦ + ФР ежедневно в течение 4 дней

ФН + СС14 ССЦ + ФН ежедневно в течение 4 дней

3. Фармакотерапия мономерными и димерными стильбенами поражения печени при экспериментальном CClj-гепатите

Контрольные животные Растворители препаратов

СС14-гепатит ССЦ + растворители препаратов ежедневно в течение 4 дней

Максар + СС14 ССЦ + максар ежедневно в течение 4 дней

ПКМА + ССЦ ССЦ + ПКМА ежедневно в течение 4 дней

Мономериые стильбены + ССЦ ССЦ + мономерные стильбены ежедневно в течение4 дней

Димерные стильбены + ССЦ ССЦ + димерные стильбены ежедневно в течение 4 дней

Двукратное введение препаратов связано со стремлением поддержать более длительное время терапевтическую концентрацию БАВ в организме лабораторного животного. Контрольной группе наряду с тетрахлорметаном вводили эквиобъемное количество растворителя.

Через сутки после последнего введения препаратов или их растворителей крыс де-капитировали под легким эфирным наркозом. Для исследования использовали сыворотку крови и ткань печени.

Белок в сыворотке крови определяли спектрофотометрически биуретовым методом с использованием «Диагностикума для определения общего белка в сыворотке и плазме крови» производства ГП НПО «Вирион» (Россия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Глюкозу в сыворотке крови определяли ферментативным методом с помощью стандартного набора «Новоглюк» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Общие липиды (холестерин, фосфолипиды, триацилглицериды, жирные кислоты и др.) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически, используя набор «Bio-La-Test» фирмы «Lachema» (Чехия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Холестерол в сыворотке крови определяли спектрофотометрически, используя набор «Bio-La-Test» фирмы «Lachema» (Чехия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Триацилглицериды (ТАГ) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически, используя набор «Bio-La-Test» фирмы «Lachema» (Чехия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Липопротеипы низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови определяли тур-бидиметрическим методом с применением стандартного набора «Biozyme» фирмы «Biocon diagnostic» (Германия) (Меньшиков В.В., 1974).

Билирубин в сыворотке крови определяли спектрофотометрически с использованием стандартных наборов «Biotest» фирмы «Lachema» (Чехия). Коэффициент глюкуро-нирования билирубина вычисляли как отношение концентраций конъюгированного с глюкуроновой кислотой и общего пигментов (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Мочевину в сыворотке крови определяли с помощью ферментативного теста, используя набор «Biozyme» фирмы «Biocon diagnostic» (Германия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Активность алашшшшютрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), в сыворотке крови оценивали с использованием стандартных наборов «Biotest» фирмы «Lachema» (Чехия). Вычисляли отношение ACT/AJ1T (коэффициент де Ритиса) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови измеряли ферментативным методом с помощью стандартного набора «Новофосфал» (АО "Вектор-Бест", г. Новосибирск) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Активность кислой фосфатазы (КФ) в сыворотке крови оценивали ферментативным методом с помощью набора «Новофосфацид» (АО «Вектор-Бест») Россия (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Активность галшаглутамилтранспептидазы (ГГТП) и общей лактатдегид-рогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически с применением стандартного набора «Biozyme» фирмы «Biocon diagnostic» (Германия) (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982).

Морфологические исследования. Печень фиксировали в 10 % нейтральном формалине, заливали в парафин; депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином-эозином (Меркулов Г.А., 1969). На гистологических препаратах на 1000 гепатоцитов подсчитывали количество некротизированных (имеющих ядро в состоянии пикноза,

9

лизиса) и двуядерных гепатоцитов, также характеризовали общие изменения (нарушение балочной структуры, сосудистые изменения и др.). Плотность клеточного инфильтрата подсчитывали с использованием сетки Автандилова и окуляр-микрометра в 1 мм2, определяли плотность макрофагов, лимфоцитов, сегментоядерпых клеток (Автандилов Г.Г., 1990).

Томографические исследования печени. Проводили в ТИБОХ ДВО РАН на магнитно-резонансном томографе «PharmaScan US 70/16» фирмы Bruker BioSpin MR1 (Coventry, United Kingdom), который служит для визуализации высококачественных изображений различных органов и тканей животных массой до 350 г. С помощью программы ROI (Region of Tool Instruments) - программного обеспечения томографа, был проведен сравнительный анализ изменения объемов печени крыс и изучены изменения интенсивности сигнала от паренхимы органа (протонной плотности (количества протонов в исследуемой ткани), времени спин-решетчатой релаксации (Т1), времени спин-спиновой релаксации (Т2), движения или диффузии исследуемых структур. Были получены Т1 и Т2 взвешенные послойные изображения (Т1-ВИ и Т2-ВИ) печени крыс в режимах RARE 8 и FLASH в аксиальной и коронапьной проекциях.

Антирадикальные свойства препаратов измеряли по способности взаимодействовать с дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ). Активность характеризовали показателем 1С50, означающим эффективную концентрацию вещества, при которой восстанавливается 50 % свободных радикалов ДФПГ (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия «Н» Крускала-Уоллиса с определением средней арифметической (М) и ее стандартной ошибки (т). Расчёты проводили с использованием программы Statistica 6.0 для Windows (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Фармакотерапия ПКМА экспериментального ССЦ-гепатита

В группе крыс, получавших гепатотоксин в течение 4-х дней, выживаемость составила 77,5 %, в контрольной группе и у животных, которым наряду с гепатотоксином вводили ПКМА и максар, этот показатель достигал 100 %. Биохимические показатели крови животных с ССЦ-гепатитом свидетельствуют о глубоких нарушениях метаболических процессов в печени. Так, по сравнению с контролем гетрахлормеган увеличивал активность ACT в 2,3 раза, что говорит об увеличении проницаемости мембран митохондрий и диффузии фермента в кровь. Соотношение АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса) составило 1,04 мккат/л (у контрольных животных - 1,3). При терапии ПКМА и максаром активность ACT снижалась в 1,24 и 1,28 раза, а соотношение АСТ/АЛТ увеличилось до 1,33 и 1,26 соответственно. Изменения активности АЛТ в сыворотке крови отравленных и леченых животных были схожи с динамикой соответствующего показателя ACT (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние ПКМА на биохимические показатели в сыворотке крови крыс при остром СС14-гепатите (М±т, средние из 6-10 определений)

Показатели Экспериментальные группы

Контрольные ССЦ-гепатит Максар + сси ПКМА+ сси

Выживаемость, % 100 77,5 100 100

ACT, мккат/л 0,61±0,04 1,44±0,02' 1,1210,022 1,1610,042

AJ1T, мккат/л 0,47±0,02 1,3810,06' 0,8910,032 0,8710,032

АСТ/АЛТ 1,30 1,04 1,26 1,33

ЩФ, мккат/л 4,810,64 15,2+0,8' 11,75+0,622 10,410,712

ГГТП, мккат/л 0,09+0,01 0,6610,Об' 0,2810,042 0,30+0,032

Билирубин общий, мкмоль/л 9,00+0,86 19,25+0,79' 13,40+0,552 12,6510,412

Билирубин непрямой, мкмоль/л 2,04±0,95 14,93+2,02' 6,76+0,852 7,70+0,432

Белок, г/л 67,53±2,03 48,8614,41' 65,74+0,842 64,97+1,432

Общие липиды, г/л 1,76+0,07 2,7710,24' 1,9310,432 1,9910,332

Холестерол, ммоль/л 5,61+0,33 10,2310,53' 6,7310,182 9,77+0,91'

Примечание:

' - р<0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита 2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов ' - р<0,05 по отношению к максару для ПКМА

Повышенная активность ЩФ в сыворотке крови служит маркером холестаза (Ха-занов А.И., 1988). Уровень ЩФ в сыворотке крови у животных, получавших гепатоток-син, повышался в 3 раза, а ГГТП - в 7,3 раза по сравнению с показателями контрольной группы, что свидетельствует об остром характере поражения печени. В группах животных, получавших на фоне интоксикации тетрахлорметаном ПКМА и максар, активность ЩФ достоверно снизилась на 32 и 23 %, а ГГТП на 55 и 58 % соответственно по сравнению с данными в группе, получавшей только гепатотоксин (табл. 2).

Гепатотоксин оказывал деструктивное влияние на обмен билирубина, увеличивая общую концентрацию этого вещества в сыворотке крови животных более чем в два раза, конъюгированного - в 7 раз. Оценка влияния препаратов на содержание пигмента в сыворотке крови показала, что препараты достоверно понижали как его общий уровень (ПКМА - до 12,65 мкмоль/л, максар - 13,4 мкмоль/л), так и концентрацию конъюгированного пигмента: ПКМА - до 7,70 мкмоль/л, максар - 6,76 мкмоль/л. Важной характеристикой антитоксической функции печени является активность процессов глюкурони-рования. В нашем эксперименте в норме 77,5 % билирубина содержалось в связанном виде. Тетрахлорметан понижал степень связывания пигмента с глюкуроновой кислотой до 22,4 %. Оценка влияния ПКМА и максара на процесс глкжуронирования показала, что

наиболее активно восстанавливал связывание пигмента максар - до 49,4 %, а ПКМА почти до 40 % (табл. 2).

В группе крыс, получавших тетрахлорметан в течение 4-х дней, концентрация общих липидов в сыворотке крови выросла в 1,6 раза и составила 2,77 г/л. В группах животных, которым наряду с гепатотоксином вводили ПКМА и максар, уровень общих липидов понизился на28 и 30 % соответственно (табл. 2).

Максар препятствовал развитию гиперхолестеролемии, снижая содержание холе-стерола в 1,5 раза по сравнению с показателями отравленных тетрахлорметаном животных. В то же время, ПКМА не влиял на концентрацию холестерола в крови, что, по-видимому, обусловлено отсутствием в его составе моно- и димерных стильбенов. Известно, что мономерный стильбен резвератрол препятствует развитию атеросклероза (Mokni М. et al., 2007; Pezzuto J.M. et al., 2009) (табл. 2).

В наших экспериментах содержание белка в сыворотке крови крыс в норме составило 67,5 г/л, применение гепатотоксина приводило к статистически значимому снижению его уровня на 27,6 %. ПКМА и максар одинаково эффективно восстанавливали концентрацию белка до показателей контрольных животных (табл. 2).

Гепатотоксическое действие тетрахлорметана сопровождалось морфологическими изменениями в печени. В соответствующей группе крыс выявлено характерное для этой патологии изменение структуры печеночных долек, многие гепатоциты уменьшены в размерах, преимущественно за счет цитоплазмы. Нарушена структура ядра, в цитоплазме большинства гепатоцитов содержались капли жира, печеночные триады почти полностью повреждены, междольковые желчные капилляры местами разорваны, между гепатоцитами изливалась желчь. Количество некротизированных гепатоцитов возросло в 7 раз, с жировой и белковой дистрофией - в 18 раз, в 3 раза было снижено количество двуядерных гепатоцитов, плотность клеточного инфильтрата увеличена в 8,6 раза (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние ПКМА на морфологические показатели печени крыс при остром СС14-гепатите (М±т, средние из 6-10 определений)

Показатели Экспериментальные группы

Контрольные СС14-гепатит Максар + СС14 ПКМА + СС14

Некротизированные гепатоциты,% 1,07±0,25 6,80±0,87' 3,52±0,692 2,31±0,262

Гепатоциты с дистрофией, % 0,53±0,19 9,84±0,57' 5,65±0,712 2,81±0,3723

Двуядерные гепатоциты, % 2,33±0,78 0,71±0,14' 1,58±0,402 5,1±0,652'3

Плотность клеточного инфильтрата, в 1 мм2 9,35±1,60 80,4±7,80' 41,7±6,002 25,6±3,932'1

Примечание:

' - р<0,05 по отношению к контрольным животным для ССЦ-гепатита

2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов 1 - р<0,05 по отношению к максару для ПКМА

ПКМА и максар, введенные на фоне с тетрахлорметаном, препятствовали развитию морфологических нарушений печени. При терапии максаром большая часть гепато-цитов формировала нормальные печеночные дольки с печеночными пластинками, определялись только единичные некротизированные гепатоциты, часть клеток находилась в состоянии мелкокапелыюй и крупнокапелыюй жировой дистрофии. Содержание некротизированных клеток достоверно снижалось в 1,9 раза, с жировой и белковой дистрофией - в 1,7 раза, плотность клеточного инфильтрата - в 1,9 раза; количество двуядерных гепатоцитов возрастало в 2,2 раза (табл. 3).

ПКМА достоверно в наибольшей степени препятствовал развитию морфологических нарушений печени при остром ССЦ-гепатите. Печеночные пластинки сохраняли нормальную структуру, гепатоциты имели полигональную форму с четкими контурами и центрально расположенным ядром. Большая часть гепатоцитов сохраняла нормальное строение, определялись единичные клетки с некротическими изменениями, признаками мелкокапелыюй жировой дистрофии и гипертрофии. Количество некротизированных гепатоцитов статистически значимо уменьшалось в 2,9 раза, с жировой и белковой дистрофией - в 3,5 раза, плотность клеточного инфильтрата - в 3,1 раза; количество двуядерных гепатоцитов возрастало в 4,9 раза (табл. 3).

Прижизненные МРТ исследования крыс с острым СС14-гепатитом регистрировали увеличение линейных размеров печени на 20 % по сравнению с данными контрольной группы, а также изменения интенсивности сигналов от паренхимы органа на Т1-ВИ и Т2-ВИ на 75 и 50 у/е соответственно. В результате терапии ПКМА и максаром на фоне интоксикации тетрахлорметаном, объем печени сохранялся на уровне размеров органа контрольной группы и происходила нормализации интенсивности сигнала от паренхимы органа на Т1-ВИ и Т2-ВИ (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние ПКМА на объем печени и интенсивность сигнала от паренхимы печени крыс на Т1-ВИ и Т2-ВИ при остром СС14-гепатите (Mim, средние из 6-10 определений)

Показатели Экспериментальные группы

Контрольные СС14-гепатит Максар + СС14 ПКМА + СС14

Объем печени, см1 269,4± 14,9 320,2±18,9' 219,5±17,62 248,9±26,42

Интенсивность сигнала Т1-ВИ, у/е 149,1+8,3 224,8±17,7' 114±5,52 137,9+8,02

Интенсивность сигнала Т2-ВИ, у/е 51,8+7,3 105+12,3' 67,1+7,02 84,4+13,32

Примечание:

' - р<0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита 2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов 1 - р<0,05 по отношению к максару для ПКМА

Таким образом, применение ПКМА и максара приводило к нормализации активности ферментов печеночного происхождения: ACT, АЛТ, ГГТП и уровня белка в сыворотке крови, ограничивали явление цитолиза, нормализовали антитоксическую и экскреторную функцию печени. ПКМА достоверно эффективнее максара восстанавливал морфологические показатели печени, препятствовал некрозу гепатоцитов и развитию лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрации, а также активно стимулировал регенерацию ткани печени. Некоторые различия в проявлении гепатопротективной активности ПКМА и максара вероятно связаны с их химическим составом, характеризующимся как разным уровнем содержания общих групп биологически активных соединений, так и их качественным компонентным составом. Напомним, что действующими веществами максара являются изофлавоны (генистеин, даидзеин, ретузин, афромозин, формононетин, оробол, текторигенин, 3-гидроксивеститон) и гидроксилированные стильбены (резвератрол, пицеатаннол, сцирпусины А и В, маакин, маакин А, маакиазин, медикарпин, маакиаин), которые имеют в своем составе фенольные гидроксилы с высокой антирадикалыюй и антиоксидантной активностью, сопоставимой с эффектом ионола (Власова Т.В., 1991; Fedoreyev S.A. et al., 2004). ПКМА в отличие от максара не содержит в своем составе мономерные и димерные стильбены (Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P., 2008). Наши эксперименты показали, что, несмотря на отсутствие в составе ПКМА веществ, принадлежащих к классу стильбенов, сила его гепатопротективного действия не уступает активности препарата максар. По-видимому, механизмы гепатопротективного действия ПКМА связаны, в первую очередь, с наличием в его составе группы полифеиольных соединений, которые обладают регулирующим влиянием на деятельность ряда ферментных комплексов, а также способностью оказывать антиоксидантное и мембраностабилизи-рующее действие.

2. Фармакотерапия ФР и ФН экспериментального СС14-гепатнта

С целью определения влияния технологии ПКМА на его гепатопротективные свойства, нами проведена оценка активности фракций ПКМА, полученных по традиционной методике получения препарата максар, где извлечение комплекса полифенолов проводят этилацетатом (ФР) и комплекса полифенолов, не извлеченных этилацетатом (ФН).

Активность 1ДФ в сыворотке крови, увеличенная в 6,6 раз под влиянием гепато-токсина, снижалась в результате терапии максаром, ФН и ФР на 53, 49 и 51 % соответственно (табл. 5).

Наиболее эффективным корректором нарушений обмена билирубина при СС14-гепатите оказался максар. Курсовое введение этого препарата на фоне интоксикации тетрахлорметаном приводило к уменьшению концентрации общего билирубина в 2,8 раза. ФР и ФН статистически значимо снижали общее содержание пигмента в крови в 1,6 и 2,2 раза соответственно. Ослабление гипербилирубииемии под влиянием препаратов

Таблица 5 - Влияние ФР и ФН на антитоксическую, экскреторную функции печени и липидный спектр крови крыс при остром^ССЦ-гепатите (М±т, средние из 6-10 определений)

Показатели Экспериментальные группы

Контрольные СС14-гепатит Максар + СС14 ФР+ССЦ ФН+ССЦ

Выживаемость, % 100 88 100 100 100

ЩФ, мккат/л 5,3±1,1 35,2+3,3' 16,3+0,452 17.9+1.42 17,1±1,02

Билирубин общий, мкмоль/л 9,4±0,9 38,6±3,9' 13,6±1,32 24,4±1,42 17,5±1,22'3

Билирубин непрямой, мкмоль/л 1,4±0,3 22,7±3,1' 3,8±0,22 9,8±0,52 3,5±0,52'3

ЛПНП, Е 28±13,8 43,1±13,0' 16,4±5,72 16,8±7,62 5,1±1,22'3

Холестерол, ммоль/л 0,78+0,04 5,46+0,31' 3,27±0,112 3,40±0,102 3,13±0,122

ТАГ, ммоль/л 2,08±0,31 4,72±1,04' 3,40+0,392 3,16+0,252 2,23±0,482

Общие липиды, г/л 1,77±0,27 5,00±0,83' 3,39±0,512 2,69±0,402 2,62±0,442

Примечание:

' - р<0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита 2 - р<0,05 по отношению к ССЦ-гепатиту для препаратов 1 - р<0,05 по отношению к ФР для ФН

обеспечивалось за счет уменьшения в 4,5-6 раз количества непрямой фракции. В группах применения максара, ФН, ФР отмечалась стимуляция экскреции билирубина засчет конъюгацией его с глюкуроновой кислотой и повышения коэффициента глюкуронирова-ния до 60-72 % (табл. 5).

Гиперлипидемия отравленных тетрахлорметаном животных, характеризующаяся повышенным содержанием общих липидов, ТАГ и холестерола в сыворотке крови, заметно ослаблялась под влиянием максара, ФР и ФН (уровень общих липидов, ТАГ и холестерола достоверно уменьшался на 40-47 %). При этом ФН действовала несколько более эффективно по сравнению с ФР. Полученные данные коррелировали со способностью исследуемых фракций ограничивать жировую инфильтрацию гепатоцитов: гисто-химически в клетках печени животных под влиянием максара, ФР и ФН ожирение оценивалось не выше 2,2 баллов.

В группах животных, получавших на фоне введения токсиканта максар и ФР, концентрация липопротеинов низкой плотности, повышенная тетрахлорметаном в 1,5 раза, снижалась на 61 % и 62 % соответственно, а под влиянием ФН на 85 % (табл. 5).

Применение ФР и ФН ограничивало развитие морфологических нарушений печени. Терапия ФР приводила к восстановлению структуры печеночных долек и печеночных триад, уменьшала венозное полнокровие. Применение ФР, вызывая гипертрофию

15

гепатоцитов, 5,1 раза снижало плотность клеточной инфильтрации ткани печени. Антинекротическое действие ФР проявлялось понижением в 2,6 раза количества клеток, уменьшенных в размере, с неоднородной окраской цитоплазмы, крупнодисперсной зернистостью, мелкими пикнотичными ядрами и восстановлением числа двуядерных гепатоцитов. Лишь в единичных клетках печени выявлялись признаки мелкокапельной жировой дистрофии, при этом не обнаруживались гепатоциты с крупными зернами в цитоплазме коагулированного белка (табл. 6).

Таблица 6 - Влияние ФР и ФН на морфологические показатели печени крыс при остром ССЦ-гепатите (М±т, средние из 6-10 определений)

Показатели Экспериментальные группы

Контрольные СС14-гепатит ФР ФН

Нектротизированные гепатоциты, % 0,76±0,15 6,29±0,57' 2,44±0,362 1,47±0,082i

Гепатоциты с дистрофией, % 1,28±0,36 24,28±1,88' 8,43±0,682 7,58±0,512

Двуядерные гепатоциты,% 1,55+0,35 0,4210,12' 1,30±0,282 2,28±0,542

Плотность клеточного инфильтрата, в 1 мм2 9,06±1,2 88,18+3,43' 17,30±3,902 15,88+0,932

Примечание:

' - р<0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита

2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов

3 - р<0,05 по отношению к ФР для ФН

ФН незначительно превосходила ФР по степени влияния на морфологические па-рушения печени при интоксикации тетрахлорметаном. При терапии ФН многие гепатоциты стремились сформировать печеночную дольку, отсутствовали очаги крупных и мелких диапедезных кровоизлияний. Следует отметить, что венозное полнокровие уменьшалось, а на некоторых препаратах почти не выявлялось. Также, достоверно сокращалась плотность клеточного инфильтрата в 5,6 раза, и он локализовался, преимущественно периваскулярно, исчезали очаги склероза. Содержание некротизированных клеток при терапии ФН статистически значимо снижалось в 4,3 раза, однако в отличие от ФР, ФН более существенно повышала количество двуядерных гепатоцитов (в 5,4 раза по сравнению с показателями при остром ССЦ-гепатите), что указывает на усиление регенерации ткани печени. Вместе с тем, несмотря на выраженный терапевтический эффект, действие исследуемых препаратов не приводило к полной нормализации исследуемых показателей, что свидетельствует о тяжести патологического процесса (табл. 6).

Таким образом, ФР и ФН являются эффективными стимуляторами антитоксической функции печени, они также как и гепатопротектор максар, препятствовали гибели отравленных тетрахлорметаном животных, ограничивали проявления цитолиза и

16

холестаза. Обе фракции предупреждали развитие жировой дистрофии печени. ФР и ФН ограничивали развитие морфологических изменений в печени, при этом ФН достоверно более эффективнее препятствовала некрозу гепатоцитов и развитию лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрации по сравнению с ФР. Стоит отметить, что ФН немного лучше нормализовала показатели липидного обмена, а уровень ЛПНП уменьшался ниже уровня контрольных животных в 5,5 раз. Снижение содержания ЛПНП ниже нормы, может быть связано с формированием адаптационно-компенсаторных механизмов. Небольшие различия в гепатопротективной активности ФР и ФН могут объясняться химическими свойствами экстрагентов, которые были использованы при их получении. Известно, что этилацетат относится к весьма селективным растворителям, что обусловливает максимальное извлечение узкой группы БАВ. Вместе с тем, по большинству показателей эти различия не носят достоверный характер и, подводя итог, можно сказать, что гепатопротективная активность обеих фракций находится приблизительно на одном уровне, что связано с близким компонентным составом.

3. Фармакотерапия мономерными и димерными стильбенами экспериментального ССЦ-гепатита

Для установления вклада мономерных и димерных стильбенов в гепатопротектив-ный эффект полифенольного комплекса маакии амурской изучено их влияние на метаболические нарушения печени при остром ССЦ-гепатите.

В экспериментальных группах, получавших наряду с гепатотоксином ПКМА, мак-сар и мономерные стильбены, гибели животных не наблюдалось. В результате применения димерных стильбенов до конца эксперимента дожили лишь 22,5 % животных, а интоксикация гепатотоксином в течение 4-х дней вызывала гибель лишь 12,5 % особей.

При терапии максаром и ПКМА активность ACT и АЛТ в сыворотке крови, повышенная тетрахлорметаном в 1,7 и 1,8 раза, снижалась на 30 %. Под влиянием мономерных стильбенов активность этих ферментов возрастала весьма значительно до 3,21 и 2,08 мккат/л соответственно, димерные стильбены на уровень ACT и АЛТ в сыворотке крови достоверно не влияли (табл. 7).

Максар и ПКМА нормализовали уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови при остром СС14-гепатите. В группе животных, получавших на фоне интоксикации тетрахлорметаном мономерные и димерные стильбены, активность этого фермента была несколько выше показателей контроля и крыс, получавших максар и ПКМА, но достоверно отличалась от показателей нелеченной группы животных (табл. 7).

Активность КФ в сыворотке крови животных, отравленных гепатотоксином, под влиянием максара и ПКМА снизжалась на 40 %. Мономерные и димерные стильбены не препятствовали росту концентрации этого фермента (табл. 7).

Таблица 7 - Влияние мономерных и димерных стильбенов на активность ферментов в сыворотке крови при остром СС14-гепатите (М±т, средние из 6-10 наблюдений)

Экспериментальные группы Показатели

АСТ, мккат/л АЛТ, мккат/л КФ, Е/л лдг, мккат/л

Контрольные 0,59±0,04 0,45+0,03 16,1+1,1 3,19+0,13

СС14-гепатит 1,01±0,03' 0,81 ±0,03' 33,8±4,8* 4,64+0,21'

Максар + СС14 0,68± 0,022 0,63±0,042 19,6±1,52 3,21+0,192

ПКМА + СС14 0,66± 0,042 0,66±0,022 21,7±1,42 3,29+0,032

Мономерные стильбены + СС14 3,21+0,692 2,08±0,262 35,9+5,4 3,40+0,132

Димерные стильбены + СС14 0,87± 0,08 1,01 ±0,54 40,2+8,6 3,54+0,152

Примечание:

1 -р<0,05 по отношению к контрольным животным для ССЦ-гепатита

2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов

Нарушение экскреторной функции под влиянием тетрахлорметана в данной серии экспериментов характеризовалось увеличением содержания, как общего билирубина, так и его связанной фракции более чем в 3 раза (табл. 8).

Таблица 8 - Влияние мономерных и димерных стильбенов на экскреторную функцию печени и активность ферментов в сыворотке крови при остром СС14-гепатите (М+т, средние из 6-10 наблюдений)

Экспериментальные группы Показатели

Билирубин общий, мкмоль/л Билирубин прямой, мкмоль/л ЩФ, мккат/л ГГТП, мккат/л

Контрольные 5,6±0,4 1,4±0,1 11,55±1,05 0,09±0,02

СС14-гепатит 19,3+0,8' 5,5+0,5' 18,53±0,26' 0,24±0,011

Максар + СС14 7,6+0,52 1,9+0,12 13,80±0,432 0,13±0,022

ПКМА + СС14 7,1+0,42 1,8+0,12 14,03±27,62 0,14±0,012

Мономерные стильбены + СС14 14,3±3,0 4,9±0,7 18,75+2,58 0,22+0,03

Димерные стильбены + СС14 10,4±1,42 2,7+0,42 17,07+4,91 0,25+0,02

Примечание:

-р<0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита 2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов

Максар и ПКМА способствовали элиминации билирубина, достоверно снижая его общий уровень до 7,6 и 7,1 мкмоль/л соответственно. Мономерные и димерные стильбе-ны ограничивали повышенную при СС14-гепатите гипербилирубинемию менее значительно до 14,3 и 10,4 мкмоль/л соответственно. Максар и ПКМА снижали содержание

18

прямого билирубина в сыворотке в 2,9 раза, димерные стильбены - в 2 раза, а мономерные стильбены не оказывали влияния на концентрацию этого пигмента при интоксикации тетрахлорметаном (табл. 8).

Максар и ПКМА понижали активность ЩФ и ГГТП в 1,4 и 1,8 раза по сравнению с показателями отравленных тетрахлорметаном животных. Мономерные и димерные стильбены на уровень ЩФ и ГГТП в сыворотке крови не влияли, активность этих ферментов оставалась практически на одном уровне по сравнению с показателями нелеченпых особей (табл. 8).

Под влиянием тетрахлорметана содержание белка в сыворотке крови снижалось на 30,5 %. Максар, ПКМА, мономерные и димерные стильбены примерно в одинаковой степени ограничивали гипопротеинемию - восстанавливали уровень белка до показателей контрольных животных (табл. 9).

Таблица 9 - Влияние мономерных и димерных стильбенов на белковый, липидный и углеводный обмены крыс при остром СС14-гепатите (М±т, средние из 6-10 определений)

Экспериментальные группы Показатели

Мочевина, ммоль/л Белок, г/л Холестерол, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Жировая инфильтрация гепатоцитов, баллы

Контрольные 6,0+0,3 67,9+1,3 2,2+0,12 7,50±0,3 0

СС14-гепатит 10,3±0,3' 47,2+2,6' 4,0+0,36' 4,20±0,1' 3,5+0,42

Максар + СС14 6,2±0,72 62,2+2,б2 2,4±0,282 7,70±0,92 2,2±0,242

ПКМА + ССЦ 7,7+0,52 67,9+2,72 3,9+0,19 7,80±0,82 1,7±0,742

Мономерные стильбены + СС14 6,5±0,42 58,8+2,32 2,6±0,222 6,90±0,72 2,3±0,532

Димерные стильбены + СС14 16,3±2,7 69,2+2,42 3,5+0,60 4,70±0,6 2,4±0,442

Примечание:

1 -р<0,05 по отношению к контрольным животным для ССЦ-гспатита

2 - р<0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препарата

Максар и мономерные стильбены препятствовали развитию гиперхолестеролемии, концентрацию холестерола достоверно снижалась в 1,7 и 1,6 раза соответственно. В отличие от них, ПКМА и димерные стильбены не влияли на уровень холестерола в сыворотке крови (табл. 9).

Концентрация мочевины при интоксикации гепатотоксином увеличилась до 10,3 ммоль/л, что свидетельствовало о нарушении антитоксической функции печени (в

контрольной группе этот показатель составлял 6,0 ммоль/л). Терапия максаром и ПКМА достоверно восстанавливала содержание мочевины до 6,2 и 7,7 ммоль/л соответственно. Мономерные стильбены также понижали уровень мочевины до 6,5 ммоль/л в отличие от димерных стильбенов, которые не влияли на этот показатель (табл. 9).

Максар и ПКМА восстанавливали до нормы сниженную тетрахлорметаном концентрацию глюкозы в крови. Мономерные и димерные стильбены не влияли на этот показатель (табл. 9).

При терапии максаром и ПКМА регистрировалась меньшая, чем при СС14-гепатите интенсивность жировой инфильтрации печени - 2,2 н 1,7 баллов соответственно. В группе животных, получавших мономерные стильбены, жировая дистрофия оценивалась в 2,3 балла, димерные стильбены - 2,4. Следует заметить, что капли жира у леченых животных всех групп локализованы, главным образом, по периферии печеночной дольки, в отличие от отравленных тетрахлорметаном животных, не подвергавшихся лечению (табл. 9).

Нарушения морфологической структуры печени отравленных тетрахлорметаном животных в данной серии экспериментов также сопровождались характерными для гепатотоксина неспецифическими повреждениями. Терапия мономерными стильбенами не приводила к улучшению гистоархитектоники печени. В препаратах присутствовала дольчатость, характерная для цирроза печени (соединительная ткань вокруг долек), клетки гипертрофированы, клеточный инфильтрат был представлен в основном макрофагами в сосудах и ткани. Проявлялись все признаки глубокой интоксикации с нарушением структуры печеночных долек. В группе крыс, получавших на фоне интоксикации тетрахлорметаном димерные стильбены, произошли глубокие нарушения морфологической структуры печени, которые по степени выраженности превышали соответствующие показатели животных с ССЦ-гепатитом.

Таким образом, мономерные и димерные стильбены при введении крысам с экспериментальной тетрахлорметановой гепатопатией не проявили выраженного лечебного эффекта, а воздействовали лишь на липидный, белковый обмен и экскреторную функцию печени. Димерные стильбены не оказывали влияние на антитоксическую функцию печени, что проявлялось в снижении выживаемости крыс даже по сравнению с группой, получавшей только тетрахлорметан, не понижали активность ферментов печеночного происхождения, за исключением достоверного снижения активности ЛДГ. Вместе с тем, димерные стильбены достоверно снижали гиперхолестеролемию и активировали синтез белка, восстанавливая его до показателей контрольных животных. Терапия мономерными стильбенами на фоне интоксикации гепатотоксином достоверно приводила к незначительному улучшению показателей углеводного обмена, снижению активности ЛДГ, уменьшала степень жировой инфильтрации гепатоцитов. В то же время мономерные стильбены до нормы понижали концентрацию холестерола, что вероятно, связано с наличием в их составе стильбена резвератрола. Известно, что резвератрол обладает

20

разносторонним воздействием на организм человека. Он является антиоксидантом, связывает и выводит из организма свободные радикалы; нормализует уровень липидов (в частности холестерола) в крови (Оуевпа Ъ. й а1., 2006; Stojanovic Б. е1 а1., 2001). Мономерные стильбены не оказывали положительного влияния на морфологические показатели печени на фоне интоксикации тетрахлорметаном, а терапия димерными стильбенами приводила к ухудшению морфологической структуры, и приближала ее к строению, характерному для цирроза.

4. Аптирадикальная активность ПКМА, максара, мономерных и димерных стильбенов

В результате экспериментов установлено, что эффективная концентрация (1С50) классического максара, содержащего изофлавоноиды и стильбены, при которой количество стабильного радикала ДФПГ в модельной системе снижалось вдвое, составила 7,5 мкг/мл. Активные концентрации других компонентов полифенольного комплекса маакии амурской, при которых уровень стабильного радикала ДФПГ в модельной системе снижался вдвое, составили для димерных стильбенов - 4,9 мкг/мл, мономерных стильбенов - 7,0 мкг/мл, ПКМА - 22,9 мкг/мл (табл. 10).

Таблица 10 - Антирадикальная активность ПКМА, максара, мономерных и димерных стильбенов на модели ингибирования ДФПГ (1С5о)

Исследуемые образцы Степень ингибирования, 1С50, мкг/мл

Максар 7,5 мкг/мл

ПКМА 22,9 мкг/мл

Мономерные стильбены 7,0 мкг/мл

Димерные стильбены 4,9 мкг/мл

Следовательно, фракция димерных стильбенов наиболее эффективно восстанавливает стабильный радикал ДФПГ в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 мкг/мл и обладает наиболее выраженной антирадикальной активностью.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии корреляции между антирадикалыюй активностью препаратов из полифеиолыюго комплекса маакии амурской в модельной системе и их гепатопротективным эффектом in vivo. Мономерные и димерные стильбены, обладающие наиболее высокой антирадикальной активностью, оцененной по их способности восстанавливать стабильный радикал ДФПГ в модельной системе, не проявили выраженной гепатопротсктивной активности при остром ССЦ-гепатите. Димерные стильбены даже потенцировали действие гепатотоксина, а фармакологическая активность мономерных стильбенов ограничивалась нормализующим влиянием на показатели липидного обмена. Это позволяет предполагать, что в гепато-

протективной активности ПКМА, также как и оригинального гепатопротектора максара, в опытах in vivo основное значение имеет не способность соединений, входящих в состав комплекса, взаимодействовать с активными радикалами, а другие механизмы, обеспечивающие фармакологический эффект. Это, в первую очередь, мембранно-стабилизирующее действие полифенолов и индукция ими ферментов антиперекисной защиты, возможно, через антиоксидант-респонсивный элемент. Эти данные создают предпосылки для совершенствования технологии производства гепатопротективных препаратов из культуры тканей маакии амурской.

ВЫВОДЫ

1. Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской при остром экспериментальном гепатите, вызванном тстрахлорметаном, благоприятно влияет на показатели метаболизма и функции паренхимы печени:

- оказывает общее антитоксическое действие;

- улучшает экскреторную функцию печени;

- ослабляет развитие гиперферментемии;

- нормализует углеводный, белковый обмен, улучшает показатели липидного обмена;

- ограничивает развитие морфологических нарушений в печени.

2. При сравнении с максаром полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской при остром ССЦ-гепатитс:

- менее эффективно воздействует на показатели липидного обмена;

- равноэффективно улучшает экскреторную функцию печени, показатели белкового, углеводного обмена и ослабляет развитие гиперферментемии;

- более эффективно восстанавливает морфологическую структуру печени.

3. Фракция клеточной культура маакии амурской, растворимая в этилацетате, и фракция клеточной культуры маакии амурской, не растворимая в этилацетате, проявляют выраженную гепатопротективную активность при остром СС14-гепатите:

- ослабляют развитие гиперферментемии; -улучшаютпоказатели липидного обмена;

- восстанавливают экскреторную функцию печени;

- ограничивают развитие морфологических нарушений в печени.

4. Мономерные и димерные стильбены, выделенные из полифенолыюго комплекса маакии амурской, обладая антирадикальными свойствами в опытах in vitro, не проявляют выраженной гепатопротективной активности на фоне острого экспериментального тетрахлорметанового гепатита. Выявлено их положительное влияние на показатели липидного и белкового обмена, димерных стильбенов - также на показатели обмена билирубина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской рекомендуется в качестве перспективного источника получения гепатопротективных препаратов для лечения и профилактики заболеваний гепатобилиарной системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ратькин, Е.В. Гепатопротективная и желчегонная активность комплексного препарата растительного происхождения / Е.В. Ратькин, Н.В. Трифонова // Актуальные проблемы фармакологии и фармации: Сборник статей по материалам всероссийской 62-ой итоговой научной конференции имени Пирогова. - Томск, 2003. - С. 206-207.

2. Гепатопротективные свойства экстрактивного комплекса клеточной культуры маакии амурской / Е.В. Ратькин, В.С Чучалин, С.А Федореев и др. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современные проблемы фармакологии и фармации», Новосибирск, 2005. - С. 488-490.

3. Ратькин, Е.В. Гепатопротекторные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской / Е.В. Ратькин, A.C. Саратиков, B.C. Чучалин и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т. 68. №. 2. -С. 51-54.

4. Ратькин, Е.В. Культура растительных клеток маакии амурской как источник сырья для получения максара / Е.В. Ратькин // XI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2005. — С. 96

5. Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенольных комплексов ядровой древесины и клеточной культуры маакии амурской / Е.В. Ратькин, С.А. Федореев, В.П. Булгаков и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т.5, Приложение №2. -С 127-128.

6. Ратькин, Е.В. Роль стильбенов маакии амурской в обеспечении гепатопротек-тивного эффекта / Е.В. Ратькин, A.B. Ратькин // Здоровье и образование в XXI веке: Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А. Л. Чижевского- М: 2008. - С. 403.

7. Гепатопротективные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры маакии амурской / Е.В. Ратькин, A.C. Саратиков, B.C. Чучалин, и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Т.7, № 1. - С. 51-55.

8. Ратькин, Е.В. Влияние гепатопротектора максара и этанольных фракций клеточной культуры маакии амурской на липидный обмен / Е.В. Ратькин, A.B. Ратькин // Бюллетень Северного государственного медицинского университета, Архангельск. -2009. - Выпуск XXII, № 1.-С. 183-184.

9. Ратькин, Е.В. Влияние максара и полифенолов клеточной культуры маакии амурской на липидный обмен / Е.В. Ратькин, A.B. Ратькин, С.С. Зоркальцев // Науки о

человеке: материалы X конгресса молодых ученых и специалистов; под ред. J1.M. Огородовой, J1.B. Капилевича. - Томск: СибГМУ. - 2009. - С. 122-123.

10. Ратькин, Е.В Роль биологически активных веществ клеточной культуры маа-кии амурской в обеспечении гепатопротективного эффекта / Е.В. Ратькин, A.B. Ратькин // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 64-й всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, г. Екатеринбург, 28-29 апр. 2009 г. - Екатеринбург: Изд-во УГМА,2009.-С. 472-473.

11. Гепатопротекторные свойства полифенолов клеточной культуры маакии амурской / Е.В. Ратькин, B.C. Чучалин, A.B. Ратькин и др. // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». -2009. -2 том. - С. 354-357.

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

AJ1T - алапинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

БАВ - биологически активные вещества

ДФПГ - дифенилпикрилгидразил

ГГТП - гаммаглутамилтранспептидаза

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МРТ - магнитно-резонансная томография

ПКМА - полифепольный комплекс клеточной культуры маакии амурской

ТАГ - триацилглицериды

Т1-ВИ -Т1 взвешенные послойные изображения

Т2-ВИ - Т2 взвешенные послойные изображения

ФН - фракция полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской, нерастворимая в этилацетате

ФР - фракция полифенольного комплекса клеточной культуры маакии амурской, растворимая в этилацетате

ЩФ - щелочная фосфатаза

Подписано в печать 28 сентября 2010 г. Усл. печ. листов Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ №231 Тираж 120 Экземпляров

Актуальность темы

В последние десятилетия возрос и имеет дальнейшую тенденцию к распространению удельный вес заболеваний гастроэнтерологической патологии, около половины которой составляют заболевания печени. Поиск новых источников субстанций для получения лекарственных средств, способных усиливать регенераторные процессы в печени, внедрение их в« широкую медицинскую практику, является важнейшей задачей, решение которой позволит удовлетворить в полном объеме запросы здравоохранения.

Более 50 % количества гепатопротекторов относятся к средствам растительного происхождения. Вместе с тем, ресурсы природной флоры ограничены и не способны обеспечить в полном объеме все возрастающие потребности фармакотерапии. Лекарственное растительное сырье характеризуется сезонным характером заготовки. Специфика воспроизводства растений, как правило, ограничивает возможность их полного и ежегодного использования; накопление ряда биологически активных веществ (БАВ) идет медленно, что уменьшает эксплуатационные возможности природных ресурсов. Технология каллусных культур, напротив, не зависит от указанных факторов, поскольку изолированные растительные ткани выращиваются в любых географических зонах и климатических условиях независимо от времени года. Использование генной инженерии позволяет существенно увеличить продуктивность биологического материала. Культуры клеток могут продуцировать вещества, несвойственные исходным растениям, что также определяет перспективу биотехнологической разработки конкретного вида. Стоимость культуры* тканей относительно невелика, так как клетки растений культивируются на сравнительно простой среде, и при переходе на производственные масштабы стоимость препаратов может быть сопоставима или даже ниже той, которая характерна для лекарственных средств из традиционного растительного сырья. Следовательно, при усовершенствовании этого метода промышленность может получить практически неиссякаемый источник сырья для получения фармацевтических продуктов [6, 11, 41, 54].

Все это определяет целесообразность исследований по получению культур растительных тканей и клеток растений — продуцентов БАВ в качестве альтернативного источника сырья для производства лекарственных препаратов.

Весьма перспективным гепатопротективным средством является оригинальный препарат максар, разработанный в.Тихоокеанском^институте биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН совместно с кафедрами фармацевтической технологии и фармакологии Сибирского государственного медицинского университета. Препарат представляет собой полифенольный комплекс ядровой древесины маакии амурской (Maakia amurensis Rupr. Et Maxim, сем: Fabaceae) — единственного древесного представителя сем: Бобовые (Fabaceae) BO флоре российского Дальнего Востока. На различных моделях острого токсического гепатита максар был оценен как высокоэффективный гепатопротектор для патогенетической фармакотерапии заболеваний печени, не уступающий по эффективности широко используемым импортным гепа-тотропным средствам (эссенциале форте, гептрал) [12, 17, 42, 43, 52]. Сырьевой источник получения максара - маакия амурская, является крайне эндемичным растением, естественные запасы которого невелики и весьма медленно самовозобновляются [42, 45, 123]. В Амурской области дерево занесено в «Красную книгу растений Амурской области». В последние годы наблюдается обеднение видового состава и сокращение площади лесов с ее участием. Это связано с влиянием антропогенных факторов — систематическими лесными пожарами, а также с проводившимися ранее рубками, в процессе которых выбирались наиболее крупные и полнодревесные экземпляры этого вида [10, 35].

В связи с этим представляет интерес определить перспективы использования в качестве сырья для получения максара альтернативного источника - клеточной культуры маакии амурской.

Цель работы

Изучение фармакологических свойств полифенольного комплекса клеточной- культуры маакии амурской в качестве потенциального источника сырья для получения гепатопротективных препаратов.

Задачи-исследования

1. Провести сравнительную оценку влияния' полифенольного комплекса клеточной' культуры маакии амурской' и максара на метаболические и морфологические* нарушения* печени крыс при гепатите, вызванном' тетра-хлорметаном.

2. Изучить гепатопротективные свойства' отдельных групп- биологически активных веществ, полифенольного комплекса клеточной культуры, маа-кии амурской приэкспериментальном ССЬггепатите.

3'. Оценить влияние мономерных и димерных стильбеновна метаболические и морфологические нарушения печени при интоксикации тетрахлор-метаном.

4. Уточнить роль отдельных биологически' активных веществ полифенольного комплекса маакии амурской и ее клеточношкультуры в реализации гепатопротективногоэффекта.

Научная!новизна работы

Впервые экспериментально изучена гепатопротективная активность полифенольного комплекса клеточной культуры, маакии амурской (ГЖМА). Установлено, что выраженность фармакотерапевтического эффекта* ПКМА при экспериментальной-* гепатопатии, вызванной тетрахлорметаном, не уступает активности оригинального гепатопротектора максара.

Установлена роль отдельных биологически активных компонентов маакии амурской в обеспечении гепатопротективного эффекта ПКМА.

Впервые, метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) применен для оценки эффективности терапии гепатопротекторами поражения печени крыс при интоксикации тетрахлорметаном.

Практическая значимость работы

Экспериментально обоснована целесообразность внедрения ПКМА в! качестве профилактического и лечебного средства при патологии гепатоби-лиарной системы.

Показана перспектива использования клеточной культуры маакии амурской и полифенольного комплекса на ее основе в качестве источника сырья для производства гепатопротективного препарата.

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты исследования фармакологических свойств ПКМА и. ее компонентов:

1. Терапия ПКМА в течение 4 дней, на фоне интоксикации тетрахлор-метаном, ослабляет развитие гиперферментемии, улучшает экскреторную < функцию печени, нормализует углеводный, белковый обмен, улучшает показатели липидного обмена, препятствует развитию жировой дистрофии. и ограничивает развитие морфологических нарушений в печенш

2. Способность ПКМА препятствовать развитию метаболических и структурных нарушений печени при экспериментальном СС1.Ггепатите не уступает гепатопротективному эффекту максара.

3. Гепатопротективные свойства ПКМА основаны на способности общего комплекса полифенольных соединений, входящих в состав препарата стимулировать экскреторную и антитоксическую функции1 печени, стабилизировать мембраны гепатоцитов, нормализовать показатели жирового, углеводного, белкового обменов и томографические характеристики печени.

4. Мономерные и димерные стильбены, не оказывают существенного влияния на способность максара препятствовать метаболическим1 и структурным нарушением печени при экспериментальной гепатопатии, вызванной тетрахлорметаном. Их гепатопротективная активность ограничивается нормализацией показателей липидного и белкового обмена.

Апробация и публикации

Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005), XI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005), всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (г. Екатеринбург, 2009), международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (г. Шимкент, 2009).

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного препарату максар и отдельным группам БАВ маакии амурской, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 112 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 147 источников, из них — 69 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской при остром экспериментальном гепатите, вызванном тетрахлорметаном, благоприятно влияет на показатели метаболизма и функции паренхимы печени:

- оказывает общее антитоксическое действие;

- улучшает экскреторную функцию печени;

- ослабляет развитие гиперферментемии;

- нормализует углеводный, белковый обмен, улучшает показатели липидного обмена;

- ограничивает развитие морфологических нарушений в печени.

2. При сравнении с максаром- полифенольный комплекс клеточной' культуры маакии амурской при остром СС1.г гепатите:

- менее эффективно воздействует на показатели липидного обмена;

- равноэффективно улучшает экскреторную функцию печени, показатели, белкового, углеводного обмена и ослабляет развитие гиперферментемии;

- более эффективно восстанавливает морфологическую структуру печени.

3. Фракция клеточной культура <маакии> амурской, растворимая в этил-ацетате, и, фракция клеточной культуры маакии-амурской, не растворимая в этилацетате,- проявляют выраженную гепатопротективную активность при* остром СС14-гепатите:

- ослабляют развитие гиперферментемии;

- улучшают показатели липидного обмена;

- восстанавливают экскреторную функцию печени;

- ограничивают развитие морфологических нарушений в печени.

4. Мономерные и димерные стильбены, выделенные из полифенольно-го комплекса маакии амурской, обладая антирадикальными свойствами в опытах in vitro, не проявляют выраженной гепатопротективной активности на фоне острого экспериментального тетрахлорметанового гепатита. Выяв

5 > t лено их положительное влияние на показатели липидного и белкового обмена, димерных стильбенов - также на показатели обмена билирубина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской рекомендуется в качестве перспективного источника получения гепатопротектив-ных препаратов для лечения и профилактики заболеваний гепатобилиарной системы. I