Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние эфферентно-клеточных технологий на гемолимфоциркуляцию и хроническое воспаление при синдроме диабетической стопы

На правах рукописи

ХАБАРОВ Дмитрий Владимирович

003062206

ВЛИЯНИЕ ЭФФЕРЕНТНО-КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ НА ГЕМОЛИМФОЦИРКУЛЯЦИЮ

И ХРОНИЧЕСКОЕ ВОСПАЛЕНИЕ ПРИ СИНДРОМЕ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.37 - анестезиология и реаниматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибнрск-2007

003062206

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные консультанты:

член-корр РАМН, доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук, профессор

Любарский Михаил Семенович Смагин Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Сафронов Игорь Дмитриевич

Поляков Лев Михайлович

Кохно Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится «»2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001 048 01 В ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу ул. Академика Тимакова, 2, г Новосибирск, 630117, тел./факс 8 (383)3336456

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, дбн

Пальчикова Н А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) и его осложнения являются одной из самых актуальных проблем современной медицинской науки Синдром диабетической стопы (СДС) объединяет патологические изменения нервной системы, артериального и микроциркуляторного русла, представляющие непосредственную угрозу развития язвенно-некротических процессов и гангрены стопы (Дедов ИИ и др, 1998, 2003, 2005, Frykberg R G et al, 2000) По данным Goodridge D (2005) язвы на фоне СДС в 84% случаев приводят к низким ампутациям, и увеличивают смертность в 2,4 раза в сравнении с пациентами, страдающими СД без язв

В патогенезе СДС ведущее место занимают три основных фактора -нейропатия, поражение артерий нижних конечностей и инфекция (Дедов И И , 1993, 1998, Балаболкин М И, 1994, 1998, 2000, Edmonds М Е., 1987, Pecoraro R Е и et al, 1990, Caputo G М et al, 1994, Lechleitner M et al, 2004, Stiegler H, 2004)

Нецелесообразно видеть этиологию сосудистых поражений в действии какого-то одного фактора (Калинин А П и др, 2000) Предполагается, что при сахарном диабете происходит нарушение функции не только артериальных, но и венозных и лимфатических сосудов и эти нарушения ухудшают течение заболевания Согласно работам академика РАМН Бородина Ю И (2001, 2003) лимфатическая система является одной из основных систем в обеспечении процессов детоксикации регионов, органов, тканей и всего организма Нарушения процессов лимфоциркуляции, не зависимо от того первичный или вторичный характер они имеют, требуют регистрации, контроля и активного терапевтического воздействия

Важнейшими факторами являются нарушения неспецифической реактивности организма на фоне хронического воспаления при СДС Существуют явные признаки вторичного иммунодефицита, что оказывает отрицательное влияние на процессы репарации, элиминация инфекционного агента (Гришина и др , 2001) Ряд исследований указывают на дисбаланс цитокинов, факторов роста и протеаз в хронической язве на фоне СДС (Trengove N J et al, 2000, Graves DT et al, 2001) Отечественные специалисты указывают на необходимость использования тех или иных вариантов иммунотерапии при СДС (Спесивцев ЮА, Егоренков MB, 1999, Козлов В К, 2002, Попович А М, 2004)

Таким образом, существуют веские предпосылки для активного влияния на неспецифическую реактивность, гемолимфоциркуляцию в регионе нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне СДС Поэтому становится очевидным, что только комплексирование иммунологических методов и экстракорпоральной гемокоррекции, по нашему мнению, способно качественно корригировать нарушения гемолимфоциркуляции, явления хронического воспаления и эндотоксикоза при СДС, повысить возможности собственных саногенных сил организма и в конечном итоге улучшить результаты лечения и повысить качество жизни пациентов

Данное представление проблемы и пути ее решения предопределили цели и задачи данной научно-исследовательской работы, а также дали основание считать ее перспективной и актуальной для современной медицины и науки

Цель. Изучить гемолимфоциркуляцию нижних конечностей и хроническое воспаление при трофических язвах на фоне синдрома диабетической стопы при использовании эфферентно-клеточных технологий Задачи:

1 Исследовать морфологическое состояние аутолимфоцитов, полученных на сепараторах клеток крови и обработанных полиоксидонием или глутоксимом, и обосновать их применение у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы

2 Изучить изменения клеточного и гуморального звеньев иммунитета, а так же маркеров воспаления при использовании лечебного аппаратного лимфоцитафереза и модифицированного плазмафереза у пациентов с хроническим воспалительным процессом на фоне синдрома диабетической стопы

3 Исследовать гемолимфоциркуляцию нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании эфферентно-клеточных технологий

4 Изучить изменения биохимических и функциональных показателей печени и почек, уровня гликемии у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании эфферентно-клеточных технологий

5 Разработать способ лечебного аппаратного лимфоцитафереза и регионарной клеточной коррекции нарушений гемолимфоциркуляции и хронического воспалительного процесса у пациентов с синдромом диабетической стопы

6 Модифицировать дискретный плазмаферез посредством включения в схему метода глутоксима или полиоксидония с целью коррекции нарушений гемолимфоциркуляции и хронического воспалительного процесса у пациентов с синдромом диабетической стопы

7 Провести сравнительную оценку эффективности лечения пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании предложенных технологий и стандартной терапии Научная новизна. Морфометрия аутолимфоцитов, полученных на сепараторах клеток крови и обработанных глутоксимом или полиоксидонием, показала отсутствие клеточной деструкции, что позволяет использовать данные аутолимфоциты в коррекции нарушений клеточного и гуморального звеньев иммунитета и хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы

Впервые проведено обоснование применения эфферентно-клеточных технологий и доказана их эффективность в коррекции патологического про-

цесса у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы

Впервые изучено состояние клеточного и гуморального звеньев иммунитета у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании аппаратного лимфоцитафереза с экстракорпоральной иммуномодуляцией в сочетании с регионарной терапией происходит увеличение Т-общих лимфоцитов главным образом за счет Т-хелперов и ци-тотоксических лимфоцитов, увеличение иммуноглобулина А, снижение иммуноглобулина в, циркулирующих иммунных комплексов, что указывает на купирование хронического воспаления

Впервые проведено комплексное изучение гемолимфоциркуляции нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы под воздействием предложенных методов эфферентно-клеточной терапии и показано улучшение показателей артериального притока, венозного и лимфатического оттока данного региона

Впервые показано, что использование эфферентных технологий у пациентов с синдромом диабетической стопы улучшает азотвыделительную функцию почек, отсутствует отрицательное влияние предложенных методов лечения на уровень гликемии

Практическая значимость. Разработан способ аппаратного лимфоцитафереза в сочетании с регионарной клеточной коррекцией нарушений гемолимфоциркуляции нижних конечностей и клеточного и гуморального звеньев иммунитета у пациентов с синдромом диабетической стопы

Разработана методика дискретного плазмафереза в сочетании с полиок-сидонием или глутоксимом, которая позволяет улучшить результаты лечения пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы, увеличивается скорость закрытия язвенного дефекта на 20% в сравнении с группой стандартной терапии

Проведенная сравнительная оценка эффективности используемых методов в коррекции нарушений гемолимфоциркуляции в регионе нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы доказывает преимущество эфферентно-клеточных технологий перед стандартными методами лечения

Предложенные эфферентно-клеточные методики с применением дискретного плазмафереза в сочетании с глутоксимом или полиоксидонием, аппаратного лимфоцитафереза, экстракорпоральной иммуномодуляции и регионарной терапии являются безопасными для пациентов (не было зарегистрировано осложнений, связанных с проведением лимфоцитаферезов, дискретных плазмаферезов, регионарной терапии аутолимфоцитами), не оказывают отрицательного влияния на уровень гликемии, не отмечено отрицательного влияния на функцию почек

Положения, выносимые на защиту: 1 Использование методов эфферентно-клеточных технологий уменьшает выраженность нарушений гемолимфоциркуляции в регионе нижних конечностей при синдроме диабетической стопы и сопровождается

возрастанием скоростных и объемных характеристик артериального, венозного и лимфатического тока и снижением резистивных показателей данных коллекторов

2 Аутолимфоциты, полученные на сепараторах клеток крови и обработанные иммуномодуляторами при температуре 37,0-37,5°С, сохраняют целостность органелл и клеточной стенки, в клетках доминируют пластические процессы

3 Использование дискретного плазмафереза с обработкой клеточной массы иммуномодулятором позволяет позитивно воздействовать на клеточное и гуморальное звенья иммунитета Наиболее выраженное корригирующее влияние на клеточное и гуморальное звенья иммунитета и течение хронического воспаления при синдроме диабетической стопы достигается при использовании разработанного метода аппаратного лимфоцитафереза с экстракорпоральной иммуномодуляцией ау-толимфоцитов и введением их в артериальную систему нижней конечности с язвой, что выражается в более быстром восстановлении нарушенных функций, в большей скорости заживления язвенного дефекта по сравнению с группой стандартной терапии

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в клиническую практику Некоммерческого Фонда «Медсанчасть-168», клиники Научно-исследовательского Института клинической и экспериментальной лимфологии (г Новосибирск) Научно-исследовательские результаты используются в лекционном курсе кафедры хирургических болезней НГУ Апробация работы. Основные положения работы были доложены на V Международном научном симпозиуме, VI Чуйской научно-практической конференции (Чолпон-Ата, 2001 г), VIII Всероссийском съезде анестезиологов и реаниматологов (Омск, 2002 г), 13-й (XVII) международной конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов «Современные методы лечения в сосудистой хирургии и флебологии», (Ярославль, 2002 г ), I съезде лимфологов России, (Москва, 2003 г), XIV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2004 г ), II региональной научно-практической конференции «Эфферентная медицина на современном этапе достижения, проблемы, перспективы решения» (Новосибирск, 2004 г), научной конференции с международным участием «Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса» (Новосибирск, 2004 г), II Всероссийской научно-практической конференции «Интенсивная медицинская помощь проблемы и решения», (Ленинск-Кузнецкий, 2004 г), II съезде лимфологов России, (Санкт-Петербург, 2005 г ), международном симпозиуме «Диабетическая стопа» (Москва, 2005 г), научно-практической межрегиональной конференции «Актуальные проблемы современной эндокринологии», (Новосибирск, 2005 г), I Сибирском съезде лимфологов с международным участием «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии», (Новосибирск, 2006 г )

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 работы, из них 10 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ, одна монография, патент на изобретение РФ

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа содержит введение, пять глав, обсуждение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы Текст диссертации изложен на 288 страницах машинописного текста Работа иллюстрирована 49 рисунками, цифровой материал исследований представлен в 80 таблицах, список цитируемой литературы включает 154 отечественных и 156 иностранных научных источника

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика больных, в терапии которых использовались эфферентные технологии

Работа основана на анализе клинического материала, набранного в хирургическом отделении Некоммерческого Фонда "Медсанчасть-168" и хирургическом отделении клиники ГУ НИИКиЭЛ СО РАМН Пациенты поступали на стационарное лечение с диагнозом "Синдром диабетической стопы" Больным назначалась стандартная консервативная терапия согласно консенсусу по лечению стопы диабетика

В зависимости от вида проводимого лечения 205 пациентов были распределены в группы две контрольных и четыре основных или сравнения

Первую - контрольную - группу составили 35 пациентов, которым проводилась стандартная - базовая терапия Аббревиатура группы «КСТ»

Вторая - контрольная - группа была сформирована из 44 пациентов, терапия которых включала 3 сеанса дискретного плазмафереза (ПА) и стандартное лечение Аббревиатура группы «К-ПА»

Третья - основная - группа была сформирована из 30 больных, в программу терапии которых были включены методы эфферентной терапии - сеансы дискретного плазмафереза с обработкой клеточной массы глутоксимом ПА начинали выполнять через 2-3 суток после поступления пациента в стационар и делали с периодичностью 36-48 часов Всего за курс лечения было проведено 3 сеанса дискретного ПА Аббревиатура группы «ПА-Г»

Четвертую - основную - группу составили 34 пациента, получавших дискретный ПА с обработкой клеточной массы полиоксидонием наряду со стандартным лечением Основное отличие от третьей группы - замена глу-токсима на полиоксидоний Аббревиатура группы «ПА-П»

В пятую - основную - группу были включены 32 пациента, получавших наряду со стандартной терапией сеансы аппаратного лимфоцитафереза с обработкой лимфоцитарной массы глутоксимом На курс лечения приходилось 3 операции экстракорпоральной гемокоррекции (лимфоцитафереза) с последующим внутриартериальным введением обработанных иммуномодулятором аутолимфоцитов, с интервалом 48 часов Аббревиатура группы «ЛЦФ-Г»

В шестую - основную - группу были включены 30 пациентов, которым проводился аппаратный лимфоцитаферез с обработкой лимфоцитарной массы полиоксидонием на фоне стандартного лечения Основное отличие от пя-

той группы - замена глутоксима на полиоксидоний Аббревиатура группы «ЛЦФ-П»

Контрольные и основные группы были сопоставимы по учетным признакам (полу, возрасту, продолжительности и тяжести заболевания и характеру сопутствующей патологии)

Методы эфферентно-клеточных технологий

1) Аппаратный лимфоцитаферез и регионарная терапия После подготовки пациента (создание определенной гемоделюции и гипокоагуляции) производили подсоединение через венозный доступ к сепаратору клеток крови «Haemonetics MSC+», США или AS-TEC 204 фирмы «Fresenius», Германия Скорость перфузии составляла от 30 мл/мин до 50 мл/мин, общий объем перфузируемой крови зависел от концентрации получаемых лимфоцитов и составлял от 30% до 50% ОЦК Концентрация аутолимфоцитов составляла от 200 до 500 клеток/мл Скорость центрифуги, количество используемого антикоагулянта определялись автоматически, согласно выбранной программе сепарации Во время проведения сеанса лимфоцитафереза больному внутривенно капельно проводилась инфузия физиологического раствора в количестве от 600 мл до 800 мл, что зависело от общего объема перфузируемой крови и количества эксфузируемой плазмы Выделенные аутолимфоциты подвергались инкубации in vitro с иммуномодулятором (глутоксим 3%-1 мл или полиоксидоний 6 мг) в течение 45 минут при температуре 37-37,5°С в термостате ТС 1/20 После окончания времени инкубации производилась реинфу-зия обработанных аутолимфоцитов внутривенно капельно Для регионарного введения аутолимфоцитов был выбран артериальный сосуд пораженной нижней конечности - бедренная артерия соответствующей стороны Объем введенных аутолимфоцитов составлял 15-20 мл в зависимости от исходной концентрации полученных клеток при лимфоцитаферезе Кроме того, возможности сепаратора клеток крови позволяли одновременно проводить плазмаэкстракцию у пациентов во время сеанса лимфоцитафереза, т е осуществлять процедуру плазмафереза

2) Модифицированный плазмаферез После подготовки пациента (создание определенной гемоделюции и гипокоагуляции) производили эксфу-зию крови самотеком в пластиковые контейнеры "Гемакон" емкостью 500 мл из расчета 6-8 мл на килограмм веса больного Контейнеры центрифугировали на центрифугах PC - 6 либо «Jouan» (Франция) После чего контейнер извлекали и с помощью пружинного плазмоэкстрактора удаляли плазму Оставшуюся клеточную массу подвергали инкубации in vitro с иммуномодулятором (глутоксим 3% - 1 мл или полиоксидоний 6 мг) в течение 45 минут при температуре 37-37,5°С в термостате ТС 1/20 После окончания времени инкубации производилась реинфузия обработанной клеточной массы внутривенно капельно

Морфологическое исследование лимфоцитов

Изучение аутолимфоцитов, полученных на сепараторах клеток крови AS-TEC 204 фирмы «Fresenius» и «Haemonetics MSC+», проводили в световом

микроскопе и просвечивающем режиме электронного микроскопа Данный фрагмент работы выполнен совместно с д б н , профессором Бгатовой Н П Исследованию подвергались три вида аутолимфоцитов 1) аутолимфоциты до обработки иммуномодулятором, 2) аутолимфоциты, обработанные глутокси-мом, 3) аутолимфоциты, обработанные полиоксидонием Каждую линию ау-токлеток фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на фосфатном буфере, затем в 1% растворе OsC>4 на фосфатном буфере, затем дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали то-луидиновым голубым, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки для исследования в электронном микроскопе Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм на ультратоме LKB-8800, контрастировали насыщенным водным раствором уранил-ацетата, цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1010

Лимфоциты фотографировали при увеличении 6000 в электронном микроскопе Морфометрические исследования лимфоцитов выполняли в соответствии с общепринятыми принципами и методами при увеличении в 48000 и использовании открытой тестовой системы

Методика реолимфовазографни нижних конечностей Способ реолимфовазографни (РЛВГ) разработан и впервые применен в клинике ГУ НИИКиЭЛ СО РАМН для оценки показателей лимфогемодина-мики (А с № 2126226, дата приоритета - 18 07 94) Способ осуществляется с помощью 6-канального аппарата "Bioset" (Венгрия), совмещающий в себе реограф и электроэнцефалограф, и парных электродов с последующей фиксацией в памяти ЭВМ посредством аналого-цифрового преобразователя Электроимпедансная кривая, получаемая с реографа, оцифровывалась посредством аналого-цифрового преобразователя по алгоритму скрытых фаз Запись реолимфовазографни осуществляется по методике стандартной тет-раполярной реографии При оценке состояния гемолимфоциркуляции нижних конечностей запись реолимфовазограммы осуществляется на двух сегментах каждой конечности на голени и стопе

Методика импедансометрии мягких тканей нижних конечностей Импедансометрия является электроимпедансометрическим способом оценки количества внеклеточной жидкости в биологических тканях Исследование проводилось по методике, разработанной в ГУ НИИКиЭЛ СО РАМН с использованием устройства для измерения активной составляющей электропроводности биологических тканей и жидкостей Измерение активной составляющей удельного сопротивления мягких тканей нижней конечности проводилось контактным способом при помощи четырехэлектродной контактной площадки, предложенной Р Р Ибрагимовым и Р Ш Ибрагимовым (1995) Исследование выполнялось на пяти уровнях нижней конечности Дистантная термография (тепловидение) Методом оценки периферического кровоснабжения является теплови-зионное обследование Принцип метода основан на измерении кожной температуры конечности путем регистрации интенсивности инфракрасного из-

лучения, зависящего от характера артериального кровоснабжения исследуемого органа Исследование проводилось на тепловизоре "ИФП-М" состоящего из тепловизионной камеры на стойке, источника питания, системного блока на базе персонального компьютера IBM PC, принтера цветной печати, с сопровождаемым программным обеспечением Тепловизионная камера сделана на основе матричного детектора DIMS InAs 128x128 в криостате с использованием жидкого азота в качестве хладогента

Лазерная допплеровская флоуметрия Для проведения лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) использовался аппарат JIAKK-01 (красный лазер), область исследования - плантарная поверхность 1 пальца стопы, запись производилась при стандартных условиях Метод ЛДФ основывается на зондировании ткани лазерным излучением и последующей регистрации излучения, отраженного от подвижных и неподвижных компонентов ткани Регистрируемый при ЛДФ сигнал характеризует кровоток в микрососудах в объеме 1-1,5 мм3 ткани

Ультразвуковое исследование артерий и вен нижних конечностей Ультразвуковое исследование проводилось по оригинальной методике, на аппарате "Aloka SSD-680", работающем в режиме реального времени При исследовании использовался датчик линейного сканирования на 7,5 МГц, позволяющий визуализировать подкожные вены и датчик на 3,5 МГц позволяющий выявлять глубокие вены и артерии

Определение общего иммунного статуса Иммунологическое обследование больных проводилось при поступлении в клинику и перед выпиской Общий иммунный статус показывал состояние клеточного и гуморального иммунитета и включал в себя определение общего и относительного числа лимфоцитов и их субпопуляций Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических лимфоцитов, НК-клеток (натуральные киллерные клетки), В-лимфоцитов, уровня иммуноглобулинов G, М, А, циркулирующих иммунных комплексов, сводного показателя - иммуноре-гуляторного индекса (ИРИ)

Субпопуляции лимфоцитов определяли с помощью моноклональных антител иммунофлуоресцентным методом (Г Фримкель, 1987, Ленинградский НИИ гематологии, 1986)

Для определения иммуноглобулинов был использован метод радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини В основе метода лежит одномерная радиальная иммунодиффузия по Манчини Значение концентрации иммуноглобулинов определяли по таблице, рассчитанной для каждой серии ди-агностикумов с использованием стандартов, рекомендуемых ВОЗ

Для определения ЦИК был использован метод преципитации полиэти-ленгликолем 600 (ПЭГ) определенной концентрации, с последующим сравнением величины светопускания опытного (сыворотка в среде ПЭГ) и контрольного (сыворотка в среде без ПЭГ) образцов

Определение биохимических показателей крови Определение уровня билирубина в плазме крови проводилось ручным способом по методике Ендрашека - Грофа прот Фотометр 5010

Определение уровня аспартатаминотрансферазы (ACT) и алани-наминотранферазы (AJIT) проводились кинетическим методом с использованием реактивов BIOCON

Определение уровня креатинина и мочевины. Креатинин определялся кинетическим методом Мочевина определялась колометрическим методом (модификация метода Бертелота)

Протромбиновый индекс (или индекс протромбина). Индекс протромбин выражает отношение протромбинового времени здорового человека к протромбиновому времени больного Выражается в процентах

Определения общего белка в сыворотке и плазме крови по биурето-вой реакции

Определение фибриногена заключается в определении времени свертывания разбавленной цитратной плазмы избытком тромбина Время свертывания при этом пропорционально концентрации фибриногена, которую определяют по калибровочному графику

Определение уровня суточной протеинурии Метод основан па свойстве сульфосалициловой кислоты реагировать с белками, вызывая помутнение, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка в моче Для определения суточной протеинурии - суточное содержание белка в г/л умножают на суточный объем мочи в литрах Методика проведения пробы Реберга Проба Реберга основана на определении содержания креатинина в сыворотке крови и моче (креатинина клиренс-тест) Мочу собирают в течение 24 часов До и во время проведения теста больной получает адекватное количество жидкости, чтобы обеспечить скорость тока мочи более 2мл/мин По объему собранной мочи устанавливают минутный диурез В крови и моче определяют концентрацию креатинина Фильтрацию и реабсорбцию расчитывают по формулам Ф = МП* d мин, где Ф- клубочковая фильтрация (мл/мин), М- концентрация креатинина в моче, П- концентрация креатинина в плазме крови, d мин-минутный диурез (мл), Р(%) = Ф-d мин/Ф * 100 или Р(%) = К-1/К* 100, где Р(%) - реабсорбция, К- концентрационный индекс (К = М П) Определение креатинина в моче по цветной реакции Яффе (метод Поппера и соавт ) Принцип метода При взаимодействии креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде образуется соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации креатинина

Бактериологическое исследование отделяемого из язвы

Материал берется двумя тампонами, один из которых используется для микроскопии, а другой - для посева Материал, взятый одним из тампонов, «размазывается» по стерильному предметному стеклу, окрашивается по Гра-му и просматривается под микроскопом При обнаружении микроорганизмов отмечается их морфологическая характеристика Материал, взятый другим тампоном из того же участка язвы, засевают на чашку с 5% кровяным агаром, на «среду для контроля стерильности» и сахарный бульон Производится дифференцировка на наличие микроорганизмов растущих в виде монокуль-

туры или в ассоциации При обнаружении ассоциации на плотной питательной среде производится исследование преимущественного роста какого-либо представителя ассоциации

Измерение площади поверхности язвы

Скорость уменьшения площади трофической язвы вычислялось по формуле V=(Si-S2)/(Si t) 100% (Мизуров Н А , 1998), где V-скорость уменьшения площади раны, Si-площадь трофической язвы до лечения, Бг-площадь трофической язвы после лечения, t - время лечения в сутках С целью определения площади поверхности трофической язвы, их контуры переносились на прозрачную бумагу, затем производился подсчет площади по палетке Статистические методы исследования

Полученные результаты подвергались статистической обработке с вычислением средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (т) Достоверность различий сравниваемых параметров рассчитывалась с использованием параметрического критерия t-Стьюдента и величины нормированного отклонения Z (Лакин Г Ф , 1980, Иванов Ю И , Погорелюк О Н , 1990) Различия считались статистически значимыми при р < 0,05 и статистически малозначимыми при р < 0,1 Расчеты производили на персональном компьютере IBM PC с использованием пакета статистических программ «Microsoft Excel'2000» и «Statistica 5 0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проблема циркуляторных расстройств сопровождает многие патологические состояния Выраженность данных нарушений и способность их коррекции во многом определяет как течение самого заболевания, так и его прогноз Важным аспектом циркуляторных нарушений является то, что имеется сопряжение сразу трех основных коллекторов артериального, венозного и лимфатического При этом, очевидно, что при наличии нарушений хотя бы в одном из трех, другие два начинают испытывать определенное напряжение и включать компенсаторные реакции для удержания общего баланса гемолим-фоциркуляции Но, если на фоне данных циркуляторных расстройств существует или возникает другой патогенетический фактор или альтерирующий процесс, то возможен срыв компенсаторных реакций и формирование выраженного многокомпонентного патогенеза патологического процесса Приведенные выше аспекты вполне справедливы в отношении синдрома диабетической стопы на фоне сахарного диабета II типа с наличием трофических язв Как известно, в возникновении данного состояния принимают участие три основных фактора нейропатия, ангиопатия и инфекция, и ряд менее значимых, но способных оказывать существенное влияние на течение патологического процесса метаболические, иммунокомплексные и гемореологические нарушения Результатом взаимодействия данных факторов является нарушение гемолимфоциркуляции и хроническое воспаление в виде длительно незаживающей язвы

Проведенные в клинике ГУ НИИКиЭЛ СО РАМН исследования гемо-лимфоциркуляции с помощью реолимфовазографии у пациентов с СДС выявили, что имеются нарушения артериального притока, венозного и лимфатического оттока Наиболее выраженные изменения наблюдались на стопе Для всех пациентов было характерно угнетение лимфатического оттока, характеризовавшееся, в основном, снижением скоростных показателей Нарушения венозного оттока проявлялись преимущественным снижением объема венозного оттока на фоне увеличения кинетического сопротивления венозному оттоку, отмечалось резкое увеличение сопротивления артериальному притоку, сопровождающееся снижением его скоростных показателей (Любарский и др , 2005) Результаты РЛВГ подтверждают данные импедансомет-рического исследования Выявлены следующие особенности повышение объема внеклеточной жидкости на уровне средней и нижней трети голени с тенденцией к повышению на уровне верхней трети голени и бедра (Любарский М С и др , 2005) Сопоставляя данные этих двух исследований, можно сказать, что выявленные нарушения гемолимфоциркуляции не компенсируются и приводят к тому, что в регионе нижних конечностей происходит задержка жидкости, результатом чего является нарушение разгрузки интерсти-циального пространства от продуктов клеточного метаболизма А если учесть, что в данном регионе имеется очаг хронического воспаления, то уровень интоксикации в данном сегменте становится чрезвычайно высоким, и требует эффективных мероприятий по разрешению подобной ситуации

Стандартная схема терапии при СДС оказывает благоприятное влияние на артериальный коллектор микроциркуляции по данным РЛВГ пациентов группы КСТ Но при этом достоверно снижается только резистивные характеристики артериального притока Поэтому необходимо усиление воздействия на данный участок микроциркуляции Включение в схему терапии СДС эфферентных технолог ий позволило достоверно изменить ряд характеристик артериального звена микроциркуляции как на уровне стопы, так и на уровне голени у пациентов с осложненным течением СДС Но самые выраженные положительные изменения отмечены на уровне стопы, поскольку исходно именно в этом сегменте имеется поражение в виде язв, и их заживление на фоне проводимой терапии находятся в тесной взаимосвязи с микроциркуляцией Все характеристики артериального кровотока на стопе с язвой по данным РЛВГ в группах, где использовался метод аппаратного лимфоцитафере-за, претерпевали достоверные положительные изменения (рис 1) Данное обстоятельство мы связываем с регионарным методом введения модифицированных аутолимфоцитов, поскольку в группах с применением дискретных ПА высокая достоверность изменений была отмечена для меньшего числа показателей РЛВГ и выраженность положительных изменений каждой характеристики была ниже в сравнении с группами ЛЦФ-Г и ЛЦФ-П

Состояние лимфатического региона вообще и в зоне поражения в частности играет одну из центральных ролей в системе детоксикации Одна из

Рис. 1. Изменение показателей артериального звена микроциркуля цнм на уровне стоим с язвой по данным peo л и мфовазографи и в группах исследования (%), * ■ достоверно при сравнении данных до и после лечении, р < 0,05

основных задач лимфатической системы - это элиминация из зоны воспаления токсинов и различи ыхметабодитов, инактивация их в лимфатических узлах, в которых гак же происходит комплекеированне с иммунной системой для выработки адекватной защитной реакции организма. Применение эфферентных технологий показало высокую и\ потенцию в улучшении характеристик лимфатического оттока в сравнении со стандартным лечением. Если стандартное лечение ни данным РЛВГ вызывало только положительную тенденцию по скоростным, объемным и резистивным характеристикам лимфо-тока на стопе с язвой, то включение в схему терапии дискретных IIA, как в сочетании с иммуномодуля горами, гак и без них, качественно улучшило данные показатели. Это связано в первую очередь с тем, что детоксикацион-ные эффекты ПЛ позволяют Снизить нагрузку па собственные системы де-токсикацни организма, создается временной интервал работы Данных систем в более облегченном режиме, кроме того, устраняется чрезмерная нагрузка па лимфатический аппарат, что способствует активации собственных еано-генных механизмов. Поэтому, эфферентная детоксикация н состоянии ни пели решать подавляющее воздействие продуктов воспаления и собственных метаболитов. II результате подобного воздействия лимфатическая система к окончанию курса эфферентных воздействий но данным РЛВГ приобрела более высокую способность функционирования. Сочетание дискретного ИД с и ммуно модуляторам и (глутоксим или полиоксидоний) оказало более _>ффек-tBBiioe воздействий в сравнении с традиционным дискретным ПА: достоверно улучшение было отмечено по всем трем параметрам лимфотока, тогда как в последнем варианте по двум (рис. 2). Данное обстоятельство связано с тем, что улучшается взаимодействие лимфатической и иммунной системы ¡i зоне их комнлексировупия под воздействием используемых препаратов.

Максимальная динамика показателей лимфотока была достигнута при использовании аппаратного лимфоцитафереза и регионарной терапии, поскольку при этом реализованы эффекты НА и иммуно модуляторе в, которые

имели место в группах ПЛ-1 и ПА-П, а так же клеточные технологии и регионарное введение Йродимфоцитов. Модифицированные аутолимфоцйты посредством артериальной системы попадали в зону микроциркуляции пораженной язвой стопы, где и реализовали свое воздействие.

Рис. 2. Изменение показателен лимфатического оттока на уровне стопы с язвой по данным реолимфовязографии в группах исследования (%),* - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р< 0.05

I'iiс. 3. Изменение показателей венозного тока на уровне стоны е язвой по данным рсолимфовазографии в группах исследования (%),* - достоверно при сравнении данных до и после лечении, р < 0,05

Улучшение характеристик артериального и лимфатического тока у пациентов с СДС на фоне предложенных методов терапии закономерно оказало благоприятное влияние и па состояние венозного коллектора микроциркуляции. Увеличение скоростных и объемных характеристик артериального притока приводит к возрастанию скорости и объема венозного отгока. Об этом и свидетельствуют результаты РЛВГ в группах исследования по венозному компоненту {рис. 3).

Эффективность предложенных эфферентных технологий в сравнении между собой оказалась в целом на одном уровне: два из трех показателей венозного тока достоверно увеличивались, при этом численная динамика была несколько выше в группах Л1 [Ф-1' и ЛЦФ-П.

Исследуй скоростные, объемные и резистивные характеристики гемо-лимфоциркуляции нижних конечностей мы косвенно могли определить состояние внеклеточного региона, который находится в теснейшей взаимосвязи с« «семи тремя коллекторами - артериальным, венозным и лимфатическим. Метод импедансометрии помог определить динамику объема внеклеточной жидкости мягких тканей нижних конечностей па фоне применяемой терапии с помощью регистрации активной составляющей удельного сопротивления (АСУС) межклеточного пространства. Совокупная оценка данных РЛШ и им¡тедансометрий позволила более взвешенно подойти к интерпретации полученных изменений.

Сравнение данных импеданеометрии нижних конечностей с язвой и без неё показало но всех группах исследования достоверное снижение АСУС. Данное обстоятельство указывает на большую задержку интерстициальной жидкости в регионе, где имеется выраженное альтерирующее течение СДС. Наличие язвы создает ситуацию по ухудшению процессов межуточного обмена, что, по словам академика РАМН Ю.И. Бородина, приводит' к «заболачиванию» интерстиция. 11римепение эфферентных технологий позволило качественно изменить исходную ситуацию. Максимальный результат достигнут при использовании клеточных технологий, именно в группах ЛЦФ-Г и ЛЦФ-П четыре ид няги регистрируемых еегментоа АСУС мягких тканей достоверно увеличивалась, при этом и средний показатель достоверно был выше после курса терапий. Дискретные НА, как в сочетании е иммупомодулято-рами. так и без них показали способность достоверно улучшать 2 показателя.

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Рнс. 4, Изменение активной составляющей удельного сопротивления мягких тканей нижней коисчписти е язвой в группах исследования, (Ом), * - достоверно при сравнении данных до ч после лечения, р < 0,05

Разнонаправленные изменении АСУС были зарегистрированы только по одному показателю на уровне голеностопного сустава в группах исследования, по их достоверность была низкая (рис. 4).

Таким образом, эфферентные технологии способны снижать объем внеклеточной жидкости в регионе нижней конечности с язвой. Ото связано как с улучшением циркуля торных процессов в сосудистой части, так и с эли-минацнонным эффектом Г1Д, который снижает общий уровень интоксикации. Наибольшее изменение АСУС в группах ЛЦФ-Г и ЛЦФ-il, очевидно,

связано с непосредственным введением аутопимфоцитов обработанных им-муномодуляторами в данный peí ион. Хорошо известна способность лимфоцитов посредством цитокинов изменять проницаемость сосудов, характер иммунологических реакций, высту пать в качестве трофо цитов, что напрямую оказывает влияние на динамику обменных процессов между сосудистой и внесосу диетой системами циркуляции жидкости.

Еще одним методом для оценки состояния микроциркуляции исследуемого региона явилась лазерная допплеровская флоуметрия. II группе контроля со стандартным лечением не было зарегистрировано достоверной динамики показателей ЛДФ, ири этом отмечалось незначительное улучшение параметров микроциркуляции па нижней конечности с язвой. Включение курса дискретных ИЛ, как в сочетании с иммуномодуляцией, так и без неё. усилило воздействие, что особенно отразилось на динамике индекса эффективности микроциркуляции (ИЭМ). В группах К-ПЛ, ПА-Г и 11Л-П показатель ЮМ повышался достоверно, кроме того динамика остальных показателей была более существенной, чем в первой, хотя и малодостоверной. Включение в программу терапии аппаратного лимфоцигафереза и рег ионарной терапии позволило оказать более Выраженное воздействий па микроциркуляцию по данным ЛДФ: достоверно изменились два параметра - среднее арифметическое значение показателя микроциркуляции (М) и индекс эффективности микроциркуляции. В группе Л1ДФ-Г - на 44.5% и 31,8% соответственно, в группе ЛЦФ-П - на 45,3% и 23,4% соответственно (рис. 5),

Р[!(\ 5, И тиснение показателей лазерной допплеровсхой флоуметрии конечности с язвой в группах исследования (96),* - достоверно при сравнении данных до и после .течения, р < 0,05

Данные изменения свидетельствовали о возрастании роли активных механизмов регуляции микроциркуляции (симпатической вазоконстрикции, миогенного тонуса), В том же векторе лежало и малодостоверное изменение среднего квадратичного отклонения показателя микроциркуляции (а) и коэффициента вариации (Ку). повышений данных показателей указывало па улучшение функционирования механизмов модуляции тканевого кровотока

Результаты дистантной термографии, направленной па выявление тепловой ассиметрии, выявили изменения, подтверждающие большую выра-

жен пост ь патологического процесса При СДС на нижней конечности с язвой. Тепловая ассиметрия была зарегистрирована на всех пяти сегментах определения кожной температуры нижних конечностей (два показателя между точками одной конечности - ДТ1 и ЛТ2. три показателя между симметричными точками нижних конечностей - ДТЗ, ДТ4 и АТ5). Изменение ЛТ па фоне эфферентных методов терапий показало достоверное уменьшение тепловой ас-снметрии. Причем использование аппаратного лимфоцитафереза и регионарной терапии позволило достигнуть такого результата по веем пяти параметрам. причем данная динамика более Выражена, чем в группах с дискретным ПА {рис. 6, 7).

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 О

■ ДТ1 □ АТ2

ш 11 I

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Рис.6. Изменение ДТ сегментов нижней конечности с язвой в группах исследования, (%),* - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Рис.?. Изменение АТ ................ сегментов нижних конечностей в группах исследования на фоне лечения, {%),* - достоверно при сравнении данных до и после лечения. р < 0,05

Данное обстоятельство связано с введением аутолимфоцитов в артериальное русло нижней конечности с язвой. Уменьшение тепловой асеиметрии указывает на снижение выраженности патологического процесса на конечности с язвой, что согласуется с результатами других исследований (РЛВГ, ЛДГ, импедансомегрия).

Важно подчеркнуть, что НивелирОваНие термографической асеиметрии происходит не только между конечностями (показатели ДТ3, ДТ4, ДТ5), по и в пределах наиболее пораженной конечности (показатели ДТЬ ДТт).

1S

Следующим важнейшим аспектом патогенеза СДС является хроническое воспаление и тесно связанные с ним метаболические и иммуноком-плексные расстройства Исследование показателей общего иммунного статуса до использования предложенных методов выявляло у большинства пациентов исследования абсолютный или относительный вторичный иммунодефицит По Т-клеточному звену отмечалось относительное или абсолютное снижение общих Т-лимфоцитов, либо они находились на нижнем уровне условной нормы Такая же закономерность прослеживалась и для субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов Отмечалось резкое увеличение ЦИК, что отражало напряжение иммунологических реакций организма Ряд авторов отмечает способность ЦИК повреждать эндотелий сосудов, что ведет к усилению ангиопатических проявлений и гемолимфоциркулятор-ных нарушений Лимфоциты СБ 16+ и СБ72+ у пациентов всех групп на момент начала терапии регистрировались на уровне нижней границы нормы либо незначительно выше ее В гуморальном звене иммунной системы регистрировалось достоверное повышение ЦИК во всех группах исследования до начала применения предложенных методов Иммуноглобулин в регистрировался либо на уровне верхней границы нормы, либо незначительно выше ее Иммуноглобулин А был на уровне нижней границы нормы, либо незначительно выше Иммуноглобулин М был достоверно повышен во всех группах исследования Таким образом, в организме имеется выраженное напряжение неспецифической реактивности организма с явлениями снижения функций иммунной системы Данное обстоятельство связано как с проявлениями СД, так и с развитием хронического воспалительного процесса

Таким образом, без целенаправленного воздействия на иммунологическую реактивность организма невозможно качественно улучшить состояние иммунитета и повысить способность организма к сопротивлению инфекции, кроме того, сложно достичь купирования явлений хронического воспаления, эндотоксикоза и ускорить заживление язв При этом необходимое воздействие должно сочетать возможность детоксикации и иммуномодуляции С этой целью для терапии трофических язв на фоне СДС мы решили комбинировать эфферентные технологии с использованием иммуномодулирующих препаратов Клеточную массу, полученную при ПА, модифицировали одним из двух препаратов - глутоксимом или полиоксидонием Выбор глутоксима был основан на уникальных свойствах данного тиопоэтина Он обладает полифункциональным биолого-фармакологическим эффектом благодаря воздействию на тиол-дисульфидный обмен, окислительно-восстановительные ферменты и регуляторные белки сигнал-передающих систем Использование препарата полиоксидоний связано не только с иммуномодулирующими свойствами, но и с выраженными детоксикационными возможностями данного фармакологического агента Полиоксидоний повышает функциональную активность иммуноцитов, что проявляется в усилении синтеза цитокинов и фагоцитоза, повышает иммунную резистентность организма

Наше исследование показало, что полиоксидоний и глутоксим в сочетании с дискретным плазмаферезом обладает определенными возможно-

стями в коррекции иммунологических нарушений у пациентов с трофическими язвами па фоне СДС (рис. 8,9,10),

К сожалению, возможности дискретного плазмафереэа не позволяют выделить одну из центральных клеток Организма — лимфоцит. При плазма-фсрезе происходит модификация всей клеточной массы иммуномодулято-ром, таким образом, происходит определенное «распыление» препарата между всеми клетками полученной после -экстракции плазмы взнеси. Поэтому, несмотря на полученный положительный результат, имеется и резерв, реализовать который способен тот метод, при котором возможно непосредственное взаимодействие «ли мфоцйт-им му н омадул я гор». Этим методом полноправно является аппаратный лимфоцитаферез. Полученные ^утолим фон и ты на сепараторе клеток крови мы обрабатывали либо Глутоксимом, либо поли-оксилопием.

1600 1400 1200 10ВД 800 600 400 200 О

I

-ff^

S

□ CD3+ ДО

лечения

□ CD3+ после лечения

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Гнс.Я. Показатели СРЗ+ п группах исследования ло и после лечения (х 10%), * ■ достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

Таким образом, предложенный метод аппаратного лимфрцитафереза с последующей модификацией полученных аутолимфоцитов качественно изменяет состояние абсолютного или относительного вторичного иммунодефицита и сторону увеличения количества клеток популяций и субпопуляций Т-лимфоцнтов. Непосредственное воздействие на ау то клетку, а именно па аутолимфоцит, выделенный при аппаратном лимфоцнтаферезе, оказывает наиболее продуктивное влияние. В условиях in vitro мы моделируем повое окружение в виде имму но модулятора. Извлекая клетку из патологически измененного микроокружения, способствуем функционированию аутолимфо-цита в том векторе, который направлен на усиление процессов сопротивления инфекции и репарации. Модифицированный таким образом лимфоцит возвращается в организм с новыми возможностями, или точнее сказать со «старыми», но угнетенными в результате нарушенных процессов реактивности и функционирования иммунной системы.

Поэтому мы видим, что обработка одним и тем же иммуномодулято-ром |у ТО лимфоцитов и клеточной массы вызывает различные изменения по силе воздействия: динамика прироста выше в группах лимфоцитафереза, но

вместе с тем данные изменения лежат в одном векторе - увеличении показателен CD3+, CD4+ и СШ+ (см. рис. 8,9,10).

□ CD4+ до

лечения

□ CD4+ поспе лечения

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Рис.9. Показателя CD4+ и группах исследования до и после лечения (хЮ /л), * - достоверно нрн сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

700

600

S00

100

300

200

100

О

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

1'нс.Ю. Показатели CD4+ в группах исследования до и после лечения (х 10 /л), * - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

Динамика показателей гуморального звена Иммунитета так же свидетельствует о благоприятном влиянии предложенных эффере!тю-клеточных технологий. Особенно это относится к группам, где использовался аппаратный лимфоцитаферез. Так, достоверно увеличивался уровень иммуноглобулина Л (исходно сниженный) в группе ЛЦФ-Г, что связано с тем, что ауто-лймфоциты обрабатывались именно глутоксимом. Именно в данной группе произошло достоверное увеличение lí-лимфоцитов, с которыми связана продукция иммуноглобулинов. А в группе ЛЦФ-П, где использовался лолиокси доний отмечено достоверное снижение иммуноглобулина G, что указывает па уменьшение напряженности иммунологических реакций. Данную особенность подтверждает динамика иммуноглобулина G в группах ПА-Г и ПА-П, где так же прослеживается более выраженное снижение Ig G при использовании полиоксидония (рис. ) 1).

100

50

о

-50

Рис.11. Изменение показателей иммуноглобулинов в группах исследования на фоне лечения(%).* - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

КСТ К-ПА ПА-Г ПА-П ЛЦФ-Г ЛЦФ-П

Рис.12. Показатели [ ¡.И К в группах исследования до и после лечения (сд.) * - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05 Одним из важнейших показателей напряженности процессов реактивности в организме является количество циркулирующих иммунных комплексов. ! 1роведенное нами исследование по динамике этого показателя выявило, что присоединение всех вариантов эфферентной терапии, предложенных па-ми. вызывало достоверное снижение ЦИК у пациентов с СДС (рис. 12). имеете с тем. не только элиминационный эффект предложенных нами эфферентных технологий, по и им му но корригирующее воздействие оказало значимое влияние па снижение I (ИК л группах сравнения. Наиболее выраженное снижение ЦИК было выявлено там, где был использован полиоксидоний. Это согласуется с тем. что сам препарат полиоксидоний, благодаря своей структуре, обладает детоксипирующими способностями в отличие от глутокеима.

Для оценки эффективности используемых методов наряду с показателями неспецифической реактивности организма, мы анализировали параметры инфекционно-воспалительного процесса, характерные Для проявления пе-специфической реактивности - фибриноген, СОЭ, ЛИИ.

Во всех группах исследования отмечались изменения, свидетельствующие о снижении выраженности патологического процесса, но их досто-

1С V И'®!

верность была разная. Уровень фибриногена достоверно снижался в группах сравнения, причем исходно он был выше, что связано, как уже указывалось выше, с тем, что язвенное поражение в группах ЛЦФ-Г и ЛЦФ-11 было значительнее. чем в других группах (рис. 13).

Рис. 13. Изменение уровня фибриногена криви в группах исследования на фоне терапии {%),* - достоверно при сравнении данных до н после лечения, р < 0,05

Рис.14. Изменение уровня СОЭ в группах исследования на фоне терапии (%), * - достоверно при сравнении данных до и после лечения, р < 0,05

Та же ситуация была характерна и для показателя СОЭ, и его достоверное снижение было отмечено только для групп, где использовался аппаратный лимфоцитаферез и регионарная терапия (рис.14). Снижение ЛИИ отмечалось но всех группах исследования, что коррелировало с процессами заживления и уменьшения выраженности инфекциоцно-воспдлительного процесса. ¡ lo при этом достоверная динамика отмечена только в группах сравнения, среди которых наибольшее снижении ЛИИ регистрировалось в группах ЛЦФ-Г и ЛЦФ-П.

Мы выделили следующие преимущества аппаратного лимфоци таферс-

за:

- выделение точного количества аутолимфоцитов;

- прицельное воздействие и м му но модулятором на аутолимфоциты в

экстракорпоральных условиях,

- возможность элиминации из организма определенного количества аутолимфоцитов,

- возможность проводить одновременно экстракорпоральную детоксика-цию - элиминацию плазмы, а с ней и части продуктов иммуновоспалитель-ных реакций

Аппаратный лимфоцитаферез позволяет не только выделять аутолим-фоциты, но и проводить одновременно эксфузию плазмы, т е плазмаферез Таким образом, удачно сочетаются два очень важных лечебных мероприятия положительные моменты, которые характерны для дискретного плазмафере-за, несет в себе метод аппаратного лимфоцитафереза К наиболее значительным эффектам плазмафереза мы относим

- элиминацию определенного количества интоксикантов различной природы,

- создание определенного функционального покоя естественным системам

детоксикации,

- эффект «деплазмирования» форменных элементов, в результате которого

происходит повышение чувствительности рецепторного аппарата,

- противовоспалительный эффект,

- улучшение реологических свойств крови

Но, к сожалению, у части пациентов данного исследования имелись противопоказания для проведения ПА, поэтому проводилось только выделение аутолимфоцитов

Поскольку для выделения аутолимфоцитов кровь должна пройти сложный технологический цикл в сепараторах клеток крови, контактируя с различными системами и резервуарами, подвергаясь действию гравитационных сил в центрифугах, было проведено морфологическое исследование полученных аутоклеток с использованием световой и электронной микроскопии Было зарегистрировано, что аутолимфоциты сохраняли целостность ядра, ор-ганелл и клеточной стенки, явлений клеточной деструкции отмечено не было Таким образом, выделенные аутолимфоциты у пациентов с СДС могли быть использованы для проведения аутологичной клеточной терапии После обработки аутолимфоцитов иммуномодулятором световая и электронная микроскопия показала, что по-прежнему не обнаруживалась клеточная деструкция Ядро, органеллы и клеточная стенка имели строение характерное для лимфоцитов человека Но вместе с тем произошел ряд количественных изменений в субклеточных структурах При обработке глутоксимом достоверно отмечалось возрастание в 2,48 раза объемной (Уу) и численной (ЫА) плотности митохондрий (увеличение на 6,4), при этом на 93% возрастала концентрация крист митохондрий, что также достоверно (рис 16) Это свидетельствовало о росте энергетического потенциала клетки и согласовывалось с фармакологическими данными глутоксима, который способен повышать уровень редокс-систем и динамику фосфорилирования ключевых блоков сигнал-передающих систем и транскриптационных факторов Достоверное повышение полисомальных рибосом, ответственных за синтетические процессы в

клетке, после обработки аутодимфоцитов глутоксимом так же свидетельствует о том, что данные аутоклетки обладают более высоким уровнем пластических процессов, чем исходные.

Рис. 16. Изменение показателей морфометрического анализа аутолнмфоцитов обработанных иммуномодулятором, * - достоверно в сравнении е контролем, р < 0,05

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

Лизосомы (ИА)

Везикулы (V«)

Рнс.17. Изменение показателей морфометрическою анализа аутолимфоцнтОв обработанных иммукрмодуляторами, * - достоверно в сравнении с ко паролем, р < 0,05

При обработке аутоклеток полиоксидонием достоверно увеличивалось на 33% численная плотность свободных полисом ал ьных рибосом. Митохондрии имели хорошо выраженные кристы. Отмечалась тенденция к увеличению объемной и численной плотности митохондрий, возрастала, но недостоверно, концентрация крист митохондрий, и отличие от глутоксима, при обработке полиоксидонием в ау то лимфоцитах достоверно увеличивается численная плотность лизосом. высокая детоксикационная способность нолиок-сидоиия, Очевидно, связана не только со структурой препарата, по и с выше выявленной особенностью в отношении лизосом. Так же, отмечалось достоверное увеличение объемной плотности везикул в аутолимфоцитах, обработанных 110 (рис. 17),

Использование эфферен тных технологий, где Присутствуют элимина-ционный и иммунокорригируюший эффекты, ставит правомочный вопрос об

их влиянии на различные параметры гомеостаза организма Поскольку соотношение положительных и побочных влияний определяет перспективу и широту использования любого метода, включая и экстракорпоральные способы лечения

Во время проведения процедур эфферентной и регионарной терапии достоверных колебаний гликемического профиля выявлено не было как относительно групп исследования, так относительно исходных значений При этом отмечалась общая тенденция к снижению уровня глюкозы в крови, что связано с более эффективной инсулинотерапией в условиях стационара Контроль гликемического профиля после завершения курса терапии в группах исследования свидетельствовал о том, что достигнутое снижение уровня гликемии сохранялось, а в ряде случаев продолжалась дальнейшее снижение уровня гликемии, но при этом р > 0,05 (рис 18)

12

ю

. 8 i

! 6 4

2 О

-•— кст

-»-К-ПА ПА-Г -*-ПА П -ж-ЛЦФ-Г -»-ЛЦФ-П

11

13 часы

17

20

Рис 18 Гликемический профиль после завершения курса терапии в группах исследования

Следующим этапом исследования была оценка влияния предложенных методов терапии СДС на ряд биохимических параметров Полученные результаты не зарегистрировали достоверного изменения уровня общего белка во всех группах исследования Так же не выявлено достоверных изменений на фоне проводимой терапии уровня ACT, AJ1T, общего билирубина и ПТИ Но в отличие от группы со стандартным лечением, в группах, где были использованы эфферентные методы, отмечалась тенденция к снижению уровней ACT, АЛТ и общего билирубина

Анализируя динамику параметров, отражающих функцию почек на фоне применения предложенных способов терапии можно заключить, что эфферентные технологии не вызывают усиления явлений диабетической нефропатии Более того, включение в алгоритм терапии ПА (дискретного или аппаратного) приводит к улучшению азотовыделительной функции, что находит отражение, как в достоверном снижении креатинина крови, так и в тенденции к снижению уровня мочевины крови

Важнейшим параметром оценки эффективности предложенных методов лечения язв нижних конечностей на фоне СДС, стала скорость уменьшения площади язвы Именно этот показатель позволяет окончательно подтвер-

дить, что все те положительные изменения гемол и м фоци ркулщ и и и реактивности организма, свойственные для той или иной группы исследования, привели к усилению процессов репарации и закрытий язвенного дефекта, 11аиболее высокая скорость уменьшения площади язвы отмечалась и группах, где использовался аппаратный лимфоцитаферез и регионарная терапия {рис. 19).

V ■г

щ 1

... »

... "' * ¿.■ад

... - — ■ _

КСТ К-ПА ПА-Г ПАгП ЛЦФ-Г ПЦФ-П

Рнс. 19. Скорость уменьшения площади дефекта в группах исследования,

* - достоверно к сравнении с первой группой контроля (КСТ), р < 0,05;

** - достоверно I! сравнении со второй группой контроля (К-ПА), р < 0,05

Таким образом, проведенное исследование показало, что включение в алгоритм терапии эфферентно-клеточных методов способно качественно изменить течение патологического процесса при СДС. Причем, в зависимости от метода, изменяется Степень выраженности терапевтического влияния на гемфшмфоциркуляцию в регионе нижних конечностей, показатели реактивности организма, скорость заживления хронических язв на фоне СДС. Данное исследование показало, Что наиболее выраженное положительное влияние на гемолимфоциркуляцию нижних конечностей с язвами было достигнуто при использовании аппаратного лимфоцитафереза и регионарной терапии с аутолимфоцитами, обработанными и мму ном одул я го ром. Достоверных различий между тем, каким иммупомодулятором - глутоксимом или гто-лиоксидонием совершалась обработка ауток леток, выявлено не было. Следует отметить, что положительно! влияние было отмечено по веем трем коллекторам: артериальному, венозному и лимфатическому. Наиболее выраженное влияние было оказано на лимфоток стопы.

Исследование общего иммунного статуса гак же показало наибольшую эффективность аппаратного лимфоцитафереза в коррекции имеющихся нарушений клеточного и гуморального звеньев иммунитета. По при этом уже отмечались особенности воздействия, связанные со свойствами иммуномо-дулятора, используемого для обработки аутолимфоци гов. Итак, наиболее выраженные изменения гемолимфе циркуля ни и, реактивности организма обу-

словили и самую высокую скорость закрытия язвенного дефекта у пациентов с СДС в группах ЛЦФ-Г и ЛЦФ-П Данное обстоятельство связано с выделением аутолимфоцитов, обработкой их иммуномодулятором и введением в артерию наиболее пораженной нижней конечности, что определяет подведение аутоклеток в зону поражения - язвенного дефекта Данный метод с одной стороны, сочетает в себе признаки клеточной технологии, а с другой - реализует концепцию направленного транспорта лекарственных веществ По данным ЬоЬтапп И е1 а1 (2005) лимфоциты через секрецию одних цитокинов (1Ь-4) способны активизировать пролиферацию фибробластов и синтез коллагена, других (1Ь-6) - усиливать инфильтрацию фибробластами и их метаболизм Поэтому вполне вероятно, что высокая скорость закрытия язвенных дефектов при использовании модифицированных аутолимфоцитов в определенной степени связана и с этими механизмами Кроме того, среди эффектов глутоксима есть способность к инициации системы цитокинов, в том числе эндогенной продукции Полиоксидоний так же способен индуцировать продукцию цитокинов, активировать фагоцитоз Данное обстоятельство вполне соответствует полученным результатам заживления язв Следует заметить, что в группах сравнения, где использовался дискретный ПА с обработкой клеточной массы иммуномодулятором (глутоксим или полиоксидоний) так же регистрировалась достаточно высокая эффективность На что указывает и улучшение гемолимфоциркуляции нижних конечностей, показателей неспецифической реактивности организма Конечно, степень выраженности положительных изменений и количество достоверно результатов было меньшим, чем в группах ЛЦФ-П и ЛЦФ-Г И, если влияние на гемолимфо-циркуляцию на уровне стопы и голени нижней конечности с язвой было меньшим в группах с дискретным ПА, то относительно контралатеральной конечности данное влияние было на одном уровне с группами, где использовался аппаратный лимфоцитаферез Как и в группах ЛЦФ-П и ЛЦФ-Г, приведенные выше положительные изменения оказали влияние и на скорость заживления язв, но достоверное улучшение касалось только одной группы -первой контрольной КСТ Это связано с некоторым упрощением технологии обработка не аутолимфоцитов, а клеточной массы, что «распыляет» иммуно-модулятор, и отсутствие регионарного введения, что делает транспорт фармпрепаратов менее направленным Исследование гликемического профиля, общего белка, функции почек не выявило нарушений при использовании эф-ферентно-клеточных технологий

Проведенное исследование показало, что важнейшим аспектом предложенных эфферентно-клеточных технологий является комплексность воздействия улучшение показателей артериального притока, венозного и лимфатического оттока, микроциркуляции, клеточного и гуморального звеньев иммунитета, снижение проявлений хронического воспаления, повышение функциональной способности органов естественной детоксикации (почки, печень) Таким образом, предложенные эфферентно-клеточные технологии обладают позитивным воздействием на различные звенья патогенеза при

синдроме диабетической стопы с трофическими язвами, что позволяет в конечном итоге повысить эффективность лечения пациентов с данной патологией

Выводы

1 Морфологическое состояние аутолимфоцитов, полученных на сепараторах клеток крови и обработанных иммуномодулятором, характеризуется отсутствием клеточной деструкции и увеличением уровня пластических процессов (количества митохондрий, полисомальных рибосом, лизосом, везикул), что доказывает жизнеспособность данных клеток и указывает на возможность их применения у пациентов с синдромом диабетической стопы

2 Изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета при использовании аппаратного лимфоцитафереза в сочетании с регионарной терапией свидетельствуют о снижении проявлений хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы и сопровождаются повышением количества Т-лимфоцитов, уровня иммуноглобулина А, снижением уровня циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулина в, а так же снижением уровня маркеров воспаления фибриногена и ЛИИ

3 У пациентов с синдромом диабетической стопы при использовании модифицированного плазмафереза изменяются показатели клеточного и гуморального иммунитета, свидетельствующие об уменьшении выраженности воспалительного процесса, что сопровождается увеличением общих Т-лимфоцитов, главным образом за счет Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов, но в меньшей степени, чем при аппаратном лимфоцитаферезе

4 При использовании эфферентно-клеточных технологий происходит позитивная коррекция нарушений гемолимфоциркуляции нижних конечностей у пациентов с синдромом диабетической стопы по всем трем коллекторам артериальному, венозному и лимфатическому Увеличиваются объемные и скоростные характеристики артериального притока, лимфатического и венозного оттока, уменьшается сопротивление артериальному притоку, лимфатическому и венозному оттоку по данным реолимфовазографии Возрастает роль активных механизмов регуляции микроциркуляции (симпатической ва-зоконстрикции, миогенного тонуса) по данным лазерной допплеровской флоуметрии Возрастает подвижность процессов массопереноса по данным импедансометрии

5 Предложенные эфферентно-клеточные технологии оказывают положительное влияние на функциональное состояние почек, не вызывают нарушений углеводного обмена, белково-синтетической функции печени

6 Использование разработанного способа аппаратного лимфоцитафереза в сочетании с регионарной терапией приводит к более быстрому купированию воспалительного процесса, что выражается в улучшении показателей гемолимфоциркуляции, клеточного и гуморального звеньев иммунитета, снижении уровня маркеров воспаления

7 Модифицированный дискретный плазмаферез позитивно воздействует на нарушения гемолимфоциркуляции, уменьшает проявление воспалительного процесса у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы

8 Сравнительный анализ эффективности лечения показал, что способ аппаратного лимфоцитафереза в сочетании с регионарной терапией оказывает более выраженное положительное влияние на клеточное и гуморальное звенья иммунитета, на гемолимфоциркуляцию нижних конечностей, развитие хронического воспалительного процесса по сравнению с другими методами эфферентных технологий и улучшает результаты лечения у пациентов с синдромом диабетической стопы увеличивается скорость репаративных процессов на 58% в сравнении с группой стандартной терапии

Практические рекомендации

1 С целью коррекции нарушений неспецифической реактивности организма и хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы показано применение разработанных эфферентно-клеточных технологий

а) сеансы дискретного модифицированного плазмафереза в сочетании с глу-токсимом (30 мг) или полиоксидонием (6 мг), инкубация клеточной массы в течение 45 минут при температуре 37-37,5°С в термостате Всего показано проведение трех процедур через 36-48 часов на фоне стандартной терапии,

б) сеансы аппаратного лимфоцитафереза с обработкой аутолимфоцитов глу-токсимом или полиоксидонием с последующим проведением регионарной терапии На курс лечения показано 3 операции экстракорпоральной гемокор-рекции (аппаратного лимфоцитафереза) с интервалом 48-72 часа, выделенные аутолимфоциты (80 мл, 200-500 клеток/мл) необходимо подвергать инкубации in vitro с раствором иммуномодулятора (глутоксим 30 м г или поли-оксидоний 6 мг) в течение 45 минут при температуре 37-37,5°С в термостате, после чего 20 мл аутоклеток вводится в бедренную артерию нижней конечности с трофической язвой (пункция артерии в типичном месте, предварительно, с целью профилактики артериального спазма внутриартериально вводится 2 мл но-шпы в разведении раствором NaCl 0,9%-10,0 мл), а 60 мл внутривенно капельно

2 С целью оценки эффективности воздействия предложенных методов эфферентной терапии и клеточной коррекции на микроциркуляцию нижних конечностей у пациентов с СДС следует использовать лазерную допплеров-скую флоуметрию до начала и после завершения лечения с определением следующих показателей среднее арифметическое значение показателя микроциркуляции, характеризующего поток эритроцитов в единицу времени в зондируемом объеме ткани (М), среднее квадратичное отклонение микроциркуляции (ст), коэффициент вариации микроциркуляции (Kv), индекс эффективности микроциркуляции (ИЭМ),

3 Для определения эффективности воздействия предложенных методов эфферентной терапии и клеточной коррекции на гемолимфоциркуляцию ниж-

них конечностей у пациентов с СДС при госпитализации и на момент выписки пациента следует применять а) реолимфовазографию с определением объемных, скоростных и резистивных характеристик артериального притока, венозного и лимфатического оттока, б) дистантную термографию с определением тепловой ассиметрии, в) импедансометрию с регистрацией активной составляющей удельного сопротивления мягких тканей нижней конечности на пяти уровнях

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Морозов В В Использование эфферентных и лимфотропных методов в лечении пациентов с диабетической стопой / В В Морозов, О А Шумков, Д В Хабаров // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины Материалы 3 молодежной научной конференции СО РАМН - Новосибирск, 2001 -С 119

2 Новые подходы в лечении пациентов с «диабетической стопой» / М А Колпаков, Д В Хабаров, В В Морозов, Л В Титова, В А Миронов, А А Ра-китин, А В Габитов // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма Материалы V Международного научного симпозиума, VI Чуйской научно-практической конференции - Чолпон-Ата, 2001 -Том I -С 135-136

3 Хронаксиметричекая электродиагностика как критерий эффективности регионарной лимфотропной терапии в лечении больных с синдромом диабетической стопы / В В Морозов, Ю А Архипов, О Г Авдонина, Д В Хабаров, М А Колпаков // Бюлл СО РАМН -2002 -№1 -С 16-18

4 Хабаров Д В Лимфоцитаферез и регионарная терапия в комплексном лечении трофических язв / Д В Хабаров, Л В Титова, О А Шумков // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины Материалы IV молодежной научной конференции СО РАМН - Новосибирск, 2002 -С 73-74

5 Возможности экстракорпоральных методов в лечении трофических язв / М С Любарский, А А Смагин, Д В Хабаров, Л В Титова, А А Ракитин // Материалы VIII Всероссийского съезда анестезиологов и реаниматологов -Омск, 2002 -С.271

6 Многоуровневая эфферентная гемолимфокоррекция в лечении синдрома диабетической стопы / А А Ракитин, М С Любарский, А А Смагин, Д В Хабаров, Л В Титова // Материалы VIII Всероссийского съезда анестезиологов и реаниматологов - Омск, 2002 -С 275-276

7 Возможности лимфоцитафереза и регионарной терапии в лечении трофических язв / Д В Хабаров, М С Любарский, А А Смагин, А А Ракитин, Л В Титова// Ангиология и сосудистая хирургия -2002 -№3 (приложение) -С 179

8 Шумков О А Эндоскопические вмешательства на венозной системе нижних конечностей у больных с трофическими язвами / О А Шумков, Д В Хабаров // Бюлл СО РАМН - 2003 -№ 1 -С 35-36

9 Нарушения микроциркуляции больных с СДС и их коррекция / М А Колпаков, М С Любарский, А А Смагин, А И Шевела, А А Ракитин, В А Миронов, О А Шумков, Д В Хабаров, Н Р Мустафаев, Е М Белов, А В Габи-тов // Хирургия Морфология Лимфология Сборник трудов НЦРВХ - Бишкек, 2003 -Вып №1 -С 130-131

10 Возможности лимфоцитафереза в коррекции трофических нарушений на фоне синдрома диабетической стопы / Д В Хабаров, М С Любарский, А А Смагин, Л В Титова, О А Шумков // Бюлл СО РАМН-2004-№ 1 -С 138141

11 Методы коррекции нарушений гемолимфоциркуляции у пациентов с синдромом диабетической стопы / М С Любарский, А А Шевела, А И Бромбин, А А Смагин, В В Морозов, В В Нимаев, Ю А Архипов, Н Р Мустафаев, Д В Хабаров, Е М Белов // Вестник НГУ -2004 -Т 2 -№ 4 -С 60-63

12 Методы эфферентной медицины в клинической практике / А А Смагин, Д В Хабаров, В В Морозов, Л В Титова, Е А Комбанцев // Эфферентная медицина на современном этапе достижения, проблемы, перспективы решения Материалы Второй региональной научно-практической конференции -Новосибирск, 2004 -С 52-53

13 Лимфологические подходы к лечению пациентов с гнойными осложнениями синдрома диабетической стопы / М С Любарский, А А Шевела, Н Р Мустафаев, О А Шумков, В В Нимаев, А А Ракитин, Д В Хабаров, Е М Белов, Р И Аглиулин // Проблемы лимфологии и интерстициального массо-переноса Материалы научной конференции с международным участием -Новосибирск, 2004 -Т 10 (часть 1) -С 264-265

14 Возможности эфферентных методов в терапии синдрома диабетической стопы / Д В Хабаров, А А Смагин, О А Шумков, Л В Титова, Н Р Мустафаев // Актуальные вопросы современной медицины Материалы 14 научно-практической конференции врачей - Новосибирск, 2004 -С VI-50

15 Возможности коррекции нарушений микроциркуляции у больных синдромом диабетической стопы / М А Колпаков, М С Любарский, А А Смагин, А И Шевела, А А Ракитин, В А Миронов, О А Шумков, Д В Хабаров, Н Р Мустафаев, Е М Белов, А В Габитов // Хирургия Морфология Лимфология - 2004 -Т 1 -№1 -С 53-55

16 Лимфостимуляция у пациентов с гнойными осложнениями синдрома диабетической стопы / М С Любарский, Н Р Мустафаев, Д В Хабаров, О А Шумков, Е М Белов, Р И Аглиулин // Интенсивная медицинская помощь проблемы и решения Материалы II Всероссийской научно-практической конференции - Ленинск-Кузнецкий, 2004-С 138-139

17 Лимфокоррекция у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы / О А Шумков, М С Любарский, А А Шевела, Д В Хабаров, В А Миронов, О В Каменская // Хирургия Морфология Лимфология -2004 -Т 1 -№2 -С 38-40

18 Синдром диабетической стопы Очерки по клинической лимфологии / А А Шевела, А А Смагин, С Г Штофин, В В Нимаев, О А Шумков, Н Р Мустафаев, Д В Хабаров, О В Каменская, Ю А Архипов, Р С Хапаев, М Л

Пупышев, А И Бромбин, Под ред М С Любарского - Новосибирск ООО «РИЦ», 2005 -172 с

19 Влияние эфферентных технологий на течение патологического процесса при трофических нарушениях на фоне синдрома диабетической стопы / Д В Хабаров, М С Любарский, В И Братко, А А Смагин, О А Шумков, О В Каменская, Н Р Мустафаев, Е Г Павлюк // Вестник НГУ -2005 -Т 3 -№ 1 -С 60-65

20 Влияние лимфогенных методов терапии на течение патологического процесса при синдроме диабетической стопы / М С Любарский, Д В Хабаров, А А Смагин, В В Нимаев, О А Шумков, Н Р Мустафаев, Л В Титова // Бюлл СО РАМН -2005 -№ 1 -С 121-123

21 Проведение лимфостимуляции у пациентов с гнойными осложнениями синдрома диабетической стопы / М С Любарский, А А Шевела, Н Р Мустафаев, В В Нимаев, О А Шумков, Д В Хабаров, Е М Белов, Р И Аглиулин // II съезд лимфологов России - Санкт-Петербург, 2005 -С 196-197

22 Лимфоцитаферез и регионарная терапия в комплексном лечении синдрома диабетической стопы / М С Любарский, А А Смагин, Д В Хабаров, О А Шумков, В В Морозов, Л В Титова, Н Р Мустафаев // Диабетическая стопа Материалы международного симпозиума - Москва, 2005 -С 120

23 Проведение лимфостимуляции у пациентов с хирургической стадией СДС / М С Любарский, А А Шевела, Н.Р Мустафаев, В В Нимаев, О А Шумков, О В Каменская, Д В Хабаров, А А Зайцев, Е А Комбанцев // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма Материалы VII Международного симпозиума и VIII Чуйской научно-практической конференции - Чолпон-Ата, 2005 -С 108-110

24 Применение модифицированных аутолимфоцитов в комплексном лечении синдрома диабетической стопы / Д В Хабаров, М С Любарский, А А Смагин, J1В Титова, О А Шумков, Н Р Мустафаев // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма Материалы VII Международного симпозиума и VIII Чуйской научно-практической конференции -Чолпон-Ата, 2005 -С 158-159

25 Хабаров Д В Новые подходы в терапии трофических язв на фоне синдрома диабетической стопы / Д В Хабаров, А А Смагин, О А Шумков // Актуальные проблемы современной эндокринологии Материалы Научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 70-летию ГОУ ВПО НГМА - Новосибирск, 2005 -С 125-127.

26 Роль методов лимфостимуляции у пациентов с хирургической стадией синдрома диабетической стопы / М С Любарский, А А Шевела, В В Нимаев, О А Шумков, О В Каменская, Ю В Архипов, Н Р Мустафаев, Д В Хабаров, А А Зайцев, Е А Комбанцев // Хирургия Морфология Лимфология -2005 -Т 2 -№4 -С 24-26

27 Лимфогенные технологии в коррекции патологического процесса при обострении хронического пиелонефрита у пациентов с сахарным диабетом II

типа / М С Любарский, О В Каменская, Д В Хабаров, Р С Хапаев // Сибирский консилиум -2006 -№2(49) -С 25-28

28 Синдром диабетической стопы как проблема клинической лимфологии / М С Любарский, О.А Шумков, Д В Хабаров, О В Каменская, П В Бахмин // Сибирский консилиум -2006 -№5 (52) -С 47-50

29 Морфологические характеристики обработанных полиоксидонием лимфоцитов у пациентов с синдромом диабетической стопы / М С Любарский, Д.В Хабаров, Н П Бгатова, О А Шумков // Сибирский консилиум -2006 -№5 (52) -С 58-60

30 Каменская О В Особенности гемолимфоциркуляции при обострении хронического пиелонефрита на фоне диабетической нефропатии и методы коррекции с использованием лимфотропной антибактериальной терапии / О.В Каменская, Д В Хабаров, Р С Хапаев // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии Материалы 1 Сибирского съезда лимфологов с международным участием - Новосибирск, 2006 -С 156

31 Состояние микроциркуляции при использовании аутолимфоцитов у пациентов с синдромом диабетической стопы / Д В Хабаров, Ю В Архипов, М А Колпаков, А А Смагин, Н Р Мустафаев // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии Материалы 1 Сибирского съезда лимфологов с международным участием - Новосибирск, 2006 -С 340

32 Влияние эфферентных методов на объем внеклеточной жидкости нижних конечностей пациентов с синдромом диабетической стопы / Д В Хабаров, Р С Хапаев, А А Смагин, Л В Титова // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии Материалы 1 Сибирского съезда лимфологов с международным участием - Новосибирск, 2006 -С 341

33 Местное лечение трофических язв на фоне синдрома диабетической стопы / О А Шумков, В В Нимаев, Д В Хабаров, О В Каменская // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии Материалы 1 Сибирского съезда лимфологов с международным участием - Новосибирск, 2006-С 369

34 Пат №2228204 (РФ) Способ лечения трофических язв на фоне синдрома диабетической стопы / М С Любарский, А А Смагин, Д В Хабаров, А И Шевела, О А Шумков // Бюллетень Российского агентства по патентам и товарным знакам -2004 -№13

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение №2005121821/14(024603) (РФ) Способ лимфостимуляции при нарушениях гемолимфоциркуляции нижних конечностей у больных с синдромом диабетической стопы / М С. Любарский, А А Смагин, Н Р Мустафаев, О В Каменская, О А Шумков, Д В Хабаров, Р С Хапаев

Список терминологических сокращений

AJIT - аланинаминотрансфераза ACT - аспаргатаминотрансфераза

АСУ С - активная составляющая удельного сопротивления

ДСАП - динамическое сопротивление артериальному притоку

ДСВО - динамическое сопротивление венозному оттоку

ДСЛО - динамическое сопротивление лимфатическому оттоку

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

ИЭМ - индекс эффективности микроциркуляции

Kv - коэффициент вариации микроциркуляции

ЛДФ - лазерная допнлеровская флоуметрия

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

МАТ - моноклональные антитела

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НК - натуральные киллеры

ОАП - объем артериального притока

ОВО - объем венозного оттока

ОЛО - объем лимфагического оттока

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПА - плазмаферез

ПО - полиоксидоний

ПТИ - протромбиновый индекс

ПЦР - полимеразноцепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РЛВГ - реолимфовазография

СД - сахарный диабет

СДС - синдром диабетической стопы

САП - скорость артериального притока

СВО - скорость венозного оттока

СЛО - скорость лимфатического оттока

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

Соискатель

Хабаров Д В

Подписано в печать 19 01 07 Бумага офсетная Печать RISO Гарнитура Times New Roman Формат 60x84 1/16 Уч-изд л 1 Тираж 100 Заказ №351 630102, г Новосибирск, ул Нижегородская, 6, СибАГС

Актуальность проблемы. Сахарный диабет и его осложнения являются одной из самых актуальных проблем современной медицинской науки. Одним из самых частых и грозных осложнений СД является синдром диабетической стопы (СДС) (Frykberg R.G. el al. 2000, Дедов И.И. н др. 2СЮ5). Синдром диабетической стопы объединяет патологические изменения нервной системы, артериального и микроциркуляторного русла, представляющие непосредственную угрозу развития язвенно-некротических процессов и гангрены стопы (Дедов И.И. и др., 1998. 2003). По данным Goodridge D. и соавт. (2005) язвы на фоне СДС в 84% случаев приводят к низким ампутациям, и увеличивают смертность в 2,4 разз в сравнении с пациентами, страдающими СД без язв.

В патогенезе СДС ведущее место занимают три основных фактора -нейронатня, поражение артерий нижних конечностей и инфекция (Дедов 1993. 199В, Балаболкии 1994, 3998, 2000, Рссогаго R-E ct al., 1990, Edmonds М.Е, 1987, CajHito G. M. et al., 1994, Lechleitner M e« al., 2004, Stiegler H, 2004). Кроме того, прн возникновении трофических язв на фоне СДС, важнейшими аспектами патогенеза данного патологического состояния становятся нммунокомплексные и гемореологическис карушения.

Нецелесообразно видеть этнологию сосудистых поражений в действии какого-то одного фактора (Калинин A XL и др., 2000). Предполагается, что при сахарном диабете происходит нарушение функции не только артериальных, но и венозных и лимфатических сосудов и эти нарушения ухудшают течение заболевания. Вследствие автономной нейропатии, вызывающей лила-тацию мелких артерий и компенсаторный сброс избытка артериальной крови через артериовенозные шунты в венозную систему возникают нейропатиче* ские отеки (Дедов И И, и др., 1998, 2002, Комелягина Е,Ю., Анциферов М-Б. 2003, Lorber D. 2004). Повышается гидростатическое давление в венах нижних конечностей, нарушаются процессы микроцирку ля цин в капиллярах стоп. В конечном счете, это приводит к локальной -задержке жидкости в дис-тальных отделах нижних конечностей. Можно предположить, что возникновению отеков способствует патология лимфатической н венозной систем развивающаяся при сахарном диабете, А согласно работам Бородина Ю-И-(2001, 2003) лимфатическая система является одной из основных систем в обеспечении процессов детокенкании регионов, органов, тканей и всего организма. И нарушения процессов лнмфоцнркуляцин, не зависимо от того первичный нли вторичный характер они имеют, требуют регистрации, контроля и активного терапевтического воздействия.

Важнейшими факторами являются нарушении неспецифической реактивности организма на фоне хронического воспаления при СДС. Существуют явные признаки вторичного иммунодефицита, что оказывает отрицательное влияние на процессы репарации, элиминация инфекционного агента (Гришина и др., 2001). Имеются данные о способности циркулирующих иммунных комплексов повреждать эндотелий сосудов, что ведет к усилению ангиопати-ческнх проявлений и гсмолнмфоцнркуляторных нарушений, Кроме того, ряд исследований указывают на дисбаланс иитокннов, факторов роста и протеаз а хронической язве на фоне СДС (Trcngove NJ. et al,, 2000, Graves D.T el al., 2001). А в эксперименте на живота ых показано, что обработка ран кожи у животных с FL-2 увеличила число лимфоцитов в ранах и привела к лучшему производству коллагена, что демонстрирует положительное влияние Т-клеток ив заживление раны (Barbul A. et al., 1986, 1988). Отечественные специалисты указывают на необходимость использования тех или нных вариантов иммунотерапии при СДС (Спесивцев Ю.А., Егорснков М.В. 1999 Г., Козлов В,К. 2002 г. Попович A.M. 2004 г.)

Учитывая нарушения гемолнмфоцнркуляннн и неснецифичсской реак* тивности организма, взаимное влияние н сопряженность циркул игорных расстройств и хронического воспаления, справедливо говорить о наличии эндо-токсикоза у пациентов с трофическими язвами на фоне СДС.

Таким образов существуют веские предпосылки для активного влияния на ««специфическую реактивность, гемолимфоцнркуляцню в регионе нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне СДС- Поэтому становится очевидным, что только комплекс ированис иммунологических методов и экстракорпоральной гемокоррекини. по нашему мнению, способно качественно корригировать нарушения гемолимфоцнркуллцни. явления хронического воспаления и эндотокенкоза прн СДС, повысить возможности собственных саногенных сил организма и в конечном итоге улучшить результаты лечения и повысить качество жизни пациентов

В итоге это предопределило цели и задачи данной научно-исследовательской работы, а также далн основание считать её перспективной и актуальной для современной медицины н науки.

Цель

Изучить гемолимфоцнркуляцию нижних конечностей и хроническое воспален не при трофических язвах на фоне синдрома диабетической стопы при использовании зфферентно-клеточиых технологий.

Задачи:

1. Исследовать морфологическое состояние аутолимфоцнтов, полученных на сепараторах клеток крови и обработанных полнокендоннем нлн глутоксимом, и обосновать нх применение у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы.

2. Изучить изменения клеточного н гуморального звеньев иммунитета, а так же маркеров воспаления при использовании лечебного аппаратного лнмфоцитафереза и модифицированного плазмафереза у пациентов с хроническим воспалительным процессом на фоне синдрома диабетической стопы.

3. Исследовать гемолнмфоннркуляпню нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании эфферентно-клеточных технологий.

4. Изучить изменения биохимических н функциональных показателей печени и почек, уровня гликемии у пациентов с трофическими лавами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании эфферентно-клеточных технологий.

5. Разработать способ лечебного аппаратного лимфоцитаферета и регионарной клеточной коррекции нарушений гемолимфоциркуляции и хронического воспалительного процесса у пациентов с синдромом диабетической стопы,

6. Модифицировать дискретный плазмаферез посредством включения в схему метода глутоксима нлн полнокендоння с целью коррекции нарушений гемолимфопиркуля цнн н хронического воспалительного процесса у пациентов с синдромом диабетической стопы

7. Провести сравнительную оценку эффективности лечения пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании предложенных технологий н стандартной терапии.

Научная новизна

Морфомегрия аутолнмфоцнтов, полученных на сепараторах клеток крови и обработанных глутоксимом или нолиоксидоннем, показала отсутствие клеточной деструкции, что позволяет использовать данные аутолнмфо-циты в коррекции нарушений клеточного и гуморального звеньев иммунитета и хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы.

Впервые проведено обоснование применения эфферентно-клеточных технологий и доказана нх эффективность а коррекции патологического пропесса у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы.

Впервые изучено состояние клеточного н гуморального звеньев иммунитета у пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы при использовании аппаратного лнмфонитафсреза с экстракорпоральной иммуномодуляцией в сочетании с регионарной терапией: происходит увеличение Т-общнх лимфоцитов главным образом за счет Т-хслпоров и ци-тртоксическнх лимфоцитов, увеличение иммуноглобулина А, снижение иммуноглобулина G, циркулирующих иммунных комплексов, что указывает на купирование хронического воспаления.

Впервые проведено комплексное изучение гемолимфоннркуляини нижних конечностей у пациентов с трофическими язвами на фоне сннлрома диабетической стопы под воздействием предложенных методов эфферентно-клеточной терапии и показано улучшение показателей артериального притока, венозного и лимфатического оттока данного региона.

Впервые показано, что использование эфферентных технологий у пациентов с синдромом диабетической стопы улучшает азотоы делительную функцию почек, отсутствует отрицательное влияние предложенных методов лечения на уровень гликемии.

Практическая значимость. Разработан способ аппаратного лимфоцита-фереза в сочетании с регионарной клеточной коррекцией нарушении гемо-лнмфоцнркуляции нижних конечностей и клеточного и гуморального звеньев иммунитета у пациентов с синдромом диабетической стопы.

Разработана методика дискретного плазмафереза в сочетании с полиок-ендоннем или глутокснмом, которая позволяет улучшить результаты лечения пациентов с трофическими язвами на фоне синдрома диабетической стопы: увеличивается скорость закрытия язвенного дефекта на 20% в сравнении с группой стандартной терапии.

Проведенная сравнительная оценка эффективности используемых методов в коррекции нарушений гемолимфоцнркуляции в регионе нижннх коиечностей у пациентов с 1рофическнмн язвами на фоне синдрома диабетической стопы доказывает преимущество эфферентно-клеточных технологий перед стандартными методами лечения,

Предложенные эфферентно-клеточные методики с применением дискретного плазмафереза в сочетании с глутокснмом или лолноксидоннем, аппаратного лнмфоцнтафереза, экстракорпоральной нммуномодуляини и регионарной терапии являются безопасными для патентов (не было зарегистрировано осложнений, связанных с проведен нем лнмфоиитафереюв, дискретных плазмаферезов, регионарной терапии аутолимфоцитамн), не оказывает отрицательного влияния на уровень гликемии, не отмечено отрицательного влияния на функцию ночек.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование методов эфферентно-клеточных технологий уменьшает выраженность нарушений гемолнмфоциркуляцин в регионе нижних конечностей при синдроме диабетической стопы и сопровождается возрастанием скоростных н объемных характеристик артериального, венозного и лимфатического тока и снижением резнстнаных показателей данных коллекторов,

2. Аутолнмфоинты, полученные на сепараторах клеток крови н обработанные иммуномодуляторами при температуре 37.0-37.5t сохраняют целостность оргаиелл и клеточной стенки, в клетках доминируют пластические процессы.

3. Использование дискретного плазмафереза с обработкой клеточной массы иммуномодулятором позволяет позитивно воздействовать на клеточное и гуморальное звенья иммунитета Наиболее выраженное корригирующее влияние на клеточное н гуморальное звенья иммунитета н течение хронического воспаления при синдроме диабетической стопы достигается при использовании разработанного метода аппараткого лныфоцитафереза с экстракорпоральной иммуномодуляцнсЙ ау-толммфоцнтое и введением их о артериальную систему нижней конечности с язвой, что выражается в более быстром восстановлении нарушенных функций, в большей скорости заживления язвенного дефекта по сравнению с группой стандартной терапии,

Выводы

1. Морфологическое состояние аутолимфоцитов, полученных иа сепараторах клеток крови и обработанных иммуномодулятором, характеризуется отсутствием клеточной деструкции и увеличением уровня пластических процессов (количества митохондрий, полисомальных рибосом, лнзосом. везикул), что доказывает жизнеспособность данных клеток и указывает на возможность их применения у пациентов с синдромом диабетической стопы.

2. Изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета при использовании аппаратного лимфоинтафереза в сочетании с регионарной терапией свидетельствуют о снижении проявлений хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы н сопровождаются повышением количества Т-лнмфоцнтов, уровня иммуноглобулина А, снижением уровня циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулина G, а так же снижением уровня маркеров воспаления: фибриногена и ЛИИ.

3. У пациентов с синдромом диабетической стопы при использовании модифицированного плазмафереза изменяются показатели клеточного и гуморального иммунитета, свидетельствующие об уменьшении выраженности воспалительного процесса, что сопровождается увеличением общих Т-лнмфоцнтов, главным образом за счет Т-хелперов н цитоток-сическнх лимфоцитов, но в меньшей степени, чем при аппаратном лнм-фоцитаферезе.

4. Предложенные эфферентно-кдеточные технологии оказывают положительное влияние на функциональное состояние почек, не вызывают нарушений углеводного обмена, белково-сннтетической функции печени.

5. При использовании эфферентно-клсточных технологий происходит позитивная коррекция нарушений гемолимфоциркуляинн нижних конечмостсй у пациентов с синдромом диабетической стопы по всем трем коллекторам: артериальному, венозному и лимфатическому. Увеличиваются объемные и скоростные характеристики артериального притока, лимфатического и венозного оттока, уменьшается сопротивление артериальному притоку, лимфатическому н венозному опоку по данным ре-олнмфоваэографнн. Возрастает роль активных механизмов регуляции микроциркуляции (симпатической вазоконстрнкинн, емиогенного тонуса) по данным лазерной допплеровекой флоуметрин. Возрастает подвижность процессов массопереиоса по данным импедансомстрнн.

6. Использование разработанного способа аппаратного лимфопита-фереза в сочетании с регионарной терапией приводит к более быстрому купированию воспалительного процесса, что выражается в улучшении показателей гемолнмфоциркуляции, клеточного и гуморального звеньев иммунитета, снижении уровня маркеров воспаления.

7. Модифицированный дискретный плазмаферез позитивно воздействует на нарушения гемолнмфоциркуляции, уменьшает проявление воспалительного процесса у пациентов с трофическими язвамн на фоне синдрома диабетической стоны.

8. Сравнительный анализ эффективности лечения показал, что способ аппаратного лнмфоцнтафереза в сочетании с регионарной терапией оказывает более выраженное положительное влияние на клеточное и гуморальное звенья иммунитета, на гемолнмфоииркуляпию нижних конечностей, развитие хронического воспалительного процесса по сравнению с другими методами эфферентных технологий и улучшает результаты лечения у пациентов с синдромом диабетической стопы: увеличивается скорость репаративных процессов на 58% в сравнении с группой стандартной терапии.

Практические рекомендации: t. С целью коррекции нарушений неспецифической реактивности организма и хронического воспаления у пациентов с синдромом диабетической стопы показано применение разработанных эфферентно-клеточных технологий: а) сеансы дискретною модифицированного плазмафереза в сочетании с глутокснмом (30 мг) или полнокендоннем (6 мг). инкубация клеточной массы в течение 45 минут при температуре 37-37,5*0 в термостате. Всего показано проведение трех процедур через 36-48 часов на фоне стандартной терапии; б) сеансы аппаратного лимфоцнтафереза с обработкой аутолимфоцитов глутокснмом или полнокендоннем с последующим проведением регионарной терапии. На курс лечения показано 3 операции экстракорпоральной гемокор-рекцин (аппаратного лимфоцнтафереза) с интервалом 48-72 часа; выделенные аутолнмфоцнты (80 мл, 200-500 клеток/мл) необходимо подвергать инкубации in vitro с раствором иммуномодулятора (глутокснм 30 мг или полиоксидоний б мг) в течение 45 минут при температуре 37-37,5 °С в термостате, после чего 20 мл аутоклеток вводится в бедренную артерию нижней конечности с трофической язвой (пункция артерии в типичном месте, предварительно, с целью профилактики артериального спазма анугриартермально вводится 2 мл но-шлы в разведении раствором NaCI 0,9%-10,0 мл), а 60 мл внутривенно капельно.

2. С целью оценки эффективности воздействия предложенных методов эфферентной терапии и клеточной коррекции на мнкроциркуляцню нижних конечностей у пациентов с СДС следует использовать лазерную допллеров-екую флоуметрню до начала и после завершения лечения с определением следующих показателей: среднее арифметическое значение показателя микроциркуля цнн, характеризующего поток эритроцитов в единицу времени в зондируемом объеме ткани (М); среднее квадратичное отклонение микро-цнркуляцнн (о); коэффициент вариации мнкроциркуляции (Kv); индекс эффективности мнкроциркуляцин (ИЭМ);

3. Для определения эффективности воздействия предложенных методов эфферентной терапнн и клеточной коррекции на гемолимфоцнркуляцню нижних конечностей у пациентов с СДС при госпитализации н на момент выписки пациента следует применять: а) реолнмфоваэографию с определением объемных» скоростных и резнстиьных характеристик артериального притока, венозного к лимфатического оттока; б) дистантную термографию с определением тепловой ассиметрии-, в) импедансометрию с регистрацией активной составляющей удельного сопротивления мягких тканей нижней конечности на пяти уровнях.