Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:ДНК-повреждения в формировании этанол-индуцированных пре- и постнатальных нарушений у потомства крыс и их коррекция афобазолом

На правах рукописи

Шредер Екатерина Дмитриевна

ДНК-ПОВРЕЖДЕНИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ЭТАНОЛ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ПРЕ- И ПОСТНАТАЛЫШХ НАРУШЕНИЙ У ПОТОМСТВА КРЫС И ИХ КОРРЕКЦИЯ АФОБАЗОЛОМ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О ОКТ 2014

МОСКВА-2014

005554042

005554042

Работа выполнена в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

чл.-корр. РАН Дурнев Андрей Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ревазова Юлия Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Сычева Людмила Петровна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени

Б. Д. Гольдберга»

Защита состоится «_»_2014 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» по адресу. 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в учёной части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Употребление алкоголя во время беременности часто приводит к невынашиванию беременности и к появлению у потомства морфологических аномалий и поведенческих расстройств (Шилко В.И, 2009).

Хорошо известен фетальный алкогольный синдром новорожденных (ФАС), который характеризуется фенотипическими отклонениями (сглаженный носогубный желобок, тонкая кайма верхней губы, микрофтальмия), наличием дефицита веса и роста, структурно-функциональными нарушениями центральной нервной системы, снижением когнитивных и социальных возможностей у потомства (Mattson S.N., 2001; Basford D.L. 2004; Akers K.G., 2011).

По данным TERIS (Teratogen Information System) величина тератогенного риска, связанного со злоупотреблением алкоголем во время беременности, достаточно высока. В России 60% женщин во время беременности потребляет алкоголь минимум однократно, из которых 35% опрошенных многократно (Kristjanson A.F., 2007). В зависимости от региона, частота рождения детей с различными врожденными нарушениями, возникающими в связи с пренатальным воздействием алкоголя на плод, колеблется от 3,5% до 45% новорожденных (Баринская Т.О., 2007; Farag М., 2011; Popova S., 2011).

Таким образом, не вызывает сомнения негативное влияние потребления алкоголя на вынашивание беременности и постнатальное развитие потомства.

Возникновение пре- и постнатальных нарушений под действием этанола в основном объясняется его нейротоксическим/цитотоксическим действием (Hamre К.М., 1993; Goodlett C.R., 2005; Riley Е.Р., 2005).

Одновременно с этим, существуют данные о сопряженности цитотоксического, нейротоксического и ДНК-повреждающего действия отдельных химических соединений (Kruman I.I., 2012) и свидетельства о мутагенах/генотоксикантах как потенциальных тератогенах (Diehle S.R., 1993; Бочков Н.П., 2011), что предполагает существование генотоксического механизма индукции пре- и постнатальных нарушений.

Свидетельства в пользу генотоксичности этанола, полученные в экспериментальных тест-системах с использованием соматических клеток in vitro и in vivo, единичны, а данные, отрицающие подобную активность, многочисленны (Ellahueñe М. F., 2012; Kenjiro Т., 2013). Вопрос о ДНК-повреждающем влиянии

этанола или его метаболитов на эмбриональные клетки остается открытым. В доступной литературе не обнаружено сведений об оценке ДНК-повреждающей активности этанола в клетках эмбрионов, внимание фокусировалось исключительно на цитогенетических повреждениях.

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» был разработан вариант методики «ДНК-комет», позволяющий регистрировать повреждения ДНК в эмбриональных клетках, и получены данные, свидетельствующие о корреляциях между предмутационными поражениями ДНК эмбриональных клеток и нарушениями пре- и посгнатального развития при действии ряда агентов (Дурнев А.Д., 2009; Дурнев А.Д., 2010; Никитина В.А., 2011).

В рамках настоящей работы была сформулирована рабочая гипотеза о способности этанола индуцировать повреждения ДНК в эмбриональных клетках, вовлеченности повреждений ДНК в формирование пре- и постнатальных нарушений развития потомства, получавшего этанол в период внутриутробного развития, и проведена ее экспериментальная проверка. В том числе, через оценку влияния афобазола, обладающего антимутагенными свойствами (Жанатаев А.К., 2010), на проявление ДНК-повреждающих эффектов этанола, пре- и постнатальных нарушений, возникающих под его воздействием.

Цель исследования. Оценка роли повреждений ДНК эмбриональных клеток в формировании нарушений пре- и постнатального развития потомства крыс, подвергнутого внутриутробному воздействию этанола, и исследование влияния антимутагена афобазола на проявления генотоксических, тератогенных эффектов и поведенческих нарушений постнатального развития.

Основные задачи исследования.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить этанол-индуцированные ДНК-повреждения в плацентарных и эмбриональных клетках в период активного органогенеза крыс.

2. Оценить влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг на генотоксические эффекты этанола в плаценте и эмбриональной ткани в связи с пренатальными отклонениями в развитии потомства крыс.

3. Оценить влияние афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг на генотоксические эффекты этанола в плаценте и эмбриональной ткани в связи с постнатальными отклонения в развитии у потомства.

4. Выявить связь генотоксических эффектов этанола в плаценте и эмбриональной ткани с пренатальными отклонениями в развитии потомства крыс на основе использования метода «ДНК-комет» и классических методов оценки репродуктивной токсичности лекарственных средств.

5. Выявить связь генотоксических эффектов этанола в плаценте и эмбриональной ткани с поведенческими нарушениями у потомства экспериментальных крыс в постнатальный период развития.

Научная новизна. Выявлены ранее неизвестные генотоксические эффекты этанола в эмбриональных клетках эмбрионов крыс, впервые установлена и подтверждена в экспериментах с антимутагенным модификатором вовлеченность повреждений ДНК в формировании пре- и постнатальных нарушений у потомства крыс.

Впервые установлено, что афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при введении во внутриутробный период снижает генотоксические эффекты в клетках эмбрионов и плацент и корригирует поведенческие нарушения у потомства крыс, подвергнутых действию этанола в период беременности.

Полученные данные обосновывают представления о значимости повреждений ДНК в формировании нарушений пре- и постнатального развития и подкрепляют сведения, указывающие на генотоксиканты/мутагены как потенциальные эмбриотоксиканты/тератогены.

Научно-практическая значимость. Выявление способности афобазола предупреждать этанол-индуцированные генотоксические эффекты и связанные с ними фетальные нейротоксические, поведенческие отклонения в развитии потомства крыс в совокупности с ранее достигнутыми данными, указывающими на сходные эффекты афобазола в отношении других генотоксических эмбриотоксикантов, создают основу для разработки афобазола в качестве возможного средства профилактики и коррекции отдаленных последствий пренатальных нарушений, индуцированных этанолом и другими эмбрионально-тропными генотохсикантами.

Выявление корреляционных зависимостей между повреждением ДНК эмбриональных и плацентарных тканей и пре- и посгнатальными нарушениями у потомства на разных патологических моделях даегг основания для разработки подходов к применению метода ДНК-комет в области пренатальной диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Этанол в дозе 1,6 г/кг с 10 по 13 день беременности индуцирует ДНК-повреждения в эмбриональных и плацентарных клетках крыс. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг, при пероральном введении в те же сроки, снижает уровень этанол-индуцироваяных ДНК-повреждений в этих клетках.

2. Этанол в дозе 1,6 г/кг с 10 по 19 день беременности вызывает нейротоксические поражения головного мозга и замедление оссификации у эмбрионов крыс. Афобазол, при пероральном введении в дозах 1 и 10 мг/кг в те же сроки, корригирует эти нарушения.

3. Этанол в дозе 1,6 г/кг с 10 по 19 день беременности вызывает нарушения формирования сенсорно-двигательных рефлексов, снижение ориентационно-исследовательской, когнитивной функций, уменьшает способность избегать стресс-ситуацию и повышает тревожность у потомства, пренатальное введение афобазола перорально в дозе 1 и 10 мг/кг корригирует эти этанол-индуцированные нарушения у потомства крыс.

4. Установлена корреляция между повышением уровня поврежденности ДНК в тканях эмбрионов и плацент и формированием пре- и постнатальных нарушений у потомства. Коррекция этанол-индуцированных ДНК-повреждений афобазолом приводит к уменьшению количества нарушений, что подтверждает неформальный характер выявленных корреляций.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии в получении исходных данных, их систематизации и апробации результатов исследования. Автором лично выполнена экспериментальная и аналитическая часть диссертации, сформулированы положения и выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на 4-ом Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), конференции молодых ученых «Татьянин день» в ПМГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), 17-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их

решения» (Москва, 2011), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), Первой всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013), а также представлены на внутрилабораторной конференции с привлечением заинтересованных лиц 18 июня 2014 года.

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 5 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 главе в книге, изданной за рубежом, 10 тезисах докладов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Иллюстрирована 19 таблицами и 41 рисунком. Библиографический указатель включает 86 отечественных и 116 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали беспородных белых крыс массой 200-250 г (питомник «Столбовая» РАМН). Общее количество животных, использованных в экспериментах, составило: взрослых 240 самок и 50 самцов, инфантов 100 самок и 100 самцов, 2109 эмбрионов. Содержание животных в виварии соответствовало Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Беременности достигали путем ссаживания самок с самцами по схеме 2 самки - 1 самец, день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках принимали за 1-й день беременности.

Экспериментальную модель пренатальной алкоголизации создавали введением 40 об% этанола (per os, в дозе 4,3 мл/кг - 1,6 г/кг чистого этанола) самкам с 10 по 19 день беременности. В качестве антимутагена и возможного фармакологического корректора пре- и постнатальных нарушений использовали афобазол (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибетимидазола гидрохлорид) - оригинальный селективный анксиолитик, разработанный в ФГБНУ «НИИ Фармакологии им. В. В. Закусова» (Per. № ЛС-000861 от 03.11.2005). Выбор доз афобазола осуществляли в соответствие с данными предыдущих исследований, в частности, по оценке его

антимугагенных и антитератогенных свойств (Середенин С.Б., Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., 2000, Шредер О.В., Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 2009).

Беременных крыс распределяли случайным образом в одну из пяти групп: контрольная (1 группа), модельная (2 группа), группа постнатального лечения (3 группа) и две группы пре- и постнатального лечения (4 и 5 группы). Самкам модельной и экспериментальных групп ежедневно с 10-го по 19-й дни беременности вводили 40 об% этанол, per os. Крысам 4 и 5 групп после обработки этанолом вводили афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг, per os, соответственно, и в послеродовой период (200 мг/кг, per os) в течение 20 дней. Самки группы постнатального лечения получали афобазол (200 мг/кг, per os) только в период вскармливания крысят в течение 20 дней (Шредер О. В. и соавт., 2010). Животным контрольной группы вводили per os физиологический раствор с 1-го дня беременности по 20-й день вскармливания крысят.

Принципы и методы эмбриотоксических исследований соответствовали требованиям методических рекомендаций (Дурнев А.Д. и соавт. 2012). Было исследовано 436 эмбриона от 40 экспериментальных беременных самок. Самок выводили из эксперимента на 20 день беременности с использованием гильотины. После вскрытия самок проводили оценку желтых тел, мест имплантации. Регистрировали число живых и мертвых плодов, наличие аномалий развития, массу и кранио-каудальный размер. Анализ аномалий развития внутренних органов и скелета плодов осуществляли общепринятыми методами Вильсона и Доусона в модификации Дыбана (Дыбан А.П., 1986). Для дифференцированного окрашивания скелета (кости и хрящи) использовали метод двойного окрашивания П. Петерса (Peters Р., 1977). Статистическую обработку результатов исследования эмбриотоксичности проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, нормальность распределения проверяли при помощи критерия Шапиро-Уилкса.

Этанол-индуцированные ДНК-повреждения в клетках плацент и эмбрионов моделировали пероральным введением 40 об% этанола в дозе 1,6 г/кг (4,3 мл/кг) с 10 по 13 день беременности крыс. Афобазол вводили перорально в дозах 1 и 10 мг/кг после обработки этанолом. Животных выводили из эксперимента на 13 день беременности (день активного эмбриогенеза мозга), через 3 и 6 часов после последней обработки афобазолом и/или этанолом, вскрывали матку, извлекали эмбрионов и плаценты для оценки целостности ДНК. Анализ ДНК в тканях плацент и

эмбрионов проводили методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») в соответствии с рекомендациями. Регистрировали показатели «% ДНК в хвосте кометы» (далее «% ДНК в хвосте») и количество «апоптотических ДНК-комет». (Дурнев А. Д., Жанатаев А. К. и соавт., 2012). Общая схема метода включала приготовление гель-слайдов, получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток. Было исследовано 1673 эмбриона от 150 самок. При статистической обработке учитывали среднее значение показателя поврежденности ДНК. Повреждения более 50 % ДНК эмбриональных и плацентарных тканей оценивали как «апоптотические кометы». Проверку нормальности распределения в выборках животных осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Достоверность различий средних значений поврежденности ДНК эмбрионов и плацент контрольной и экспериментальных групп животных оценивали методом параметрического дисперсионного анализа с использованием критерия Ньюман-Кеулса.

Изучение влияния афобазола на формирование сенсорно-двигательных рефлексов проводили на 5 день развития крысят в тестах «переворачивание на плоскости» и «избегание края».

Исследование когнитивной деятельности потомства крыс проводили на модели формирования пшцедобывательного навыка в условиях свободного выбора (установка «Т-лабиринт» (T-maze test), поливинилхлорид, высота стенок 32 см, НПК «Открытая Наука», Россия). В течение 5 дней животные совершали по 5 побежек длительностью 5 минут (300 сек). Длительность пищевой депривации перед началом эксперимента составляла 24 ч. Когнитивная задача состояла в целенаправленном достижении пищевого подкрепления в условиях свободного выбора (результат обучения), находящегося в кормушке одного из рукавов лабиринта, в пределах фиксированного времени проведения эксперимента (скорость достижения цели). Регистрацию и обработку условно-рефлекторных показателей обучения осуществляли с помощью программного обеспечения RealTimer (процедурный таймер) НПК «Открытая Наука» (Россия). Исследование ориентировочно-исследовательской деятельности и уровни тревожности у половозрелого потомства алкоголизированных крыс изучали в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт».

Этих же животных исследовали в установке тест «Экстраполяционное избавление» (ТЭИ) на предмет способности избегать стресс-ситуацию. Все показатели фиксировали отдельно для самцов и самок.

В поведенческих исследованиях проверку нормальности распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Определение уровня статистической значимости изменений осуществляли методами непараметрической статистики. Использовали метод множественных сравнений, основанный на знаковых рангах Вилкоксона, и критерий Манна-Уитни с учетом множественности сравнений. Всего было исследовано 100 самок и 100 самцов в возрасте от 2 до 3 месяцев. При оценке взаимосвязи между показателями поврежденности ДНК плацент и эмбрионов и выходом аномалий головного мозга у плодов на 20 день развития, а также показателями поведенческих и когнитивных нарушений, использовали коэффициент корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ /. Модель пренатальной алкоголизации крыс Первым этапом исследования явилась отработка модели пренатальной алкоголизации крыс. Выбор доз осуществляли в соответствии с ранее известными сведениями об эмбриотоксических свойствах этанола (Львова Ю.А., 2004). Была поставлена предварительная задача по подбору дозы, в которой этанол вызывает генотоксический и эмбриотоксический эффект без увеличения гибели эмбрионов и алкоголизированных самок. В процессе отработки экспериментальной модели использовали 40 об% этанол в дозах 1,6 г/кг, 2,2 г/кг и 3,0 г/кг в пересчете на чистый этанол.

Таблица 1

Этанол-индуцированные ДНК-повреждения в эмбриональных и плацентарных тканях

К] выс

Группа Объект исследования Время экспозиции (час! % ДНК в хвосте (ср. зн.) «Апоптоти-ческие кометы» (CD. HI.) Количество исследованных клеток (абс. знЛ

Контроль плацента 3 2,25±0,36 1,50±0,17 543

эмбрион 3,79±0,44 2,00±0,40 1105

Этанол (40 об%) 1,6 г/кг плацента 11,61±1,66* 5,00±1,32* 1422

эмбрион 10,62±1,02* 2,80±0,63 1353

Контроль плацента 6 2,82±0ДЗ 1,60+0,23 481

эмбрион 2,89±0,16 2,00±0,38 1342

Этанол (40 об%) 1,6 г/кг плацента 10,36±0,57* 9,94±2,36* 970

эмбрион 10,19±0,68* 3,92±1,35 749

Условные обозначения: * - Статистически значимые различия (Р < 0.05) по сравнению с контролем

При введении этанола в дозах 2,2 и 3,0 г/кг у крыс наблюдались признаки общей интоксикации организма, которая приводила к гибели до 50 % беременных самок. При использовании этанола в дозе 1,6 г/кг, были зарегистрированы генотоксические эффекты в тканях плацент и эмбрионов (таблица 1) и эмбриотоксические эффекты в виде различных аномалий головного мозга 20 дневных эмбрионов экспериментальных крыс, без увеличения гибели беременных самок (см раздел 3.1).

Таким образом, были определены условия получения экспериментальной модели пренатальной алкоголизации крыс - введение 40 об% этанола в дозе 1,6 г/кг, per os, с 10 по 19 день беременности, позволяющие проводить исследование эмбриотоксических и генотоксических эффектов этанола, а также оценку фармакологической коррекции выявляемых эффектов с помощью афобазола.

2. Исследование влияния афобазола на ДНК-повреждения в эмбриональных и плацентарных клетках крыс.

У контрольных крыс на 13 день беременности степень фрагментации ДНК в клетках плацент варьировалась в диапазоне 2,3 - 2,8 % «ДНК в хвосте», а у эмбрионов 2,9 - 3,8 % «ДНК в хвосте». Количество «апоптотических комет» в клетках плацент составило 1,5 % - 1,6 %, а эмбрионов - 2 % от общего числа исследованных клеток. Эти результаты сходны с данными, характеризующими поврежденность ДНК у контрольных крыс, полученными в независимых исследованиях (Дурнев А.Д. и соавт. 2010).

Плацента

■ ДНК-коыеты (3-часа)

• ДНК-кометы (6-часов)

■ Апо1гтот11чес кие кометы (3-часа) • Апо1тшт1|чес кис кометы (6 часов)

Контроль Этанол 40 обН Эшгол 40 об% + Этанол 40 обН +

афобазол 1 мг'кг афобазол 10 ыг/кг Груши

Рисунок 1а. Влияние афобазола на этанол-индуиированные ДНК-повреждения в клетках плаценты крыс. По вертикали - % ДНК в хвосте, по горизонтали - условия обработки животных.

Условные обозначения: * - статистически значимые различия (Р <0,01) по сравнению с контролем; ■ - статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с результатами, характеризующими генотоксический эффект этанола, через 3 часа после обработки крыс; # - статистически значимые различия (Р С 0,00 ПО сравнению с результатами, характеризующими генотоксический эффект этанола, через 6 часов после обработки крыс.

На фоне введения этанола в дозе 1,6 г/кг наблюдалось значимое повышение поврежденное™ ДНК в плацентарных и эмбриональных клетках крыс до 10,2-11,6 % «ДНК в хвосте» (Рисунок 1 а,б).

В плацентарных клетках было отменено значимое повышение количества «апоптотических комет». Через 3 часа после введения этанола количество «апоптотических комет» составило 5,0 %, через 6 часов - 9,9 %.

Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг через 3 часа после введения не оказывал значимого действия на проявление генотоксических эффектов этанола в клетках плаценты. Через 6 часов препарат в обеих дозах снижал уровни «апоптотических комет» до контрольных значений. В тот же срок афобазол в дозе 1 мг/кг не влиял, а в дозе 10 мг/кг значимо, вплоть до контрольных значений, снижал генотоксический эффект этанола в плаценте (рисунок 1а).

В эмбриональных клетках афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг значимо, вплоть до контрольных значений, снижал генотоксический эффект этанола через 6 часов после воздействия препарата (рисунок 1 б).

Таким образом, было установлено, что введение 40 об% этанола вызывает повреждение ДНК в клетках плацент и эмбрионов, а афобазол в дозе 10 мг/кг снижает эти эффекты до контрольных значений.

Эмбрион

■ ДНК-кометы (3-часа)

- ДНК-комет ы (6-часов)

•Ллоптотнчес кие кометы (Л-часа) ■ АПОПТО III1:;' кис кометы (6 часов)

Рисунок 16. Влияние афобазола на этанол-индуцироваиные ДНК-повреждения в клетках эмбрионов крыс. По вертикали - % ДНК в хвосте, по горизонтали - доза афобазола. Условные обозначения: * - статистически значимые различия (Р < 0.01) по сравнению с контролем; ■ - статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с результатами, характеризующими генотоксический эффект этанола, через 3 часа после обработки крыс; # - статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с результатами, характеризующими генотоксический эффект этанола, через 6 часов после обработки крыс.

Контроль Этанол 40 об% Этанол 40 обН + Этанол 40 обЧ+

афобазол ! мг/кг афобазол 10 мг/кг Группа

3. Влияние афобазола на эмбриотоксические эффекты этанола

В таблице 2 представлены результаты исследования влияния афобазола на эмбриотоксические эффекты этанола.

Таблица 2

Влияние афобазола на эмбриональное развитие плодов крыс, подвергнутых __действию этанола

Группа Число желт, тел/ самка Число мест имплан. / самка Пред имплан. гибель, % Число живых плодов/ самка Пост имплан. гибель, % Масса плодов, г Размер плодов, см

Контроль 9,82±0,44 9,64±0,47 1,85 9,64±0,47 0,00 2,85±0,06 3,01 ±0,02

Этанол 1,6 г/кг 9,43±0,97 9,14±1,10 1,52 8,7Ш,08 3,13* 2,48±0,03 2,88±0,03

Этанол + афобазол 1 мг/кг 11,57±0,48 1 1,42±0,37 1,23 11,42±0,37 0,00- 2,54±0,03 3,03±0,02

Этанол + афобазол 10 мг/кг 10,87±0,48 10,50±0,42 2,29 10,50±0,42 0,00- 2,61 ±0,04 3,05±0,01

Условные обозначения:

* - Статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с контролем.

" - Статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с результатами, характеризующими эмбриотокснческий эффект этанола.

Было установлено, что введение этанола крысам с 10 по 19 день беременности приводит к значимому повышению постимплантационной гибели плодов до 3,13 %, по сравнению с контрольной группой животных. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг снижал показатель постимплантационной гибели до контрольных значений.

3.1 Исследование внутренних органов плодов

Макроскопическое исследование плодов, подвергнутых пренатальному действию этанола, не выявило внешних аномалий развития.

Исследование внутренних органов показало, что действие этанола в период внутриутробного развития приводит к формированию различных аномалий головного мозга эмбрионов (рисунок 2).

У эмбрионов группы 2 были зарегистрированы патологические изменения в структуре головного мозга: односторонняя у 14 % эмбрионов и двусторонняя (27,9 %) гидроцефалия, левосторонняя (30,2 %) и правосторонняя (39,5 %) гидроцефалия, гидроцефалия среднего желудочка (25,6 %), а также аномальный морфогенез мозга (9,3 %). У эмбрионов крыс, получавших афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг на фоне воздействия этанола, наблюдалось значимое дозозависимое снижение показателей поврежденности мозговых структур эмбрионов (рисунок 2).

13

Нейротоксические повреждения были обнаружены у 72 % эмбрионов, пренатально подвергнутых воздействию этанола. В контрольной группе этот показатель составил 0 %, а у эмбрионов, получавших внутриутробно вместе с этанолом корректор афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг, повреждения мозга зафиксированы только у 38 % и 8 % эмбрионов, соответственно, что значимо ниже, чем под воздействием этанола per se.

Таким образом, было установлено, что пренатальная алкоголизация беременных крыс приводит к формированию широкого спектра этанол-индуцированных поражений головного мозга эмбрионов. Отмечено снижение количества эмбрионов с патологией головного мозга в группах животных, получавших афобазол. Более выраженный корригирующий эффект наблюдается при использовании афобазола в дозе 10 мг/кг.

~ Контроль Этанол Этанол + афойаадл Этанол + афобазол

^ I мг/кг 10 мг/кг

» двусторонняя гидроцефалия. (°о) ■ односторонняя гидроцефалия. (%)

Я гидроцефалия с расширением 3-го желудочка. (%) ■ Аномальный морфогенез мозга. (%) ■ Эмбрионы с нейротоксическнмн нарушениями." о

Рисунок 2. Влияние афобазола на индуцированное этанолом аномальное формирование эмбрионального мозга. Условные обозначения: * - Статистически значимые различия (Р < 0,05) по сравнению с контролем. ■ - Статистически значимые различия (Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими эмбриотоксический эффект отдельно взятого алкоголя.

3.2. Исследование костной системы плодов

В костной системе плодов, подверженных воздействию этанола в эмбриональный период, отмечено нарушение оссификации пястен, плюсен, тазовых костей и позвоночника.

Афобазол в дозе 1 мг/кг снижал количество плодов с нарушениями в области пястен, тазовых костей и позвонков до контрольных значений. Состояние костной системы пренатально алкоголизированных плодов, получавших афобазол в дозе 10 мг/кг, не от отличалось от контроля (таблица 3).

Таблица 3

Влияние афобазола на оссификацию точек окостенения на фоне повреждающего _действия этанола в эмбриональный период развития плода_

Показатели (количество точек окостенения) Контроль Этанол 1,6 г/кг Этанол + афобазол 1 мг/кг Этанол + афобазол 10 мг/кг

Кол-во эмбрионов 65 70 66 62

Количество точек окостенения пястн левая 2,80±0,13 1,73±0,15* 2,20±0,16*" 2,86±0,09-

правая 2,84±0,12 1,70±0,15* 2,13±0,16* 2,86±0,09-

Количество точек окостенения тазовых костей левая 3,00±0,00 2,44±0,11* 2,96±0,03" 2,98±0,02-

правая 3,00±0,00 2,44±0,11* 2,96±0,03- 2,98±0,02-

Количество точек окостенения плюсн левая 2,80±0,13 1,93±0,18* 2,35±0,18 2,88±0,10"

правая 2,84±0,12 1,93±0,18* 2,35±0,18 2,88±0,10-

Количество точек окостенения грудины 2,92±0,26 2,30±0,21 2,80±0,26 3,33±0,17"

Количество ребер 13,00±0,00 13,00±0,00 13,00±0,00 13,00±0,00

Количество позвонков 30,36±0,10 28,81±0,17* 30,00±0,12в 30,00±0,12-

Наличие затылочной кости (%) 100% 63 %* 85 %■ 95 %■

Условные обозначения:

* - Статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с контролем. • - Статистически значимые различия (Р < 0,01) по сравнению с результатами, характеризующими эмбриотоксическпй эффект этанола.

Таким образом, под действием афобазола наблюдается дозозависимое снижение количества плодов с диспластическнми изменениями костной системы 4. Влияние афобазола на когнитивное поведение потомства крыс, подвергнутых воздействию этанола в период беременности В таблицах 4 и 5 представлены данные, демонстрирующие способность афобазола корригировать когнитивные нарушения потомства алкоголизированных крыс, получавших афобазол.

4.1. Исследование влияния афобазола на формирование пищедобывательного навыка у крыс, подвергнутых действию этанола в период пренатального

развития

Контрольные самки и самцы в 1-й день тестирования осуществляли локальное знакомство со средой Т-лабиринта без проявления стрессовых реакций и брали пищевое подкрепление в кормушках при первом обнаружении (таблица 4). Значимое снижение времени достижения пищевого подкрепления у самок отмечено со 2-го, а у самцов с 3-го дня тестирования.

У животных 2 группы с 1-го дня тестирования наблюдали импульсивные реакции на новизну обстановки, которые сопровождались хаотическими побежками по площадке лабиринта. На фоне повышенной двигательной активности и усиления пищевой мотивации, со 2-го по 5-й день, эмоциональность самок и самцов этой группы сменялась агрессией в виде угрожающих стоек, повизгивания и нападения на руку исследователя в процессе тестирования. Самки и самцы группы 2 отличались от контрольных животных удлинением времени достижения пищевого подкрепления (1-3-й дни тестирования) на фоне повышенной двигательной активности и импульсивности, переходящей в активную форму проявления агрессии на незнакомую среду лабиринта и усиления пищевой мотивации, как дополнительного стрессирующего фактора. Показатель времени достижения пищевого подкрепления у самок и самцов 2 группы не имел значимых различий с контролем только на 4 день тестирования.

В группе самок пренатально алкоголизированного потомства, получавшего афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг, показатель времени достижения пищевого подкрепления не отличался от контрольных значений на 3 я 1 день соответственно, а у самцов уже на 2 и 1 день соответственно.

Необходимо отметить, что группа потомства, подвергнутого только постнатальной коррекции афобазолом в дозе 200 мг/кг (только в период лактации) была значимо меньше чувствительна к корригирующему действию афобазола, чем группы, получавшие и пре- и постнатально афобазол.

Примечательно, что у пренатально алкоголизированных самцов и самок, получавших афобазол в дозе 10 мг/кг в пре- и постнатальный период развития, характер поведенческих реакций в ответ на незнакомую среду и формирование когнитивной деятельности не отличались от таковых в контрольной группе животных.

Таким образом, было установлено, что пренатальное воздействие этанола вызывает когнитивные нарушения у потомства, выявляемые при исследовании формирования пищедобывательного навыка в тесте «Т-образный лабиринт», а использование афобазола внутриутробно в дозах 1 и 10 мг/кг приводит к значимому и дозозависимому снижению выявленных нарушений.

Таблица 4

Влияние афобазола на формирование пищедобывательного навыка у крыс, подвергнутых пренатальному воздействию этанола

Группа Время достижения пищевого подкрепления, сек (Медиана (25%-75%)) Число взятий пищевого подкрепления, абс.зн., (Медиана (25%-75%))

1 день | 2 день | 3 день | 4 день | 5 день 1 день | 2 день | 3 день | 4 день | 5 день

Самки

1 группа 13,54 (9,88-15,30) 5,78' (4,25-8,24) 3,68' (2,21+5,88) 3,58' (1,72+4,27) 5,45' (4,56+5,99) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5-5) 5 (5+5)

2 группа 55,14* (33,12+67,83) 15,98*' (10,36-25,75) 6,32*' (4,79+7,30) 4,20' (3,65+6,31) 4,56' (3,15+6,61) 4* (3+5) 51 (5+5) 5' (5+5) 5' (5-5) 5' (5+5)

3 группа 28,31* (22,85-37,25) 18,60* (13,90-27,23) 4,75' (4,06+10,72) 4,02' (2,74+5,59) 2,58*-' (1,94+2,70) 5- (5+5) 5 (5-5) 5 (5-5) 5 (5+5) 5 (5+5)

4 группа 46,32* (30,47-59,49) 16,99*' (11,49-23,66) 5,00' (4,45+15,59) 5,21' (4,85+14,59) 2,95*' (2,74+3,26) 5- (3+5) 5 (5-5) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5+5)

5 фуппа 20,57-(14,37-22,71) 7,71-' (7,51-15,55) 5,33' (1,64+6,91) 3,22' (2.73+3,56) 2,92*-' (2,54+3,43) 5- (5+5) 5 (5+5) 5 (5-5) 5 (5+5) 5 (5-5)

Самцы

1 группа 18,52 (9,79-29,09) 13,06 (8,25-17,98) 3,51' (2,93+6,33) 2,61' (2,22+4,26) 4,97' (3,85+5,50) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5+5) 5 (5+5)

2 группа 78,51* (31,89-93,97) 22,98*' (15,85-33,43) 9,99*' (7,24+15,54) 6,07' (4,20+10,02) 3,38' (2,19+4,54) 2* (2-4) 51 (4+5) 5' (5+5) 5' (5+5) 5' (5+5)

3 группа 58,06* (38,30-92,92) 19,51*' (17,20+44,49) 8,16*' (5,94+13,92) 5,07*' (3,39+6,81) 3,59' (2,71+4,84) 5- (4+5) 5 (5+5) 5 (5-5) 5 (5-5) 5 (5+5)

4 группа 44,27*-(24,58-46,72) 13,08' (9,60-23,04) 4,63' (3,36+11,76) 3,37-' (2,51+4,28) 2,18*-' (1,69+2,49) 5- (4+5) 5 (5-5) 5 (5-5) 5 (5-5) 5 (5+5)

5 группа 28,33-(14,66-39,90) 9,91-' (6,31+13,04) 4,35-' (3,66+8,53) 2,13-' (1,60+2,97) 1,46*-' (1,35+1,84) 5- (5+5) 5 (5+5) 5 (5-5) 5 (5+5) 5 (5+5)

Условные обозначения:

* - Статистически значимые различия (Р < 0,05) по сравнению с контролем, • • Статистически значимые различия (Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими эффект этанола, 1 - Статистически значимые различия (Р < 0,05) по сравнению с 1 днем.

Примечание:! группа - Контроль; 2 группа - Модель {40 об% этанол); 3 группа - Модель + постиатальное лечение афобазолом; 4 группа - Модель + пре- и постиатальное лечение афобазолом в дозе 1 мг/кг; 5 группа - Модель + пре- и постиатальное лечение афобазолом в дозе 10 мг/кг

4.2. Влияние афобазола на этанол-индуцированные нарушения у потомства крыс, выявляемые в условиях повышенного стресса

В тесте «экстраполяционного избавления» у потомства, пренатально получавшего этанол, было отмечено значимое повышение латентного времени поднырнвания под край цилиндра.

На фоне введения афобазола во всех группах увеличилось число животных, принявших адекватное решение в тесте «экстраполяционное избавление». Достоверное снижение латентного времени поднырнвания под край цилиндра было отмечено у самок и самцов 3, 4 и 5 группы (таблица 5).

Таблица 5

Влияние афобазола на способность крыс, подвергнутых пренатальному воздействию этанола, находить адекватное решение в стресс ситуации в тесте

Группа Пол Время в стакане,сек Время плавания, сек Дефекации Замирание

1 группа Самки 8,00-(5,00-И 2,00) 1,50 (0,00+2,00) 0,00 (0,00+1,00) 0,00 (0,00+1,00)

Самцы 13,50- (6,00-49,00) 4,50 (2,00+6,00) 1,00 (0,00+4,00) 0,00 (0,00+0,00)

2 группа Самки 53,50* (18,00+60,50) 3,00 (1,00+8,00) 0,00 (0,00+0,00) 0,00 (0,00+0,00)

Самцы 70,50* (17,00+120,00) ¡,50 (0,00+3,00) 1,50 (0,00+5,00) 0,50* (0,00+1,00)

3 группа Самки 16,50*-(12,00+28,00) 3,00* (2,00+5,00) 0,00 (0,00+1,00) 0,00 (0,00+0,00)

Самцы 11,50-(7,00+17,00) 5,00-(4,00+7,00) 0,00-* (0,00+0,00) 0,00-(0,00+0,00)

4 группа Самки 8,50-(7,00+15,00) 2,00 (1,00+7,00) 0,00 (0,00+0,00) 0,00 (0,00+0,00)

Самцы 6,00-* (3,00+8,00) 2,00 (1,00+3,00) 0,00-* (0,00+0,00) 0,00-(0,00+0,00)

5 группа Самки 11,50-(7,00+17,00) 4,50* (2,00+6,00) 0,00 (0,00+0,00) 0,00 (0,00+0,00)

Самцы 9,00-(6,00+15,00) 6,00-(5,00+10,00) 0.00 (0,00+2,00) 0,00-(0,00+0,00)

■ - Статистически значимые различия ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими эффект этанола Примечание: I группа - Контроль; 2 группа - Модель (40 об% этанол); 3 группа -Модель + постнатальное лечение афобазолом; 4 группа - Модель + пре- и постнатальное лечение афобазолом в дозе 1 мг/кг; 5 группа - Модель + пре- и постнатальное лечение афобазолом в дозе 10 мг/кг.

У самок группы постнатальной коррекции и на фоне введения афобазола в дозе 10 мг/кг было отмечено значимое увеличение латентного времени плавания в 3 и 2 раза соответственно. Также, у самцов, пренатально подвергнутых действию этанола, были зафиксированы достоверно высокие случаи замирания в

цилиндре, которые не отличались от контроля в остальных группах.

Таким образом, пренатальное воздействие этанола снижает у потомства способность избегать стресс-ситуацию в тесте «экстраполяционного избавления», а афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг значимо и дозозависимо корригирует эти нарушения.

4.3. Влияние афобазола на форм ирования сенсорно-двигательных рефлексов, ориентировочно-исследовательской деятельности и уровня тревожности у потомств, подвергнутого пренатальному воздействию этанола Результаты исследования влияния афобазола на формирования сенсорно-двигательных рефлексов, ориентировочно-исследовательской деятельности и уровня тревожности у потомства, подвергнутого пренатальному воздействию этанола изложены в тексте диссертации.

4.4. Корреляционный анализ полученных результатов Совокупность результатов проведенного исследования, позволяет заключить, что антимутаген афобазол корригирует проявления генотоксических и тератогенных эффектов, а также поведенческих нарушений, обнаруживаемых в постнатальный период развития крыс, пренатально подвергнутых повреждающему действию этанола.

Таблица 6

Нейротоксическ ие эффекты Генотоксические эффекты

% ДНК в хвосте Атигготические кометы % ДНК в хвосте Апопготические кометы

Плацента | Эмбрион Плацента | Эмбрион Плацента ] Эмбрион Плацента 1 Эмбрион

3 часа экспозиции 6 часов экспозиции

Двусторонняя гидроцефалия К=0,23 р =0,004 11=0,25 р =0,001 - - 11=0,31 р =0,000 11=0,25 р =0,001 - -

Односторонняя гидроцефалия 11=0,22 р =0,005 11=0,23 р =0,003 - - 11=0,22 р =0,005 11= 0,28 р =0,000 Я=0,17 р =0,026 -

Левосторонняя гидроцефалия 11=0,24 р =0,002 Я= 0,27 р =0,000 - - 4=031 р =0,000 11=0,27 р =0,000 - -

Правосторонняя гидроцефалия Я=0,31 р =0,000 Я=0,33 р =0,000 - Я-0,21 р =0,007 К» 0,39 р =0,000 Я= 0,36 р =0,000 Я=0,19 р =0,017 -

Гидроцефалия с расширением среднего желудочка 11=0,23 р =0,003 Я= 0,26 р =0,001 - Я=0,26 р =0,000 Я= 0,27 р-0,001 Я= 0,33 р-Ю,000 -

Аномальный морфогенез мозга - 11=0,16 р =0,037 11=0,15 р =0,046 - 11=0,23 р =0,003 11=0,17 р =0,030 Я= 0,24 р =0,002

Примечание. В таблице показана статистически значимая корреляция при р < 0,05

С помощью корреляционного анализа выявлены взаимосвязи между

повышением уровня поврежденное™ ДНК и апоптотических комет в тканях

эмбрионов и плацент и формированием этанол-индуцированных поражений

головного мозга у эмбрионов, что указывает на высокую значимость роли

19

генотоксических эффектов в нарушении морфогенеза эмбрионального мозга (таблица 6).

Аналогичным образом была выявлена взаимосвязь между повышением уровня поврежденности ДНК и апоптотических комет в тканях эмбрионов и

плацент и поведенческими нарушениями, выявляемыми у пренатально алкоголизированных крыс в постнатальный период развития (Таблица 7).

Таблица 7

Пока зател и обуч аемо стн д е н ь Генотоксические эффекты

% ДНК в хвосте Апоптотические кометы % ДНК в хвосте Апоптотические кометы

Плацента Эмбрион Плацента Эмбрион Плацента Эмбрион Плацента Эмбрион

3 часа экспозиции 6 часов экспозиции

САМКИ

Время достижения пищевого подкрепления 1 11= 0,53 р = 0,000 14= 0,73 р =0,000 Я= 0,30 р =0,031 И= 0,39 р =0,006 Я- 0,68 р =0,000 И' 0,67 р =0,000 Я= 0,47 р =0,001 -

2 - Р.= 0,42 р =0,002 - Я= 0,29 р =0,040 11=0,37 р =0,008 0,41 р =0,003 11=0,56 р =0,000 1*= 0,43 р =0,002

3 - - - Я= 0,38 р =0,007 - - - р =0,027

4 - Я-0,33 р =0,020 - - 11=0,30 р =0,034 - Я= 0,50 р =0,000 Я- 0,31 р =0,026

5 - - - 11=0,44 р =0,001 - - 11=0,29 р =0,041 -

Число взятий пищевого подкрепления 1 - - - - - - - -

2 - - - - - - - -

3 - - - - - - -

4 - - - - - -

5 - - - - - - - -

САМЦЫ

Время достижения пищевого подкрепления 1 11=0,60 р =0,000 К=0,65 р =0,000 11=0,37 р =0,009 Я-0,30 р =0,037 11=0,63 р =0,000 11=0,63 р =0,000 - -

2 - К =0,41 р =0,003 - 11=0,34 р =0,016 й=0,56 р =0,000 К-0,35 р =0,012 - -

3 - - Я=-0,41 р =0,003 - - - - -

4 - - 11=-0,32 р =0,024 - - - 11=0,35 р =0,012 -

5 - - - 11=0,34 р=0,015 11=0,28 р =0,045 - - 11=0,32 р =0,024

1 1 Ш 2 5 о 1 - - - - - - - -

2 Я= -0,41 р =0,003 К= 41,41 р =0,003 Я= -0,44 р =0,001 - - - Я= -0,34 р =0,016 -

3 - - - - - - - -

й а * »яч 2 в ° У с с 4 - - - - - - - -

5 - - - - - - - -

Примечание. В таблице показана статистически значима» корреляция при р < 0,05

***

Комплексный анализ совокупности результатов проведенного исследования позволяет заключить, что этанол способен индуцировать ДНК-повреждения в эмбриональных и плацентарных тканях крыс, вызывать нарушения пре- и постнатального развития крысят, проявляющиеся появлением аномалий внутренних органов и органических поражений эмбрионального мозга, приводящих к отсроченной поведенческой патологии в виде аномалий эмоциональной сферы и когнитивных расстройств у потомства.

На основании выявленных корреляций между уровнями поврежденности ДНК и количеством нарушений у потомства подтверждена рабочая гипотеза о вовлеченности ДНК повреждений в формирование этанол-индуцированных пре-и постнатальных нарушений у потомства крыс.

Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при различных режимах введения эффективно снижает генотоксические и нейротоксические эффекты этанола у эмбрионов. Установленная способность афобазола снижать генотоксически обусловленные тератогенные эффекты и поведенческие нарушения, индуцированные этанолом, явилась подтверждением широкого спектра протекторных свойств этого препарата, продемонстрировавшего антигенотоксические и антитератогенные эффекты в ранее проведенных исследованиях на других моделях экспериментального тератогенеза.

Способность афобазола снижать этанол-индуцированные генотоксические, эмбриотоксические, нейротоксические поражения и функциональные расстройства открывает перспективы для дальнейшего экспериментального и клинического изучения препарата в качестве средства профилактики и коррекции внутриутробной патологии различного генеза.

ВЫВОДЫ:

1. Этанол в дозе 1,6 г/кг при ежедневном пероральном введении с 10 по 13 день беременности самкам крыс значимо увеличивает уровень повреждений ДНК через 3 и 6 часов экспозиции после последнего введения в клетках плаценты до 11,6% и 10,4%, в клетках эмбрионов до 10,6% и 10,2% «ДНК в хвосте», соответственно.

2. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении с 10 по 13 день беременности значимо и дозозависимо вплоть до контрольных значений снижает уровни этанол-индуцированных повреждений ДНК в плацентарных и

21

эмбриональных клетках через 6 часов после введения и не проявляет значимой антигенотоксической активности при 3-х часовой экспозиции.

3. Этанол в дозе 1,6 г/кг при ежедневном перорапьном введении с 10 по 19 день беременности приводит к повышению постимплантационной гибели, возникновению у плодов нарушений развития мозга (односторонняя и двусторонняя гидроцефалия, гидроцефалии среднего желудочка, а также аномальному морфогенезу мозга) и замедлению оссификации на 20 день развития.

4. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном перорапьном введении с 10 по 19 день беременности значимо и дозозависимо снижает уровень постимплантационной гибели, нейротоксических повреждений и нормализует оссификацию у плодов до уровня контрольных значений.

5. Этанол в дозе 1,6 г/кг при пероральном введении с 10 по 19 дни беременности приводит к нарушению формирования сенсорно-двигательных рефлексов, ориентировочно-исследовательской деятельности, когнитивных функций, способности выходить из стресс-ситуаций и повышению уровня тревожности у половозрелого потомства ал ко голизиро ванных крыс.

6. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг при ежедневном пероральном введении в периоды пренатального развития и/или вскармливания крысят значимо снижает зтанол-индуцированные постнатальные нарушения развития у потомства крыс.

7. Выявлена корреляция между уровнем этанол-индуцированных повреждений ДНК в плаценте и эмбрионе и пре- и постнатальными нарушениями у потомства. Это указывает на вовлеченность повреждений ДНК в формирование этанол-индуцированных нарушений у потомства крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ На основе результатов проведенных исследований, рекомендуются:

1. Разработка афобазола в качестве средства профилактики и коррекции отдаленных последствий пренатальных нарушений, индуцированных этанолом и эмбриональнотропными генотоксикантами.

2. Использование модели алкоголизации беременных крыс для поиска фармакологических средств коррекции репродуктивных эффектов этанола и других ксенобиотиков.

3. Использование метода «ДНК-комет» для расширения представлений о вовлеченности повреждений ДНК в формирование тератогенных эффектов.

4. Разработка подходов к внедрению метода ДНК-комет в качестве возможного к разработке способа диагностики в области пренаталогии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Шредер, О.В. Модельное исследование распределения афобазола у беременных и кормящих самок крыс и новорожденных крысят [Текст]/О.В. Шредер, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, Д.В. Бастрыгин, Е.Д. Шредер, A.C. Соломина, А.О. Виглинская, В.В. Забродина, В.П. Жердев, А.Д. Дурнев, С.Б. Середении //Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, № 8. - С. 17-20.

2. Durnev, A.D. In vivo study of genotoxicity and teratogenicity of silica nanocrystals [Текст]/ A.D. Durnev, A.S. Solomina, N.O. Daugel-Dauge, A.K. Zhanataev, E.D. Shrcder, E.P. Nemova, O.V. Shreder, V.A. Veligura, L.A. Osminkina, M.B. Gongalsky, V.Yu. Timoshenko, S.B. Seredenin//Int. J. Biomedical Nanoscience and Nanotechnology. -2010. - Vol. 1. - № 1. - P.70-86.

3. Шредер, O.B. Сопряженность генотоксических и тератогенных эффектов, вызываемых циклофосфамидом, и их модификация афобазолом [Текст]/О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин// Гигиена и санитария. - 2011. - № 5,- С.64-68.

4. Шредер, Е.Д. Влияние афобазола на генотоксические и нейротоксические эффекты в модели пренатальной алкоголизации крыс [Текст]/ Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, В.В. Забродина, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2014. - № 4. — С.492-495.

5. Забродина, В.В. Нарушения пренатального развития и гликемичесюого статуса у потомства крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом и их коррекция афобазолом [Текст]//В.В. Забродина, Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2014. - Т. 158, №7. - С. 20-24.

Глава в научном издании: 1. Shreder, O.V. Effects of Afobazole on the Searching Activity and Food-Procuring Skill of the Offspring of Rats Exposed to Hypoxia during Fetal Development [Text]/O.V. Shreder, E.D, Shreder, V.V. Zabrodina, A.D. Durnev // Long-Term Memory: Mechanisms, Types and Disorders / Eds. A.K. Alexandrov and L.M. Fedoseev. - N-Y, USA: Nova Science Publishers, 2012. - Ch. 5- P. 117-131. Тезисы:

1. Шредер, О.В. Распределение афобазола и его метаболита М-11 в тканях и биологических жидкостях крыс и новорожденных крысят [Текст]/О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, Д.В. Бастрыгин, A.C. Соломина, А.О. Виглинская, В.В. Забродина, В.П. Жердев, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин. //Материалы 4-го международного конгресса по репродуктивной медицине «Проблемы репродукции», 18-21 января, 2010, Москва. — М., 2010. - С.146-147.

2. Шредер, О.В. Влияние внутриутробной гипоксии и нейропротектора афобазола на обучаемость крыс [Текет]/О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, Трофимов С.С., Воронина Т.А., А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин. //Материалы 4-го международного конгресса по репродуктивной медицине «Проблемы репродукции», 18-21 января, 2010, Москва. - М., 2010. - С.146-147.

3. Шредер, Е.Д. Фармакокинетика афобазола в организме крысят, получавших препарат через материнское молоко [Электронный ресурс]/Е.Д. Шредер, В.В. Забродина // Материалы конференции молодых ученых «Татьянин день» в ММА им. И.М. Сеченова, 25 января 2010 года, Москва 2010, CD-ROM.

23

4. Шредер, Е.Д. Поврежденность ДНК и ее модификация афобазолом в клетках плаценты и эмбрионов алкоголизированных крыс [Текст]/Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.К. Жанатаев, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин/УТезисы докладов 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня, 2010, Москва. - М., 2010. -С. 96.

5. Шредер, О.В., Влияние афобазола на ДНК-повреждения, обнаруживаемые в эмбриональных тканях и плаценте крыс, подвергнутых гемической гипоксии [Текст]/О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин/Лезисы докладов 17-го Российского национального конгресса «Человек и лекарства», 12-16 апреля, 2010, Москва. - М„ 2010. - С. 87.

6. Шредер, Е.Д. Модификация анксиолитиком афобазолом повреждений ДНК и нарушений поведенческих реакций у потомства крыс, обработанных этанолом [Текст]/ Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин//Материалы Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды и Научного совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов, и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека», 15-16 декабря, 2010, Москва. - М., 2010. - С. 137-138.

7. Забродина, В.В. Исследования проникновения афобазола в плаценту и ткани эмбрионов и его влияние на биохимический состав амниотической жидкости и крови крыс получавших препарат в период беременности [Текет]/В.В. Забродина, Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» 18-21 сентября 2012 года, республика Татарстан, г. Казань. - М.: Фолиум, 2012. - С.66.

8. Шредер, О.В. Влияние афобазола на биохимический состав крови и амниотической жидкости самок крыс подвергнутых действию циклофосфамида в период беременности [Текст]/О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, В.В. Забродина, А.Д. Дурнев// Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии » 18-21 сентября 2012 года, республика Татарстан, г. Казань. — М.: Фолиум, 2012. -С. 202.

9. Шредер, Е.Д. Влияние афобазола на поисковую активность и выработку пищедобывательного навыка у крыс, подвергнутых действию гипоксии в период внутриутробного развития [Текст]/Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, В.В. Забродина, А.Д. Дурнев // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» 18-21 сентября 2012 года, - республика Татарстан, г. Казань. - М.: Фолиум, 2012. -С. 202.

10. Шредер, Е.Д. Влияние афобазола на нейротоксические и генотоксические эффекты в модели пренатальной алкоголизации крыс [Текст]/Е.Д.Шредер//Материалы Первой всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» 3-5 июня 2013 года -Москва. -М„ 2013. - С. 133.

Подписано в печать 07.10.2014 г.

Заказ № 183 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.