Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка минерало-биотических комплексов "дигидрокверцетин - аспарагинаты металлов"

07-6 о •

3251.

, На правах рукописи

ПЕГОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

РАЗРАБОТКА МИНЕРАЛ О-БИОТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ «ДИГИДРОКВЕРЦЕТИН - АСПАРАГИНАТЫ МЕТАЛЛОВ»

15,00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению н социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук Кононова Светлана Владимировна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шаталасв Иван Федорович доктор фармацевтических наук Гаммель Ирина Владимировна

Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 30 октября 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 208. 085. 03 при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443 079, г. Самара, проспект К. Маркса, 165 Б).

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «-"¿У »¿SSSftgr c^s^C-C 2007 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, к.ф.н., доцепт

if/>". У"

Е.В.Лвдсева

---------РОССи ЙСКАЯ

государственная

,0М1Й Л ПОТЕКА

а иа 7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Процессам свободно-радикального окисления в организме, приводящим к старению и гибели клеток и организма в целом, наследственным отклонениям, нарушению обмена веществ и образованию опухолей, противостоит эффективная система защиты. Ее основу составляют вещества, относящиеся к различным классам химических соединений, но объединенные способностью переводить свободные радикалы в неактивное состояние - антиоксиданты. К ним относятся как собственные антноксидантиые вещества, вырабатываемые организмом, так и антиоксиданты, поступающие извне: витамины (С, Е, (3-каротин), минеральные вещества (соединения селена, магния, меди), некоторые аминокислоты, растительные полифенолы (например, флавоноиды).

Одним из значимых полифенольных флавоноидов, являющимся эффективным антиоксидантом, является дигидрокверцетин (ДКВ), также проявляющий Р-витаминную активность [Ткжавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А., 1996]. За прошедшие годы выявлено его противовоспалительное, радиопротекторное, антигистаминное, противоопухолевое, антидиабетическое, капилляроукреплягощее действие. ДКВ также влияет на ферментные системы, антиоксидантную активность и проявляет сродство к фосфолипидным компонентам мембран.

Взаимодействие ДКВ с ферментными системами, его антиоксидантная активность сопряжены с реакциями катализа и редокс-процессов с участием ионов переходных металлов, таких как Си2+, 2п2+, Сг3+, Мп2+, а также с процессами окислительной биодеструкции, промотируемыми ионами щелочных (№\ К+) и щелочноземельных (Са2+, М£2+) металлов.

В зависимости от природы ионов металла, рН среды, присутствия других веществ, способных синергетически поддерживать окислительное равновесие в биологической системе, возможна реализация различных механизмов действия ДКВ и, соответственно, достижения прогнозируемого лечебного эффекта.

Разработка новых лекарственных средств (ЛС) и биологически активных добавок (БАДы), представляющих миперало-биотические комплексы, требует знания о возможных взаимодействиях компонентов ЛС в твердом состоянии, в растворах, яри

хранении, способах стабилизации и повышения эффективности действия ЛС и умения прогнозировать свойства ЛС в живой системе.

Целью настоящей работы является разработка новых минерало-биотических комплексов на основе дигидрокверцетина и соединений металлов, изучение их физико-химических свойств, выявление условий хранения и стабилизации изучаемых комплексов. Задачи исследования:

1. Исследование условий получения, изучение физико-химических свойств и стабильности по отношению к окислительным процессам комплексов дигидрокверцетина с ионами щелочных ("Ыа"1", К+), щелочноземельных (Са2+, М^^) и переходных металлов (Си2+, 7ж+, Сг3+, Мп2+ ) в водной среде.

2. Разработка методов анализа дигидрокверцетина при совместном присутствии с соединениями металлов, комплексов ДКВ с ионами металлов.

3. Выбор оптимального стабилизатора в составе минерало-биотического комплекса, изучение синергизма их действия.

4. Прогнозирование проницаемости через мембрану компонентов комплекса, включающих дигидрокверцетин и ионы металлов, проведение сравнительного анализа с препаратами хромоновой группы на синтетических моделях биомембран.

5. Выбор и обоснование оптимального состава минерало-биотического комплекса, включающего дигидрокверцетин, аспарагинаты переходных металлов и аскорбиновую кислоту.

6. Фармакологические исследования разработанной фармацевтической композиции.

7. Разработка проекта нормативной документации на новую биологически активную добавку.

Научная новизна.

Впервые изучены условия получения комплексов дигидрокверцетина с асгшрагинатами металлов, исследованы их физико-химические свойства, спектральные свойства в УФ и видимой области. Выявлены показатель К, отражающий вклад интенсивности поглощения хромонового и катехолятного циклов, и длина волны, характеризующая появление новых комплексов в растворах, что может быть рекомендовано для анализа на подлинность минерало-биотических комплексов.

Изучены УФ спектры комплексов в процессе окисления дигидрокверцетина в водных растворах под действием света и в присутствии кислорода воздуха, а также в присутствии иопов металлов. Выявлена полоса поглощения, характеризующая окисленную (хиноидпую) форму дигидрокверцетина и доказано, что введение аскорбиновой кислоты приводит к стабилизации комплекса при хранении.

Предложены методики качественного и количественного анализа дигидрокверцетина, ионов металлов, аскорбиновой кислоты в предлагаемых фармацевтических композициях.

Исследованы межмолекулярные взаимодействия комплексов

«дигидрокверцетин - аспарагинаты металлов» с гидрофильными и липофильными фрагментами биомембран на искусственных моделях. Эти результаты использованы для прогнозирования проницаемости компонентов комплекса через биомембрану.

Разработан минерало-биотический комплекс «Офтальвит» на основе дигидрокверцетина, аскорбиновой кислоты и аспарагинатов цинка и хрома. Практическая значимость результатов исследования.

Фармакологические исследования, проведенные в офтальмологическом отделении городской больницы № 35 г. Нижнего Новгорода, показали, что у больных, принимающих биологически активную добавку «Офтальвит», содержащую дигидрокверцетин, аскорбиновую кислоту и аспарагинаты хрома и цинка, улучшаются показатели перекисного окисления липидов и кровоснабжение нервозрительиого аппарата при диабетической ретинопатии.

По результатам исследований разработан проект фармакопейной статьи предприятия на указанную биологически активную добавку.

Состав на основе дигидрокверцетина, аспарагинатов цинка и хрома внедрен НПП «Росбиопром», г. Саров Нижегородской области (торговая марка «Офтальвит»), предназначенный для лечения диабетической ретинопатии и других заболеваний зрительного аппарата (акт внедрения). Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Всесоюзном конгрессе «Рациональное использование лекарств», г. Пермь, 2004 г; Международной конференции «From molecules towards materials», г. Нижний Новгород, 2005г„ Международном семинаре «Новые лекарственные средства: успехи и перспективы», г.Уфа, 2005 г, Межвузовской конференции молодых ученых «Современные проблемы фармации», г.Самара, 2006 г.

По результатам исследований опубликовано 3 статьи в ведущих российских и международных журналах («Ремедиум», Мексиканский химический журнал «2° foro académico nacional de Ingenierías y Arquitectura», Казанский медицинский журнал) и 4 тезисов научных конференций.

Работа выполнена в рамках совместного проекта ГОУ ВГТО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава» с научно-производственным предприятием «Росбиопром» (г. Сэров Нижегородской области). Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертация выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований Проблемной комиссии «Фармация» ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава» (№ государственной регистрации 01200409406). Положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения физико-химических свойств комплексных соединений дигидрокверцетина с аспарагинатами металлов (С.а2+, Mn2+, Cr3\ Zn2+, Cu2+) как компонентов биологически активных добавок в водной среде;

- УФ и ИК спектральные исследования, данные потенциометрии, тензиометрии комплексных соединений дигидрокверцетина с аспарагинатами металлов и условия проведения анализов для установления подлинности компонентов разрабатываемых минерало-биотических комплексов;

- адаптированные методики количественного определения дигидрокверцетина, аскорбиновой кислоты в присутствии аспарагинатов металлов;

- результаты исследований проницаемости (пенетрации) компонентов изучаемых комплексов в липидные и гидрофильные фрагменты биомембран на искусственных моделях;

- разработка и обоснование оптимальных составов минерало-биотических комплексов «дигидрокверцетин-аспарагинаты металлов»;

- разработка проекта фармакопейной статьи предприятия на минерало-биотический комплекс, содержащий дигидрокверцетин, аскорбиновую кислоту, аспарагинаты хрома и цинка.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и клиишсо-лабораторпой оценки биологически-активной добавки «Офтальвит»), списка цитируемой

литературы, приложения, включающего проект нормативной документации на лекарственный препарат «Офтальвит», акты внедрения и отчет о проведенных клиника-лабораторных испытаниях. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 20 рисунков. Список цитируемой литературы включает 115 наименований. Объекты исследования и используемые материалы.

Аспарагинаты цинка Zn(C4N04H6)2, хрома Cr(C4N04H6)3, кальция Ca(C4N04Hfi)2, меди Cu(C4N04H6)2, марганца Mn(C4N04H,,)2 и кобальта Co(C4N04H<,)2 были 99% чистоты и получены от ОАО «Кристалл».

Церулоплазмин - КФ 1.16.3.1 был представлен ФГУП НПО «Микроген» Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов «ИмБио».

Дигидрокверцетии (2,3-дишдро-3,5,7-тригидрокси-2-[3',4',-дигидроксифенил]-4Н-1-бензопиран-4-он), полученный из древесины лиственницы Даурской, был предоставлен НПП "Росбиопром" (г. Сэров Нижегородской области). ДКВ был многократно перекристаллизован из смеси спирта с водой и высушен до постоянной массы и соответствовал требованиям ФС 42-3853-99.

Концентрацию ДКВ определяли методом цианидиихлоридиой пробы и анализом УФ-спектров в области Хта)1=290нм в соответствии с калибровочным графиком.

Лецитин (1-пальмитоил-2-олеил-8п-глицерофосфатидилхолин) 99% чистоты, для получения модельных биомембран использован в виде хлороформного раствора (SIGMA Chemical Со).

Приборы и техника эксперимента.

Электронные спектры были записаны в области 200-700нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре "Specord М-40" фирмы Carl Zeiss lena (DDR). Спектры записывались в сравнении с бидистиллированной водой.

Идентификация ДКВ в БАД проводили методом ВЭЖХ на хроматографе «Shimadzu LC-10». ГСО ДКВ определяли на колонке С18, подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды (градиентный режим) при скорости потока подвижной фазы 1мл/мик. Спектр поглощения - 230 им и 287 им.

ИК-спектры исследуемых образцов были получены на ИК-спектрометре "Shimadzu LC-ll)Avp" в области 3200-500 см"1 в виде смесей с бромистым калием при концентрации изучаемых веществ в смеси 0,1-0,3%, а также в тонкой пленке вазелинового масла.

Изотермы сжатия 7t=f(A0) были получены на автоматизированной установке,

Размер тефлоновой ванны 200х137*2(мм). Весы Ленгмюра, снабженные ИК-

7

датчиком, позволяют обеспечить точность измерения поверхностного давления л, равную 0,05мН/м, погрешность определения молекулярной площади по стандарту -арахиновой кислоте - составляла не более 2-5%.

Измерение поверхностного натяжения растворов производили двумя методами: полустатическим методом максимального давления образования пузырька и методом пластинки Вильгельми.

Содержание катионов определялось методом АЭС ИСП на многоканальном анализаторе эмиссионных спектров МАЭС марки АЭС ИСП-28 и фотометрически. Использовался спектрофотометр видимой области НАСН БЬШООО с кюветами толщиной 1 дюйм. Во всех определениях применялись градуировочныс кривые, заложенные в прибор производителем.

Исследования метабопитических показателей у больных с диабетической ретинопатией, старческой дальнозоркостью, глаукомой и миопатпей различной этиологии оценивали:

- по интенсивности свободно-радикального окисления методом хемилюминисценции, индуцированной железом и пероксидом водорода.

- по уровню первичных продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) -диеновых конъюгатов (ДК) и триеновых конъюгатов (ТК) в метанол-гексановой фазе экстракта липидов при длинах волн 232нм и 275нм, а также по содержанию конечных продуктов - оснований Шиффа (0111) методом флуоресценции при длине волны возбуждения 365им и длине волны эмиссии 420нм.

Основное содержание работы.

1. Разработка условий получения, изучение физико-химические свойств комплексных соединений дигидрокверцетина с ионами металлов в водной среде

Нами показано, что растворы дигидрокверцетина (ДКВ) в воде, водно-спиртовых смесях, в медицинских изотонических средах («гемодез», «ацесоль», «хлосоль», физ. раствор), а также в смесях ДКВ с соединениями металлов нестабильны. Концентрация полифенола после выдержки в течение одного месяца в водно-спиртовом растворе уменьшается практически вдвое. Во всех случаях происходит изменение окраски растворов (от бесцветного до желто-коричневого) и появляется желто-коричневый осадок. Исключение в ряду изучаемых соединений

составляет медьсодержащий фермент - церулоплазмин, для которого не наблюдается образование осадка в широком концентрационном интервале в течение днух месяцев.

Наиболее интенсивное взаимодействие ДКВ отмечается для аспарагинатов металлов Са*\ 7л\~*. Си2', Мп2\ Со2+ и Сг1+. При добавлении комплексных солей (в виде водных растворов или кристаллических порошков) в водный раствор ДКВ наблюдается в ряде случаев интенсивное ценообразование и газовыделение, быстрое изменение окраски до желтой или лимонно-желтой, появление желто-коричневых осадков (т=3часа), сопровождающееся снижением рН и поверхностного натяжения (табл.1).

Таблица 1- Свойства реакционных смесей дигидрокверцетина с соединениями металлов: С<|дЮ,=2,(г10"3М; С°ДКВ:С|)М=2:1.; т=1сутки; ^С-комнатная

и/п Соединение металла рН Поверхностное натяжение, у, мН/м Доля ионов металла в растворе, %

начальное конечное начальное конечное

1. №С1* 6,4 6,2 73,0 73,0 100

2. 1^04* 5,2 4,9 74,0 70,0 100

3. СаС12 6,0 5,8 74,0 70,3 95,0

4. Са(Азр)2 5,4 5,0 73,4 53,2 92,0

5. гп(Азр)2 8,0 7,8 70,2 50,2 30,0

6. Си(СН3СОО)2 6,4 6,0 73,4 65,0 25,0

7. Си(А.чр)2 7,2 6,6 74,2 53,8 32,0

8. Церулоплазмин 6,2 6,0 62,4 50,0 100

9. Мп(А5р)2 6,2 5,8 73,4 52,3 87,0

10. Сг(Аяр)3 6,2 5,8 73,5 56,0 81,1

11. Со(А5р)2 6,2 6,0 73,4 62,0 95,0

Примечания: * - - стя = Ш

Снижение рН растворов и поверхностного натяжения (табл. 1) вероятно, обусловлено комплексообразованием ДКВ с ионами металлов и появлением аспарагиновой кислоты, проявляющей поверхностно-активные свойства (рис. 1). Газовыделение при взаимодействии ДКВ и аспарагината цинка, вероятно, связано с образованием по положению 3,4-у-пнроиового цикла, флавонолягных комплексов гп(ДКВ)2, которые катализируют быструю окислительную деструкцию ДКВ до

депсида и СО, аналогично окислению кверцетина флавонолятом меди (И) [Ва^11-Нег§оу1с11 Е., е1 а], 2000].

но.

У "т" /

ОН о-7>

—■дав

ДКВ

А эр

Н+ + Аяр"

он

Д.. , 011

- НА яр

Асшрягиновая кислота ОН

1-, ОН

^Л^ но. ...... „0 ,1

I Г I — г |[ I

у у '«и "<-:о ЧЛс<й

ОН о ¿н

Рисунок ]. Схема взаимодействия ДКВ с испарагинатом цинка.

В ИК-снектрах твердого продукта, образующегося на первой стадии взаимодействия ДКВ и аспарагинага цинка, отмечается сдвиг полосы с V = 1635 см"1 (С=0) до 1604 см"1, что также подтверждает комплексную структуру осадка.

Анализ УФ-спектров поглощения проведен по отношению интенсивности основной полосы поглощения хромоновой группы флавоноида в области 290нм и плеча в области 325нм (К = А290/А325) после соответствующего разбавления. Величина К практически не изменяется в течение недели для водного раствора ДКВ и составляет 3,8±0,4. В отличие от этого, в водно-спиртовой смеси (1:1) интенсивность поглощения плеча 325нм минимальна и К » 3,8±0,4.

УФ-спекгр поглощения темно-коричневой водно-спиртовой жидкой фазы над коричневым осадком, образующимся после двух месяцев хранения на свету насыщенного водно-спиртового раствора ДКВ, существенно отличается от спектра исходного ДКВ (рис. 2 а,б): изменяется вид основной полосы с Хгам=290пм и плеча 325нм, появляется четкая полоса поглощения с >1ПЮ=330им, при этом интенсивность поглощения в области 200-220нм значительно уменьшается (фепольные гидроксилы). Введение чистого ДКВ к темно-коричневому водно-спиртовому раствору приводит к

увеличению поглощения в области 290нм. Полоса поглощения с четким максимумом Х,„и=330нм соответствует продукту окисления хиноидного тина.

Л™ Л„„

X, им

Рисунок 2 а, б, в. УФ спектры поглощения 3,28'10~5М водных к водно-спиртовых растворов ДКВ: I -спиртовый раствор образующегося осадка, полученного после выдержки на свету в течение двух месяцев; 2 - исходный водный раствор; 3 - смесь (1) после добавления ДКВ; 4,5,6 - в присутствии 2п(Азр)2, ДКВ:гп(Азр)2=1:1,5: время реакции: т = 3 мин (кривая 4): т = 1 сутки (кривая 5); х = 6 суток (кривая б).

Характер УФ-спектров поглощения реакционных смесей ДКВ с соединениями металлов зависит от рН раствора, от концентрации и природы соединения металла, ионной силы раствора и от времени взаимодействия компонентов (табл. 2). Так, в кислых средах (рН 1,89 - 3,69) в растворах ДКВ интенсивность поглощения плеча (325 нм) мала (рис. За) и величина К »4,2±0,2 (табл. 2). В нейтральных и щелочных средах с увеличением рН интенсивность поглощения в области 325 нм возрастает (рис. За), а величина К уменьшается до 0,9±0,2 (табл. 2). Появление общей точки пересечения серии спектральных кривых в растворах хлорида натрия - изобестической

точки (рис. 36) при Х=300нм в спектрах растворов ДКВ служит доказательством

существования в растворах двух форм ДКВ. Значение длины волны (ЗООнм) и

интенсивное™ поглощения АОТ„=0,425 в изобестической точке практически совпадает

с точкой пересечения спектральных кривых, полученных в растворах ДКВ при

различных рН универсальной буферной смеси (рис. 36). В спектрах реакционных

смесей ДКВ и аспарагината цинка при изменении молярного соотношения [Zn3+]:flKB

также появляется общая точка пересечения спектральных кривых (рис. Зв). А„„ Л„,„

в универсальной буферной смеси при различных рН: 1 — 1,81; 2 — 3,29; 3 — 6,80; 4 — 9,62; б) в водном растворе хлорида натрия; СшсьМ: I - 0,02М; 2 - 0,09М; 3 - 0,18М; 4 - 0,54М; 5 -1М; в) в присутствии аспарагината цинка: 6 - [Хп2+]:ДКВ = 2:1; 7 - [7лГ+]:ДКВ = 1:1; 8 -[2п2*]:ДКВ =1:2

В спектрах реакционных смесей ДКВ и соединений металлов появляется поглощение в области 400 - 420 им (табл. 2), вероятно, характеризующее комплексы ионов металлов с катехолятной группой ДКВ.

Таблица 2- Условия реакций дигидрокверцетина с соединениями металлов

и оптические свойства реакционных смесей

п/п Соедин. металла Молярн. соотнош. М"+:ДКВ Электронный спектр

нм «желтой» полосы

1. ЫаСП 26,0 1:1 1,1±0,1 (сут.) 400-420

2. Р^О., 26,0 1:1 2,8±0,2 (сут.) 400-420

1,6±0,1 (1 мес.) (ото. полосы погл. 2 мес.) 400-420

3. СаС12 26,0 1:2 4,2±0,2 (3 часа) 400-420

4. Са(Авр)2 26,0 1:2 4,3±0,3 (3 часа) 400-420

4,3±0,3(б сут.) 400-420

6,5 1,5:1 4,2±0,1(3 часа) 400-420

5. гп(А5р)2 26,0 1:2 3,0±0,2 (сут.) 417(инт.)

6,5 1,5:1 1,1±0,2 (сут.) 417(инт.)

6. Си(Азр)з 26,0 1:2 4,4±0,3(3 часа) 417

6,5 1,5:1 2,3±0,1 (сут.)

7. Церулоплазмин 6,5 1:25 - 417

8. Мп(Аар)2 79,0 1:2 4,7*0,2 400-420

6,5 1,5:1 2,7±0,2

9. Сг(А5р)3 26,0 1:2 4,7±0,2 400-420

6,5 1.5:1 4,4±0,2

10. Со(Азр)2 26,0 1:2 4,&±0,3 (3 часа) 400-420

6,5 1,5:1 4,8±0,4 (3 часа)

Таким образом, величину К и А™* в области 400-420 нм можно использовать для анализа на подлинность растворов ДКВ и реакционных смесей с соединениями металлов, в частности с аспарагинатами металлов, поскольку все изучаемые аспарагинаты металлов в выбранной области концентраций были прозрачны в анализируемом диапазоне электронного спектра (280-420 нм).

При избытке аснарагинагов металлов, значения величины К, как правило, уменьшаются но сравнению с исходной величиной К для чистого ДКВ (табл. 2, рис. Зв). Максимальное изменение К. отмечено для реакционной смеси аспарагината цинка и ДКВ - К=1,1±0,2. Низкое значение К обусловлено щелочной средой ДКВ. В слабокислой смеси ДКВ и аспарагината марганца величина К=4,7±0,2 (табл. 2).

Комплексообразование сопровождается окислительно-восстановотельными реакциями в растворах. В спектрах смесей ДКВ и аспарагинатов марганца плечо сдвигается в сторону 333 нм, при этом значение К уменьшается (рис.4), а жидкая фаза становится бесцветной.

К 5

4 3 2 1 О

Рисунок 4. Динамика комплексообразования Ми(А8р)2 с ДКВ.

Изменение окраски раствора характерно для реакций восстановления окрашенных ионов металлов, например, исчезновение фиолетового цвета, характерного для гидратированного [Сг(Н20)6]3+.

Оценка доли окисленного ДКВ (относительная убыль) была проведена методом цианидинхлоридной пробы. Установлено уменьшение концентрации ДКВ от 100% до 50%, а в случае полного обесцвечивания до 10%.

Совместное введение в раствор ДКВ аспарагинатов цинка(П) и хрома(ПГ) при избытке ДКВ (табл. 1) ускоряет процессы обесцвечивания раствора, образования осадка и ценообразования.

Синергизм действия ионов хрома и цинка в окислительных реакциях с ДКВ подтверждается данными по относительной убыли а, % ДКВ. При совместном присутствии аспарагинатов цинка и хрома а составляет 10%, в аналогичных условиях в присутствии только одного из аспарагинатов а - не менее 50%.

2. Прогнозирование свойств минерало-биотичсских комплексов с использованием моделей мембранных систем

Характер взаимодействия комплексов «ДКВ - аспарагииаты металлов» с липидными и гидрофильными фрагментами биомембрапы изучен методом

15'(1:3) 15'(1,5:1) 7 дней (1,5:1) 10 днай (1,5:1)

молекулярной фармации на искусственных моделях, в качестве последних использованы ленгмюровские монослои лецитина и жирных кисло']1 на границе раздела «вода-воздух».

Нерастворимые монослои на водной поверхности (субфазе) получают нанесением известного количества лецитина или жирной кислоты в хлороформе на водную поверхность. Анализируют зависимость тс=Г(Ао), измеряя площадь поверхности А при сжатии монослоя и возникающее при этом поверхностное давление л, равное (уо-у), где у0 и у - поверхностное натяжение на границе раздела воздух- вода без моиослоя и с мопослоем вещества, соответственно.

Аналитической характеристикой изотерм сжатия монослоев я = Г(А0) является величина молекулярной площади Ар, равная площади одной молекулы в плотно-упакованном монослое. А0 рассчитывают экстраполяцией кривой я=1"(А) в точку л=0.

В качестве субфазы при формировании ленгмюровских монослоев использованы водные растворы ДКВ и асиарагинатов металлов (СдКВ=2-^5'10"5М).

На рисунке 5 представлена изотерма сжатия тг=Г(А0) монослоя лецитина на водной субфазе (кривая I ). Экстраполяционная величина А0 (при 7г=0) лецитина равна 0,54±0,02 нм2/молекула.

№ Субфаза Ац, нм

1 гьо 0,54(±0,02)

2 ДКВ, С-5'10"1, М 0,60(±0,02)

3 Ст(Аяр)з С^г-10"4 м 0,63(±0,02)

4 СКАярЪ + ДКВ 0,83(±0,02)

5 гщлярь, оя-кг'м 0,70(±0,02)

6 2п(Л.чр)2+ ДКВ 0,92(±0,03)

7 Анр)2+Ст( АврЬ + ДКВ 0,89(±0,03)

Рисунок 5 а, б. Изотермы сжатия я=Г(А(1) моноспоя лецитина над водной субфачой

15

В присутствии аспарагинатов металлов молекулярная площадь А0 лецитина изменяется с 0,54±0,02 им2/молекула (субфаза - вода) до 0,63±0,02 им2/молскула (субфаза - водный раствор 2i0"4M Cr(Asp)3) и до 0,70±0,02 им2/молеку.1Ш (еубфнзи -водный раствор 2iO"sM Zn(Asp)2) (рис. 5 а,б). Установлено аналогичное влияние катионов других металлов в аспарагинатах на А0 лецитина. Эффективность воздействия аспарагинатов металлов увеличивается в ряду:

Ca(Asp)f= Mn(Asp)2 < Cr(Asp)3 < Cu(Asp)2 ~ Zn(Asp)2 A0j нм" 0,62 0,63 0,70

При совместном присутствии ДКВ и аспарагинатов металлов в субфазе молекулярная площадь А0 лецитина существенно увеличивается до 0,83±0,03 им2/молскула (субфаза - водный раствор ДКВ с Cr(Asp)3) (рис. 5а), до 0,90±0,03нм2/молекула (субфаза - водный раствор ДКВ с Zn(Asp)2) (рис. 56). Установлено сопоставимое увеличение А0 лецитина в моиослое над смесями ДКВ и аспарагинатов Са2+, Си2+, Мп2+ (А0= 0,86±0,05 нм3/молекула).

Полученные результаты свидетельствуют об иммобилизации в монослой лецитина составляющих комплекса (явление пенетрации), причем ДКВ значительно усиливает пенетрацию, а, следовательно, и проницаемость аспарагинатов металлов в липидные фрагменты биомембран.

Отмечено усиление пенетрации аспарагинатов металлов в гидрофильную мембрану в присутствии ДКВ. Этот эффект изучен на монослоях пальмитиновой (С|6) и арахиновой (С2о) кислот - моделях гидрофильного фрагмента биомембраны. Молекулярная площадь А0 не зависит от природы кислоты, образующей монослой: А0 = 0,205±0,001. На примере субфазы, содержащей соединения меди установлено, что А0 монослоен жирных кислот над водным раствором Си(ООССН3Ь меньше, чем над водным раствором Cu(Asp)¡. Совместное введение ДКВ и аспаршшшта меди в субфазу увеличивает молекулярную площадь, занимаемую карбоксильной группой в моиослое (А0 увеличивается до 0.320 им2) (рис. 6).

№ кривой Состав субфазы. рН Ао±0,001, нм"/молекула

1 Вода, рИ 6,0 0,205

2 |Си(СНзСОО)2] = 1,75- 10°М, рН 5,8 0,180

3 [ДКВ] = 1,75-10_5М, рН 5,6 0,250

4 СЩАярЬ = 1,75- 10"5М, рН 5,8 0.250

5 Смесь [ДКВ] = 1,75-10'5М с [Си(СМзСОО)21 = 1,75- 10"5М, рН 5,6 0,220; 0,320

6 Смесь [ДКВ]= 1,75-10"5Мс 0.220

[Си(Авр)21 = 1,75-10"5М, рН 5,8 0.320

Рисунок б а, б. я-Ац - изотермы монослоя арахиновой кислоты, полученные на субфазах Проведено сравнение воздействия ДКВ и лекарственного вещества, имеющего хромоновый цикл - хромогликата натрия Влияние ионов металлов, как в

составе неорганических солей, так и в аспарагннате на состояние монослоев пальмитиновой кислоты в присутствии хромогликата натрия и ДКВ представлено на рисунке 7.

А0, А'/молекула

Рисунок 7. Молекулярная площадь А» пальмитиновой кислоты в монослоях над субфазой, содержащей лекарственный вещества и соли металлов

Резкое уменьшение (на 30 %) молекулярной площади Л„ под влиянием ионов щелочноземельных метшшов Си*' и Му"', вероятно. обусловлено поверхностным мицеллирошшием жирно-кислотных мопослоен и отсутствии лекарственных веществ (рис.7). При совместном действии попов щелочноземельных металлов и лекарственных веществ, отмечается стабилизация состояния монослоев жирной кислоты (Ло близко к исходному значению), при этом действие Д1СВ более «мягкое».

Ионы переходных металлов иммобилизуются монослоем пальмитиновой кислоты. Действие лекарственных веществ усиливает этот эффект. Д1СВ в присутствии ионов цинка также проявляет стабилизирующее действие.

3. Разработка минерало-биотнчсскнх комплексов ДКВ и аснарагинптов

металлов

Слабокислая среда способствует процессам восстановления возможных продуктов ДКВ хиноидного типа за счет и-дефекто» поды в капиллярах [Домрачев Г.А., Доклады АН, 2005] и. соответственно, восстановлению аптиоксидаитпой функции ДКВ. Ионы металлов, а также аскорбиновая кислота способствуют сохранению окислительно-восстановительного равновесия в живой системе, содержащей флавоиоид, ион металла и аскорбиновую кислоту.

Нами предложено три состава минерало-бнотичееких комплексов, включающих одновременно дигидрокверцетин. аспарагинаты металлов (Са2', 7лг\ С,г'+, Мп2+) и аскорбиновую кислоту. Количество основных действующих веществ в капсуле приведено в таблице 3.

Таблица 3 - Предлагаемые составы БАД

№ га, мг Фармакологические свойства

ДКВ М(Азр)„ АК

1 20,0 Са(АзрЬ-10,00 30,0 Восполнение дефицита кальция, прот11т>шшщ'нческо1М^)едет1ю

2 100,0 Мп(А,чр)> - 2,50 40,0 Профилактика и лечение сердечно-сосудистых заболевании, антнокепдшп'

3 15,0 2и(АйрЬ- 2,50 Ст(Аяр)д - 0,03 30,0 Лечение чаболеиашш чртильмого шпшрата

Масса содержимого одной капсулы 324,0 мг, наполнитель - лактоза. Спецификация Офтальвита представлена н таблице 4.

Таблица 4 - Спецификация «Офтальвит» капсулы желудочно-резистентные

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Твердые капсулы желтого цвета, цилиндрическом формы с полусферическими концами, почти без запаха. Поверхность гладкая, без повреждений и видимых воздушных и механических включений. Содержимое капсулы - мелкокристаллический порошок кремово-белого цвета, практически без запаха.

Средняя масса и отклонение от средней массы ГФ XI 324 мг ±5% Отклонение в массе содержимого каждой капсулы от средней соответствует требованиям ГФ XI

Подлинность 1. Аспарагинат-ион 2.Катион цинка 3.Катион хрома 4. ДКВ 5. Кислота аскорбиновая Реакция с ниигидрином АЭС ИСП АЭС ИСП тех, ИК спектроскопия (4400-650см"1), ВЭЖХ Цианидии-хлоридная проба ВЭЖХ Сине-фиолетовое окрашивание Линии совпадают со стандартами цинка и хрома Соответствие приведенным Rr Соответствие приведенному ИК спектру Время удерживания пика ДКВ должны совпадать с временем удерживания па хроматограмме PCO Малиновое окрашиваиие Время удерживания пика аскорбиновой кислоты должно совпадать с временем удерживания па хроматограмме PCO

Количественное определение 1. Аспарагинат цинка 2. ДКВ 3. Кислота аскорбиновая Трилонометрия ВЭЖХ ВЭЖХ 2,5 мг ±10%/на капсулу 15,0 мг 7,5%/на капсулу 30,0 мг ±7,5%/на капсулу

Сульфатная зола ГФ XI Не более 0,1% из 1г

Микробиологическая чистота ГФ XI Препарат должен выдерживать требования по микробиологической чистоте для нестерильных лекарственных средств

Расттдаемоеть ГФ XI Не более 60 мин

Растворение ГФ XI Не менее 75% за 45 мин

Упаковка По 10 капсул в контурной ячейковой упаковке (блистере). По 2 блистера вместе с инструкцией по применению в картонной коробке

Маркировка В соответствии с НД

Хранение В сухом, прохладном и защищенном от света месте

Срок годности 2 года

В результате проведенных клииико-лабораторпых исследований и анализа литературных данных но дозам микроэлементов предложенный нами состав 3 (табл 3) минерало-биотичеекого комплекса для лечения заболеваний зрительного аппарата зарегистрирован под товарным знаком «Офтальлит» НИИ «Росбиопром». г. Саров Нижегородской области.

Клияико-лабораторная оценка предлагаемого минерало-биотичеекого комплекса «Офтальвит» подтвердила его эффективность при лечении больных с заболеванием глаз. У больных, принимавших предлагаемый комплекс в течение 20 дней по 5 капсул в день, средние уровни показателей хемилюминограм.мы не отличались от нормы (табл. 5).

Таблица 5 - Показатели свободно-радикального окисления по данным хемилюминесценции у больных, принимавших "Офтальвит", по сравнению с

контролем

Группы 1тах, тУ 8, т V 1/8 tg2a

Контроль До лечения После лечения 0,897 ±0,02 14,54±1,45 0,061 ±0,012 -0,171± 0,010

0,85б±0,37 15,81±2,81 0,054±0,012 -0,167 ±0,012

Офтальвит До лечения После лечения 0,961 ±0,025 13,6±1,31 0,071±0,011 -0,149± 0,011

1,29±0,059 15,01±2,31 0,075±0,01 -0,230± 0,010

• - достоверность различии по сравнению с состоянием больных до лечения (р < 0,05)

Наблюдалось достоверное снижение первичных продуктов ПОЛ - диеновых (ДК) и триеновых (ТК) конъюгатов па 24% и 41%, соответственно (табл. 6).

Таблица б - Показатели перскисного окисления липндов у больных, принимавших "Офтальвит", по сравнению с контролем

Группы Показатели перскисного окисления лигшдов (ПОЛ)

ДК ТК ОШ

Контроль До лечения После лечения 0,201 ±0,016 0.031 ±0,003 3,18±0,65

0,188± 0,013 0,0371- 0,001 4,11±1,10

Офтальвит До лечения После лечения 0,210± 0,011 0,041±0.002 4.24:0,69

0,160+0,011* 0,023^-0,01* 2.17+0,51*

*- достоверность различия по сравнению с состоянием больных до лечения ( р <0,05).

Концентрация конечных продуктов ПОЛ - оснований Шиффа (ОШ) в конце курса приема препарата но сравнению с контрольной группой снизилось на 46%. Стандартная терапия, проводимая в группе контроля, подобного улучшения антиоксидантного статуса не дала.

Выраженный положительный эффект минерало-биотического комплекса при лечении больных с заболеванием глаз можно объяснить не только известными антиокеидантными свойствами микроэлементов цинка и хрома, но и их комплексным воздействием на организм человека.

Выводы:

1. Методами потенциометрии, электронной спектроскопии, тензиометрии, спектрофотоколориметрических анализов ионов металлов и дигидрокверцетина изучены условия окислительной деструкции дигидрокверцетина в присутствии ионов Ыа+, К+, Са2+, Си2\ Со2+, 2п2+, Сг3+, Мп2\ а также образование и свойства комплексных соединений дигидрокверцетина с ионами металлов. Показано, что комплексообразование и деструкция зависят от рН среды, концентрации, природы соединения металла, ионной силы раствора, действия света и от времени взаимодействия компонентов в водной среде. Наиболее интенсивно этот процесс проходит в присутствии аспарагинатов металлов. Комплексообразование дигидрокверцетина с ионами металлов вссгда предшествует окислительной деструкции.

2. Предложены методы анализа компонентов комплекса. Мерой гсомплексообразования является величина К, равная отношению Агчо цМ/Аз25 а также появлению новой полосы поглощения в области 400-420 им.

3. Доказана стабилизация аскорбиновой кислотой компонентов минерало-биотического комплекса в твердом состоянии и в растворе.

4. На моделях линофильиого и гидрофильного фрагментов биомембран, в качестве которых были использованы ленгмюровские монослои лецитина и жирной кислоты (арахиновой и пальмитиновой) изучено взаимодействие монослоев с компонентами комплексов. Наибольшее увеличение молекулярной площади А0 лецитина (с 0.54±0.02 до 0.86±0.05 нм2) и жирной кислоты (с 0.205±0.001 до 0.320:1:0.008 им2) характеризует эффективную иммобилизацию монослоями компонентов раствора.

высокую проницаемость как через гидрофильные ионные поры, так и через липидиые бислои биомембран.

5. Сравнение влияния дигидрокверцетина и хромогликата натрия па моделе гидрофильной пальмитиновой кислоты показало более «мягкое» действие дигидрокверцетина по стабилизации биомембраны.

6. Обоснован состав БАД - минерало-биотического комплекса, включающего дигидрокверцетин, аспарагинаты цинка и хрома, аскорбиновую кислоту, зарегистрированный под товарным знаком «Офтальвит». Его эффективность доказана клиническими испытаниями в офтальмологическом отделении городской клинической больницы № 35 г. Нижнего Новгорода. Доказано, что в присутствии аспарагинатов хрома и цинка не только увеличивается антиоксидантная активность дигидрокверцетина, но и улучшается кровоснабжение нервозрительного аппарата при диабетической ретинопатии.

7. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия на лекарственный препарат «Офтальвит».

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мельникова, Н.Б. Опыт первичного скрининга лекарственных веществ на моделях биомембран. Механизм действия и практические рекомендации / II.Б. Мельникова, И.А Пегова, С.В.Кононова // Рациональное использование лекарств: Тезисы докладов Российской научно-практической конференции. — Пермь, 2004. — С.35

2. Мельникова, Н.Б, Прогнозирование свойств лекарственных веществ с использованием моделей мембранных систем / Н.Б. Мельникова, И.А. Пегова, О.В. Бирюкова, C.B. Кононова, Е.Г. Кочнева // Ремедиум. — 2005.- № 6. — С. 44-45.

3. Пегова, И.А. Минерал о-биотические комплексы дигидрокверцетин -аспарагинаты металлов / Пегова И.А., Кононова C.B., Мельникова Н.Б. // V Всероссийский научный семинар и Молодежная школа «Химия и медицина». Сборник тезисов докладов «Новые лекарственные средства: успехи и перспективы».—Уфа, 2005,—С. 142-143.

4. Melnikova, N.B. Mineral-biotic complexes "üihydroquercetine - Asparaginates of metáis" / 1.,. Domralcheva l.vova, N.B. Melnikova, Г.А. Pegova, S.V. Kononova, G. Domraehev // International Conferenoe "From molecules lowards materials". — Nizhny Novgorod, Russia, 2005/P- 76.

5. Иегова, И.А. Пепетрация аспарагинатов хрома и цинка в липидный фрагмент биомембран в присутствии дигидрокверцетина / И.А. Пегова // Межвузовская конференция молодых ученых «Аспирантские чтения - 2006». — Самара, 2006,— С. 264-268.

6. Domratcheva Lvova, L. Efecto de dihidroquercetina y sus complejos en las isotermas de presión de monoeapas de Langmuir / L. Domratcheva Lvova , N.B. Melnikova, J.G. Rutiaga-Quiñones, I.A. Pegova, S.V. Kononova, G.A. Domraehev // 2° foro académico nacional de Ingenierías y Arquitectura - Morelia, Michoacán, México, 2Ü06/P.— 357360.

7. Мельникова, II.К. Фармацевтическая совместимость и синергизм действия дигидрокверцетина и аспарагината цинка / Н.Б. Мельникова, И.А. Пегова, А.А. Волков, О.В. Кольчик // Казанский медицинский журнал. — 2007. - № 5.—С. 345348.

Автор выражает благодарность:

научному консультанту зав. кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии, д.х.и., профессору Мельниковой Нине Борисовне за неоценимую помощь и постоянное внимание к данной работе;

- сотрудникам Г1Г1П «Росбиопром» Киселеву Павлу Борисовичу и Лапину Александру Юрьевичу за содействие в разработке минерало-биотического комплекса «Офтальвит»;

- зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики, д.б.н., профессору Конторщиконой Клавдии Николаевне за проведение биохимических исследований.

ПЕГОВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

РАЗРАБОТКА МИНЕРАЛО-БИОТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ «ДИГИДРОКВЕРЦЕТИН - АСПАРАГИНАТЫ МЕТАЛЛОВ»

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати Формат бумаги 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г. Нижний Новгород, ул. Трудовая, 6. Лиц. сер. ПД №18-01150 от 08.02.2002 г. Тел.: 436-86-40