Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:β-эндорфин в регуляции функций клеток адаптивного и врождённого иммунитета in vivo

9 15-3/6

На правах рукописи

Небогатиков Владимир Олегович

Р-ЭНДОРФИН В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КЛЕТОК АДАПТИВНОГО И ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА IN VIVO

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2015

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Гейн Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

Гусев Евгений Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН Институт иммунологи и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, лаборатория иммунологии воспаления, заведующий.

Колупаев Виталий Анатольевич - доктор биологических наук, доцент, ФГОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры» Министерства спорта Российской Федерации, кафедра теории и методики лыжного спорта, профессор.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» г. Новосибирск.

Защита диссертации состоится и*-сс<Л 2015 года в Стасов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетом образовательном учреждении высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайге www.chelsma.ru.

Автореферат разослан « /% 2015 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Юлия Сергеевна Шишкова

Общая характеристика работы

Ак/уяльносгь темы исследования и степень её разработанности

Опиовдные пептиды и рецепторы являются частью гипоталамо-гапофизарной оси и обеспечивают взаимодействие нервной и иммунной систем (Корнева Е.А. Ведение в иммунофизиологию. СПб.: Элби, 2003. 48 е.). Существует три основных семейства опиоидных пептидов: эндорфины, энкефалины и динорфины, которые образуются при расщеплении крупных молекул-предшественников -проопиомеланокоргина, проэнкефалина и продинорфина. Эндогенные опиоидные пептиды, наиболее активным и полифункционапьным представителем которых является (J-эндорфин, уже более 30 лет исследуются в аспекте их роли в регуляции иммуногенеза. Однако до сих пор не существует четкой картины, иллюстрирующей опиатергические процессы, протекающие при развитии иммунных реакций. |3-Эндорфин в равной степени взаимодействует с ц-, 5-опиатными рецепторами, экспрессия которых на клетках иммунной системы доказана на транскрипционном и трансляционном уровнях (Sharp В.М. Multiple opioid receptees on immune cells modulate intracellular signaling. Brain Behav. Immun. 2006. Vol. 20. P. 9-14.; Pasternak G. W. The opiate receptors. Second Edition. Humana Press, 2011. 529 p.). Плотность ц- и 8-рецепторов на клетках иммунной системы существенно возрастает после антигенной или митогенной активации (Bidlack J.M. Detection and Funktion of Opioids Receptor on Cells from the Immune System. Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 2000. Vol. 7, № 5. P. 719723). Помимо этого, на клетках иммунной системы присутствуют неопиоидные сайты связывания Р-эндорфина, не блокируемые классическими опигными антагонистами (Наволоцкая Е.В. и др. Выявление и характеристика неопиоидных рецегтгоров Р-эндорфина коры надпочечников крысы. Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1071— 1078). В условиях стресса, травмы или физической нагрузки (J-эндорфин секрегируется в периферическую кровь из гипофиза (Solomon S. POMC-derived peptides and their biological action. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1999. Vol. 885. P. 22-40.). Помимо этого, пептид продуцируется местно в различных органах и тканях, в том числе, и клетками иммунной системы, в ответ на попадание антигена, либо в

присутствии высоких концентраций про воспалительных цитокинов, обусловливая широкий спектр иммунорегуляторных эффектов, реализуемых по пара- и аутокринному механизму (Smith М. Е. Neuropeptides as signal molecules in common with leukocytes and the hypothalamic-pituitaiy-adrenal axis. Brain, Behavior, and Immunity. 2008. Vol. 22. P. 3-14.). В настоящее время основная масса предстаапенных в литературе данных, посвященных изучению иммунорегуляторных эффектов Р-эндорфина, получена в системе in vitro (Bodnar RJ. Endogenous opiates and behavior: 2008. Peptides. 2009. Vol. 30. P. 2432-2479.3), что не даёт возможности экстраполировать полученные данные на организм в целом, благодаря наличию in vivo многоуровневых регуляторных систем, процессов межклеточной кооперации, которые крайне трудно искусственно воссоздать в пробирке.

Цель исследования

Изучение роли Р-эндорфина в регуляции иммунного ответа и функциональной активности клеток адаптивного и врождённого иммунитета in vivo.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние p-эндорфина на выраженность гуморального иммунитета в фазу индукции и в эффекторную фазу системного иммунного ответа.

2. Оценить влияние Р-эндорфина на пролиферативный ответ мышиных спленоцитов, продукцию интерлейкина-2, интерлейкина-4, ингерферона-у в условиях блокады опиаггных рецепторов in vivo.

3. Исследовать влияние p-эндорфина на антигелогенез, продукцию ингерлейкина-2, интерлейкина-4 и кортикосгерона в зависимости от времени введения пептида.

4. Оценить влияние Р-эндорфина на продукцию активных форм кислорода, про- и противовоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами мышей in vivo.

Методология и методы исследования

Все эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациями и этическими нормами, указанными в «Европейской конвенции по защите

позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1985).

В ходе экспериментальной части исследования изучалось влияние (3-эндорфина на функции эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета в системе in vivo, проводилась оценка зависимости эффектов пептида от времени его введения, установлено влияние пептида на продукцию кортикосгерона.

1. При исследовании адаптивного иммунитета использовались следующие методики:

• Реакция локального гемолиза в геле агарозы (Реакция Ерне) для оценки количества антител образующих клеток в селезенке;

• Реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитами барана, для оценки изменения титра антител.

2. Оценка влияния ß-эндорфина на прсшиферативную активность спленоцитов производилась с использованием тритий-меченого тимидина

3. Продукцию цигокинов оценивали методом твердофазного иммуноферменгного анлиза с использованием наборов Bender Medsystems (Австрия) и R&B (США).

4. Влияние пептида на продукцию активных форм кислорода макрофагами исследовали методом люминолзависимой хемилюминесценции

5. Продукцию кортикосгерона оценивали методом конкурентного твердофазного иммуноферменгного анализа с использованием набора Enzo Life Sciences (США).

В ходе аналитической части исследования был проведен поиск и анализ данных об оказываемых ß-эндорфином эффектах на иммунную систему, его свойствах и взаимодействии пептида с опиатными рецепторами. В результате были спланированы и проведены эксперименты с участием антагонистов ц- и ö-опиатных рецепторов, изучены эффекты ß-эндорфина в зависимости от времени введения на адаптивный иммунитет, продукцию цигокинов и кортикосгерона

Для визуализации полученных данных была проведена статистическая обработка с использованием однофакторного дисперсионного анализа для непарных данных и post-hoc критерия наименьшей значимой разницы (LSD-тест). При оценке совместных эффектов ß-эндорфина и антагонистов использовали факторный анализ и непарный t-кригерий Сгьюденга

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Основные положения работы доложены и обсуждены на I Всероссийской VIII молодежной научной конференции Института физиологии Коми УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009 г.), 1 Всероссийской IX молодежной научной конференции Института физиологии Коми УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2010 г.), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), Сыктывкар 2014, VII Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2014» (Екатеринбург, 2014).

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы и постановка проблемы осуществлялась совместно с научным руководителем Гейном Сергеем Владимировичем, экспериментальная работа и подготовка статей проводилась совместно с Баевой Татьяной Александровной и Тендряковой Светланой Петровной. Анализ отечественной и зарубежной научной литературы, статистическая обработка данных с описанием полученных результатов, их систематизацией, написание и оформлении рукописи диссертации выполнялись лично автором под контролем научного руководителя.

Положения, выносимые на защиту

1. Р-эндорфин увеличивает число антител образующих клеток в селезёнке мышей и титр антиэритроцитарных антител в периферической крови, действуя как в фазу индукции иммунного ответа, так и в эффекторный период иммунного ответа.

2. При внутрибрюшинном введении в физиологических дозах Р-эндорфин усиливает Кон А - индуцированную пролиферативную активность спленоцигов, стимулирует продукцию интерлейкина-4 и угнетает спонтанную и индуцированную

липополисахаридом продукцию интерлейкина-2. Блокада ц-рецепторов налоксоном нивелирует эффект Р-эндорфина на пролиферацию и продукцию интерлейкина-4.

3. Стимулирующее влияние Р-эндорфина на количество антител образующих клеток в селезёнке наблюдается при введении пептида за час до введения антигена и через час после введения антигена. При этом усиление продукции интерлейкина-4 наблюдается через 6 часов после введения р-эндорфина

4. р-эндорфин в дозах 1 и 100 мкг/кг угнетает продукцию активных форм кислорода макрофагами, в то же время в стимулированных зимозаном культурах дозы 0,01 и 0,0005 мкг/кг стимулируют продукцию активных форм кислорода, р-эндорфин ингибирует продукцию интелейкина-ф, интерлейки на-10 и не влияет на продукцию П\1Р-а.

Научная новизна

В работе впервые исследовано влияние Р-эндорфина в широком диапазоне доз на системный иммунный ответ, пролиферацию спленоцигов, продукцию интерлейкина-2, интерлейкина-4, ингерферона-у, основных штгокинов, участвующих в направлении ТЪ1 /7Ъ2-дифференцировки Т-хелперов, а так же секреторную активность перигонеальных макрофагов. В работе показано, что, в условиях системной иммунизации, внугрибрюшинное введение р-эндорфина в дозах 1; 0,01; 0,0005 мкг/кг увеличивало количество ангигелобразующих клеток в селезенке и титр антиэритроцигарных антител в плазме крови экспериментальных животных. Высокие дозы пептида угнетали выраженность ЛЗХЛ, в то время как низкие дозы стимулировали продукцию активных форм кислорода Установлено, что внугрибрюшинное введение Р-эндорфина мышам стимулировало пролиферативную активность спленоцигов в присутствии как В-, так и Т-клегочного митогена, не влияло на продукцию ингерферона-у, снижало уровень интерлейкина-2 и стимулировало секрецию интерлейкина-4, основного ТЬ2-поляризующего фактора Впервые проведено сравнение эффектов пептида с эффектами селективных агонистов опиатных рецепторов пептидной природы, оценена роль |д-,5-рецепгоров в реализации эффектов Р-эндорфина, в работе впервые оцениваются эффекты Р-эндорфина на выраженность гуморального звена иммунитета, продукции

кортикосгерона, ингерлейкина-2, интерлейкина-4, интерферона-у в зависимости от времени введения. Установлено, что петтгид является быстродействующим фактором, эффект которого на ангателогенез наблюдается в небольшом временном диапазоне, относительно экспериментальных воздействий (±1 ч). В то же время усиление продукции интерлейкина-4 сохраняется и в более поздний период. В условиях системной иммунизации блокада 5-рецепгоров нагттриндолом отменяла стимулирующее действие Р-эндорфина 0,0005 мкг/кг на количество антителобразующих клеток и титр ангиэритроцитарных антител. В то время как продукция интерлейкина-4 контролировалась через стимуляцию ц-рецепторов.

Теоретическая и практическая значимость

В теоретическом плане работа существенно дополняет и расширяет существующие представления о роли опиоидных пептидов и опиатных рецепторов в регуляции функций иммунной системы. Показано, что в системе /и vivo (J-эндорфин в низких дозах усиливает ангителогенез, активирует пролиферативный ответ и продукцию активных форм кислорода, усиливает продукцию интерлейкина-4, способствуя поляризации Т-хелперов в сторону ТЬ2-клеток.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).

Конкурсная поддержка

Диссертационная работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-96000 и программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1024.

Публикации

Соискатель имеет 18 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 18 научных работ общим объёмом 1,5 печатных листа, в том числе 8 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций; 10 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура и диссертации

Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литера!уры, включающего 276 наименований, в том числе 44 отечественных и 232 зарубежных.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследования были выполнены на 576 беспородных мышах-самцах массой 22-25 г. Животных содержали в условиях лабораторного вивария с 12-часовым циклом освещения, а так же с неограниченным доступом к воде и пище. Животных выводили из эксперимента путем декапигации под эфирным наркозом.

В экспериментах использовали р-эндорфин (8ку1ек ЬаЬога1опе5, США), натгриндола гидрохлорид (1С1ч1, США), налоксона гидрохлорид (АО Варшавский фармацевтический завод Польфа). р-эндорфин вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 100 до 0.0005 мкг/кг массы животного. Роль опиатных рецепторов в реализации эффектов Р-эндорфина исследовалась путем их фармакологической блокады налоксона гидрохлоридом или налтриндола гидрохлоридом. Налоксона гидрохлорид в дозе ОД мг/кг и налтриндола гидрохлорид в дозе 0,1 мг/кг вводили подкожно за 20 мин до введения Р-эндорфина.

Мышей иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) (ФГУП «НПО «Микроген» Пермский филиал «Биомед») внутрибрюшинно (108 клеток/0,2 мл 0,09% №С1) для индукции системного иммунного ответа

В экспериментах с иммунизацией животных выводили из эксперимента на 5-е сутки, оценивали количество АОК в селезенке, титр антиэритроцитарных антител в плазме периферической крови. При изучении эффектов (З-эндорфина на продифративную активность спленоцитов и их цитокинсекретирующую функцию, животных выводили из эксперимента через 1 час после введения опиоидных пептидов.

Эксперименты по изучению гуморального иммунного ответа проводили на холодной забуференной среде RPMI1640 (Биолог) с добавлением 2 шМ L-глутамина и 10 mM HEPES. Для гомогенизации и готовых суспензий использовали посуду из антиадгезивного материала Селезенку выделяли, очищали от жировой ткани, затем осторожно гомогенизировали орган с помощью ножниц и пинцетов, разрушая соединительнотканную капсулу.

Объем среды, взятой для гомогенизации, учитывали в последующем подсчете абсолютного числа ядросодержащих клеток. Количество лейкоцитов и ЯСК в суспензиях подсчитывали в камере Горяева по стандартной методике.

Определение числа антител образующих клеток производили методом локального гемолиза в геле агарозы (Jeme). Определение количества антител - в реакции активной гемагглютинации с наггивными эритроцитами барана

Пролиферативную активность спленоцотов оценивали по включению радиактивного 'Н-метилтимидина Продукция активных форм кислорода (АФК) оценивалась с помощью реакции люминолзависимой хемилюминесценции (J13XJ1). Определение концентрации кортикостерона производили методом конкурентного твердофазного иммуноферменгного анализа с помощью коммерческих тест-систем Enzo life Sciences (Дания).

Определение концентрации цигокинов проводили методом твердофазного иммуноферменгного анализа с помощью наборов R&D (США). Полученный материал обрабатывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа для непарных данных и post-hoc критерия наименьшей значимой разницы (LSD-тест). При оценке совместных эффектов (кждорфина и антагонистов использовали факторный анализ и непарный /-критерий Сгьюденга

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние Р-эндорфина на гуморальный иммунный ответ в условиях системной иммунизации

Установлено, что введение мышам Р-эндорфина в дозах 1; 0,01 и 0,0005 мкг/кг массы тела статистически значимо увеличивало количество АОК в селезенке (Р=4,38; р<0,005). Наиболее выраженное действие было зарегистрировано в группах животных, которым пептид вводили в дозе 0,01 мкг/кг. При введении р-эндорфина в высокой дозе (100 мкг/кг), статистически значимые, по сравнению с контролем, изменения числа АОК отсутствовали (рисунок 1 А). При анализе влияния Р-эндорфина на титр антител к эритроцитам барана в плазме периферической крови мышей выявлена сходная картина (Р= 12,08; р<0,001). Как видно из рисунка 1 Б, в ответ на введение р-эндорфина в дозах 1; 0,01 и 0,0005 мкг/кг в опытных группах наблюдалось статистически значимое увеличение уровня антиэригроцитарных антител в плазме крови. Введение животным пептида в дозе 100 мкг/кг не приводило к статистически значимым изменениям тигра антиэритроцигарных антител. В процессе формирования иммунного ответа ведущую роль играют процессы пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.

Представленные в современной лигера1уре данные о влиянии Р-эндорфина на пролиферативную активность клеток иммунной системы весьма неоднозначны и противоречивы, а также получены преимущественно в системе ¡п у1йо.В настоящем разделе рассматривается влияние внугрибрюшинного введения Р-эндорфина на спонтанный и стимулированный Кон А и ЛПС прсшиферагивный ответ сгшеноцитов, а так же продукцию ТЬIЛЪ2 - поляризующих цигокинов 1Ь-2,1Ь-4, П-ТМ-у.

Как показано на рисунке 2 А, спонтанная пролиферативная активность спленоцитов под влиянием исследуемых концентраций пегтгида статистически значимо не изменялась, в то время как на фоне мигогенной активации клеток зарегистрированы стимулирующие эффекты Р-эндорфина на уровень включения радиоактивной метки спленоцигами (Р=4,4; р<0,003). Как в присутствии ЛПС, неспецифического активатора В-лимфоцитарного звена, так и при стимуляции Кон

А, поликлонального митогена Т-лимфоцитов, эффект Р-эндорфина проявлялся во всём исследуемом диапазоне доз.

4,»

4,6

,4,4 л

¿4,2 О

5 «

9

< 3,1 м

~ 3,6 3,4

0,0005

0/11

миг/кг

0,01

мкг/кг

Рисунок I — Влияние Р-эндорфина на количество АОК селезенки (А) и титр антиэритроцитарных антител в периферической крови мышей (Б) при развитии системного иммунного ответа (п=10). Примечание. * - р<0,05 по критерию.

При этом в культурах с Кон А можно отметить тенденцию к усилению пролиферативного ответа при увеличении концентрации пептида, но в ЛПС стимулированных культурах такой тенденции не отмечается.

При анализе влияния Р-эндорфина на продукцию ключевых ТЫ АГЬ2 поляризующих цитокинов (1Ь-2, (ПМ-у и 1Ь-4) обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на сопоставимое усиление пролиферации в культурах с Кон А и ЛПС, продукция цитокинов выражено стимулировалась только в культурах с Кон А, тогда как в культурах с ЛПС она практически не отличалась от нестимулированных культур (рисунки 2, 3). Несмотря на усиление Р-эндорфином пролиферативного ответа сплеиоцитов, продукция 1Ь-2, одного из основных цитокинов подерживающих пролиферацию, в Кон А-стимулированных культурах статистически значимо не изменялась (Рисунок 2 Б), хоть и была выше, чем в спонтанных и Л ПС-стимулированных культурах. В культурах без добавления митогена и в присутствии ЛПС (Р=3,55; р<0,013) уровень 1Ь-2 снижался у животных,

которым вводили Р-эндорфин в дозах 1; 0,01; 0,0005 и 0,01; 0,0005 мкг/кг соответственно (рисунок 2 Б).

А

Без митогена

2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0

-

гЬ

к 0.0005 0.01 I 100

20000 15000 10000 5000 О

ЛПС ... «•• »»»

гЬ

¿1

к 0.0005 0,01 I 100

Кон А

к 0.0005 0.01 I 100

Без митогена

53

-Ь

к 0.0005 0.01 I 100

ЛПС

гЬ

к 0,0005 0,01 1 100

Кон А

и 0.0005 0,01 1 100

Рисунок 2 — Влияние р-эндорфина на пролиферативный ответ (А, п= 13) и секрецию 1Ь-2 (Б, п=7) в культурах мышиных спленоцитов. Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 к контролю по по Ь8В-критерию. Спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция цитокинов представлена по основной, а Кон А-стимулированная - по дополнительной оси.

Напротив, продукция 1Ь-4 (рисунок ЗА) под воздействием Р-эндорфина усиливалась (Р=2,9; р<0,027) в культурах с Кон А при введении животным пептида в низких (близких к физиологическим) дозах 0,01 и 0,0005 мкг/кг, в присутствии ЛПС значимый эффект пептида проявлялся только в наиболее низкой дозе 0.0005 мкг/кг (Р=2,73; р<0,034). Продукция 1Р]ч|-у (рисунок 3 Б) под воздействием Р-эндорфина статистически значимо не изменялась, однако

обращает на себя внимание видимый угнетающий эффект пептида в дозах 1; 0,01 и 0,0005 мкг/кг как в стимулированных, так и в нестимулированных культурах.

Таким образом, в условиях системной иммунизации внутрибрюшинное введение Р-эндорфина стимулирует пролиферативную активность спленоцитов, активирует Кон А-индуцированную продукцию 1Ь-4 и снижает продукцию 1Ь-2, и как следствие, направляет поляризацию Т-хелперов в сторону ТЬ2-клеток.

А

Без митогена

гН

п

1+1

ЛПС

гЬ

к 0,0005 0,01 I

к 0,0005 0.01 1

1+1

500 400 300 200 100

Кон А ***

-1

гЬ

Нп

к 0.0005 0.01 I 100

Без митогена

¿ЖЁ£еь.

Б ЛПС

т'1г*1

2800 2100 1400 700 0

Кон А

[Ь

¿1

к 0.0005 0,01 I 100

к 0,0005 0,01

100

к 0,0005 0,01 I 100

Рисунок 3 — Влияние р-эндорфина на секрецию 1Ь-4 (А, п=7) и П^-у (Б, п=7) в культуре мышиных спленоцитов. Примечание: * - ¡к0,05; ** -/»<0,01; *** - /КО,001 к контролю но по ЬБО-критерию. Спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция цитокинов представлена по основной, а Кон А-стимулированная - по дополнительной оси.

Влияние Р-эндорфина на пролиферацию и секрецию цитокинов на фоне блокады опиатных рецепторов

Установлено, что предварительное введение мышам налоксона гидрохлорида отменяло активирующее действие Р-эндорфина на стимулированный Кон А пролиферативный ответ и продукцию 1Ь-4. На фоне блокады 6-опиатных рецепторов налтриндолом гидрохлоридом эффекты Р-эндорфина не модифицировались (рисунок 4).

А 70000 4 6 90

К ее N0 ИХ N0 «X « К I» II «1 » I К № И » Ж * ВЕ N0 М N0 ИХ

•ВЕ »ВЕ «ВЕ (ВЕ .ВЕ -ВЕ ВЕ -ВЕ

Рисунок 4 — Влияние р-эндорфина на пролиферативную активность мышиных спленоцитов (А п=15-17) и секрецию ими 1Ь-4 (Б п=10) в условиях блокады опиатных рецепторов. Примечание: * - р<0,05 по непарному 1-кригерию Стьюдента по сравнению с контролем.

Таким образом, Р-эндорфин усиливал пролиферативную активность и продукцию 1Ь-4 в стимулированных Кон А культурах (Р=6,3; р=0,017), эффект блокировался налоксоном, что свидетельствует об участии |Д-рецепторов в регуляции процессов пролиферации и продукции 1Ь-4.

Зависимость выраженности эффектов р-эндорфина на системный иммунный ответ от времени его введения

Установлено, что пептид значимо влиял на исследуемые показатели за час до введения антигена и через час после введения. При одномоментном введении Р-эндорфина и антигена наблюдалась выраженная тенденция к стимуляции как количества АОК в селезенке, так и антиэритроцитарных антител в плазме крови, но она оказалась статистически незначимой. Введение Р-эндорфина за

6 или через 6 часов после иммунизации влияния на интенсивность антителогенеза в селезёнке не оказывает (рисунок 5).

»6ч «1ч синхрон череИч череэЬч „1Ч синхрон чер«1ч черсмбч

Рисунок 5 — Зависимость выраженности эффектов р-эндорфина на количество АОК селезенки (А) и титр антител периферической крови (Б) мышей от временного отрезка между введением пептида и иммунизацией (п=10). Примечание: Светлый столбец - конгрольная группа (введение 0,9% раствора ЫаС1), темный столбец - введение Р-эндорфина 0,0005 мкг/кг. * - р<0,05 по непарному 1 критерию Стьюденга то отношению к контрольной фуппе.

При оценке влияния пептида на продукцию 1Ь-2 и 1Ь-4 за 1 час и за 6 часов до выведения животных из эксперимента были получены следующие результаты. При оценке влияния пептида на продукцию 11.-4 наблюдалось усиление Кон А - индуцированной продукции как через 1 ч, так и через 6 ч после инъекции. На спонтанную продукцию 1Ь-4 спленоцитами Р-эндорфин не влиял. Кон А - индуцированную продукцию 1Ь-2 пептид не модулировал как за 1 ч, так и за 6 ч до получения спленоцитов. В то время как спонтанную продукцию за 1 ч до введения пептид угнетал, а через 6 ч после введения -стимулировал (таблица 1).

Помимо прямого эффекта на клетки иммунной системы, Р-эндорфин может влиять на их активность опосредованно через модуляцию продукции гормонов гипоталамо-гипофизарной оси, и в частности кортикостерона, продуцируемого клетками коры надпочечников. Нами было исследовано влияние различных доз Р-эндорфина на уровень кортикостерона у интактных

мышей за 1 час (Р=0,45; р=0,768) и за 6 часов (Р=1,166; р=0,348) до выведения животных из эксперимента.

Таблица 1 - Влияние Р-эндорфина на секрецию цитокинов 1Ь-2 и 1Ь-4 в зависимости от времени введения

Митоген

БЭ I 1L-2 j

через! ч после введения р-эндорфина

IL-4

Без митогена Контроль 4,11 ±0,83 4,8±0,6

БЭ 0,0005 1,17±0,54* 6,1±1,3

Кон А Контроль 639,5±164,3 205,7±27,7

БЭ 0,0005 403,2±54,6 389,9±91,4*

черезб ч после введения Р-эндорфина

Без митогена

Кон А

Контроль БЭ 0,0005 Контроль БЭ 0,0005

4,7±0,8 8,8±1,7*

555,2±79,8 535,4±81,2

1,9±0,1 1,5±0,6 115,7±25,6 215,8±41,6*

Примечание: * - р<0,05 к контролю по непарному t-критерию Стьюдента

Нами отмечено, что концентрация кортикостерона в плазме крови интактных мышей под воздействием Р-эндорфина не изменяется как в ранние, так и в поздние сроки, после введения пептида, что в свою очередь свидетельствует об отсутствии опосредованности эффекта пептида через продукцию кортикостерона (данные не приводятся).

Влияние Р-эндорфина на секреторную активность перитонеальных макрофагов /я vivo. Установлено, что Р-эндорфин в дозах I и 100 мкг/кг угнетает спонтанную продукцию АФК в течение всего периода наблюдения.

В культурах, стимулированных зимозаном 150 мкг/мл, пептид в дозе 100мкг/кг угнетает ЛЗХЛ на 5-й и 10-й мин эксперимента. В дозе 1 мкг/кг пептид стимулировал зимозан-индуцированную ЛЗХЛ на 20 и 30 мин эксперимента. Доза 0,01 стимулировала продукцию АФК на 10, 15 и 20 мин наблюдений, а доза 0,0005 мкг/кг усиливала продукцию АФК на 10 и 15 мин

эксперимента. После 30-ой минуты реакции эффекты Р-эндорфина не регистрировались (рисунок 6).

a s' iff is' 20* is' за ss1 « 45 м ss'

О' 5' Iff IS' 20' 25' 30' 35' 40' 45' 50' 55' »'

Рисунок 6 — Продукция АФК перитонеальными макрофагами мышей под воздействием p-эндорфина в несгимулированных (А) и стимулированных зимозаном в концентрации 150 мкг/мл (Б) культурах (п=12). Примечание: По оси абсцисс - время в мин. * - р<0,05 но непарному t критерию Стьюденга по отношению к контрольной фуппе.

В дозах 100; 0,01; 0,0005 мкг/кг p-эндорфин угнетал спонтанную продукцию IL-ip (F=6,7; р=0,0001) и не влиял на зимозан-стимулированную продукцию цитокина (F=l,27; р=0,3) (рисунок 7 А). Пептид угнетал спонтанную продукцию IL-10 (F=3; р=0,034) во всём исследуемом диапазоне доз и статистически значимо не влиял на стимулированную зимозаном продукцию IL-10 (F=l,8; р=0,!6) (рисунок 7 Б). Введение Р-эндорфина животным не приводило к изменению продукции TNF-a перитонеальными макрофагами как в стимулированных, так и в нестимулированных культурах (рисунок 7 В).

Таким образом, p-эндорфин в зависимости от вводимой дозы разнонаправлено влиял на продукцию АФК и угнетал продукцию IL-ip и IL-10.

Зимоэаи ISO миг/иг

Зимозам 150мкг/кг

00005 0,01 1 100

В

Без стимуляции

0.0005 0,001 1 100

Зимохан 150мкг/кг

к 0,0005 0.001 1 100

250 Г

1-1- —1-----

■

ffr * * йт ■i i

0,0005 0,01

Рисунок 7 — Продукция IL-IO (A), TNF-a (Б) и IL-ip (В) перитонеальными макрофагами мышей под воздействием Р-эндорфина в нестимулированных и стимулированных зимозаном в концентрации 150 мкг/мл культурах (П=6). Примечание: По оси абсцисс - доза p-эндорфина (мкг/кг). * - р<0,05 по непарному LSD критерию.

Заключение

В заключении необходимо отметить, что внутрибрюшинное введение Р-эндорфина стимулирует антителогенез, пролиферативную активность спленоцитов, активирует продукцию IL-4, не влияет на секрецию IFN-y, и как следствие, направляет поляризацию Т-хелперов в сторону ТИ2-клеток. Факторами, оказывающими существенное влияние на данные процессы, являются доза введения препарата, время оценки исследуемых параметров, продолжительность воздействия и состояние объекта исследования.

Мы считаем, что характер участия ц-, 6-рецепторов в регуляции иммунных реакций в системах ¡n vivo определяется разнообразием вариантов реализации эффектов Р-эндорфина, в первую очередь, способностью пептида оказывать воздействие как через налоксон-чувствительные, так и через налоксон-нечувствительные механизмы, существованием на клетках иммунной системы p-эндорфин-связывающих сайтов, не имеющих аналогов в ЦНС, а также динамикой экспрессии опиатных рецепторов в ходе развития иммунного ответа.

Полученные результаты открывают новые направления в исследовании роли опиоидных пептидов в регуляции процессов активации, пролиферации и дифференцировки клеток адаптивного и врождённого иммунитета, показывают перспективность исследования роли опиоидэргической системы при стрессе, являются основой для изучения возможности терапевтического применения эндогенных лигандов опиатных рецепторов и их синтетических аналогов.

Выводы

1. Показано, что в условиях системного иммунного ответа р-эндорфин в низких дозах усиливает образование антителобразующих клеток в селезёнке и титр антиэритроцитарных антител в периферической крови, действуя как в стадию индукции иммунного ответа, так и в эффекторный период иммунного ответа. Эффект p-эндорфина в индуктивную фазу блокируется агонистом 5-опиатных рецепторов.

2. Внутрибрюшинное введение Р-эндорфина в низких дозах усиливает пролиферативную активность спленоцитов, индуцированную липоплисахаридом и конканавалином А, стимулирует продукцию интерлейкина-4 и угнетает спонтанную и липоплисахарид-индуцированную продукцию интерлейкина-2. Блокада ц-рецепторов налоксоном отменяет эффект p-эндорфина на Кон А- индуцированную пролиферацию и продукцию интерлейкина -4.

3. Установлено, что стимулирующее влияние ß-эндорфина в дозе

0.0005.мкг/кг на антителогенез в селезёнке наблюдается преимущественно при введении пептида в часовом интервале от момента введения антигена. В то же время усиление продукции интерлейкина-4 сохраняется через 6 ч после введения ß-эндорфина и не зависит от уровня кортикостерона в плазме крови.

4. В дозах 1 и 100 мкг/кг ß-эндорфин угнетает продукцию активных форм кислорода макрофагами, в то же время в стимулированных зимозаном культурах дозы 0,01 и 0,0005 мкг/кг стимулируют продукцию активных форм кислорода. ß-эндорфин ингибирует продукцию интерлейкина-1 ß, интерлейкина-10 и не влияет на продукцию фактора некроза опухоли-а.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Баева, Т.А. Влияние ß-эндорфина на пролиферацию спленоцитов мыши ех vivo // Т.А. Баева, C.B. Гейн, В.О. Небогатиков / Сборник тезисов VIII Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике». - Сыктывкар, 2009. - С. 23-26.

2. Баева, Т.А. Влияние ß-эндорфина на гуморальный иммунный ответ при системной иммунизации in vivo // Т.А. Баева, В.О. Небогатиков, C.B. Гейн / Сборник тезисов II всероссийского с международным участием конгресса «Симбиоз Россия 2009». - Пермь, 2009. - С. 276-278.

3. Baeva, Т.А. Influence of beta-endorphin on humoral immune response in the model of systemic immunization in vivo // T.A. Baeva, B.O. Nebogatikov, S.V. Gein / Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «Symbiose 2009». -Kasan, 2009.-P. 98-99.

4. Баева, Т.А. Влияние бета-эндорфина на функциональную активность спленоцитов мыши in vivo II Т.А. Баева, В.О. Небогатиков, С.П. Тендрякова / Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1 (29). -С. 93-94.

5. Баева, Т.А. Некоторые особенности влияния бета-эндорфина на гуморальный иммунный ответ при различных способах введения антигена in vivo // Т.А. Баева, В.О. Небогатиков / Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1. - С. 10-11.

6. Баева, Т.А. Роль блокады fi- и d-опиатных рецепторов в динамике развития гуморального иммунного ответа // Т.А. Баева, В.О. Небогатиков / Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 4. - С. 13-14.

7. Баева, Т.Д. Модуляция функциональной активности спленоцитов бега-эндорфином в условиях блокады опиатных рецепторов // Т.А. Баева, В.О. Небогатиков / Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7., №2-3. -С. 164.

8. Баева, Т.А. Влияние бета-эндорфина на секрецию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами мыши / Т.Д. Баева, В.О. Небогатиков, Е.И. Шутова/ Российский иммунологический журнал. - 2014 - Т. 8(17), №3.-С. 261-263.

9. Баева, Т. А. Влияние бета-эндорфина на секрецию IL-ip, TNF-a и 1L-10 перитонеальными макрофагами мыши // Т.А. Баева, В.О. Небогатиков, Е.И. Шутова / Материалы VII Всероссийского Конгресса молодых биологов. - Екатеринбург, 2014.-С. 226-228.

10. Гейн, C.B. Влияние бета-эндорфина на антителогенез, пролиферацию и секрецию Тх1/Тх2-цитокинов in vivo II C.B. Гейн, Т.А. Баева, В.О. Небогатиков, С. П. Тендрякова / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011 - Т. 152, № 11. - С. 526-529.

11. Гейн, C.B. Влияние бета-эндорфина на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов in vivo II C.B. Гейн, Т.А. Баева, В.О. Небогатиков / И ммунология. - 2012. - Т. 33, № 2. - С. 102-103.

12. Гейн, C.B. Влияние бета-эндорфина на функциональную активность спленоцитов мыши в условиях блокады Цг,6-опиатных рецепторов in vivo II C.B. Гейн, Т.А. Баева, В.О. Небогатиков / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2014 - Т. 158, № 9. - С. 344 - 348.

13. Небогатиков, В.О. Некоторые аспекты иммунорегуляторной активности Р-эндорфина in vivo // В.О. Небогатиков, Т.А. Баева, C.B. Гейн / Материалы IX Всероссийской молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». - Сыктывкар, 2010. -С. 115-119.

14. Небогатиков, В.О. Опиоидные пептиды в регуляции функциональной активности В-лимфоцитов in vivo // В.О. Небогатиков, Т.А. Баева, C.B. Гейн / 111 Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз -Россия 2010». -Н ижний Новгород, 2010. - С. 141.

15. Небогатиков, В.О. Динамика антигелообразования под воздействием бега-эндорфина на разных стадиях имунного ответа // В.О. Небогатиков, Т.А. Баева, С.В. Гейн / [V Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011». - Воронеж, 2011. - С. 51 -54.

16. Небогатиков, В.О. Зависимость активности антителогенеза у мышей от времени введения (кэндорфина // В.О. Небогатиков, ТА. Баева, С.В. Гейн / Материалы V Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2012». - Тверь, 2012. - С. 29-31.

17. Nebogatikov, V.O. Improvement of В-endorphin effect on spelenocyte proliferation and IL-2, IL-4 secretion in vivo using 5-opiate receptor antagonist // V.O. Nebogatikov, T.A. Baeva, S.V. Gein / Abstracts VI Russian Congress of Young Biologists "SymBioS Russia 2013" with international participation. - Irkutsk, 2013. - P. 528 (325).

18. Небогатиков, В.О. Бета-эндорфин in vivo стимулирует секрецию IL-4 через опиагаый ц-рецептор // В.О. Небогатиков, С.П. Тендрякова, ТА. Баева, С.В. Гейн / Материалы XIII Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН. - Сыктывкар 2014. -С. 101-103.

Список основных сокращений

АОК - антителообразующая клетка

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

Кон А - конканавалин А

ЛПС - липополисахарид

ПОМК - проопиомеланокортин

ГТЦР - полимеразная цепная реакция

РБТЛ - реакция бласпрансформации лимфоцитов

ФГА - ф итогемагглютинин

ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана

ЭБ - эритроциты барана

ЯСК - ядросодержащие клетки

IFN-интерферон

IL - интерлейкин

NK-клетки - натуральные киллеры TNF - фактор некроза опухоли

15- 6131!

На правах рукописи

Небогатиков Владимир Олегович

Р-ЭНДОРФИН В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИИ КЛЕТОК АДАПТИВНОГО И ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА /Д VIVO

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2015

2015677569

Подписано в печать Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ

Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

2015677569