Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в условиях холодового воздействия

На правах рукописи

Се^Л

Андросова Ольга Геннадьевна

Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов при холодовом воздействии (экспериментальное исследование)

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

24 АПР 2014

Владивосток - 2014

005547688

005547688

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Доровских Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты:

Хотимченко Максим Юрьевич — доктор медицинских наук, доцент, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный Федеральный университет», заведующий лабораторией фармакологии и биоиспытаний

Савченко Ольга Владимировна - кандидат медицинских наук, институт биологии и моря имени A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, научный сотрудник лаборатории фармакологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «25» июня в 12.00 часов 2014 года на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Тихоокеанском государственном медицинском университете по адресу: 690600, Приморский край г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Сайт http://www.tgmu.ru

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного сов<

Просекова Елена Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Адаптационные реакции организма, их механизмы и возможности оптимизации, пути и способы повышения резистентности организма к неблагоприятным воздействиям различной природы остаются в ряду важных проблем фармакологии и патофизиологии (Лесовская М.И., 2003; Миронова Г.В., 2007; Minois N., 2000; Guillot G., 2002). Решение проблемы приспособления человека и животных к температурным условиям окружающей среды возможно только на основе глубокого понимания естественных механизмов резистентности к охлаждению, среди которых необходимое в условиях воздействия низких температур повышение устойчивости липидов мембран к повреждающему действию кислородных радикалов (Симонова Н.В., 2004; Павлов A.C., 2007; Шаповаленко Н.С., 2011). Холод традиционно рассматривается как прооксидантный фактор (Доровских В.А., 2006), причем как однократное холодовое воздействие, так и многократное охлаждение организма животных ведет к активации процессов перекисного окисления липидов с увеличением количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ (Новоселова A.A., 2009; Ли О.Н., 2011).

Известно, что в интактной клетке оксидативные процессы находятся под строгим и чрезвычайно разнообразным контролем ферментативных и неферментативных систем (Козлов Ю.П., 2006). Обращая внимание на процессы липопероксидации в биологических мембранах, следует отметить, что хотя этот процесс развивается в липидной фазе клетки, многие стадии этой сложной системы реакций окисления протекают и в водной среде (Владимиров Ю.А., 2000), поэтому часть эндогенных защитных систем в клетке локализована в липидах биологических мембран, часть - в водной фазе, среди которых: ферменты внутриклеточной защиты (каталаза, пероксидаза, супероксидцис-мутаза, цитохромом-с-450 и др.), ферменты, контролирующие уровень NO* (Вартанян Л.С., 2000; Меныцикова Е.Б., 2000; Рябченко Н.И., 2001), низкомолекулярные антиок-сиданты (тиолы, биогенные амины, пептиды, витамины) и другие антиоксиданты (фос-фолипиды, убихинон, ураты, билирубин, фенолы, микроэлементы, ионы металлов переменной валентности) (Болдырев A.A., 1998). Этими компонентами эндогенного фона резистентности реализуются антиоксидантные механизмы защиты, приводящие к разрушению и (или) предотвращению образования избытка продуктов ПОЛ и восстановлению их стационарного уровня, что приобретает особую значимость в условиях холо-дового воздействия (Ших Е.В., 2002; Скальная М.Т., 2003; Simonova N.V., 2009). Подобный стресс является патогенетическим моментом в развитии многих заболеваний (воспалительных, бронхо-легочных и сердечно-сосудистых и т.д.) (Collins А., 1994).

В связи с изложенным выше, поиск способов коррекции свободнорадикального окисления в условиях холодового стресса является своевременным и актуальным, так как повышение адаптационных возможностей теплокровного организма к повреждающему воздействию холода при помощи модификаторов биологического действия, в число которых входят средства природного происхождения, становится важным моментом профилактики возникновения патологических состояний (Разина Т.Г., 2006; Громовая В.Ф., 2008; Симонова Н.В., 2012; Хобракова В.Б., 2012). Широкое поле деятельности для поиска АО представляют соединения флавоноидной природы (Плотников М.Б., 2000; Ломбоева С.С., 2008;), повсеместно встречающиеся в клетках зеленых растений (Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Лыско А.И., 2007) и являющиеся объектом

значительного научного и терапевтического интереса, изучение которых свидетельствовало о наличии антиоксидантных свойств у многих представителей данного класса (Кушнерова Н.Ф., 2003; Макаров В.Г., 2005; Толкачева A.B., 2010; Williams R.J., 2004; Prochazkova D., 2011), в частности у дигидрокверцетина (Мельникова Н.Б., Иоффе И.Д., Лапин А.Ю., 2002; В.А. Бабкин, Ю.А. Малков, JI.A. Остроухова, 2003; Доровских В.А., Целуйко С.С., Тимофеев К.В, 2007).

Дигидрокверцетин - флавоноид антиоксидантной группы Р-витаминов, который на сегодняшний день используется в качестве гемореологического, капилляро-, гепато-и онкопротекторного средства (А. Шакула, В. Некрасов, А. Щегольков, 2008; Доровских В.А., 2012). По сравнению со всеми известными, в том числе и синтетическими, антиоксидантами дигидрокверцетин является эталонным продуктом: его антирадикальная активность проявляется при концентрациях 10"4 - 10"5 % на фоне полного отсутствия мутагенной активности для человека, эмбриотоксического и тератогенного эффектов, аллергизирующего и токсического действия (Жанатаев А.К., Кулакова A.B., Насонова В.В., Дурнев А.Д., 2008). Доказано, что дигидрокверцетин обладает мембранопро-текторным действием (Мельникова Н.Б., 2002; Куркин В.А., Рыжов В.М., Бирюкова О.В., 2008), проявляет свойства антиоксиданта в различных модельных системах окисления (Бабкин В.А., Малков Ю.А., Остроухова Л.А., 2003): свободнорадикальное окисления липосом из яичных фосфолипидов, индуцированное с помощью системы Fe2+-аскорбат (Тесёлкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., 1996) или фотосенсебили-зированное производными гематопорфирина при облучении гелий-неоновым лазером (Klebanov С., Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., 1996). Вместе с тем, результаты изучения антиоксидантного действия различных доз дигидрокверцетина в условиях холодового стресса не нашли отражения в литературе, что послужило основанием для проведения настоящих исследований.

Цель работы: Изучение эффективности применения различных доз дигидрокверцетина в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран в теплокровном организме в условиях холодового воздействия.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дигидрокверцетина на интенсивность процессов свободно-радикального окисления липидов и оценить уровень антиокислительного действия в условиях in vitro;

2. Изучить антиоксидантные свойства различных доз дигидрокверцетина при холодовом воздействии in vivo;

3. Выявить наиболее оптимальную дозу дигидрокверцетина, способную предотвратить прооксидантное действие низких температур в различные сроки в условиях in vivo;

4. Провести сравнительный анализ антиокислительного эффекта дигидрокверцетина с антиокислительным эффектом альфа-токоферола в экспериментах in vivo в условиях холодового воздействия;

5. Изучить морфофункциональные параметры ткани печени при охлаждении в различные сроки на фоне введения различных доз дигидрокверцетина и токоферола.

Научная новизна.

Впервые проведено исследование влияния дигидрокверцетина на процесс пере-кисного окисления липидов в мембранах микросом печени крыс.

Впервые изучены антиоксидантные свойства дигидрокверцетина при холодовом воздействии.

Впервые проведено комплексное биохимическое и морфологическое исследование печени лабораторных животных при действии холода на фоне применения дигидрокверцетина.

Впервые изучено влияние дигидрокверцетина на теплокровный организм в условиях длительного холодового воздействия, на сроки адаптации к холоду, мембраномо-дулирующее действие в условиях воздействия низких температур.

Получены данные о потенцирующем влиянии дигидрокверцетина на характер адаптационных процессов, развивающиеся в организме при действии холода.

Впервые проведен сравнительный анализ антиокислительного эффекта дигидрокверцетина с антиокислительным эффектом альфа-токоферола при воздействии на организм низких температур, при этом оценено и зафиксировано состояние антиокислительной системы организма и процессов перекисного окисления липидов in vivo. Теоретическая и практическая значимость работы.

Выявлена эффективность применения дигидрокверцетина для профилактики патогенного воздействия холода на организм.

Получен ряд новых экспериментальных данных, обуславливающих повышение устойчивости организма к холодовому воздействию при использовании дигидрокверцетина.

Результаты работы могут послужить основанием для дальнейших исследований в направлении поиска природных антиоксидантов, обладающих высокой биологической ценностью.

Полученные в исследовании данные являются основой для рекомендации к практическому использованию дигидрокверцетина в качестве средства, облегчающего адаптацию организма к действию низких температур. Введение дигидрокверцетина, эффективность которого получила биохимическое и морфологическое обоснование, может быть рекомендована для коррекции состояний, сопровождающихся активацией ПОЛ в организме. Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях in vitro при индукции аскорбат-зависимого и НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени дигидрокверцетин проявляет выраженный антиокси-дантный эффект.

2. В условиях in vivo при активации процессов ПОЛ в организме животных влиянием низких температур введение дигидрокверцетина приводит к снижению содержания продуктов ПОЛ на фоне увеличения активности компонентов АОС (каталаза, Гл-6-Ф-ДГ, церулоплазмин, витамин Е) в крови и ткани печени.

3. Антиоксидантный эффект дигидрокверцетина находится в обратной зависимости от дозы вещества и срока применения.

4. Антиоксидантный эффект дигидрокверцетина в дозе 0,1 мг/кг в условиях in vivo более выражен, чем аналогичный эффект токоферола на фоне холодовой нагрузки.

5. На фоне длительного холодового воздействия введение дигидрокверцетина в дозе 0,1 мг/кг приводит к нормализации морфофункциональных изменений в ткани печени.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровней: VI Международной российско-китайской конференции (Россия, Благовещенск, 2009); The 2th China, Japan and Korea international conference for TCM and The 7th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2010); расширенном заседании кафедр фармакологии, гистологии, биохимии, патофизиологии и проблемной комиссии ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия (Благовещенск, 2013). Основные положения и материалы диссертации представлены в виде докладов, стендовых сообщений, обсуждены на IX, X, XI региональных научно-практических конференциях «Молодежь XXI века: Шаг в будущее» (г. Благовещенск, 2008, 2009 и 2010 гг.), на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2009 г.). Работа поддержана государственным грантом по проекту «Ступени в будущее российской науки» на материально - техническую поддержку молодых ученых Амурской области в 2010 г.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе Зстатьи — в журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад соискателя заключается в непосредственном участии в выполнении всех экспериментов и статистической обработке полученных результатов. Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, аналитического обзора научной литературы, описания методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа содержит 14 таблиц, 16 рисунков. Список литературы включает 242 источников, в том числе 88 — зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986 г.), приказе Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) о «Порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)» путем декапитации. Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии, соответствует нормативным требованиям проведения доклинических экспериментальных исследований (выписка из протокола № 2заседания Этического комитета ГБОУ ВПО Амурская ГМА от 15 декабря 2007г.).

В работе использованы биохимические, гистологические, гистохимические, мор-фометрические методы исследования. Биохимическому исследованию подвергались кровь и ткань печени (определяли продукты ПОЛ (ДК,ГПЛ,МДА) и компоненты

АОС(каталаза, церулоплазмин, уровень глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и витамин Е). Гистологическому исследованию подвергалась печень крыс на оптическом уровне.

В работе использовали дигидрокверцетин в виде порошка производства компании ЗАО «Аметис» Амурской области г. Благовещенска. Партия № 530 соответствует ТУ 9325-001-70692152-07 и СанПин 2.3.2.1078-01 на основании протокола микробиологических исследований № 5053, физики - химических измерений № 599 и протокола радиологических исследований № 551р - 07/684. Для экспериментальных исследований из порошка дигидрокверцетина готовили раствор нужной концентрации. Первоначально проводился анализ данных литературы по дигидрокверцетину, что позволило спрогнозировать возможность использования данного вещества для облегчения адаптации теплокровного организма к воздействию низких температур. Альфа-токоферол (витамин Е) - один из основных алиментарных антиоксидантов растительного происхождения, был выбран с целью сравнения степени защитного действия от холода дигидрокверцетина (табл. 1).

Таблица 1

Дозы и условия введения исследуемого вещества

Препарат Доза Путь введения Условия введения

ДКВ 100мг/кг массы животного Per os (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

50мг/кг массы животного Per os (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

10мг/кг массы животного Peros (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

1мг/кг массы животного Peros (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

0,1 мг/кг массы животного Peros (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

Витамин Е ЗОмг/кг массы животного Peros (внутрь) За 20 минут перед охлаждением

Эксперименты проводили на беспородных крысах - самцах массой 150 -200 г. С целью активации ПОЛ в организме животных была использована холодовая модель эксперимента (Доровских В.А., 1987). Ежедневно в утреннее время животных помещали на 3 часа в климатокамеру фирмы «Fentron» (ГДР) при температуре - 15°С при 50% влажности в течение 7, 14, 21 дней. В работе камеры предусматривался световой режим, подача воздуха для предупреждения кислородной гипоксии и создавался режим охлаждения. В созданных условиях происходят значительные биохимические изменения, проявляющиеся в колебании содержания перекисных продуктов в соответствии с развитием стадий приспособительного процесса.

Холодовое воздействие (I эксперимент) Ежедневно на протяжении 7, 14, 21 дня животным перорально вводили дигидрокверцетин, а-токоферол и помещали в климатокамеру. Одновременно исследовали 4 группы животных по 10 особей в каждой группе: 1 группа — интактная - животные находились в стандартных условиях вивария; 2 группа — контрольная — крысы подвергались холодовому воздействию при температуре -15°С в течение 21 дня по 3 часа ежедневно; 3, 4, группы — подопытные - животным за 20 минут перед охлаждением перорально вводили дигидрокверцетин в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, массы животного соответственно. Забой животных декапитацией проводили на 7, 14, 21 сутки.

Холодовое воздействие (II эксперимент')

Ежедневно на протяжении 7, 14, 21 дня животным перорально вводили дигидро-кверцетин, а-токоферол и помещали в климатокамеру. В ходе эксперимента исследовали 6 групп животных по 10 особей в каждой группе: 1 группа — интактная — животные находились в стандартных условиях вивария; 2 группа - контрольная — крысы подвергались холодовому воздействию при температуре —15°С. в течение 21 дня по 3 часа ежедневно; 3, 4, 5 группы - подопытные - животным за 20 минут перед охлаждением перорально вводили дигидрокверцетин в дозе 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг массы животного соответственно; 6 группа — подопытная — животным за 20 минут перед охлаждением перорально вводили 10% масляный раствор витамина Е в дозе 30 мг/кг массы животного. Забой животных путем декапитации осуществляли на 7, 14, 21 сутки эксперимента. Биохимическому исследованию подвергались кровь и ткань печени, в которых определяли продукты ПОЛ (ДК, ГП, МДА) и компоненты АОС (каталаза, церуло-плазмин, Гл-6-ф и витамин Е).

Индукция ПОЛ в микросомах печени крыс:ПОЛ в суспензии микросом печени крыс, содержащей 0,8 м/М аскорбат (или 1 мМ НАДФН); 0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида/мл (1,0 белка) микросом инициировали внесением ионов Fe2+B конечной концентрации 12 мкМ. Общий объем инкубационной смеси 1 мл. Продолжительность инкубации в большинстве экспериментов составляла 5 минут для аскорбат-зависимого и 20 минут для НАДФН-зависимого ПОЛ, температура 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 30% раствора ТХУ с ЭДГА в концентрации 1,5 мМ. По окончании инкубации в пробах определяли количество образовавшегося МДА по цветной реакции с ТБК (Штарберг М.А., 1998).

АОА ДКВ и токоферола оценивали по их способности тормозить аскорбат-и НАДФН-зависимое ПОЛ в суспензии микросом и выражали в процентах. Опытная инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 0,8 м/М аскорбат (или 1 м/М НАДФН); 0,2 м/М пирофосфат натрия; 50 м/М трис-HCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида (или 1 мг белка) микросом, 5Х10"6 Моль, 5х10"5 Моль, 5Х10"4 Моль, 5><10"3 Моль, что сопоставимо с дозами 0,1; 1,10,100 мг/кг и 2,5x10"3 Моль (50 мг/мг) ДКВ в 0,1 мл буферного раствора, llxlO"4 Моль и 11хЮ"3 Моль (ЗОмг/кг и ЗООмг/кг массы) эмульсии масляного раствора токоферола в 0,1 мл буферного раствора. Две контрольные пробы аналогичного состава не содержали раствора ДКВ или токоферола (контроль 1) или микросом (контроль 2). АОА рассчитывали по формуле:

О)

[МДА контроль 1 + МДА контроль 2] - МДА опыт

АОА= ------------------------------------------------------------------ х 100%

МДА контроль 1 + МДА контроль 2

Полученные цифровые данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценивая результаты эксперимента, было выявлено, что в условиях in vitro в ас-корбат-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс ДКВ проявляет антиокси-дантные свойства (табл. 2). АОА ДКВ в данных условиях составила в молярной концентрации 5хЮ"5 Моль - 4%, 5*10"4 Моль - 32%, 2,5х10~3 Моль - 97%, 2,5хЮ'2 Моль -

100%, что подчеркивает прямую дозозависимость ДКВ (с увеличением дозы ДКВ АОА возрастает) и сопоставимо с АОА токоферола, которая составила 85,4% (30 мг/мл) и 98,3% (300 мг/мл). (табл.2)

Таблица 2

Показатели МДА и АОА дигидрокверцетина и токоферола в аскорбат- и НАДФН-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс__

Аскорбат-зависимое ПОЛ НАДФН-зависимое ПОЛ

МДА нмоль/мл АОА МДА нмоль/мл АОА

Микросомы 12,710±0,032 2,608±0,049

Микросомы + ДКВ 5*10-6 Моль 13,924±0,058 -9,3% 2,769±0,034 -7,02%

Микросомы + ДКВ 5*10-5 Моль 12,117±0,033 4,5% 2,251±0,037 9,8%

Микросомы + ДКВ 5*10-4 Моль 8,543±0,107 32,7% 0,385±0,043 84,5%

Микросомы + ДКВ 2,5*10-3 Моль 0,346±0,03 97,2% 0,262±0,027 89,9%

Микросомы + ДКВ 5*10-3 Моль 1,324±0,03 89,6% 0,193±0,011 92,5%

Микросомы+вит.Е 11*10-4 Моль 1,463±0,03 85,4% 1,022±0,03 72,2%

Микросомы+вит.Е 11*10-3 Моль 0,166±0,01 98,3% -0,469±0,02 100%

Аналогичные тенденции прослеживались и в НАДФН-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс: ДКВ проявлял антиоксидантный эффект, прямопропорцио-нальный дозе вводимого соединения. АОА в данных условиях составила в молярной концентрации 5х10"5 Моль - 9,8%, 5х 10^ Моль - 84,5%, 2,5х 10"3 Моль - 89,9%, 2,5><10"2 Моль -92%. В свою очередь, АОА токоферола составила 72,2% (30 мг/мг) и 112,7% (300 мг/мг).

В целом, оценивая полученные результаты, был зафиксирован факт выраженной антиоксидантной активности ДКВ в условиях in vitro, сопоставимой с активностью классического антиоксиданта - токоферола, что вполне объяснимо, поскольку ДКВ -представитель класса флавоноидов, который, в свою очередь, относится к антиоксидан-там прямого действия (донорам протона). Основным механизмом антиокислительного действия веществ этой группы является взаимодействие с образующимися в ходе ПОЛ перокси- (ROO*) и алкокси-радикалами (RO*) за счет легко подвижного атома водорода одной или нескольких фенольных групп в составе молекулы АО. Кроме этого, флаво-ноиды способны хелатировать катионы металлов, выступая в роли АО-комплексообразователей и изолируя эти ионы, предотвращая, тем самым, формирование свободных радикалов. Полученные нами результаты эксперимента in vitro согласуются с работами В.А. Бабкина (2003), Т.Г. Разиной (2006), В.Б. Хобраковой (2012), подчеркивающих результатами своих экспериментальных исследований антиоксидантный эффект дигидрокверцетина.

Исследование влияния ДКВ на процессы ПОЛ in vivo

Изучив влияние ДКВ на процессы ПОЛ в системе in vitro, мы поставили перед собой задачу исследовать антиоксидантные свойства ДКВ в условиях искусственной активации свободнорадикальных процессов в живом организме, т. е. в условиях in vivo. Из литературных данных известно о прооксидантном действии холода на организм, вызывающем активацию процессов ПОЛ в органах и тканях (Доровских В.А., Красавина Н.П.). Принимая во внимание вышесказанное, нами была использована "холодовая" модель активации ПОЛ в условиях in vivo, поскольку последняя является наиболее удобным и подробно изученным способом активации свободнорадикальных реакций в

организме лабораторных животных, при котором отмечаются типичные и стабильные изменения содержания продуктов ПОЛ и активности компонентов АОС в тканях различных органов, а также низкая летальность животных, что способствует получению статистически достоверных результатов.

В результате холодового воздействия формируются общие признаки изменения гомеостаза организма, которые можно обнаружить в различных органах и тканях. Именно поэтому была исследована кровь как самая реактивная ткань, биохимические изменения которой отражают все патологические процессы в организме, ткани печени и легких.

Степень выраженности антиоксидантного эффекта ДКВ оценивали в сравнении с анти-оксидантной активностью а-токоферола.

Антиоксидантные свойства ДКВ изучались по изменению содержания продуктов ПОЛ (ГП, ДК, МДА) и компонентов АОС (церулоплазмин, витамин Е, каталаза, Г-6-ФДГ) в крови и печени крыс, подвергнутых длительному холодовому воздействию. Определение нами ГП, ДК, МДА обусловлено тем, что данные продукты ПОЛ характеризуют в основном промежуточный и конечный этапы пероксидации мембранных фосфолипидов, содержание их в тканях более стабильно, чем начальных продуктов свободнорадикального окисления и имеет четкую зависимость от интенсивности процессов ПОЛ. Исследование биохимических показателей проводили на 7, 14, 21 дни холодового воздействия.

Влияние дигидрокверцетина на содержание продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных при холодовом воздействии Семидневное охлаждение животных сопровождалось выраженным достоверным повышением содержания продуктов ПОЛ в крови крыс контрольной группы в сравнении с интактными животными (таб. 3): содержание гидроперекисей липидов выросло на 46%, диеновых конъюгатов - на 47%, уровень МДА — на 40%.

В экспериментальных группах на фоне охлаждения прослеживалась тенденция к достоверному снижению уровня продуктов ПОЛ в сравнении с контрольной группой животных: в группе, где ДКВ вводили в дозе 50 мг/кг уровень гидроперекисей липидов был ниже аналогичного показателя в контроле на 65%, диеновых конъюгатов — на 65%, МДА - на 66%. При введении ДКВ в дозе 100 мг/кг уменьшение содержания продуктов ПОЛ относительно контроля составило соответственно 59%, 51%, 61% (табл. 3).

Таблица 3

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверце-тина в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг (7й день солодового воздействия) _

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюгаты нмоль/мг Малоновый диальде-гид нмоль/мл

Интактные животные 4,600±0,066 93,912±0,451 1,152±0,077

Контроль (холод) 8,506±0,068* 176,420±0,787* 1,897±0,042*

ДКВ50мг/кг+ холод 3,005±0,058** 65,608±0,837** 0,653±0,013**

ДКВ 100мг/кг+ холод 3,500±0,081** 87,692±0,566** 0,755±0,013**

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Полученные результаты, отразившие выраженное влияние ДКВ в обозначенных дозах на степень снижения продуктов пероксидации в крови экспериментальных животных в условиях холодового воздействия, заставили выдвинуть рабочую гипотезу о

наличии стабилизирующего влияния на степень накопления продуктов радикального характера у ДКВ в меньших дозах: 0,1 мг/кг, 1мг/кг, 10мг/кг.

Аналогично предыдущему эксперименту, охлаждение крыс в течение семи дней способствовало достоверному увеличению уровня продуктов ПОЛ в крови животных в сравнении с интактными крысами (табл. 4): содержание гидроперекисей липидов у животных, подвергнутых охлаждению, достоверно выросло с 5,551±0,093 нмоль/мл до 9,825±0,068 нмоль/мл (в 1,7 раза), диеновых конъюгатов - с 134,961±3,3 нмоль/мл до 295,042±6,7 нмоль/мл (в 2,1 раза), МДА - с 1,314±0,064 нмоль/мл до 2,914±0,037 нмоль/мл (в 2,2 раза).

В крови животных экспериментальных групп содержание продуктов ПОЛ было достоверно ниже, чем у контрольных крыс: уровень гидроперекисей липидов у животных, получавших ДКВ в дозе 10 мг/кг составил на 38,3% ниже по сравнению с контролем, в дозе 1 мг/кг на 44% ниже контроля, в дозе 0,1 мг/кг на 79% ниже, чем в контрольной группе, содержание диеновых конъюгатов в крови при воздействии холода на фоне введения ДКВ в дозе 0,1 мг/кг составило 57,308±6,0 нмоль/мл (на 80% ниже контроля), в дозе 1 мг/кг - 123,887±1,59 нмоль/мл (на 58%), в дозе 10 мг/кг -123,427±4,5 нмоль/мл (на 58%); МДА снижался от 35,7% до 44% и составил при введении ДКВ в дозе 10 мг/кг - 1,644±0,018 нмоль/мл, в дозе 1 мг/кг - 1,775±0,017 нмоль/мл, в дозе 0,1 мг/кг - 1,875±0,024 нмоль/мл.

Таблица 4

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигндрокверце-тнна в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг и витамина Е (7й день холодового воздействия)_

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 5,551±0,093 134,961±3,3 1,314±0,064

Контроль (холод) 9,825±0,068* 295,042±6,7* 2,914±0,037*

ДКВ0,1мг/кг+ холод 2,135±0,07** 57,308±6,0** 1,875±0,024**

ДКВ1мг/кг+ холод 5,572±0,129** 123,887±1,59** 1,775±0,017**

ДКВ 10мг/кг+ холод 6,064±0,082** 123,427±4,5** 1,644±0,018**

Витамин Е 30 мг/кг + холод 4,586±0,057** 91,809±1,6** 1,763±0,02**

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

В экспериментальной группе, где комбинировали охлаждение и введение витамина Е в дозе 30 мг/кг (табл. 4), уровень диеновых конъюгатов на 68,9% ниже, чем в группе контрольных крыс, содержание гидроперекисей липидов уменьшилось на 54%, МДА - на 42% (р<0,05).

Таким образом, использование ДКВ в разных дозах в эксперименте свидетельствовало об ингибирующем действии исследуемого соединения на накопление продуктов ПОЛ в условиях холодового воздействия, выраженность которого была сопоставима по показателям с эффективностью эталонного антиоксиданта - витамина Е, причем результаты исследования отразили обратную зависимость эффекта от дозы вводимого ДКВ в плане накопления первичных продуктов пероксидации: с уменьшением дозы ДКВ с 10 мг/кг до 0,1 мг/кг наблюдается увеличение антиоксидантного эффекта.

При холодовом воздействии в течение двух недель в крови животных контрольной группы наблюдалось достоверное повышение содержания продуктов пероксидации в сравнении с интактными животными (табл. 5): уровень гидроперекисей липидов увеличился на 28,6%, диеновых коньюгатов - на 32%, МДА — на 28,8% (р<0,05).

Введение ДКВ в течение 14 дней на фоне охлаждения прослеживалось увеличение содержания продуктов ПОЛ. При введении ДКВ в дозе 50 мг/кг уровень гидроперекисей липидов вырос на 41,2%, диеновых коньюгатов - на 33,8%, МДА - на 24,5% относительно животных контрольной группы; доза 100 мг/кг препарата способствовала увеличению содержания гидроперекисей липидов на 72,8%, диеновых коньюгатов - на 69,8%, МДА - на 64,7% (р<0,01).

Таблица 5

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверце-

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 2,068±0,027 47,102±0,088 0,46±0,02

Контроль(холод) 2,895±0,068* 60,437±0,104* 0,646±0,011*

ДКВ50мг/кг+ холод 4,368±0,076** 102,693±0,837** 0,855±0,048**

ДКВ 1 ООмг/кг+холод 7,779±0,071** 199,681± 1,286** 1,424±0,046**

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) — опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

В свою очередь, введение ДКВ в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в условиях хо-лодового стресса в течение двух недель препятствовало накоплению продуктов радикального характера в сравнении с животными контрольной группы (табл. 6).

Уровень гидроперекисей липидов у животных, получавших ДКВ в дозе 10 мг/кг был на 27% ниже по сравнению с контролем, в дозе 1 мг/кг - на 36%, в дозе 0,1 мг/кг -на 56% (р<0,05); содержание диеновых коньюгатов в крови при воздействии холода на фоне введения ДКВ в дозе 0,1 мг/кг достоверно снизилось на 73% относительно контроля, в дозе 1 мг/кг — на 56%, в дозе 10 мг/кг - на 53% (р<0,01); уровень МДА снижался от 40% до 35% соответственно (р<0,05). В экспериментальной группе, где комбинировали охлаждение и введение витамина Е в дозе 30 мг/кг, содержание гидроперекисей липидов уменьшилось на 44%, диеновых коньюгатов - на 68%, МДА — на 39% относительно контрольных крыс (р<0,01).

Таблица 6

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверце-тина в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг и витамина Е (14й день холодового воздействия)

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 6,624±0,102 120,856±3,6 1,585±0,076

Контроль(холод) 10,453±0,088* 254,628±5,9* 2,965±0,052*

ДКВ0,1мг/кг+ холод 4,586±0,115** 68,835±5,0** 1,915±0,066**

ДКВ1мг/кг+ холод 6,716±0,192** 112,125±2,6** 1,852±0,050**

ДКВ 10мг/кг+ холод 7,655±0,150** 120,466±5,2** 1,769±0,028**

Витамин Е 30 мг/кг + холод 5,866±0,124** 80,445±2,8** 1,810±0,031**

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Таким образом, введение ДКВ в дозе 0,1 мг/кг охлаждаемым животным в течение 14 дней способствует наиболее выраженному снижению содержания первичных продуктов ПОЛ, превосходящему по показателям степень влияния витамина Е на накопле-

ние гидроперекисей липидов и диеновых конъюгатов. Анализ уровня вторичного продукта пероксидации позволил выявить прямую зависимость степени накопления МДА от дозы вводимого ДКВ: с увеличением дозы препарата до 10 мг/кг содержание МДА снижается к концу второй недели эксперимента, что коррелирует с данными, полученными в конце первой недели опыта.

При холодовой нагрузке в течение 21 дня наблюдалась аналогичная картина накопления продуктов пероксидации в крови контрольных крыс в сравнении с интактны-ми животными (табл. 7): уровень гидроперекисей липидов достоверно увеличился на 43,5%, диеновых коньюгатов на 36,1%, МДА на 40,8%.

Таблица 7

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверце-тина в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг (21й день холодового воздействия)

Группы животных

Гидроперекиси липидов нмоль/мг

Диеновые конъюга-ты нмоль/мг

Малоновый диаль-дегид нмоль/мл 0,508±0302_

Интакшые животные

2,081±0,026

48Д25±0,096

Контроль (холод)

3,656±0,061*

73,597±1,172*

0,777±0,018*

ДКВ50мг/кг+ холод

4,592±0,095**

128,267±5,573**

0,987±0,048"

ДКВ 1 00мг/кгЬхолод

4,553±0,106**

129,026±6,532**

0,978±0,049**

Примечшше. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

ДКВ в дозе 50 мг/кг на 21й день холодового воздействия вызвал повышение уровня гидроперекисей липидов на 20,4%, диеновых коньюгатов - на 42,7%, МДА - на 21,3% в крови экспериментальных животных. Введение ДКВ в дозе 100 мг/кг способствовало повышению уровня гидроперекисей липидов на 19,8%, диеновых конъюгатов - на 43%, МДА - на 20,6% относительно контрольных крыс (табл. 7).

Таким образом, прооксидантный эффект ДКВ в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг в условиях охлаждения животных, полученный в ходе первой и второй недель опыта, прослеживался и к концу третьей недели эксперимента, причем выраженность последнего возрастает с увеличением дозы вводимого соединения.

Введение ДКВ в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в условиях холодового стресса в течение трех недель препятствовало накоплению продуктов радикального характера в сравнении с животными контрольной группы (таб. 8).

Таблица 8

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверце-

типа в дозах и,1 мг/кг, г мг/к Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 6,890±0,125 145,425±4,0 1,816±0,055

Контроль (холод) 11,036±0,186* 246,895±5,8* 2,875±0,075*

ДКВ0,1мг/кг+ холод 7,432±0,120** 139,056±4,4** 1,902±0,061**

ДКВ1мг/кг+ холод 6,558±0,205** 128,112±3,5** 1,844±0,050**

ДКВ10мг/кг+ холод 6,052±0,118** 106,227±4,0** 1,725±0,052**

Витамин Е 30 мг/кг + холод 5,968±0,105** 101,565±3,8** 1,710±0,045**

111ши«4» ^ V»-.» -----------1-----ж

лод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Уровень гидроперекисей липидов у животных, получавших ДКВ в дозе 10 мг/кг был на 45% ниже по сравнению с контролем, в дозе 1 мг/кг - на 41%, в дозе 0,1 мг/кг -на 33% (р<0,01); содержание диеновых конъюгатов в крови при воздействии холода на

фоне введения ДКВ в дозе 0,1 мг/кг достоверно снизилось на 44% относительно контроля, в дозе 1 мг/кг - на 48%, в дозе 10 мг/кг - на 57% (р<0,01); уровень МДА снижался от 34% до 40% соответственно (р<0,05). В экспериментальной группе, где комбинировали охлаждение и введение витамина Е в дозе 30 мг/кг, содержание гидроперекисей липидов уменьшилось на 46%, диеновых конъюгатов - на 59%, МДА - на 41% относительно контрольных крыс (р<0,01).

Таким образом, введение ДКВ в течение трех недель эксперимента способствовало снижению содержания продуктов ПОЛ, при этом важно отметить, что с увеличением дозы препарата от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг снижение степени накопления продуктов радикального характера увеличивается.

Влияние дигидрокверцетина на активность компонентов АОС в крови экспериментальных животных при холодовом воздействии Об интенсивности протекания процессов ПОЛ в организме можно судить по состоянию АОС, так как активность многих компонентов АОС организма играет решающую роль в защите клеточных мембран и организма в целом от повреждающего воздействия свободных радикалов. Усиление интенсивности процессов пероксидации в живом организме возможно только на фоне значительного снижения активности АОС тканей и, в свою очередь, приводит к еще большему истощению резервов антирадикальной защиты организма. Исходя из этого, мы определяли в крови лабораторных животных содержание церулоплазмина и витамина Е, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и каталазы.

Исследование состояния АОС в условиях эксперимента показало, что холодовое воздействие способствует достоверному снижению содержания основных компонентов АОС в крови животных контрольной группы относительно интактных крыс (таб. 9): уровень церулоплазмина был ниже аналогичного показателя в группе интактных животных на 27% (7 день), 38% (14 день), 28% (21 день), содержание витамина Е - на 22%, 34%, 40% соответственно (р<0,05).

Таблица 9

Содержание компонентов АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне

Группы .............. ,„„ Церулоплазмин(мкг/мл) Витамин Е (мкг/мл)

7 день 14 день 21 день 7 день 14 день 21 день

Интакшые животные 33,8±2,6 26,8±2,0 25,5±1,8 23,6±1,5 24,9±1,6 26,5±1,9

Контроль (холод) 21,2±2,5* 16,7±1,3* 18,4±1,5* 18,3±0,6* ]6,4±2,0* 16,0±1,2*

ДКВ50мг/кг+ холод 30,1±1,8** 30,5±2,3** 19,6±2,0 21,6±0,6** 23,8±1,5** 24,6±1,8**

ДКВ100мг/кг+ холод 24,5±1,9 25,9±1,5** 17,4±1,2 21,3±1,1 23,6±1,4** 16,5±2,4

*----------------1---— V""«—чи«.« .^инлиу \lilHi I и/, 1) И Л ип i ^ли-

лод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Использование ДКВ в дозе 50 мг/кг свидетельствовало о достоверном повышении уровня церулоплазмина (на 30% и 45% к концу первой и второй недель эксперимента) и витамина Е (на 15%, 31%, 35% к концу первой, второй и третьей недель опыта соответственно) в крови охлаждаемых животных (р<0,05). Введение ДКВ в дозе 100 мг/кг способствовало достоверному увеличению исследуемых показателей (табл. 9) относительно контроля на 14 день эксперимента - на 36% и 31% соответственно (р<0,01).

Изучение активности ферментов АОС в условиях холодового стресса показало, что трехнедельное охлаждение организма приводит к достоверному снижению уровня глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и каталазы в крови крыс - на 15-28% и 12-19% соответственно.

Некоторое повышение активности ферментативной системы у охлаждаемых животных удалось констатировать лишь при использовании ДКВ в дозе 50 мг/кг - в среднем на 9-11%. Введение ДКВ в дозе 100 мг/кг практически не влияло на уровень глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и каталазы в крови охлаждаемых крыс, а по некоторым показателям - превосходило контроль (табл.) 10.

Таблица 10

Содержание ферментов АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения дигидрокверцетина в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг

Группы

Интактные животные

Контроль (холод)

ДКВ 50 мг/кг + холод

ДКВ100мг/кг+ холод

Г-6-ФДГ(мкмоль НАДФН л с )

7 день

20,53±0,63

17,59±0,21*

19,66±0,42*

18,95±0,32**

14 день

19,26±0,58

15,45±0,36*

17,34±0,35**

15,51±0,54

21 день

19,72±0,65

14,28±0,30*

15,64±0,52

14,16±0,48

Каталаза (мкмоль Н2О2 г" с" )

7 день

102,6±2,6

90,2+2,7*

98,3±0,9**

96,8±1,4

14 день

98,8±2,5

84,5±2,2*

8,6±1,8

84Д±1,8

21 день

99,5±2,0

80,6±2,8*

89,9±1,7*

79,5±2,5

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Таким образом, коррекция интенсивности процессов ПОЛ в теплокровном организме в условиях холодового стресса введением ДКВ в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг запланированная нами в начале исследований, не состоялась ввиду прооксидантного действия ДКВ, причем с увеличением дозы ДКВ выраженность прооксидантного эффекта возрастает.

В результате воздействия холода на организм лабораторных животных (табл. 11) в крови наблюдалась тенденция к стабильному снижению концентрации церулоплаз-мина с 46,7±4,7 мкг/мл, 45,8±4,5 мкг/мл, 39,8±2,5 мкг/мл (на 7, 14 и 21 день эксперимента соответственно) у интактных крыс до 30,3±2,7 мкг/мл на 7 день, 32,3±2,2 мкг/мл на 14 день и 33,1±1,0 мкг/мл к концу опыта (на 35%, 30%, 17% соответственно, р<0,05).

В свою очередь, уровень витамина Е по сравнению с интактными животными в группе охлаждаемых крыс снизился до 20,0±0,6 мкг/мл (на 24%) на 7 день эксперимента, 19,6±1,4 мкг/мл (на 26%) на 14 день, 21,0±1,2 мкг/мл (на 29%) к концу третьей недели исследований (р<0,01).

Таблица 11

Содержание компонентов АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения дигидрокверцетина в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и токоферола в дозе 30 мг/кг

Группы Церулоплазмин (мкг/мл) Витамин Е (мкг/мл)

7 день 14 день 21 день 7 день 14 день 21 день

Интактные животные 46,7±4,7 45,8±4,5 39,8±2,5 26,1±1,7 26,4±1,7 29,5±1,7

Контроль (холод) 30,3±2,7* 32,3±2,2* 33,1±1,0* 20,0±0,6* 19,6±1,4* 21,0±1,2*

ДКВ0,1мг/кг+ холод 68,5±3,7** 46,1±1,8** 48,8±3,4** 21,8±1,6 43,0±2,5** 39,2±3,0**

ДКВ 1 мг/кг + холод 35,5±2,4 40,1±1,5 ** 41,1±2,5 ** 21,9±1,5 24,6±1,1** 36,6±2,4**

Токоферол ЗОмг/кг+холод 22,6±1,2** 23,2±2,0** 39,8±1,6** 55,8±2Д** 48,7±1,6** 47,2±3,0**

лод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

На фоне введения ДКВ в дозе ОД мг/кг непосредственно перед холодовьм воздействием содержание церулоплазмина в крови значительно выросло на 7 день эксперимента - в 2,3 раза (68,5±3,7 мкг/мл, р<0,05), снижаясь к 14 и 21 дню опыта до 46,1±1,8 мкг/мл и 48,9±3,4 мкг/мл (на 30% и 32% выше, чем в контроле соответственно, р<0,05), что практически соответствует уровню церулоплазмина у интактных животных и свидетельствует о восстановлении исходного содержания церулоплазмина в условиях холодового стресса.

Содержание витамина Е в крови животных на фоне введения ДКВ (табл. 11) в дозе 0,1 мг/кг на 7 день эксперимента в целом соответствует уровню последнего в контроле - 21,8±1,6 мкг/мл, к 14 и 21 дню исследований увеличивается до 43,0±2,5 мкг/мл и 39,2±3,0 мкг/мл (на 54% и 46% выше, чем в контроле, р<0,01). Введение ДКВ в дозе 1 мг/кг сопровождалось некоторым увеличением содержания церулоплазмина в плазме крови к концу первой недели опыта относительно контроля (35,5±2,4 мкг/мл), достоверное повышение данного показателя было выявлено на 14 и 21 дни исследований: 40,1±1,5 мкг/мл и 41,1±2,5 мкг/мл (на 20%, р<0,05). Содержания витамина Е в данной экспериментальной группе достоверно выросло до 24,6±1,1 мкг/мл (14 день) и 36,6±2,4 мкг/мл (21 день), что на 20% и 43% выше, чем у контрольных крыс.

Использование токоферола в эксперименте (табл. 11) свидетельствовало о снижении содержания церулоплазмина к концу первой и второй недель эксперимента и последующему росту к концу опыта (достоверно выше, чем в контроле на 17%). Исследуя уровень витамина Е на фоне введения токоферола охлаждаемым животным, в очередной раз было подтверждено антиоксидантное действие препарата в условиях холодового стресса, базируемое на увеличении содержания эндогенного витамина Е (практически в 2 - 2,5 раза) в крови лабораторных животных.

Продолжительное холодовое воздействие вызывает стойкое снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в крови лабораторных животных в сравнении с интактными крысами (табл. 12): до 16,4±0,4 мкмоль НАДФН л"1 с"1 (на 13%) на 7 день эксперимента, 14,2±0,5 мкмоль НАДФН л-1 с1 (на 26%) на 14 день и 14,7±0,6 мкмоль НАДФН л" с" (на 18%) на 21 день. В сравнении с интактными животными, у которых активность каталазы крови была на уровне 70,8±1,8 мкмоль Н202 г*'с"1, 69,7±1,2 мкмоль Н202 г'с"' и 65,8±1,3 мкмоль Н202 г"1 с"1 (на 7, 14 и 21 день эксперимента соответственно), в ходе стрессового воздействия низких температур наблюдалось значительное достоверное снижение активности этого фермента в крови подопытных животных: на 14% к концу первой недели опыта (60,8±1,6 мкмоль Н202 г'с"1), на 15% - к концу второй (59,5±3,8 мкмоль Н202 г'с"1) и на 9% - к концу третьей (60,2±1,2 мкмоль Н202 г'с"1, р<0,05).

На фоне введения ДКВ в дозе 0,1 мг/кг активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в крови восстановилась до 16,6±0,3 мкмоль НАДФН л"1 с"1 на 14 день эксперимента (на 16% выше, чем в контроле, р<0,05) и 18,5±0,3 мкмоль НАДФН л" с" к концу опыта (на 25% выше относительно контроля, р<0,01). Исследование активности каталазы позволило обнаружить не только восстановление данного показателя до показателей в группе интактных крыс, но и значительное превышение его на 7, 14 и 21 день эксперимента на 39%, 40% и 42% соответственно (р<0 01) (табл.12) '

Таблица 12

Содержание ферментов АОС в крови крыс при длительном холодовом стрессе на фоне применения дигидрокверцетина в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и токоферола в дозе 30 мг/кг_

Группы

Интактпые животные

Г-6-ФДГ (мкмоль НАДФН л"1 с"')

7 день

18,8±0,7

14 день

19,1±0,8

21 день

17,8±0,6

Каталаза (мкмоль Н2О2 г"1с'1)

7 день

70,8±1,8

14 день

69,7±1,2

21 день

65,8±1,3

Контроль (холод)

16,4±0,4*

14,2±0,5*

14,7±0,6*

60,8±1,6*

59,5±3,*

60,2±1,*

ДКВ0,1мг/кг+ холод

16,5±0,7

16,6±0,*

18,5±0,*

84,7±3,6*

83,3±3,*

85,8±4,*

ДКВ1мг/кг+ холод

19,4±0,4*

15,7±0,5

16,3±0,4*

73,0±2,5*

70,6±2,1*

71,0±3,1*

Токофе-ролЗОмг/кг+холод

20,4±0,6**

18,5±0,5**

18,5±0,4**

100,1±5,5**

89,6±4,5"

87,0±4,2*

Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Использование ДКВ в дозе 1 мг/кг перед охлаждением способствовало достоверному увеличению активности ферментов в условиях холодовой нагрузки: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - на 10-16%, каталазы - на 16-17% (р<0,05), что уступает по показателям введение ДКВ в дозе 0,1 мг/кг.

Введение токоферола, как классического антиоксиданта, приводит к стабильному увеличению уровня глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы до 20,4±0,6 мкмоль НАДФН л' с

1 (7 день) и 18,5±0,4 мкмоль НАДФН л"1 с"1 (на 21% выше, чем в контроле, р<0,01) к 21 дню эксперимента. В ходе эксперимента было выявлено увеличение активности каталазы в крови получавших токоферол животных, особенно на 7 день эксперимента -100,1±5,5 мкмоль Н202 г'с"1 (на 64% по сравнению с контрольной группой, р<0,05), в последующие дни достоверный рост уровня каталазы составил 34% (14 день) и 31% (21 день), (табл. 12)

Таким образом, изучение активности компонентов АОС в условиях холодового стресса на фоне коррекции показало, что ДКВ в дозе 0,1 мг/кг проявляет наиболее выраженное антиоксидантное действие, базируемое на увеличении уровня ферментных антиоксидантов - каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, макромолекулярного неферментативного компонента - белка сыворотки крови церулоплазмина и низкомолекулярного жирорастворимого соединения - витамина Е.

Влияние дигидрокверцетина на содержание продуктов ПОЛ в гомогенате печени экспериментальных животных при холодовом воздействии

Поскольку первый этап экспериментальной работы позволил заключить проок-сидантное действие ДКВ в больших дозах (50 мг/кг, 100 мг/кг) в условиях холодового воздействия, мы посчитали целесообразным исследовать влияние ДКВ на накопление продуктов ПОЛ в гомогенате печени, используя дозы 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в сравнении с токоферолом.

При семидневном охлаждении крыс наблюдалось выраженное достоверное повышение уровня продуктов ПОЛ в гомогенате печени животных контрольной группы (таб. 13): в сравнении с интактной группой содержание гидроперекисей липидов возросло на 61,4% (с 4,245±0,061 нмоль/мг до 8,730±0,077 нмоль/мг, р<0,05), диеновых

коньюгатов - 19,5% (со 144,715±0,262 нмоль/мг до 179,671±0,363 нмоль/мг, р<0,05), МДА - на 45,8% (с 1,031±0,027 нмоль/мг до 1,900±0,038 нмоль/мг, р<0,01).

Таблица 13

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/г) в гомогенате печени крыс на фоне применения ди-гидрокверцетина в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг и токоферола (7й день холодового воз-

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 4,245±0,061 144,715±0,26 1,031±0,027

Контроль (холод) 8,730±0,077* 179,671±0,3* 1,900±0,038*

ДКВ0,1мг/кг+холод 2,077±0,035** 120,985±0,54** 0,989±0,023**

ДКВ 1 мг/кг+ холод 4,758±0,044** 134,685±0,71** 1,071±0,024**

ДКВ 10 мг/кг+ холод 4,478±0,071** 137,252±0,32** 0,905±0,03**

Токоферол 30 мг/кг + холод 2,865±0,031** 128,03 8±0,69** 0,922±0,019**

Примечание. Значимость различий контроль (интакгные крысы) - опыт (холод) и контроль (холод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и * * при Р<0,1

В экспериментальных группах на фоне охлаждения прослеживалось снижение интенсивности ПОЛ в сравнении с контрольной группой (табл. 13): в группе, где ДКВ вводили в дозе 0,1 мг/кг, уровень гидроперекисей липидов уменьшился на 72,3% (с 8,730±0,077 нмоль/мг до 2,077±0,035 нмоль/мг, р<0,05), диеновых коньюгатов - на 32,7% (с 179,671±0,363 нмоль/мг до 120,985±0,545 нмоль/мг, р<0,05), МДА - на 48% (с 1,900±0,038 нмоль/мг до 0,989±0,023 нмоль/мг, р<0,05).

При увеличении дозы ДКВ до 1 мг/кг уровень гидроперекисей липидов относительно контрольных животных достоверно снизился на 45,5% (до 4,758±0,044 нмоль/мг), диеновых коньюгатов - на 25,1% (до 134,685±0,712 нмоль/мг), МДА - на 43,7% (до 1,071±0,024 нмоль/мг). При введении ДКВ в дозе 10 мг/кг охлаждаемым в течение семи дней животным показатели продуктов пероксидации имели тенденцию к снижению на 48,8% (до 4,478±0,071 нмоль/мг), 23,7% (до 137,252±0,325 нмоль/мг), 52,4% (до 0,905±0,03 нмоль/мг) в сравнении с контрольной группой крыс.

Двухнедельное охлаждение организма (табл. 14) способствовало повышению в гомогенате печени животных контрольной группы в сравнении с интактными крысами гидроперекисей липидов на 32,1%, диеновых коньюгатов - на 27,7%, МДА - на 45,7% (таб. 14). При применении ДКВ в дозе 0,1 мг/кг уровень МДА снизился на 39,9% (с 1,523±0,018 нмоль/мг до 0,916±0,025 нмоль/мг), показатель гидроперекисей - на 32,3% (с 5,297±0,04б нмоль/мг до 3,590±0,028 нмоль/мг), количество диеновых коньюгатов - на 29,5% (с 112,230±0,132 нмоль/мг до 79,230±0,089 нмоль/мг).

При введении препарата в дозе 1 мг/кг (табл. 14) в гомогенате печени также наблюдалось снижение показателей МДА до 1,04б±0,022 нмоль/мг (на 31,4%), гидроперекисей липидов - до 4,201±0,052 нмоль/мг (на 20,7%), диеновых коньюгатов - до 92,425±0,089 нмоль/мл (на 17,7%). Доза ДКВ 10 мг/кг, вводимая охлаждаемым в течение двух недель крысам, способствовала снижению уровней МДА и гидроперекисей липидов на 46,5%, диеновых коньюгатов - на 38,5% (р<0,01).

Введение классического антиоксиданта токоферола в условиях холодового воздействия препятствовало накоплению продуктов радикального характера в гомогенате печени крыс практически в 2,5 раза.

Таблица 14

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/г) в гомогенате печени крыс на фоне применения ди-гидрокверцетина в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг и токоферола (14й день холодового воз-

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты нмоль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 3,601±0,023 81,144±0,094 0,828±0,012

Контроль (холод) 5,297±0,046* 112,230±0,13* 1,523±0,018*

ДКВ0Дмг/кг+ холод 3,590±0,028** 79,230±0,089** 0,916±0,025**

ДКВ 1 мг/кг+ холод 4,201±0,052** 92,425±0,089** 1,046±0,022**

ДКВ 10мг/кг+ холод 2,836±0,033** 69,066±0,06** 0,816±0,019**

Токоферол 30 мг/кг + холод 1,939±0,028** 40,369±0,079** 0,650±0,013**

_ опыт (холод) и контроль (хо-

лод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

Введение ДКВ в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг в условиях холодового стресса в течение трех недель способствовало накоплению продуктов радикального характера в сравнении с животными контрольной группы (табл. 15).

Уровень гидроперекисей липидов у животных, получавших ДКВ в дозе 10 мг/кг был на 18% выше по сравнению с контролем, в дозе 1 мг/кг - на 40% (р<0,01); содержание диеновых конъюгатов в гомогенате печени при воздействии холода на фоне введения ДКВ в дозе 1 мг/кг увеличилось на 46%, в дозе 10 мг/кг - на 21% (р<0,01); уровень МДА повышался в среднем на 27% (р<0,01). Использование ДКВ в дозе 0,1 мг/кг в эксперименте снижало интенсивность процессов пероксидации, что отразилось уменьшением содержания всех исследуемых продуктов ПОЛ в гомогенате печени в условиях длительного охлаждения - на 45%, 42% и 38% соответственно (р<0,05). В экспериментальной группе, где комбинировали охлаждение и введение токоферола в дозе 30 мг/кг, содержание гидроперекисей липидов уменьшилось на 45%, диеновых конъюгатов - на 39%, МДА - на 23% относительно контрольных крыс (р<0,05).

Таблица 15

Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/г) в гомогенате печени крыс на фоне применения ди-гидроквсрцетииа в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг и токоферола (21й день холодового воз-

Группы животных Гидроперекиси липидов нмоль/мг Диеновые конъюга-ты 1моль/мг Малоновый диаль-дегид нмоль/мл

Интактные животные 1,203±0,011 24,93 5±0,364 0,672±0,019

Контроль (холод) 1,685±0,014* 34,969±0,269* 0,892±0,013*

ДКВ0Дмг/кг+ холод 0,935±0,014** 20,377±0,261** 0,551±0,021**

ДКВ 1 мг/кг+ холод 2,778±0,028** 64,671±0Д92** 1,217±0,023**

ДКВ 10мг/кг+ холод 2,061±0,027** 44,409±0,314** 1,220±0,018**

Токоферол 30 мг/кг + холод 0,931±0,027** 21,501±0,299** 0,689±0,015**

лод) - опыт (холод + препарат): * при Р<0,05и ** при Р<0,1

опыт (холод) и контроль (хо-

Таким образом, введение ДКВ в дозе 0,1 мг/кг в течение трех недель эксперимента способствовало снижению содержания продуктов ПОЛ в гомогенате печени животных, стабилизируя процессы свободнорадикального окисления липидов, индуцированные воздействием низких температур.

В целом, результаты морфологических исследований свидетельствуют о положительном влиянии ДКВ и токоферола, поскольку в группах, где экспериментальное воздействие холода сочетали с введением ДКВ или витамина Е, холодовые изменения клеток ткани печени теряли свой выраженный характер. При этом весь спектр холодовых морфологических изменений сузился до мало выраженной деформации клеток и минимальных изменений размеров просвета сосудов и межклеточных пространств. Сравнивая изменения морфологической картины на разных сроках охлаждения, видно, что уменьшение холодовых изменений ДКВ зависит от дозы препарата, причем следует отметить, сравнивая микроскопическую картину на препаратах ткани печени при 14-дневном охлаждении и введении ДКВ и витамина Е, что сохранность нормальной морфологической картины одинакова как в случае введения ДКВ в дозе 0,1 мг/кг, так и при введении витамина Е в дозе 30 мг/кг.

Таким образом, флавоноид дигидрокверцетин проявляет свою антиоксидантную активность, однако в каждом конкретном случае (например, разные модельные системы, воздействие различных физических, химических факторов и т.д.) необходима апробация доз с целью оптимальной коррекции патологических изменений, вызванных влиянием стресс-факторов.

Полученные данные позволяют предположить, что антиоксидантный эффект ди-гидрокверцетина в дозе 0,1 мг/кг по показателям снижения продуктов ПОЛ в сравнении с контрольными животными будет близок по значениям показателей к группе животных, получавших известный антиоксидант токоферол. Поэтому для сравнительной характеристики нами в эксперимент была введена группа животных, которая на фоне охлаждения получала витамин Е. При исследовании содержания продуктов ПОЛ и морфологический картины печени крыс отмечена тенденция к нормализации патологических сдвигов, вызванных стрессовым действием холода. Так содержание гидропрекисей липидов в крови на 7 день холодового воздействия снизилось по отношению к контрольным животным на 54%, процент снижения диеновых конъюгатов крови составил 62,6% (р<0,01), малонового диальдегида - 40% (р<0,05). В гомогенате печени уровень гидроперекисей липидов снизился на 67,2%, диеновых конъюгатов - на 28,8%, малонового диальдегида - на 51,5% (р<0,05) по отношению к группе животных, подвергавшихся только охлаждению. Таким образом, как было показано в многочисленных исследованиях (Yi O.S., Han D., Shin H.Q., 1991; Sies H., Stahl W., Sundquist A.R. et alt., 1992), широко известный антиоксидант а-токоферол в очередной раз подтвердил свою способность к ингибирующему влиянию на процессы свободно-радикального окисления в модельных системах. Фармакологический эффект а-токоферола связан с взаимодействием с перекисными радикалами в качестве донора водорода. Высокая реакционная способность токоферола по отношению к свободным радикалам обусловлена стереоэлеюронными эффектами хромано-вой структуры, где С9-0-С2 - остов почти копланарен с ароматическим кольцом, что позволяет р-орбиталям неподеленной электронной пары Oi принимать участие в стабилизации феноксильного радикала путем перекрывания с орбиталыо, содержащей неспарен-ный электрон.

Встраиваясь в клеточные и субклеточные мембраны, витамин Е проявляет свою антиоксидантную активность. Тесный контакт витамина Е с мембранами клетки способствует их стабилизации: а-токоферол контролирует архитектонику мембранных фосфо-липидов, снабжение фосфолипидов полиненасыщенными жирными кислотами, соединение фосфолипидов с белками.

Хорошее подтверждение антиоксидантных свойств а-токоферола было получено в результате морфологических исследований ткани печени, где размер и строение клеток тканей практически не изменялось по сравнению с интактными животными, а сохранение общего плана строения клеток позволяет заключить, что введение витамина Е обеспечивает нормализацию структур ткани печени на фоне прооксидантного холодового воздействия.

Выводы:

1. В условиях холодовой экспериментальной модели дигидрокверцетин в дозе 0,1 мг/кг проявляет выраженные антиокислительные свойства.

2. В условиях in vitro при индукции ферментативного и неферментативного ПОЛ дигидрокверцетин оказывает отчетливый антиоксидантный эффект, выраженность эффекта прямопропорциональна дозе вводимого вещества.

3. В условиях in vivo установлены статистически значимые различия изменений показателей продуктов ПОЛ (ДК, ГП, МДА) и компонентов АОС (це-рулоплазмина, витамина Е, глюкозо-6-фосфатдегидрогениза) в зависимости от доз дигидрокверцетина и длительности его применения.

4. Антиокислительные свойства дигидрокверцетина в дозах 0,1 мг/кг и 1 мг/кг сопоставимы или превосходят антиокислительные свойства токоферола по степени воздействия на накопление продуктов радикального характера и функциональную активность ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты.

5. Дигидрокверцетин предупреждает развитие морфофункциональных изменений в ткани печени в условиях холодового стресса, изменяя спектр холодовых морфологических показателей в зависимости от дозы вводимого вещества, что подтверждается результатами морфологического и биохимического исследований.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертационного исследования:

1. Круглова О.Г. (Андросова О.Г.), Доровских В.А, Тиханов В.И. Влияние ди-гидрокверцетина на продукты перекисного окисления липидов при холодовом воздействии // Дальневосточный медицинский журнал. 2011. №3. С. 90-93.

2. Круглова О.Г. (Андросова О.Г.), Доровских В.А, Тиханов В.И. Сравнительная характеристика влияния дигидрокверцетина и витамина Е на продукты перекисного окисления липидов крови лабораторных животных при холодовом воздействии // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2011. №40. С.71-73.

3. Прокопенко A.B., Круглова О.Г. (Андросова О.Г.) Высота эпителия трахеи при охлаждении организма // Научно - теоретический медицинский журнал «Морфология». 2011. Т. 140, №5. С.109.

4. Круглова О.Г. (Андросова О.Г.) Холодовой стресс и его коррекция дигид-рокверцетином у лабораторных животных// Материалы X региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: Шаг в будущее». - Благовещенск, 2009.-С. 49-51

5. Круглова О.Г. (Андросова О.Г.) Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в гомогенате ткани печени крыс при холодовом воздействии // Материалы XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2009. - С. 387.

Андросова Ольга Геннадьевна

Влияние дигидрокверцетина на перекисное окисление липидов в условиях холодового воздействия (экспериментальное исследование)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 03.04.2014 Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 150 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru