Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние дефицита и дополнительного введения витаминов А И Е на ферментные системы биотрансформации генотоксических соединений

од

На правах рукописи

МАТВИЙЧУК НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

КЛИЯНИК ЛЕтИЦИТА И ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ВИТАМИНОВ "А" И "К" НА •Ш-НЬНТНЖ СИСТЕМЫ БИОТРАЯСМЮРМАЦИИ ГБНОТОКСИЧЕСКЙХ "ОЕДИНЕНИЙ

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1996

Работа ныгюлпЧ'п г. Ниучио-исследовательскок институте фармаь->,.•'<> гни Российской н^дтш медицинских наук и Рпнницком гооулар!."."!"-!) ном университете

Н а у ч н ы -- р у к о в о д и г е л и:

Доктор медицинских наук, профессор. А. п. Дурн-д

Ликтор о>с.пкпнеких наук, профессор

11 Ф II Т И -. ." С Ч И е- О П Л о и с К Т ::

Дактор -допдноких наук, профессор А. Н Лео:'.скин

Доктор 010 логических наук Г. М. Волга, -да

Ведущая организация- Московская медицинская

академия им.И.М.Сечонооа

Защита состоится " " 1996 года в " " чассе на

заседании специализированного Ученого совета Д 001.25.01 в НИИ Фармакологии в РАМН, по адресу: 125315,Москва, ул.Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной части Института.

Ученый секретарь, к.м.н.

Е. А. Вальдман

Актуальность.

Негативное влияние мутагенов и ДНК-повреждающих агентов на ровье человека подтверждено многочисленными исследованиями [Н.Л. бпнин ,1986; Н.П.Бочков, А.Н.Чеботарев, 1989; Ames,1989. В этой с зи разрабатываются подходы, направленные на предупреждение нега': него влияния генотоксикантов на генетические структуры. Одним из иболее распространенных и радикальных методов профилактики отда; них последствий эффектов генотоксикантов является предупреждение контакта с людьми. Одновременно общепризнано, что полностью orpaj человека от влияния производственных, пищевых, косметических и t: потенциально генотоксичных соединений невозможно [У.К.Ален ров,1934; С. Б. Середенин , А. Д. Дурнев 1992]. В этой связи необхсм разработка средств защиты фармакологических структур,на основе весткых и вновь выявленных природных и синтетических соединении антимутагенными свойствами [С.Б.Середенин , А.Д. Дурнев 1992].

Проблема практического использования антимутагенов в качес средств защиты гинетических структур имеет большое количество не шейных и спорных вопросов.Например, неоднократно обращалось внима ка войкижность инверсии эффектов антимутагенов, проблемы специФ нити ;: универсальности действия антимутагенов, зависимость актп тссеннсг" действия того или иного вещества от физиологического с плн;!->: ' рганизма [С. Б. середенин , А. Д. Дурнев 1992. Harm. Sb-íftkr'. 1S90; StavríK, 1994]. Практическое изучение этих вопр>. мс "азироваться на изучении биохимических механизмов Формировс мугаггнш.х и антимутагенных эСФектов. Е частности, формирование ну гаших и аитимутагенных эффектов ксенобиотиков во многом зависит ос-.{к-н;:о.'тс-и их метаболизма, определяемых системой цитохрома F-. ¡Í-. А. it-итак и соавт. 1995]. с другой стороны очевидно, что функп; нпричание цитохрома р-450 зависит от поступления алиментарных ф.чю ро=, i частности витаминов.Е первую очередь витаминов А и Е мод» цируюшге- действие которых на мутагенные процессы и функционировав си .темь микросомального окисления ксенобиотиков неоднократно деми; трировалпсь ранее. В этой связи целью настоящего исследования явил. из;ч-нмо слияние дефицита и дополнительного введения витаминов / i но феры-лггные системы биотраиеапрмащш генотоксических соединен;'.;;.

Л "я лс "-тижешш поставленном цели были поставлены следующие зо;.'

; W влияние Нг/Дос.'Г :Т! 4!. ■",,ТИ ВИТаМИНОВ A ÍI С, ДОПОЛНИТ' .!'••

введения ретинола ацетата, ретиноевой кислоты и бета-каротина на активность в печени мышей и крыс цитохром Р-450-зависимых моно-оксигеназ, NADH- и NADPH-редуктаз, эстераз, альдегидметаболизи-рующих ферментов, глутатионзависимых ферментов, процессы пере-кисного окисления липидов.

2. Исследовать влияние дефицита витаминов А и Е, дополнительного введения препаратов этих витаминов на токсичность циклофосфамида и нитрозодиметиламина, фармакокинетику алкилирующих метаболитов циклофосфамида, состояние ферментных систем, участвующих в метаболической активации и детоксикации циклофосфамида и нитрозодиметиламина.

3. Методом учета хромосомных повреждений в клетках костного мозга мышей линий C57BL/6 оценить влияние гипо- и гипервитаминоза А на проявление кластогенных эффектов диоксидина в дозе 100 мг/кг.

4. Изучить взаимосвязи генотоксических эффектов с функционированием системы цитохрома Р-450 и обеспеченности витаминами А и Е.

Научная новизна.

В прямом эксперименте впервые подтверждено теоретическое предположение о зависимости проявления мутагенных эффектов диоксидина от обеспеченности тестерного животного витамином А, что открывает перспективы дальнейшего практического изучения этого вопроса.

Впервые на биохимическом уровне проведена сравнительная оценка действия циклофосфамида и нитрозодиметиламина с последующей их коррекцией дополнительным введением витамина А. Показано, что механизм действия ретинола, ретиноевой кислоты и токоферола при токсическом поражении печени нитрозодиметиламином и циклофосфамидом связан с модулированием активности ферментов метаболической активации и детоксикации ксенобиотиков, процессов перекисного окисления липидов. Практическая значимость.

Результаты показали, что антимутагенные свойства бемитила могут зависить от обеспеченности витамином А, а это должно учитываться при практическом использовании этого средства в качестве корректора мутагенных эффектов диоксидина.

Полученные данные расширяют существующие представления о биохимии поражения печени циклофосфамидом и нитрозодиметиламином, что служит экспериментальной основой для разработки новых гепатозащит-ных препаратов и средств профилактики.Витамины А и Е могут быть ис-

пользованы в качестве средств коррекции острых поражений печени.

Апробация работы.

Результаты представленной работы докладывались на XI объедине; ной медико-технической конференции (г.Винница. 1993) и на XIV обт единенной медико-технической конференции (г.Киев, 1996).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1; описания материалов и методов исследования (глава 2), собственш результатов (глава 3), их обсуждения (глава 4), выводов и спис] цитируемой литературы. Работа изложена на стр. машинописно] текста, содержит таблиц и рисунков.Библиографический ук< затель включает отечественных и иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 463 крысах-самцах популяции Вистар 300 мышах линий С57В1/6.

В период эксперимента животные получали полусинтетический кра: мально-казеиновый рацион с учетом требований экспериментальной в: таминологии (Ю.М.Островский, 1979). Корм содержал крахмал, казеин лярд очищенные от витаминов, смесь солей, смесь витаминов в опт! мальных количествах.

Авитаминоз ретинола создавали скармливанием животным рацио: полностью лишенного витамина А в течение 10-11 недель, а гиповит, миноз - скармливанием диеты, содержащей 150 ME витамина А на 1 корма в течение 8-9 недель. В контрольном рационе витамин А соде жался в количестве 2000 МЕ/кг. Всех животных кормили ad 1ШШ Для более точного дозирования витамина А, в последние 10 дней опы каждой крысе (исключая группу "авитаминоз") перорально вводили р тинол ацетат: в группе "дефицит" - по 30 МЕ/кг , в контрольн группе - 300 МЕ/кг. Крысы парнопитающегося контроля получали так же количество корма, которое съедали животные групп "авитамино или "гиповитаминоз". У части авитаминозных животных проводили опы по восстановлению недостаточности ретинола.

Избыток витамина А создавали пероральным 7-дневным введени контрольным животным 3000 МЕ/кг ретинола ацетата. Это количест

ретинола примерно в 10 раз превышают суточную потребность крыс в витамине А и примерно соответствуют используемым в клинике дозам.

Адекватность моделей оценивали по содержанию витамина А. У ги-повитаминозных крыс уровень ретинола в печени снизился в 4,4 раза, а у авитаминозных - в 46 раз, а при дополнительном введении ретинола - возрос в 7,8 раз, при введении ретиноевой кислоты - в 1,5 раза, а бета-каротина - в 5,2 раза. Сходные данные получены на мышах.

Недостаточность витамина Е создавали скармливанием в течение 13-14 недель животным полусинтетического рациона, не содержащего токоферол. У части животных проводили восстановление недостаточности витамина Е, скармливая им последние 2 недели рацион, содержащий оптимальные количества витамина Е (150 мг токоферола ацетата на 1 кг корма). В контрольной группе животные получали этот рацион на протяжении всего эксперимента. Избыток витамина Е создавали перо-ральным введением в течение недели 20 мг/кг токоферола ацетата. У токоферолдефицитных крыс уровень токоферола в плазме крови снижается почти в 6 раз, а у животных, получавших дополнительно 20 мг/кг токоферола ацетата - увеличивается в 1,5 раза. В микросомах печени крыс резко повышается содержание малонового диальдегида и активность МБРН- и аскорбатзависимого перекисного окисления липидов.

Нами изучено влияние витаминов А и Е на токсичность нитрозоди-метиламина, синтезирующегося эндогенно из амидопирина и нитрита натрия. Смесь этих веществ вводили крысам в желудок 5-кратно из расчета 100 мг/кг амидопирина и 50 мг/кг нитрита натрия. Нитрозоди-метиламин внутрижелудочно в суммарной дозе 8 или 10 мг/кг за два введения с интервалом в один день.

Токсичность циклофосфамида оценивали по гибели крыс в течение недели после однократного внутрибрюшинного введения в дозе 230 мг/кг. Имуннотоксическое действие циклофосфамида (40 мг/кг 5-кратно) оценивали на животных иммунизированных эритроцитами барана. Витамины начинали вводить за 3 дня до начала иммунизации и продолжали вводить на протяжении всего опыта, агглютининов.

Микросомную фракцию печени получали известными методами (Ката № и соавт., 1977; И. И. Карузина, А. И. Арчаков/ 1977). Чистоту мик-росомной фракции оценивали по распределению в постядерном гомогена-те и микросомной фракции маркерных ферментов. -

Деметилазную активность в микросомной фракции печени определяли по скорости образования формальдегида из диметиланилина, гидрокси-

лазную активность по скорости образования пара-аминофенола из ак лина, а активность NADH-редуктаз (КФ 1.6.2.2) и NADPH-редуктаз ( 1.6.2.4) оценивали по скорости обесцвечивания дихлорфенолиндофенс или скорости превращения неотетразолия в формазан (И. И. Карузин А.И.Арчаков, 1977). Процессы перекисного окисления липидов опред ляли по приросту малонового диальдегида (продуктов, реагирующих тиобарбитуровой кислотой) после инкубации микросомной фракции с а корбиновой кислотой или NADPH (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972 Содержание белка определяли микробиуретовым методом (Г. А.Кочето 1980). Концентрацию фосфолипидов оценивали по их способности обр зовывать гидрофобные комплексы с ферротаоцианатом аммония (А. А. Пе тюк и соавт., 1987).

Активность алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1) оценивали по пр росту NADH, образующегося в результате окисления этанола (Г.А.Коч тов, 1980), альдегиддегидрогеназы (КФ 1.2.1.3) и альдегидоксида (КФ 1.2.3.1) - по убыли пара-оксибензальдегида, определяемого в р акции с 2,4-динитрофенилгидразином (Г.В.Холмина, В.3.Горкин, 1979

Активность эстераз измеряли по убыли соответствующих субстр тов, определяемых в реакции Хестрина (А.А.Покровский, А.И.Арчако 1969).' Инкубационная среда для определения активности алиэстера (КФ 3.1.1.1) содержала этилацетат и ингибитор холинэстеразы - пр зерин. Среда для измерения активности арилэстеразы (КФ 3.1.1.2) с держала фенилацетат и ингибитор холинэстеразы и алиэстеразы парао сон. Ариламидазную активность алиэстеразы (карбоксилэстераза : 3.1.1.1) определяли по приросту анилина, образующегося при гидрол зе ацетанилида (Heymann, Mentleln, 1981). Активность УДФ-глюкур нилтрансферазы. (КФ 2.4.1.17) оценивали по снижению поглощению п ра-нитрофенола, который конъюгируясь с УДФ-глюкуроновой кислото: образует неокрашенный продукт (Burchell. Weatherill, 1981).

Активность глутатион-Б-трансферазы (КФ 2.5.1.18) оценивали : образованию коньюгатов с 1-хлор-2,4-динитробензолом и освобожден; нитрита из нитроглицерина (Habig, Jaeoby, 1981), гамма-глутамил рансферазы (КФ 2.3.2.2) - по освобождению пара-нитроанилина из га) ма-глутамил-пара-нитроанилида (Ceriotti, De Nadai-Frank. 197; 1973). глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) - по скорости окисления MAD! (Pinto, Bartley, 1969), формальдегиддегидрогеназы (КФ 1.2.1.1) - i убыли формальдегида (Goodman, Tephly, 1971). Активность глутатио] пероксидазы (КФ 1.11.1.9) оценивали по скорости окисления NADPH.

системе сопряженной с глутатионредуктазой, используя в качестве субстрата гидропероксид трет-бутила (В.З.Ланкин, С.М.Гуревич, 1976). Содержание восстановленного глутатиона и глутатиондисульфида в печени определяли в глутатионтрансферазной реакции (Asaoka, Taka-hashi, 1981). Глутатиондисульфид предварительно восстанавливали водородом. Цистеин определяли по реакции с нингидрином в уксуснокислой среде (Gaitonde, 1967).

Уровень ретинола определяли по реакции с трифторуксусной кислотой (Wang et al., 1978), а содержание токоферола - по реакции Эм-мери-Энгеля (Ю.М.Островский, 1979).

Содержание циклофосамида и его алкилирующих метаболитов - азотистого иприта фосфорамида и акролеина оценивали по реакции с 4-(4'-нитробензил)-пиридином (Christian et al., 1980). Рассчет параметров фармакокинетики алкилирующих метаболитов циклофосфамида проводили на ЭВМ в рамках двухчасгевой модели со всасыванием (В.Н.Соловьев и соавт., 1980; Л.Е.Холодов, В.П.Яковлев, 1985; В.К.Пиотровский, М.Вайс, 1988).

Часть экспериментальных исследований, касающихся циклофосфамида и нитрозодиметиламина проведена совместно с А.Я.Какарькиным, В. И.Гуцолом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние витамина А на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени мышей и крыс.

Характер неблагоприятного воздействия ксенобиотиков на организм во многом определяется активностью ферментов, участвующих в их метаболической активации и детоксикации. Поэтому исследована зависимость ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени от уровня витаминов А и Е.

При недостаточности ретинола снижается относительная масса печени мышей, выход белка и фосфолипида микросомной фракции (табл. 1). Введение 3000 МЕ/кг ретинола ацетата приводит к пролиферации эндоплазматического ретикулума - возрастает относительная масса печени и выход белка и фосфолипида микросом. При дефиците витамина А падает активность монооксигеназ, редуктаз, эстераз, ариламидазы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, глутатионредуктазы

(табл. 1). Однако, активность глутатион-Б-трансферазы и гамма-глу тамилтрансферазы возрастает. Содержание восстановленного глутатион изменяется мало, а окисленного - возрастает. Дополнительное введе ние витамина А повышает активность гидроксилазы и деметилазы, МИН и МБРН-редуктаз, арил- и алиэстеразы, ариламидазы, алкогольдегид рогеназы, но несколько снижает активность глутатион-Б-трансферазы уровень окисленного глутатиона.

Таблица 1

Влияние недостаточности и дополнительного введения ретинола н активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени мыше линии С 57 В1/6 (средние величины из 16-18 наблюдений, М+т)

Активность ферментов, Недостаточ- Контроль пар- Избыток

нмоль/мин на 1 мг белка ность нопитающийся витамина А

Ретиноиды. мкг/г печени 8,8 + 1,2* 94,4 ±4,5 313 + 25,2

Относительная масса, % 4,19 + 0,12* 4,66 ± 0,10 4,86 + 0, 13

Выход белка микросом, мг/г 15,1 + 0,36* 18,0 ± 0,38 20,2 + 0,46

Выход фосфолипида, мг/г 3, 47 + 0, 18* 4,45 ±0,17 5,37 + 0, 13

Деметилаза 2, И + 0, 17* 3.06 ± 0,18 3,88 + 0,24

Гидроксилаза 0, 22 + 0,02* 0,32 ±0,025 0,41 + 0,02

МБН-редуктаза ДХФИФ 35, 1 + 2,38* 47.9 ± 2.39 58,4 + 2,92

МБРН-редуктаза ДХФИФ 14,3 + 1,34* 21,6 + 1,44 28,5 + 2,28

Алкогольдегидрогеназа .2, И + 0,18* 5,30 ± 0,24 6, 20 + 0,29

Альдегиддегидрогеназа 5,69 + 0,46 6,27 ± 0,30 6,61 + 0, 32

Алиэстераза 365 + 26,5* 550 ± 26,5 662 + 33,2

Арилэстераза 950 + 73* 1475 ± 53 1656 + 60*

Ариламидаза 145 + 11,5* 222 ± 12.9 274 + 15,0

Глутатион-Б-трансфераза, ХДНБ 353 + 20* 290 ± 16 250 + 14

Глутатионредуктаза 49,5 + 2, 60* 57,0 ± 2,25 63,9 + 3,58

Гамма-глутамилтрансфераза 2, 99 + 0,11* 2,41 ± 0.14 2,57 + 0,16

СБН, мкмоль/г 4,95 + 0, 26 4, 48 ± 0,28 4,22 + 0,27

СБ-БС, мкмоль/г 0,39 + 0, 03* 0, 28 ± 0, 026 0,20 + 0,02

Примечание: 1. Знаком * обозначены достоверные различия по сравне нию с контролем. 2. В группе "недостаточность" мыши получали рацио лишенный витамина А, в контроле - ретинола ацетат 300 МЕ/кг, группе "избыток" - 3000 МЕ/кг перорально.

Опыты на крысах подтвердили результаты исследований на мышах. В зависимости от глубины дефицита витамина А снижалась активность микросомальных монооксигеназ, редуктаз, эстераз, алкоголь- и альде-гиддегидрогеназы, УДФ-глюкуронилтрансферазы, глутатионпероксидазы, но возрастала активность глутатион-Б-трансферазы (рис. 1, 2). При сравнении препаратов витамина А выявилось, что наиболее сильное влияние оказывает ретиноевая кислота, затем ретинол ацетат и бета-каротин.

ДеМБТШЗЛ ГИДРОКСИЛАЗА КАОРВ-РШКТАЗА

Ш к ЛЬ Щ ТИПОВ 3 ЁЗ АВИТ-3 |РЕТИИОУ! ЙЗ PET К ТА ££3 С-КАГОТ

Рис.. 1. Влияние витамина А на активность монооксигеназ и

NADPH-редуктазы в микросомной фракции печени крыс

АРИЛЗСТЕРАЗА M44MDKHP-A3A GSH-ПЕРОКСИДАЗА

Рис. 2. Влияние витамина А на активность арилэстеразы, УДФ-глю-куронилтрансферазы и глутатионпероксидазы в постмито-хондриальной фракции печени крыс.

ES ЛЬ ЁШгИПОВ-З э АВИТ-3 0 РЕТИНОЛ S3 PET K-TA g 5 КАРОТ

2. Влияние токоферола на активность ферментов метаболизма ка нобиотиков в печени крыс.

Дефицит витамина Е приводит к снижению на 10-25% относител; ной массы печени, выхода белка и фосфолипида микросом, к резко] снижению деметилазной, гидроксилазной и редуктазной, эстеразной альдегиддегидрогеназной активностей печени крыс (табл. 2). Силы снижается активность глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктаз] глутатионпероксидазы, концентрация восстановленного глутагиона, 1 повышается активность гамма-глутамилтрансферазы и уровень окисле] ного глутатиона. Дополнительное введение токоферола ацетата в до: 20 мг/кг существенно не влияет на исследованные показатели.

Таблица 2

Влияние дефицита и дополнительного введения токоферола на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени кры (средние величины из 6-7 наблюдений, М+т)

Активность ферментов, нмоль/мин на 1 мг белка

Недостаточность

Контроль пар-нопитающийся

Избыток токоферол^

Токоферол, мг/л Относительная масса, % Выход белка микросом, мг/г Выход фосфолипида, мг/г Деметилаза Гидроксилаза МВН-редуктаза ДХФИФ МВРН-редуктаза ДХФИФ Альдегиддегидрогеназа Алиэстераза Арилэстераза

Глутатион-Б-трансфераза,НТ

Глутатион-Б-трансфераза,ХДНБ

Глутатионредуктаза

Глутатионпероксидаза

Гамма-глутамилтрансфераза

СБН. мкмоль/г

СБ-БС, мкмоль/г

1.6 ± 2,93 ± 18,2 ± 5,17 ± 3,25 + О, 33 ± 38,3 + 24,1 ± 2,81 + 266 + 810 ± 15,3 ± 276 53,5 193 2,11 5,75 1,01

0,18* О, 09* О, 63* О, 14* 0. 28* 0,02* 2,27* 1,81* 0,24* 12,3* 42* 0,53* 10* 2, 72* 12,1* О, 09* 0,15* 0,06*

9,3

3.27 22,9 6,94 6,00 0,57 76,7

49.3 4,65 329 1158

19.4 349

72, О 269

1.28 7,56 0,44

± 0,45 ± 0,12 ± 1, 09 +0,36 ± 0,33 + 0,02 ± 1,90 + 2,84 ± 0,21 ± 18,0 ± 44 + 1,06 ± 1? ± 3,53 ±8,8 ± 0,14 ± 0, 24 ± 0,03

13,7 + 0,5. 3, 24 ± 0, 1 23.2 ± 1,1 7,32 + 0,4 6,10 + 0,1 0,60 + 0,0 82,0 + 4,9 54,7 ±3,5 5,00 ± 0,2 363 + 21, 1216 ± 44 20, 8 ± 0, 8

375 ± 17 81,0 ± 3, 1 289 ± 12, 1,11 ± 0,0 7,55 ±0,3 О, 36± 0,03

Примечание: 1. . Знаком * обозначены достоверные разлы«"« по оусшне-нию с контролем. 2. В группе "недостаточность" крысы получали рацион лишенный витамина А, в контроле - полноценный рацион, в группе "избыток" - 20 мк/кг токоферола ацетата перорально.

3. Влияние витаминов А и Е на токсичность циклофосфамида, образование алкилирующих метаболитов и активность ферментов, участвующих в биотрансформации циклофосфамида

Дефицит токоферола и ретинола усиливает токсичность циклофосфамида. Так, длительность жизни крыс дефицитных по ретинолу и токоферолу составляла 2,0+0,29 и 2,8+0,25 дней при 3,7+0,28 и 4,7+0.54 в контроле. Введение 3000 МЕ/кг ретинола ацетата. 2,06 мг/кг бета-каротина или 100 мг/кг токоферола ацетата существенно (на 25, 30 и 50% соответственно) уменьшает гибель животных, под влиянием циклофосфамида.

Введение витаминов А и Е само по себе не влияет на синтез антител у крыс в ответ на введение эритроцитов барана. Введение 3000 МЕ/кг ретинола ацетата ослабляет (в 1,5 - 1,7 раза) эффект циклофосфамида на синтез агглютининов и гемолизинов, а введение токоферола ацетата (100 мг/ кг) не изменяет действие циклофосфамида. Не исключено, что влияние витаминов на токсичность циклофосфамида и его депримирующее действие на синтез антител обусловлены их действием на процессы метаболической активации циклофосфамида.

Оказалось, что при дефиците витамина А в крови мышей увеличивается концентрация алкилирующих метаболитов (на сроки 40, 80 и 100 минут), а дополнительное введение ретинола ацетата и бета-каротина, напротив, снижает концентрацию алкилирующих метаболитов циклофосфамида (табл. 3). Дополнительное введение токоферола ацетата меньше снижает уровень алкилирующих метаболитов. Это подтверждается расс-четами параметров фармакокинетики. У ретинол-дефицитных крыс повышается максимальная концентрация алкилирующих метаболитов, в 1,5 -1,7 раза возрастает площадь под фармакокинетической кривой и период полувыведения, снижается общий клиренс алкилирующих метаболитов. Дополнительное введение ретинола ацетата оказывает противоположное влияние на параметры фармакокинетики алкилирующих метаболитов. Вли-янир бета-каротина было сходным по направленности, хотя и менее вы-

раженным. Токоферола ацетат мало изменял параметры фармакокинетики алкилирующих метаболитов циклофосфамида.

Таблица 3

Концентрация (мкг/мл) алкилирующих метаболитов циклофосфамида в плазме крови мышей (средние величины из 5 наблюдений, М±т)

Состояние Время после введения циклофосфамида, мин

10 20 40 60 80 100

Контроль 32.8+3,2 49,0±4,7 70,4+4,7 55.4+5,0 35,4+3,2 25,4+3,3 Дефицит 44,0+5,8 62,0+4.2 87,0+4,3* 68,6+3,6 49,6±2,8* 41.0±3,0* Ретинол 25.2+3,0 35,0+2,6* 49,0+2,8* 34,2+4,3* 21,6+1,9* 13,8+1,5* Каротин 30,2+3,2 40,0+3,2 54,0+3,2* 42,0±3,6 25,4+3,4 14,8+1,3* Контроль 44,4+4,7 63,2+6,0 81,8+7,4 61,0+4,7 41,2+5,5 33,2+2,6 Токоферол 35,8+6,5 48,2+5,6 60,0+6,0* 51,0+5,6 36,4+4,5 28,8+2,8 Примечание: 1. Знаком * обозначены достоверные различия.

Известно, что метаболическая активация циклофосфамида ведет к образованию токсических метаболитов, которые вызывают повреждение мембранных структур, ферментов. С другой стороны, как показали наши исследования обеспеченность витаминами А и Е влияет на активность ферментов, "которые могут участвовать 'в метаболической активации и детоксикации циклофосфамида.

Мышам вводили внутрибрюшинно циклофосфамид (по 25 мг/кг 1 раз в день в течение 3-х дней). Животных в эксперимент брали через сутки после последнего введения циклофосфамида.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что введение циклофосфамида существенно снижает содержание витамина А в печени, увеличивает относительную массу печени (что очевидно является следствием токсического гепатита), снижает выход белка и фосфолипида микросом, активность монооксигеназ, редуктаз, алкоголь- и альдегиддегидроге-наз, арилэстеразы, глутатион-З-трансферазы, уровень восстановленного глутатиона, но повышает уровень окисленной его формы. Дефицит ретинола усугублял влияние циклофосфамида на указанные показатели, тогда как дополнительное его введение препятствовало токсическим эффектам этого вещества.

Влияние дефицита и дополнительного введения витамина А на

токсичность для крыс нитро Зэдиметиламина

дефицит ретинола

Таблица 4

Влияние различной обеспеченности витамином А на индуцируемые циклофосфамидом изменения в печени мышей линии С 57 В1/6 (средние величины из 16-18 наблюдений, М+т)

Активность ферментов, нмоль/мин на 1 мг белка Недостаточность Контроль пар-нопитающийся Избыток витамина А

Ретиноиды, мкг/г печени 4. 4+1,2 50% 61.6+3.9 65% 234+13,3 75%

Относительная масса, % 5,6+0,18 133% 5. 3+0,12 114% 5,1+0, 13 105%

Выход белка микросом, мг/г 13,4+0,2 89% 16, 6+0, 32 92% 19, 0+0, 20 94%

Выход фосфолипида, мг/г 2,20+0, И 63% 3, 37+0, 07 76% 4, 31+0, 16 80%

Деметилаза 1,42+0,17 61% 2, 90+0, 28 75% 1,73+0, 30 56%

Гидроксилаза 0,14+0,02 64% 0,18+0, 02 56% 0, 29+0, 03 71%

NADH-редуктаза 28,8+2,5 82% 38,2+3,5 80% 51,5+3, .7 88%

NADPH-редуктаза 9,3+1,4 65% 13,0+1.6 69% 21,3+3, 2 75%

Алкогольдегидрогеназа 0,36+0.17 17% 1,28+0,23 24% 2, 93+0, 19 47%

Альдегиддегидрогеназа 1,53+0,21 27% 3,25+0,46 52% 4, 20+0, 50 64%

Арилэстераза 405 + 37 43% 812 + 71 55% 1107+ 53' 67%

Глутатион-Б-трансфераза 140 + 13 40% 189 + 16 65% 220 + : L2 88%

GSH, мкмоль/г 2, 33+0,19 47% 3, 52+0, 30 79% 3,68+0, ,25 87%

GS-SG, мкмоль/г 0,8+0,04 210% 0,5+0,06 : 1.71% 0, 26+0, ,02 130%

Примечание: в % выражены изменения показателей между животными по-

лучавшими и не получавшими циклофосфамид (таблица 1).

4. Влияние витаминов А и Е на токсичность нитрозодиметиламина и активность ферментов, участвующих в его биотрансформации

В биотрансформации нитрозодиметиламина принимают участие многие ферментные системы, которые продуцируют электрофильные метаболиты, или участвуют в их детоксикации. Дефицит витамина А усиливает токсичность нитрозодиметиламина, а дополнительное введение ретинола ацетата ослабляет. Так, в контроле длительность жизни крыс составляет 4, 0+0,35 дня. у ретинолдефицитных животных - 2,0+0,41, а у

кшс, получавших витамин А дополнительно - 5,06+0,28 дня. Ввелрнио юо мг/кг тилид/сроло. „г-«""-«"»- крыс оолее чем вдвое.

Нами исследовано влияние обеспеченности крыс витаминами А и Е на вызываемые нитрозодиметиламином повреждения печени.

Оказалось, что введение нитрозодиметиламина вызывает снижение активности монооксигеназ, редуктаз, глутатион-Э-трансферазы и глу-татионредуктазы, концентрации восстановленного глутатиона, при одновременном возрастании уровня окисленного глутатиона и малонового диальдегида (рис. 3). Наиболее значительные сдвиги регистрировались у ретинол-дефицитных и контрольных крыс. Дополнительное введение витамина А смягчает воздействие нитрозодиметиламина. Дефицит витамина Е также усугубляет токсическое действие генотоксина на изученные показатели, тогда как дополнительное введение токоферола уменьшает масштабы изменений со стороны исследованных показателей в печени крыс (рис. 4).__=_!_

I Г

100

гашсиш трн-РмятАЗ* сзз сзз-ч?-^ еза-?аит Рис. Влияние витамина А на индуцированные нитрозодиметиламином, изменения в печени. Величина показателей у крыс не подвер-

Рис. Влияние токоферило. на индуцированные нитрозодиметиламином, изменения в печени. Величина показателей у КРЬ!С не подвергавшихся воздействию нитрозодиметиламина принята за юо к

4. Мутаген диоксидин, полученный из ВНИИХФИ им.С. Орджоникидзе вводили внитрибюшинно на срок 24 часа в дозе 100 мг/кг животным, содержащимся на гипо- и гипердиете по витамину А.

Метафазные препараты и их анализ осуществляли в соответствии с процедурой, описанной Dean (1969).Все контрольные и экспериментальные группы включали 4-5 животных. От каждого животного анализировали на более 100 клеток.Статистический анализ (F-критерий) проводили путем сравнений долей поврежденных метафаз в опытах и контроле, в качестве хромосомных повреждений учитывали гепы, одиночные и парные фрагменты, обмены хромосом.

В исследовании использовали 4 группы животных.Первая группа -негативный контроль (НК), включала самцов мышей линии С57В1/6, содержащихся на стандартном пищевом рационе в виварии. Точно такие же, но обработанные диоксидином (100 мг/кг) животные составляли группу позитивного контроля (ПК).Экспериментальные серии составили животные получившие диоксидин в той же дозе, но содержащиеся в условиях гипер- (ГРВ-группа) и гиповитаминоза А (ГОВ-группа).

Результаты цитогенетического анализа клеток костного мозга животных указанных групп представлены в таблице М 5. В анализе НК всего было установлено 1.2+0.5 % поврежденных клеток. В ПК - 11.3+1.6 % поврежденных метафаз, что статистически достоверно (Р<0. 001).Таким образом, это подтверждает мутагенность диоксидина. В группе гиперконтроля выявленно 7.0+1.3 % аберрантных метафаз, что статистически достоверно превышает значение НК. статистически одновременно значительно ниже данных полученных в ПК. Это говорит о том, что на фоне гипервитаминоза А значительно снижаются все регистрируемые категории хронических повреждений. У гиповитаминозной группы результаты практически не отличаются от полученных в ГРВ-группе.

Частичная проверка указанного вопроса была осуществлена в рамках указанной работы.Испытание комбинации "диоксидин+бемитил" на ин-тактных животных позволил зафиксировать статистически достоверное снижение эффекта мутагена с 11,3±1.6 % до 7.3+1.1 % поврежденных клеток, что подтверждает ранее опубликованные сведения о способности бемитила ингибировать мутагенные свойства диоксидина.С другой стороны, аналогичные ¿липерименты, выполненные на животных с гипер-ИПи л-миивитаминозом А, не продемонстрировали какого-либо влияния

эмитила на мутагенный эффект диоксидина. В обоих случаях результа-а, зарегистрированные после использования комбинации "диокси-ин+бемитил" не отличались от данных, зарегистрированных после при-енения отдельно взятого диоксидина.

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что сба-знсированное питание приводит живой организм в состояние большей увствительности к действию мутагенов, чем гипо- или гипервитаминоз

Таблица N 5 Влияние бемитила на цитогенетические эффекты диоксидина у мышей линии С57В1/6

Условия эксперимента Число на 100 клеток Кол. повр. клеток Уров. знач.

мыш. кл. гепы од.фр. пар.фр. обм. всего хром, повр. клеток с множ. повр

ОДНОКРАТНОЕ ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА 100 мг/кг

1. Мыши содержались на нормальной диете

контроль ЦН+бемитил 4 4 400 400 0.5 1.0 5.75 2.75 3.0 2.5 1.25 0 10.0 5.25 2.25 1.5 11.25 7.25 дост.

2.Дефицит по витамину А

{онтроль ЦН+бемитил 4 4 400 400 0.25 0.5 3.0 3.5 2.75 0.75 0 0.25 5.75 4.0 1.0 0.25 6.25 4. 0 знач.

3.Избыток по витамину А

{онтроль ЦН+бемитил 4 5 400 500 0.25 0.4 3.25 3. 2 2.0 0.6 0.25 0 5.5 3.8 1.75 0.4 7.0 5.25 знач.

ВЫВОДЫ

1. Дефицит витаминов А и Е приводит к снижению содержания фосфоли-пидов в микросомах печени мышей и крыс, к падению активности де-метилазы, гидроксилазы, !ШН- и МБРН-редуктаз, алиэстеразы, арилэстеразы, амилэстеразы, алкоголь- и альдегиддегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионпероксиазы.Однако недостаточность ретинола сопровождается увеличением содержания восстановленного глутатиона и активности глутатион-Б-трансферазы. Дефицит токоферола вызывает противоположные сдвиги этих показателей.

2. Дополнительное введение ретинола ацетата, ретиноевой кислоты стимулирует активность монооксигеназ, редуктаз, эстераз, алкоголь- и альдегиддегидрогеназ, УДФ-глюкоронилтрансфераз, причем эффект ретиноевой кислоты превосходил таковой у ретинола и бета-каротина. Введение токоферола ацетата мало влияло на указанные показатели, снижая только интенсивность перекисного окисления липидов и уровень окисленного глутатиона.

3. Дефицит витаминов А и Е усиливает токсичность циклофосфамида и его депримирующее действие на синтез антител и увеличивает концентрацию алкилирующих метаболитов в плазме крови мышей, а дополнительное введение ретинола ацетата, бета-каротина оказывает противоположное действие. Токоферол ацетат не изменяет иммунот-ропный эффект циклофосфамида и уровень алкилирующих метаболитов.

4. Циклофосфамид ингибирует ферментные системы печени, снижает уровень восстановленного глутатиона, активирует процессы перекисного окисления липидов и повышает содержание окисленного глутатиона. Недостаточность витамина А усиливает воздействие циклофосфамида, а дополнительное введение ослабляет его.

5. Недостаточность витаминов А и Е увеличивает, а дополнительное введение ретинола ацетата и токоферола ацетата уменьшает токсичность нитрозодиметиламина, индуцируемую канцерогеном активацию перекисного окисления липидов и его неблагоприятное действие на ферментные системы печени, уровень глутатиона.

6. Цитогенетическое исследование показало, что мыши линии С57В1/6 в состоянии гипо- и гипервитаминоза А имеют меньшую чувствительность к кластогенному действию диоксидина в дозе 100 мг/кг. чем те же животные, которые содержались на сбалансированном питании.

7. Состояние гипо- и гипервитаминоза А препятствует реализации анти-

мутагенных свойств бемитила, что вании этого препарата в качестве диоксидина.

должно учитываться при использо-корректора мутагенных эффектов

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Понтюк А А. , Н. В.КатсиЯчуч. К. В. Столярчук. А. П. Лкчг.о,М. II. Червяк.

'Влияние уровня вит-дчииа А на проявление гиютоксическог' действия НДМА (нитроя 'ликетпламина). /Тезисы докладов XI Объели ненной научной .'¿елико-технической конференции.Винни-

па. 1993, с. 50-51.

д. Пентюк А. А. , А. Д. Дурнев, Н. В. Матвийчук, В. И. Гуцол. А. Н. Явор; кии, С.Б.Середенин //Витамин А и ферментные системы метабол! ческой активации генотоксических соединений./Веста

РАМН. -1995. -1. с. 3-9. О' Нлкяркия А. л. , Н. В. Матвиичук, Б. М. I'отошин/ '/Влияние препаратов ¡)^ тхнола и токоферола на образование алкилирувших метаболитов пи; ло^оодамида и активно ?ть ферментов, участвующих в его биотраьа формации./Тезисы докладов XIV Объединенной научной медико-технл ческой конференции. Винница-Киев, 1996, с. 21-*?.. 4. Матвийчук Н. В., В. М. К •тошин//Модуляция ретиноле.' и токофероле активности ферментов метаболизма ксенобиотиков - возможный мехе низы ослабления токсичности нитрозодиметилампна./Тезисы доклах XIV Объединенной научной медико-технической кон-ререиции.Винни ца-Киев, 1996, с. 25.