Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антиоксидантная и противовоспалительная активность новых производных дигидрокверцетина и их водорастворимых форм

На гтавах рукописи

Роговский Владимир Станиславович

Антиоксидаитная и противовоспалительная активность новых производных дигидрокверцетина и их водорастворимых форм

14.03.06 - «Фармакология, клиническая фармакология» (мед. науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 - т т

Москва-2014

005549416

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России)

Научный руководитель:

Д.м.н., чл.-корр. РАМН, профессор ШИМАНОВСКИЙ Николай Львович Официальные оппоненты:

ВОРОНИНА Татьяна Александровна - доктор медицинских наук, профессор (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, лаборатория психофармакологии, заведующая лабораторией)

ШВАРЦ Геннадий Яковлевич - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра патологии человека, профессор кафедры)

Ведущая организация:

ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН

Защита состоится « I 2 » О б 2014 г. в \0 часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.01., созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20 стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) и на сайте http://dissov.msmsu.ru/

Автореферат разослан I _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Лобанова Елена Георгиевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

Производные дигидрокверцетина (ПДГК) - флавоноиды, обладающие значительной антиоксидантной активностью и по химическому строению близкие к дигидрокверцетину. ПДГК представляют значительный научный интерес благодаря своей низкой токсичности (Шкаренков А.А. и др., 1998; Tapas et al., 2008) и ряду ценных фармакологических свойств, обладая противовоспалительным (Garcia-Lafuente A. et al., 2009), антиатеросклеротическим, антигипертензивным и другими эффектами (Perez-Vizcaino F., et al., 2009).

Также важна возможность антиоксидантов, в том числе дигидрокверцетина, предотвращать окисление белков. Белки, подвергнутые окислительной модификации, накапливаются в организме с возрастом, а также при различных заболеваниях (например, сахарный диабет) (Иванова И.П. и др., 2011). Однако до настоящего времени способность дигидрокверцетина и его производных оказывать влияние на окисление белков не была изучена, хотя такие исследования могут расширить обоснования применения ПДГК для терапии широкого спектра заболеваний, в патогенезе которых значительную роль играет повышенное окисление липидов и белков. ПДГК являются липидорастворимыми соединениями, что ограничивает их биодоступность. В настоящее время синтезируются новые производные дигидрокверцетина с целью создания соединений с большей сбалансированностью свойств (обладающих высокой антиоксидантной активностью при достаточной водорастворимости) (Коротеев A.M. и др., 2009).

Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности скрининга новых производных дигидрокверцетина и изучения их антиоксидантной и противовоспалительной активности.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение антиоксидантной и противовоспалительной активности новых производных дигидрокверцетина и их водорастворимых форм.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи.

1. Провести исследование антиоксидантной активности новых производных дигидрокверцетина методом Ре2+-индуцированной хемилюминесценции и методом АБТС-теста. Отобрать наиболее перспективные соединения для дальнейшего изучения.

2. Оценить сохранность антиоксидантных свойств ПДГК при образовании их водорастворимых форм (формировании комплексов включения в циклодекстрин).

3. Оценить цитотоксичность исследуемых ПДГК на культуре клеток с помощью МТТ-теста.

4. Провести исследование влияния дигидрокверцетина и его перспективных производных на окисление белков плазмы крови на модели озон-индуцированного окисления фибриногена.

5. Провести исследование противовоспалительной активности дигидрокверцетина и его перспективных производных на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши.

Научная новизна

Впервые проведено исследование антиоксидантной активности новых производных дигидрокверцетина, в том числе новых водорастворимых форм. Установлено, что производное дигидрокверцетина КН-14 " (6-[(дивторбутиламино)метил]-ДГК) обладает антиоксидантной активностью, большей, чем у нативного дигидрокверцетина (ДГК). Выявлено, что образование водорастворимых форм ДГК и его производных путем синтеза комплекса включения данных соединений в циклодекстриновую оболочку не оказывает значительного влияния на их антиоксидантную активность.

Впервые показано, что нативный дигидрокверцетин и водорастворимые формы ДПК и КН-14 (комплексы включения в циклодекстрин) обладают протективной активностью в отношении окисления озона фибриногеном, в значительной степени сохраняя нативные свойства фибриногена после окисления озоном. Также на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши впервые выявлена выраженная противовоспалительная активность ДГК и КН-14, сопоставимая с противовоспалительной активностью нестероидных противовоспалительных средств.

Практическая значимость работы

Выявленные фармакологические эффекты дигидрокверцетина и его новых производных открывают перспективы для их более эффективного клинического применения. Установление факта, что образование водорастворимых форм дигидрокверцетина и его производного КН-14 не уменьшает их антиоксидантную активность и не ослабляет другие фармакологические эффекты, создает основу для дальнейшего доклинического изучения данных соединений и создания инъекционных лекарственных форм. Также выявленная способность дигидрокверцетина и его производного КН-14 блокировать окисление фибриногена открывает перспективы использования данных соединений для профилактики и лечения нарушений свертывающей системы крови, возникающих вследствие оксидантного стресса.

Положения, выносимые на защиту

1. К наиболее перспективным для дальнейшего изучения ПДГК, помимо нативного дигидрокверцетина, относятся КН-14, КН-14-ЦЦ и ДГК-ЦЦ, обладающие выраженной антиоксидантной активностью (АОА) в различных моделях. АОА соединения КН-14 превышает АОА ДГК. При включении ПДГК в циклодекстриновую оболочку, придающую им гидрофильные свойства, антиоксидантные свойства данных соединений сохраняются.

2. Дигидрокверцетин и его производные, КН-14 и КН-14-ЦД, препятствуют окислительному повреждению фибриногена in vitro, сохраняя его нативные свойства.

3. Дигидрокверцетин и его производное КН-14 в нативной и водорастворимой форме обладают выраженной противовоспалительной активностью на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены в виде докладов и публикации тезисов на научных конгрессах и конференциях, среди которых Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 2011, XII международная молодежная конференция ИБХФ РАН «Биохимическая физика» 2012, VIII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых 2013. Диссертационная работа апробирована 15 мая 2013 г. на совместном заседании кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика РАМН П.В. Сергеева, кафедры фармакологии, кафедры физики и медицинской электроники МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 7 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России (4 статей и 3 тезисов).

Личный вклад

Автор самостоятельно проводил работы по исследованию антиоксидантной и противовоспалительной активности изучаемых соединений. Проведены эксперименты по изучению влияния исследуемых соединений на окисление фибриногена и на пролиферацию культивируемых клеток, обработка и статистический анализ полученных данных. Публикации

по теме настоящей работы подготовлены непосредственно автором диссертации.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4х глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 156 источников. Работа выполнена на 137 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 11 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалами исследования являются нативный дигидрокверцетин и его производные, синтезированные на кафедре органической химии Московского педагогического государственного университета (заведующий кафедрой член-корр. РАН, проф. Нифантьев Э.Е.), а также водорастворимые формы данных соединений (комплексы включения в 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрин, далее циклодекстрин) (Таблица 1).

Таблица 1.

Код Название соединения

ДГК Дигидрокверцетин

ДГК-ЦД Комплекс включения ДГК в циклодекстрин

КН-1 3,3,4,7-тетра-0-ацетил-2,3-ДГК

КН-2 3,3,4,5,7-пента-0-ацетил-2,3-ДГК

кн-з 3,3', 4,5,7-пента-0-бензоил-2,3-ДГК

КН-4 3,3,4,5,7-пента-0-(4"-нитробензоил)-2,3-ДГК

КН-5 3,3,4,5,7-пента-0-[ 1 "-(4"-изобутилфенил)пропионил]-2,3-ДГК

КН-6 3,3,4,5,7-пента-0-ацетилсалицил-2,3-ДГК

КН-7 3,3 , 4',5,7-пента-0-никотиноил-2,3-ДГК

КН-9 3', 4,5,7-тетра-0-бензил-2,3-ДГК

КН-14 6-[(дивторбутиламино)метил]-ДГК

КН-14-ЦД Комплекс включения КН-14 в циклодекстрин

Примечание. Содержание основных компонентов выше 98%.

Циклодекстрин (ЦД), (рис. 1), представляет собой циклический олигомер глюкозы, приближенно имеющий форму тора. Внутренняя полость

циклодекстринов обладает гидрофобными свойствами, таким образом, циклодекстрины способны образовывать водорастворимые комплексы включения гидрофобных соединений. Водорастворимость ДГК-ЦЦ, по сравнению со свободным ДГК (0,3 г/л), значительно увеличивается и составляет 53,2 г/л ( A.M. и др., 2009).

А. Структурная формула Р-циклодекстрина

ОН О

Б. Структурная формула ДГК

сн I || он

Ьн о f!i—сн —сн

II

СН—сн сн

I

сн.

В. Структурная формула КН-14

Рис. 1. Структурные формулы изучаемых соединений.

Исследование антиоксидантной активности

Исследование антиоксидантной активности проводилось хемилюминесцентным методом и с помощью АБТС-теста.

Хемилюминесцентный метод применялся на модели гомогената мозга крысы (Миронов А.Н. и др., 2012; Казаков В.П., 1980). Реакционная смесь содержала гомогенат мозга (1 мл), фосфатный буфер (рН=7,4, 7 мл), раствор эозина (1 мл), исследуемое соединение либо растворитель в качестве контроля (0,1 мл). Хемилюминесценция индуцировалась введением раствора ионов Fe2+. АБТС-тест (деколоризационный метод) основан на измерении

7

оптической плотности раствора стабильных катион-радикалов АБТС'+. Оптическая плотность данного раствора уменьшается при добавлении к нему соединений, обладающих антиоксидантной активностью. Раствор катион-радикалов АБТС'+ получали по методу Ре (Ке Я. е1 а1., 1999). По результатам применения обоих методов рассчитывалась антиоксидантная активность (АОА), численно равная обратной концентрации антиоксиданта, при которой происходит уменьшение амплитуды медленной вспышки кривой хемилюминесценции или уменьшение оптической плотности раствора АБТС** на 50%. В качестве контроля был использован раствор диметилсульфоксида (ДМСО), в котором растворялись изучаемые соединения, обладающие преимущественно липофильными свойствами. Для каждого соединения проводилось не менее трех измерений исследуемых концентраций.

Исследование влияния производных дигидрокверцетина на жизнеспособность культивируемых клеток

Исследование влияния ПДГК на жизнеспособность клеток проводилось на культуре фибробластов кожи новорожденных крысят в среде инкубации 1)МЕМ. Концентрации ПДГК в среде инкубации составляли 1,0; 0,1; 0,01 мг/мл. Максимальная концентрация растворителя (ДМСО) в среде составила 1% (при внесении 1 мг/мл образца) и достоверно не влияла на жизнеспособность клеток. Инкубировали планшеты в течение 48 часов. По окончании инкубации воздействие ПДГК на клеточный рост определяли микроколориметрическим методом при помощи МТТ-теста, который является стандартным для оценки токсичности соединений в культуре клеток (Миронов А.Н. и др., 2012).

Оценка влияния дигидрокверцетина и его производных на окисление фибриногена озоном

В данной работе проводилось окисление раствора фибриногена в стандартных условиях (Розенфельд М.А. и др., 2010), а также в присутствии нативного дигидрокверцетина и комплексов включения дигидрокверцетина и

КН-14 в ЦЦ. Полученный фибриноген переводили методом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-25 в 0.06 М фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 0,15 М NaCl. В качестве окислителя использовался озон, который является чрезвычайно удобным для проведения исследований в модельных системах. Время его полужизни в водных растворах при наличии субстрата окисления не превышает 1-2 мин. Степень окисления объекта строго регулируется, поскольку количество озона, реагирующего с восстановителем, точно оценивается спектрофотометрически при длине волны 254 нм.

Оценка нативных свойств фибриногена, как до, так и после окисления озоном, проводилась с помощью определения времени образования фибринового сгустка после добавления тромбина ("Roche", Франция) в раствор фибриногена. Раствор тромбина объемом 0,05 мл (2,5 ед. NIH) добавлялся к 0,3 мл исследуемой пробы (1,87 мг\мл фибриногена) (Розенфельд М.А. и др., 2008).

Изучение противовоспалительной активности

Для изучения противовоспалительной активности исследуемых

соединений была использована модель каррагенан-индуцированного отека

лапки мыши (Morris Р., 2003; Winter С. et al., 1962). При введении каррагенана

развивается процесс воспаления, характеризующийся выраженным отеком,

обусловленным высвобождением гистамина, серотонина и простагландинов

(Di Rosa М. et al., 1971; Silva F. R. F. et al., 2009). Исследование проводилось

на белых нелинейных мышах-самцах, весом 20-25 грамм. В правую заднюю

лапку животных субплантарно (в область пяточного апоневроза) вводился 1%

раствор каррагенана (в физиологическом растворе) объемом 0,05 мл.

Воспаление оценивалось по увеличению толщины лапки через 3 часа после

введения каррагенана. Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно в

дозах 0,02 ммоль/кг, 0,04 ммоль/кг и 0,16 ммоль/кг, за 30 минут до введения

каррагенана. Доза 0,16 ммоль/кг (соответствует 50 мг/кг ДГК) является одной

из наиболее часто применяемых доз для исследования флавоноидов, в том

9

числе ПДГК (ШсЬсШ 8. е1 а1., 2011; Ри Р. е1 а1., 2007). В качестве препарата сравнения использовался диклофенак натрия в дозе 0,02 ммоль/кг (Сафронов Д.Ю. и др., 2011).

Статистический анализ полученных результатов Точное установление вида закона распределения генеральных совокупностей в данной работе представлялось затруднительным в связи с малым объемом выборок. Вследствие этого для оценки значимости различий были использованы непараметрические критерии (критерий Краскела-Уоллеса для множественных сравнений и критерий Манна-Уитни для парных сравнений), независящие от вида закона распределения. Различия считались статистически значимыми при р<0,5.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение антиоксидантной активности новых производных дигидрокверцетина

Нами проведено скрининговое исследование антиоксидантной активности изучаемых соединений хемилюминесцентным методом и АБТС-тестом. Основным механизмом АОА ПДГК является связывание со свободными радикалами, а также хелатирующая способность данных соединений по отношению к ионам Ре2+ (Бабенкова И.В. и др., 2003). АБТС-тест позволяет непосредственно определить способность антиоксиданта к взаимодействию с радикалами (АБТС>+).

Оценка антиоксидантных свойств исследуемых соединений с помощью хемилюминесцентного метода

В используемом методе величина амплитуды медленной вспышки хемилюминесценции отражает интенсивность процессов перекисного окисления.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, нативный дигидрокверцетин, КН-14, КН-14-ЦЦ, ДГК-ЦД обладают значительной

ю

способностью ингибировать процесс Ре2+-индуцированной хемилюминесценции в гомогенате мозга крыс.

Таблица 2. Влияние производных дигидрокверцетина на амплитуду медленной вспышки кривой Ре2+-индуцированной хемилюминесценции гомогената мозга крысы.

Изучаемое соединение Растворитель ДН, %

Контроль дмсо 0

ДГК дмсо 100

ДГК-ЦЦ Вода 100

КН-1 дмсо 70 ± 1

КН-2 дмсо 26 ±3

КН-3 дмсо 13 ±8

КН-4 дмсо 20 ±9

КН-6 дмсо 9 ± 5

КН-7 дмсо 60 ±5

КН-9 дмсо 27 ±12

КН-14 дмсо 100

КН-14-ЦД Вода 100

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартных

*

ошибок среднего (М ± з.е.т.). - различия с контролем статистически значимы (р < 0,05). Концентрация изучаемых соединений 10"4 М. (ДН -уменьшение амплитуды медленной вспышки по отношению к контролю, %).

Для соединений, показавших в концентрации 10"4 М ингибирование медленной вспышки кривой хемилюминесценции на 100%, нами были построены концентрационные кривые (рис. 2) и вычислена их антиоксидантная активность, численно равная обратной концентрации антиоксиданта, при которой происходит уменьшение амплитуды медленной вспышки кривой хемилюминесценции на 50%.

Согласно анализу полученных данных, приведенных на рисунке 2, антиоксидантная активность аминометилированного производного дигидрокверцетина и нативного дигидрокверцетина в условиях метода

Ре2+-индуцированной хемилюминесценции составляет 0,053 мкМ'1 и 0,045 мкМ"1 (табл. 3). Комплексы включения ДГК и КН-14 в циклодекстрин также обладают выраженной антиоксидантной активностью, хотя и несколько меньшей, чем нативные соединения (статистически значимые отличия проявляются только в максимальной концентрации - 50 мкМ). Уменьшение антиоксидантной активности исследуемых соединений после их включения в циклодекстрин может быть объяснено экранировкой части ОН-групп, участвующих в реализации антиоксидантного эффекта.

Рис. 2. Влияние исследуемых соединений на амплитуду медленной вспышки Ре2+-индуцированной хемилюминесценции. ДН - уменьшение амплитуды по сравнению с контролем, %.

Оценка антиоксидантных свойств исследуемых соединений с помощью АБТС-теста

Антиоксидантные свойства ДГК, КН-14 и комплексов их включений в ЦЦ были оценены также с помощью АБТС-теста (рис. 3). Антиоксидантная активность ДГК и КН-14 в условиях АБТС-теста составила 0,087 мкМ"1 и 0,1 мкМ*' (табл. 3). Антиоксидантная активность комплексов включений в циклодекстрин в данном методе также является несколько меньшей, чем у нативных соединений, как и в условиях хемилюминесцентного метода. В

условиях АБТС-теста статистически значимые различия между АОА ДГК и КН-14 и их комплексами включения в ЦД проявляются только в концентрации 15 мкМ и при этом не превышают 20%. Таким образом, образование водорастворимых комплексов включения ДГК-ЦД и КН-14-ЦД сохраняет антиоксидантную активность исходных соединений.

«ДГК ■ ДГК-ЦД * КН-14 X КН-14-ЦД

С, мкМ

Рис. 3. Влияние исследуемых соединений на оптическую плотность раствора катион-радикалов АБТС. АО - уменьшение оптической плотности по сравнению с контролем, %.

Таблица 3. Антиоксидантная активность исследуемых соединений, мкМ'1

ДГК ДГК-ЦД КН-14 КН-14-ЦД Эстрадиол

Хемилюминесцентный 0,045 0,031 0,053 0,036 0,150

АБТС-тест 0,087 0,074 0,100 0,083 0,280

Также нами была оценена АОА препарата сравнения - эстрадиола. Во всех концентрациях, в условиях обоих использованных методов, эстрадиол показал статистически значимо более выраженные антиоксидантные свойства, чем ПДГК, однако, следует учитывать, что эстрадиол присутствует в плазме крови в низких концентрациях, недостаточных для проявления его антиоксидантных свойств (Rosano G. et al., 1997). В то же время ПДГК

способны накапливаться в плазме крови в концентрациях до 10 мкМ, при которых проявляется их АОА (ЬакЬапра1 Р. е! а1., 2007).

В настоящем исследовании КН-14 в концентрациях 10 мкМ, 15 мкМ и 20 мкМ проявил статистически значимо больший антиоксидантный эффект по сравнению с ДГК. Наиболее перспективными для дальнейшего изучения фармакологических свойств являются, наряду с нативным дигидрокверцетином, соединение КН-14, а также водорастворимые формы ДГК и КН-14 (рис. 1).

Влияние ПДГК на жизнеспособность культивируемых клеток

Для оценки токсичности исследуемых соединений нами с помощью МТТ-теста была оценена жизнеспособность клеток, культивируемых в присутствии ПДГК. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4. Влияние ПДГК на жизнеспособность фибробластов кожи крыс

С, мг/мл Исследуемые соединения

ДГК ДГК-ЦД КН-2 КН 4 КН 6 КН 7 КН-14 КН-14-ЦД

1,0 75% 80% 19%* 26 %* 70% 22%* 70% 82%

0,1 97% 102% 63% 85% 98% 88% 94% 101%

0,01 105% 98% 90% 110% 102% 104% 102% 105%

Примечание. С — концентрация ПДГК; % - процент жизнеспособных клеток; * - достоверные отличия от контроля (р<0,05).

Согласно полученным данным, все исследуемые ПДГК в концентрации 0,1 мг/мл и 0,01 мг/мл не оказывают влияния на жизнеспособность культивируемых клеток в условиях МТТ-теста. ДГК, ДГК-ЦД, КН-14 и КН-14-ЦД не обладают цитотоксическим эффектом и в концентрации 1,0 мг/мл (что превышает концентрацию 10"4 М, максимальную из исследованных в настоящей работе).

Оценка влияния дигидрокверцетина и его производных на окисление фибриногена озоном

Озон-индуцированное окисление фибриногена проводилось в закрытом реакторе, в контроле и в присутствии изучаемых соединений. Реакцию

окисления фибриногена озоном оценивали по изменению оптической плотности фибриногена при длине волны 280 нм. Интенсивность и характер процесса окисления определялись по УФ-спектрам, полученным для неокисленного и окисленного фибриногена. Результаты экспериментов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Оптическая плотность в максимумах поглощения изучаемых

соединений.

Исследуемые вещества Оптическая плотность(D) Изменение оптической плотности

Фибриноген до озонирования 0,65 ± 0,04 100

Фибриноген после озонирования (контроль) 0,46 ± 0,03" 70

Фибриноген+ЦД до озонирования 0,66 ± 0,04 100

Фибриноген+ЦЦ после озонирования 0,46 ± 0,02* 70

Фибриноген+КН-14-ЦД до озонирования 0,66 ± 0,05 100

Фибриноген+КН-14-ЦЦ после озонирования 0,63 ± 0,07 95

Фибриноген+ДГК-ЦД до озонирования 0,64 ± 0,02 100

Фибриноген+ДГК-ЦЦ после озонирования 0,54 ± 0,03* 85

Фибриноген+ДГК до озонирования 0,64 ± 0,02 100

Фибриноген+ДГК после озонирования 0,56 ±0,03* 88

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартных

ошибок среднего (М ± з.е.т.). * - различия с контролем статистически значимы (р < 0,05), # - различия с фибриногеном до озонирования статистически значимы (р < 0,05). Концентрация фибриногена 1,87 мг/мл. Концентрация дигидрокверцетина и его производных 10"5 М. Спектры, представленные на рисунках 4 и 5, наглядно показывают, что в случае окисления фибриногена в присутствии КН-14-ЦД оптическая плотность в максимуме поглощения фибриногена уменьшается на 5%, тогда

как в отсутствии КН-14-ЦЦ происходит более значимое уменьшение оптической плотности фибриногена - на 30%, т.е. КН-14-ЦД оказывает протективное влияние в отношении окисления озоном фибриногена.

Рис. 4. УФ-спектры смеси фибриногена (1,87 мг\мл) и циклодекстрина (10"5М) до и после окисления озоном.

Длина волны,нм

Фи6риногек+КН-14до окисления

Рис. 5. УФ-спектры фибриногена (1,87 мг\мл) в присутствии КН-14-ЦД

(10"5 М, эквимолярное соотношение КН-14 и циклодекстрина) до и после

окисления озоном.

Для оценки сохранности нативных свойств фибриногена после

окисления озоном нами было использовано свойство фибриногена

полимеризовываться в фибрин под действием тромбина (табл. 6).

16

Таблица 6. Время образования фибринового сгустка у нативного фибриногена, окисленного фибриногена, а также у фибриногена, окисленного

в присутствии изучаемых соединений

Изучаемые вещества Время образования фибринового сгустка, с

Фибриноген, контроль (до окисления) 60 ± 1

Фибриноген (после окисления) Сгусток не образовывался

Фибриноген+КН-14-ЦД, 10"5 М (после окисления) 112 ±9

Фибриноген+КН-14-ЦД, 0,8 -10"4 М (после окисления) 75 ±4

Фибриноген+ДГК, 10"5 М (после окисления) 115 ± 12

Фибриноген+ДГК, 0,8 • 10"4 М (после окисления) 86 ±2

Фибриноген+ДГК-ЦЦ, 10"5 М (после окисления) 120 ± 10

Фибриноген+ДГК-ЦД, 0,8-10"4 М (после окисления) 100 ± 12

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартных

*

ошибок среднего (М ± s.e.m.). - различия с контролем статистически значимы (р < 0,05).

Как следует из таблицы 6, фибриноген в результате окисления полностью теряет способность полимеризовываться в фибрин в условиях in vitro, а ПДГК обладают протективной активностью в отношении окисления озоном фибриногена, в значительной степени сохраняя способность фибриногена полимеризовываться в фибрин после окисления озоном.

По результатам кинетических исследований, проведенных нами, стехиометрические коэффициенты реакций взаимодействия озона с ДГК и КН-14 равны, и составляют 3. Таким образом, к одному молю ДГК и ЬСН-14 присоединяется три моля озона, что может свидетельствовать о наличии трех активных центров на молекулах ДГК и КН-14, способных присоединять молекулы озона. Константы скорости взаимодействия озона с ДГК и КН-14

17

составляют 1,0-103 и 5 ТО3 соответственно, что свидетельствует о большей скорости взаимодействия КН-14 с озоном, и, соответственно, о более выраженных антиоксидантных свойствах КН-14 в данной модели. Изучение противовоспалительной активности исследуемых соединений

Способность ПДГК уменьшать количество нестабильных свободных радикалов в очаге воспаления может способствовать уменьшению его интенсивности. Также кверцетин уменьшает синтез ключевых ферментов воспалительной реакции - циклооксигеназы 2 типа, липооксигеназы, матриксных металлопротеиназ, снижая уровень пролиферации в очаге воспаления и образование простагландина Е2, а также других медиаторов воспаления (Xiao X. et al., 2011).

В данной работе нами исследована противовоспалительная активность дигидрокверцетина и его производного КН-14, а также их водорастворимых комплексов включений в циклодекстрин. В качестве модели воспалительной реакции был выбран каррагенан-индуцированный отек лапки мыши. В качестве препарата сравнения был использован диклофенак натрия. ДГК и КН-14 растворялись в ДМСО, ДГК-ЦД и КН-14-ЦЦ растворялись в физиологическом растворе. ДГК-ЦД, КН-14-ЦД вводились в эквимолярных дозах по отношению к ДГК и КН-14. Диклофенак вводили в дозе 0,02 ммоль/кг, что, согласно методу конверсии доз (Freireich E.J. et al., 1966), примерно соответствует суточной дозе 75 мг для человека (Сафронов Д.Ю. и др., 2011). В контрольных группах мышам вводили физиологический раствор. Также оценено влияние 10% раствора ДМСО и раствора циклодекстрина в концентрации, эквимолярной содержанию циклодекстрина при введении мышам ДГК-ЦД и КН-14-ЦД. Данные соединения не оказывают влияния на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши. Результаты эксперимента представлены на диаграмме размаха на рисунке 6.

1,6

1.4

*

X

5 0,8 ■ —i—| - о

гп □

X X __

□ Median

0,2

Контроль ДГК

Диклофенак ДГК-ЦЦ

КН-14

I I 25%-75% I Min-Max

КН-14-ЦЦ

Рис. 6. Диаграмма размаха (Box and Whiskers) для визуальной оценки эффекта исследуемых соединений на величину каррагенан-индуцированного

(р < 0,05). Концентрация ПДГК 0,16 ммоль/кг.

Согласно полученным данным, в используемой модели все изученные соединения обладают противовоспалительной активностью (ПВА). Наименьшей противовоспалительной активностью обладает ДГК-ЦД, после введения которого величина каррагенан-индуцированного отека уменьшилась на 21%. КН-14-ЦД вызвал уменьшение величины отека на 46%, КН-14 на 43%, ДГК на 52%. Диклофенак в дозе 0,02 ммоль/кг вызвал уменьшение отека на 42%.

Для исследуемых соединений, показавших наибольшую противовоспалительную активность (ДГК, КН-14, КН-14-ЦЦ), нами была изучена противовоспалительная активность в дополнительных концентрациях (0,02 и 0,04 ммоль/кг). Согласно полученным данным (табл. 7), выраженная противовоспалительная активность данных соединений, сопоставимая с ПВА диклофенака в дозе, эквивалентной терапевтической, сохраняется при

отека лапки мыши.

различия с контролем статистически значимы

уменьшении дозы до 0,04 ммоль/кг (12,5 мг/кг в пересчете на ДГК). В то же время суточная доза дигидрокверцетина, рекомендованная пациентам в качестве противовоспалительного и кардиопротекторного средства, составляет до 15 мг/кг (Yegorova I., 2010). Стоит отметить, что у человека действующие дозы фармакологических веществ существенно ниже, чем у грызунов, вследствие менее интенсивного метаболизма и меньшей относительной площади поверхности тела.

Таблица 7. Влияние изучаемых соединений на каррагенам индуцированный отек лапки мыши.

Изучаемое соединение Величина отека лапки через 3 часа после введения каррагенана, мм Уменьшение отека лапки через 3 часа после введения каррагенана по сравнению с контролем, %

Контроль (физ. р-р) 1,20 ±0,11 -

Диклофенак (0,02 ммоль/кг) 0,70 ± 0,08 42'

ДГК (0,02 ммоль/кг) 1,10 ± 0,15 8

ДГК (0,04 ммоль/кг) 0,80 ± 0,09 33**

ДГК (0,16 ммоль/кг) 0,58 ± 0,09 52'»

ДГК-ЦД (0,16 ммоль/кг) 0,95 ±0,10 21"

КН-14 (0,02 ммоль/кг) 1,20 ±0,20 0

КН-14 (0,04 ммоль/кг) 0,60 ±0,10 50'*

КН-14 (0,16 ммоль/кг) 0,69 ±0,10 43'"

КН-14-ЦД (0,02 ммоль/кг) 1,18 ± 0,14 2

КН-14-ЦД (0,04 ммоль/кг) 0,66 ± 0,07 45*"

КН-14-ЦД (0,16 ммоль/кг) 0,65 ± 0,08 46-

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего (М ± з.е.т.). — различия с контролем статистически значимы (р < 0,05). * - отличия от группы, получавшей диклофенак, статистически незначимы (р >0,1).

Интересным представляется определение зависимости между структурой и фармакологической активностью ПДГК. Как показано нами,

КН-14-ЦЦ обладает большей противовоспалительной активностью, чем ДГК-ЦД. Данный феномен можно объяснить наличием двух изобутильных групп в структуре КН-14, придающих его молекуле большую липофильность по сравнению с ДГК (водорастворимость ДГК составляет 0,3 г/л (Коротеев A.M. и др., 2009), тогда как КН-14 - 0,02 г/л). Лучшие гидрофобные свойства КН-14 определяют более высокую устойчивость водорастворимой формы КН-14-ЦЦ, по сравнению с ДГК-ЦД.

ВЫВОДЫ

1. Среди изученных производных дигидрокверцетина наибольшую антиоксидантную активность показал КН-14 (АОА=0,1 мкМ"1 в условиях АБТС-теста). По результатам оценки антиоксидантных свойств, наиболее перспективными соединениями для дальнейшего изучения являются, наряду с нативным дигидрокверцетином, КН-14 и водорастворимые комплексы включения КН-14 и ДГК в циклодекстрин.

2. Образование водорастворимых комплексов включения ДГК и КН-14 в циклодекстрин сохраняет антиоксидантную активность исходных соединений.

3. ДГК, ДГК-ЦД, КН-14, КН-14-ЦД в концентрации до 10"4 М не обладают цитотоксическим эффектом на культуре фибробластов крыс в условиях МТТ-теста.

4. Дигидрокверцетин, а также комплексы включения КН-14 и ДГК в циклодекстрин в концентрации 10"5 М обладают протективной активностью в отношении окислительного повреждения фибриногена.

5. Соединения ДГК, ДГК-ЦЦ, КН-14-ЦЦ в концентрации 10"5 М в условиях озонового окисления сохраняют функциональную активность фибриногена (его способность полимеризовываться в фибрин под действием тромбина).

6. Дигидрокверцетин, КН-14 и водорастворимый комплекс включения КН-14 в циклодекстрин в дозе 0,04 ммоль/кг обладают выраженным

21

противовоспалительным эффектом на модели каррагенан-индуцированного отека лапки мыши, эквивалентным противовоспалительному эффекту диклофенака в дозе 0,02 ммоль/кг.

Практические рекомендации

1. Водорастворимые комплексы включения дигидрокверцетина и его производных в циклодекстрин могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения с целью создания инъекционных лекарственных форм.

2. Целесообразно дальнейшее доклиническое изучение комплекса включения производного дигидрокверцетина КН-14 в циклодекстрин как средства, обладающего протективной активностью в отношении окислительного повреждения белков плазмы крови.

3. Ввиду наличия выраженной антиоксидантной и противовоспалительной активности у дигидрокверцетина и его новых производных целесообразно дальнейшее доклиническое изучение данных соединений с целью их возможного использования в профилактике и терапии патологических состояний, при которых процессы воспаления и активизации окислительного стресса являются одними из основных звеньев патогенеза, например, при метаболическом синдроме.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роговский, B.C. Антиоксидантные свойства веществ, обладающих нейротропной активностью // Вестник РГМУ. - 2009. - № 3. - С. 278.

2. Роговский, B.C. Сравнение антиоксидантных свойств новых соединений из группы кверцетинов // Вестник РГМУ. - 2010. - № 2. - С. 542-543.

3. Роговский, B.C. Исследование антиоксидантной активности водорастворимой формы дигидрокверцетина / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, А.П. Порохин, Н.Л. Шимановский // Астраханский медицинский журнал. - 2010. - № 1. - С. 359.

4. Роговский, B.C. Исследование антиоксидантной активности новых соединений из группы кверцетинов / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, А.П. Порохин, Н.Л. Шимановский // Сборник материалов конгресса «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни». - М, 2010. - С. 156.

5. Роговский, B.C. Антипролиферативная и антиоксидантная активность новых производных дигидрокверцетина / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, Н.Л. Шимановский, А.В. Семейкин, Т.С. Кухарева, A.M. Коротеев, М.П. Коротеев, Э.Е. Нифантьев // Экспериментальная и клиническая Фармакология. - 2010. - Т. 73, № 9. - С. 39-42.

6. Роговский, B.C. Скриннинговая оценка антиоксидантных свойств новых производных дигидрокверцетина / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, А.П. Порохин, Н.Л. Шимановский // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство». — М.: изд-во РИЦ «Человек и лекарство», 2011. - С. 475.

7. Роговский, B.C. Перспективы применения препаратов кверцетина для профилактики и лечения атеросклероза / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, А.П. Порохин, Н.Л. Шимановский // Международный медицинский журнал. - 2011. - № 3. - С. 114-118.

8. Роговский, B.C. Антигипертензивная и нейропротекторная активность кверцетина и его производных / B.C. Роговский, Н.Л. Шимановский, А.И. Матюшин // Экспериментальная и клиническая Фармакология. - 2012. - Т. 75, № 9. - С. 37-41.

9. Rogovsky, V.S. Dihydroquercetin Inhibits Ozone Oxidation of Fibrinogen / V.S Rogovsky, M.A. Rosenfeld, V.B. Leonova, M.L.

23

Konstantinova, S.D. Razumovsky, A.I. Matyoshin, N.L. Shimanovsky // New Steps in Physical Chemistry, Chemical Physics and Biochemical Physics. - 2012. - March. - P. 151-158.

10. Роговский, B.C. Антиоксидантная активность новых производных кверцетина и стерана / B.C. Роговский, А.П. Порохин, В.В. Князев, Н.А. Кузнецова, Ю.О. Юдина // Вестник РГМУ. - 2013. - № 1. - С. 166-167.

11. Роговский, B.C. Оценка способности дигидрокверцетина ингибировать окисление фибриногена озоном / B.C. Роговский, M.A. Розенфельд, С.Д. Разумовский, А.И. Матюшин, H.JI. Шимановский, В.Б. Леонова, М.Л. Константинова // Экспериментальная и клиническая Фармакология. - 2013. - Т. 76, № 3. - С. 23-26.

12. Роговский B.C. Влияние комплекса включения аминометилированного производного дигидрокверцетина в циклодекстрин на окисление фибриногена озоном / B.C. Роговский, Т.М. Арзамасова, М.А. Розенфельд, М.Л. Константинова, В.Б. Леонова, С.Д. Разумовский, А.И. Матюшин, Н.Л. Шимановский, A.M. Коротеев, С.Е. Мосюров, М.П. Коротеев, Т.С. Кухарева, Э.Е. Нифантьев // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, № 6. - С. 10-13.

Список сокращений

ПДГК - производные дигидрокверцетина ДГК - дигидрокверцетин ЦД - циклодекстрин

ДГК-ЦД - комплекс включения дигидрокверцетина в циклодекстрин

КН-14 - 6-[(дивторбутиламино)метил]-ДГК

КН-14-ЦД- комплекс включения КН-14 в циклодекстрин

AOA - антиоксидантная активность

АБТС - 2,2'-азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат)

НПВС - нестероидные противовоспалительные средства

ПВА - противовоспалительная активность

Подписано в печать: 07.04.2014 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 225 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 2 (495)978-66-63; www.reglet.ru