Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Дезоксирибонуклеазная и БАПНА-амидазная активность фракции иммуноглобулинов класса G сыворотки крови у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки

о

На правах рукописи

КОНОРЕВ Марат Русланович

ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНАЯ И БАПНА-АМИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАКЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА в СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ

14.00.05. - внутренние болезпи

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

СМОЛЕНСК -1996

Работа выполнена в Витебском ордена Дружбы народов государственном медицинском институте

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор И.В.Козловский Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р.М.Филимонов кандидат медицинских наук, доцент П.И.Подчеко

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская военно-медицинская академия имени С.МКирова

Защита диссертации состоится " иМ-Нл&199£г. в ¿часов на заседании диссертационного совета Д 084.34.01. в Смоленской государственной медицинской академии (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д.28).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Смоленской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "¿1" 199^г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Л.В.Тихонова

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Аллергическая теория формирования язвенной болезни возникла еще в начале 20-х годов [Cesares D.,1923]. В течение последних десятилетий достаточно полно изучено состояние местного иммунитета при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Аруин Л.И.,1983; Brandtzaeg Р.,1991]. Проводятся исследования секреторных и сывороточных иммуноглобулинов при этой патологии [Janssen M.,1995; Maaroos H.,1995]. На основании полученных данных сформулирована концепция "второй линии защиты" [Ройт А., 1991; Tomasi Т..1972]. Стали считать, что не только образование, но и рубцевание язвы находится под иммунным контролем. Ведутся дискуссии по вопросу о наличии, выраженности и направленности при язвенной болезни иммунных сдвигов.

Возникновение новых разделов иммунологии, в частности абзи-мологии [Азаренок К.С.,1987; Schultz P.G.,1986; Shuster A.M.,1992; Sun M., 1994; Tawfik D.S.,1995], дало новый толчок в исследовании иммунологических изменений при различных заболеваниях, в том числе и язвенной болезни. Начало абзимологии связано с открытием иммуноглобулинов (ИГ), обладающих ферментативным действием или антител-ферментов [Lerner R.А,1986]. Доказано существование поликлональных иммуноглобулинов, обладающих широким спектром ферментативной активности [Азаренок К. С., 1987; Бронштейн И.Б.,1990; LI L.,1995]. Изучено участие каталитических ИГ в некоторых патологических процессах.

Исследование ферментативной активности препаратов иммуноглобулинов при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) представляется актуальным. Можно предположить, что они могут в определенной мере стимулировать ферментативную активность желудка и двенадцатиперстной кишки, вызывать нарушение гемодинамики в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны и способствовать формированию язвенной болезни. Данные фракции иммуноглобулинов могут участвовать в усилении местного иммунитета, в удалении с поверхности слизистой продуктов распада тканей (остатков клеток и их ядерного аппарата, различных белковых компонентов), т.е. обладать защитным действием. Появляется возможность разработать новые диагностические и прогностические критерии при данной патологии.

Выделение ИГ из слизистой ЖКТ представляется достаточно

сложным. Однако отражать активацию В-лимфоцитов in situ в стенке желудка может активность ИГ сыворотки крови. Отсюда в качестве объекта исследования была выбрана фракция поликлональных иммуноглобулинов. Изучение ферментативной активности IgG-фракции у больных данной патологией до настоящего времени не проводилось.

Цель исследования.

Целью исследования явилось изучение роли фракции сывороточных иммуноглобулинов класса G, обладающей ДНК-азной и БАПНА-ами-дазной активностью, в патогенезе и течении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.

Задачи исследования:

1) изучить ДНК-азную и БАПНА-амидазную активность фракции иммуноглобулинов класса G выделенных из сыворотки крови больных язвенной болезнью желудка, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и здоровых лиц;

2) исследовать уровни ДНК-азной и БАПНА-амидазной активности выделенных препаратов IgG у больных язвенной болезнью и их влияние на клиническую картину заболевания, взаимосвязь с полом и возрастом больных, локализацией язвенного дефекта, периодом обострения и ремиссии;

3) изучить влияние тагамета, ацилока, метацина, висмута и винилина на уровень ДНК-азной и БАПНА-амидазной активности имму-ноглобулиновой фракции при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки;

4) разработать метод иммунологической диагностики степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, метод определения ДНК-азной активности фракции иммуноглобулинов, способ выделения препаратов поликлональных IgG из сыворотки крови больных и здоровых лиц.

Научная новизна работы.

1. Впервые выявлена фракция IgG у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, обладающая способностью расщеплять дезоксирибонуклеиновую кислоту и белковые соединения по аминокислотам аргинин-лизин.

2. Показана взаимосвязь ДНК-азной и БАПНА-амидазной активности препаратов IgG с клиническими проявлениями заболевания, а также отсутствие влияния лечения препаратами тагаметом, ацило-ком, метацином, висмутом и винилином на функцию последних.

3. Выявлены антитела класса G к антигенам слизистой оболочки

двенадцатиперстной кишки и дезоксирибонуклеиновой кислоте у больных язвенной болезнью желудка и ДПК.

4. Разработан метод иммунологической диагностики степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, высокочувствительный метод определения дезоксирибонуклеазной активности и способ выделения высокоочищенных препаратов поликлональных иммуноглобулинов из сыворотки крови.

Практическая значимость работы.

По материалам исследований разработан метод иммунологической диагностики степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (инструкция на метод МЗ РБ от 02.06.95.), позволяющий использовать показатели ДНК-азной и БАПНА-амидазной активности фракции ДО как дополнительный критерий для ретроспективной и уточняющей диагностики степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, метод определения ДНК-азной активности (патент РБ №1066), позволяющий проводить в клинике оценку уровня ДНК-азной активности иммуноглобулиновых фракций и других биологических объектов, обладающих данной активностью, способ выделения препаратов поликлональных ДО из сыворотки крови и устройство для его осуществления, дающий возможность выделять из сыворотки крови высокоочищенную фракцию ДО (IgGi.IgG2.IgG4), без примесей других белковых соединений.

Основные положения диссертации выносимые на защиту:

1) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки фракция сывороточных ДО ускоряет распад белковых соединений по аминокислотам аргинин-лизин и гидролиз дезоксирибонуклеиновой кислоты;

2) фракция ДО сыворотки крови больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки обладает высокой, по сравнению со здоровыми лицами, ДНК-азной и БАПНА-амидазной активностью, которая зависит от пола, возраста больных, локализации язвенного дефекта, фазы и тяжести заболевания;

3) препараты ДО сыворотки крови больных язвенной болезнью содержат антитела к антигенам слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и дезоксирибонуклеиновой кислоте;

4) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки определяются прямые взаимосвязи показателей ДНК-азной и БАПНА-амидазной активностью фракции ДО с уровнем сывороточных антител к антигенам слизистой оболочки дуоденальной зоны и приз-

наками характеризующими тяжесть болезни, что свидетельствует о значении подобных иммуноглобулинов в патогенезе и течении язвенной болезни.

Личный вклад соискателя.

Все проведенные автором исследования в рамках диссертационной работы выполнены самостоятельно.

Апробация результатов диссертации.

Материалы диссертации доложены на 45 научной конференции молодых ученых и студентов "Актуальные вопросы теоретической и практической медицины" (Минск,1991). на 51 научно-практической конференции, посвященной 60-й годовщине основания ТОДНГМИ "Актуальные вопросы медицины" (Ашхабад, 1991), на научной конференции посвященной 60-летию ВМИ "Актуальные проблемы современной медицины" (Витебск,1994), на XXIX, XXX и XXXI научно-практических конференциях Витебской областной клинической больницы (Витебск, 1993,1994 и 1995), на научной конференции студентов-активистов СНО и молодых ученых "Вопросы фундаментальной и прикладной медицины" (Витебск,1995), на 50 и 51 научных сессиях Витебского медицинского института (Витебск,1995 и 1996).

Опубликованность результатов диссертации.

Материалы диссертации опубликованы в 25 печатных работах (журнальных статей - 8, в том числе в иностранных журналах - 1, статей в научных сборниках - 8, в тезисах конференций и съездов - 9). Издана инструкция на метод МЗ Республики Беларусь "Иммунологическая диагностика степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки" от 02.06.95г. Выдан патент Республики Беларусь №1066 "Способ определения ДНК-азной активности". Подана заявка на изобретение "Способ очистки иммуноглобулинов класса й из сыворотки крови и устройство для его осуществления".

Структура и объем диссертации.

Работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, главы, посвященной методам исследования и клинической характеристике больных, двух глав, отражающих результаты собственных исследований, из анализа и обобщения результатов исследования, списка использованных источников, включающего 167 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на.110 страницах машинописи, иллюстрирована 15 таблицами и 9 рисунками.

- 5 -

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Подбор больных осуществлялся рандомизированным методом. Всего обследовано 166 человек, в том числе больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе обострения 79 человек (первая группа), в фазе ремиссии 32 человека (вторая группа) и 55 здоровых лиц (третья группа; таблица).

Характеристика больных по полу, возрасту и длительности

заболевания

1 1 группы 1 обследованных пол муж. |жен. 1 1 всего | возраст (годы) 1 длительность за-| болевания (годы)1

|1.Язвенная болезнь I (ф. обострения) 58 121 I 79 _ 39,47+1,40 6,39+0, 67 |

12.Язвенная болезнь I (ф. ремиссии) 24 1 8 I 32 40,19+3,48 8,26+1,79 |

|3.Здоровые лица 40 |15 I 55 32.29+7,39 |

1 Всего: 1 122 144 1 |166 1 39,81 + 1,06 |

Больным проводилось комплексное клиническое обследование. Тщательно оценивались жалобы, анамнез жизни и настоящего заболевания, объективные данные. Выполнялись общий анализ крови, мочи, копроцитограмма. У всех больных изучались биохимические показатели крови: содержание прямого и непрямого билирубина, активность аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, содержание общего белка, сахара, мочевины, альфа-амилазы, серомукоида, выполнялись, тимоловая и сулемовая пробы, определялась альфа-амилаза мочи. Исследования проводились в начале лечения, а у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения в начале и в конце лечения.

Осуществлялось исследование желудочного содержимого фракционным методом с использованием пробного завтрака и, по показаниям, субмаксимального гистаминового теста по методам Лепорского и Веретянова. Выполнялось микроскопическое исследование желудочного сока. Производился подсчет количества клеток и ядер лейкоци-

- 6 -

тов в нативном мазке осадка желудочного сока.

Всем больным сделана фиброззофагогастродуоденоскопия (ФГДС). Всем больным язвенной болезнью желудка для подтверждения диагноза произведена биопсия с последующим гистологическим исследованием биоптата. Биопсия также была произведена у части больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Больным проводилось рентгенологическое исследование желудка, ультразвуковая томография желчного пузыря, • желчных путей, печени, поджелудочной железы и желудка. Все больные находились на стационарном лечении и пользовались диетой N1 по Певзнеру.

Доноры, прошедшие комплексное клиническое обследование, не имели патологии со стороны органов желудочно-кишечного тракта, других органов и систем организма, а также хронических очагов инфекции и были здоровые.

Кровь брали утром натощак из локтевой вены на следующий день после поступления больного в стационар и в день сдачи крови донорами. ИГ выделялись из сывороток в день забора крови. Полученные образцы хранились в жидком азоте.

Выделение препаратов IgG из сыворотки крови осуществлялось предложенным нами комбинированным методом (риванолсульфатно-аф-финнохроматографический метод в комбинации с ионообменной хроматографией на DEAE-молселекте А-50). Сущность предложенного способа очистки заключалась в выделении поликлональных ИГ путем первого переосаждения риванолом с последующей аффинной и ионообменной хроматографией на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, удаления остатка риванола, элюции поликлональных IgG с последующим осаждением сульфатом аммония. Удаление остатка риванола производилось путем адсорбции его на активированном угле или отмывкой непосредственно на агарозе.

При анализе чистоты полученных препаратов IgG в иммуноэлект-рофорезе по методу Грабар-Уильяме [Фримель Г.,1987; Merril C.R., 1981], капиллярном вестерн-блоттинге в присутствии додецилсуль-фата натрия [Koch С., 1985; Schibeci А.,1986], в диск-электрофорезе и вертикальном градиентном электрофорезе в диссоциирующих условиях в полиакриламидном геле [Остерман Л. А. ,1981], примесей не обнаружено. Контроль стерильности препаратов ИГ с ферментативной активностью роста бактерий не выявил. Таким образом, предложенный способ выделения поликлональных IgG из сыворотки крови позволил обеспечить высокий выход Ig и дал возможность по-

лучить препарата IgG (IgGt,IgG2,IgG4) без примесей IgA.

Исследована БАПНА-амидазная и ДНК-азная активность исходных молекул IgG и их Fab-фрагментов [Генералов И.И.,1985; Tramontano А.,1988]. Ферментативная активность сохранилась в препаратах Fab-фрагментов выделенных IgG. В связи с тем, что примесь проте-олитических ферментов, в частности плазмина [Herbert К. F.Lav., 1986], способна сохранять часть активности, по крайней мере в кислой среде [Мосолов В.В.,1971], при прогревании до 100°С в течение 30 минут, был поставлен специальный эксперимент. При данных условиях инкубации препараты ИГ теряли БАПНА-амидаз-ную активность. Наш исследования проводились при нейтральных значениях рН, где плазмин быстро инактивируется. Следовательно, наиболее вероятна принадлежность БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности непосредственно самим поликлональным IgG, причем она относится к Fab-фрагментам молекул ИГ.

ДНК-азную активность фракции IgG сыворотки крови определяли по разработанной нами методике (патент РБ №1066). В качестве субстрата использовали высокополимерную натриевую соль дезокси-рибонуклеиновой кислоты ("Sigma", США). Обнаружена способность 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактата (риванола) образовывать сгусток с дезоксирибонуклеиновой кислотой. Степень просветления рабочей смеси обратно пропорциональна ДНК-азной активности фракции поликлональных IgG. Количество риванола в образовавшемся сгустке определяли спектрофотометрическим методом на СФ-26 при 410 нм. Осуществлен подбор оптимальных параметров реакции. Построена калибровочная кривая для определения ДНК-азной активности фракции IgG по ДНК-азе с известной активностью, выраженной в пи-коКаталах (пКат). Коэффициент линейной корреляции между оптической плотностью и содержанием фермента в пробе составил -0,91 (р<0,01), сила влияния содержания ДНК-азы на оптическую плотность по результатам однофакторного дисперсионного анализа составила 82,6% (р<0,01). Изучена стабильность окрашивания проб во времени, которая оставалась постоянной в течение суток. Была произведена оценка воспроизводимости метода как опытных, так и контрольных проб. Коэффициент вариации контролей составил 2,93%. Коэффициент вариации ДНК-азной активности внутри одного определения оказался равным 7.09%, вариабельность метода низкая (опыт - 8,86%, контроль - 3,46%). Максимальная чувствительность предлагаемого способа за 24,0 часа инкубации - до 1 пг фермента в

пробе. Метод определения ДНК-азной активности превышал по чувствительности спиртовой и вискозиметрические методы в 10 раз. Снизился расход субстрата в три раза.

Протеолитическую активность фракции IgG сыворотки крови определяли по методу Эрлангера в модификации Шатерникова В.А. [1961] с нашими изменениями. В качестве субстрата использовали бензоиларгинин-р-нитроанилид (БАПНА) производства НИИ молекулярной биологии и генетики АН Украины. Выбор последнего был обусловлен тем, что распад БАПНА происходил только в результате расщепления амидной (или пептидной) связи по аминокислотам Arg-Lls, что исключало неспецифические реакции. Осуществлен подбор оптимальной концентрации IgG и субстрата БАПНА, а также оптимальных параметров реакции. Исследованы кинетические параметры взаимодействия AT с субстратом. При графическом определении в координатах Лайнуивера-Берка оказалось, что Km=l,18 мкМ, Vmax=0,2 мкМ/мин. Это средняя степень сродства фермента к субстрату. Сходные данные были получены и при изучении ферментативной активности некоторых моноклональных антител [Tramontano А.,1988]. Построена калибровочная кривая по р-нитроанилину, для определения БАПНА-амидазкой активности фракции ИГ, выраженной в пКат, в пересчете на содержание образовавшегося р-нитроанилина в пробе.

Антигены (АГ) слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки получали из биопсийного материала из краев язвы двух больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Кусочки ткани гомогенизировали методом ультразвуковой дезинтеграции [Бидненко С.И.,1985]. Экстрагирование АГ слизистой осуществлялось по стандартной методике [Егоров A.M. .1991]. Надосадок, полученный после центрифугирования при 8000 об/мин, использовали в качестве антигенного материала. Для определения антител (AT) к одному из субстратов в качестве антигена использовали высокополимерную натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты ("Sigma", США). Сорбцию антигена в лунках планшетов осуществляли по методике описанной Куляш Г.Ю. [1992]. Дальнейшую постановку твердофазного иммуноферментного анализа проводили по стандартной методике [Егоров A.M.,1991]. Результаты реакции оценивали на АИФ-Ц-01С.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере модели IBM PC АТ/386 используя пакеты прикладных программ методами одномерного и многомерного статистического анализа (корреляционного, регрессионного, дисперсионного) .

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Достоверно обладали БАПНА-амидазной активностью препараты поликлональных ИГ 79 (100,0%) больных, ДНК-азной активностью -76 (96,2%) больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе обострения (р<0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью в фазе обострения составило 0,216+0,018 пКат, а ДНК-азной -0,288+0,019 пКат.

Исследована ферментативная активность препаратов IgG в зависимости от пола больных. Средние значения БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции IgG при язвенной болезни в фазе обострения у больных мужского пола составили 0,216+0,021 и 0.283+0,021 пКат, а женского - 0,216+0,027 и 0.303+0,034 пКат соответственно.

Проведены отдельные исследования групп больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе обострения.

Достоверно обладали БАПНА-амидазной активностью препараты поликлональных ИГ 24 (100,0%) больных, а ДНК-азной - 21 (87,5%) больного язвенной болезнью желудка в фазе обострения (р<0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью желудка в фазе обострения составило 0,123+0,009 пКат. а ДНК-азной - 0.149+0.019 пКат.

Препараты поликлональных IgG всех 55 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки достоверно обладали БАПНА-амидазной и ДНК-азной активностью (р<0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения составило 0, 259+0, 024 пКат, а ДНК-азной - 0,343+0,020 пКат. Определена прямая корреляционная зависимость между ДНК-азной активностью фракции ИГ и количеством лейкоцитов в желудочном соке (лейкоциты = 20,7+3,9 в поле зрения; г=0,4189; р=0.0523) и обратная корреляционная зависимость между БАПНА-амидазной активностью препаратов ИГ и количеством ядер лейкоцитов в желудочном соке (ядра лейкоцитов = 31,7+3,4 в поле зрения; г=-0,4977; р=0,0255). Фракция иммуноглобулинов больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки обладала более высокой БАПНА-амидазной (р<0,0001) и ДНК-азной (р<0,0001) активностью, чем фракция ИГ больных язвенной болезнью желудка.

Исследована ферментативная активность препаратов IgG в зави-

симости от возраста у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения. Средние значения БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции IgG у больных язвенной болезнью ДПК, в фазе обострения от 18 до 29 лет составили 0,227+0,039 .и 0,270+0,037 пКаг. а от 30 лет И выше - 0,261+0,027 и 0,382+0,024 пКат соответственно. Имелись достоверные различия по ДНК-азной активности препаратов ИГ у лиц моложе и старше 30 лет (р<0,01).

Отмечена четкая взаимосвязь между уровнем БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности препаратов IgG и степенью тяжести процесса у больных язвенной болезнью ДПК. Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения легкой степени тяжести составило 0,132+0,015, средней - 0,259+0,015 и тяжелой - 0,480+0.087 пКат, а ДНК-азной - 0,130±0, 026, 0,374±0,026 и 0,333+0,047 пКат соответственно. Имелись достоверные различия БАПНА-амидазной активности фракции IgG у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения легкой, средней и тяжелой степени (р<0,001) и ДНК-азной активности - легкой и средней степени тяжести (р.<0,001). На основании полученных данных разработан и внедрен в практику здравоохранения метод, позволяющий использовать показатели БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности IgG как дополнительный диагностический критерий при определении степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (инструкция на метод МЗ РБ от 02.06.95г.).

Проанализировано влияние лечения препаратами тагаметом, ацидозом, метацнном, висмутом и винилином на ферментативную активность фракции иммуноглобулинов у 51 (92,7%) из 55 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения. Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в общей группе составило до и после лечения 0,259+0,165 и 0,204+0,138 (р>0,05), а ДНК-азной -0,343+0,140 и 0,300+0,210 (р>0,05) пКат соответственно. Достоверного изменения БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции ИГ у всех групп лиц, получавших тагамет, ацилок, метацин, висмут и винилин, а также в общей группе не наблюдалось.

Достоверно обладали БАПНА-амидазной активностью препараты поликлональных ИГ 32 (100,0%) больных, ДНК-азной активностью -25 (78,1%) больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии (р<0,05). Среднее значение БАПНА-ами-

дазной активности фракции igG больных язвенной болезнью в фазе ремиссии составило 0,096±0,009 пКат, а ДНК-азной - 0,156+0,028 пКат. Фракция иммуноглобулинов больных язвенной болезнью в фазе обострения обладала более высокой БАПНА-амидазной (р<0,0001) и ДНК-азной (р<0,001) активностью, по сравнению с фракцией ИГ больных язвенной болезнью в фазе ремиссии.

.Исследована ферментативная активность препаратов IgG в зависимости от пола больных. Средние значения БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции IgG у больных язвенной болезнью в фазе ремиссии мужского пола составили 0,096+0,012 и 0,173+0,037 пКат, а женского - 0,096+0,015 и 0,106+0,024 пКат соответственно. Лица мужского пола достоверно обладали более высокой ДНК-азной активностью препаратов ИГ по сравнению с лицами женского пола (р<0,05).

Проведены отдельные исследования групп больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии. Фракция ИГ больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки обладала более высокой БАПНА-амидазной (р<0,01) и ДНК-азной (р<0,001) активностью, чем фракция ИГ больных язвенной болезнью желудка.

Препараты IgG 15 (100%) больных язвенной болезнью желудка в фазе ремиссии достоверно обладали БАПНА-амидазной, а 8 (53,3%) -ДНК-азной активностью (р<0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью желудка в фазе ремиссии составило 0,069+0,009 пКат, а ДНК-азной - 0,033+0,006 пКат. Выявлена прямая корреляционная зависимость между БАПНА-амидазной активностью фракции ИГ и уровнем лейкоцитов в сыворотке крови (лейкоциты=5,4+1,2х10э/л; г=0,5839; р=0,0462).

Препараты IgG всех 17 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии достоверно обладали БАПНА-амидазной и ДНК-азной активностью (р<0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции IgG больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии составило 0,117+0,012 пКат, а ДНК-азной - 0, 235+0,036 пКат. -

При анализе ферментативной активности общей группы больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в фазе обострения и ремиссии оказалось, что достоверно обладали ДНК-азной активностью препараты поликлональных ИГ 101 (91,0%) больного, БАПНА-амидазной активностью - 111 (100.0%) больных (р<0,05).

При оценке состояния ферментативной функции фракции да у здоровых лиц оказалось, что ДНК-азной активностью достоверно обладали только 23 (41,8%) обследованных (р<0,05). Фракция полик-лональных ИГ здоровых лиц достоверно, по сравнению со спонтанным распадом субстрата, БАПНА-амидазной активностью не обладала (р>0,05). Среднее значение БАПНА-амидазной активности фракции да здоровых лиц составило 0,019+0,003 пКат. а ДНК-азной -О,046+0,007 пКат. Определена корреляционная зависимость между ДНК-азной активностью препаратов ИГ и концентрацией выделенных из сыворотки крови да (г=0,3290; р=0,0382).

Предпринята попытка установить взаимосвязь между сывороточными да, обладающими ферментативной активностью, и сывороточными антителами к антигенам слизистой оболочки ДПК, а также к одному из субстратов - дезоксирибонуклеиновой кислоте. С этой целью поставлен твердофазный иммуноферментный анализ для определения АТ к соответствующим антигенам у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки.

У 97 (87,4%) из 111 обследованных больных язвенной болезнью общей группы и у 15 (30,0%) из 50 здоровых лиц обнаружены антитела класса й к антигенам слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки (р<0,01). У клинически обследованных здоровых лиц, с морфологическим подтверждением нормальной слизистой, антитела к антигенам слизистой оболочки ДПК не выявлены. Следует отметить, что АТ были выявлены в очищенной фракции да (IgGj.IgG2.IgG4) и не определялись в сыворотке крови.

АТ к АГ слизистой оболочки луковицы двенадцатиперстной кишки обнаружены у 50 (90,9%) из 55 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения, у 19 (79,2%) из 24 больных язвенной болезнью желудка в фазе обострения, у 11 (64,7%) из 17 обследованных больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии и у 6 (40,0%) из 15 больных язвенной болезнью желудка в фазе ремиссии.

Отмечалась положительная корреляция между уровнем антител к антигенам слизистой ДПК и БАПНА-амидазной активностью препаратов поликлональных да у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения (г=0,4602; р=0,0028; сила влияния БАПНА-амидазной активности фракции ИГ по результатам однофактор-ного дисперсионного анализа - 21,18%). У больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии выявлена прямая

корреляционная зависимость средней силы между уровнем антител к антигенам слизистой и ДНК-азной активностью препаратов поликлональных IgG (г=0,6621; р=0, 0370).

У 25 (82.1%) из 28 случайно отобранных больных язвенной болезнью общей группы в сыворотке крови обнаружены антитела к дезоксирибонуклеиновой кислоте (р<0,01). У клинически обследованных здоровых лиц антитела к ДНК не выявлены. AT к ДНК обнаружены у 15 (83,3%) из 18 больных язвенной болезнью в фазе обострения и у 6 (60,0%) из 10 больных язвенной болезнью в фазе ремиссии. У больных язвенной болезнью в фазе обострения отмечалась положительная корреляция между уровнем антител к субстрату ДНК и величиной ДНК-азной активности препаратов поликлональных IgG (г= 0,7672; р=0.0015; сила влияния ДНК-азной активности фракции ИГ по результатам однофакторного дисперсионного анализа - 58,10%).

Существует несколько теорий происхождения ИГ фракций, ускоряющих распад биополимеров. Данные фракции AT появляются в результате идиотип-антиидиотипических взаимодействий [Wïiyte А.,1989], прямой иммунизации АГ, имеющими выраженный заряд, при непосредственном использовании энергии связывания АГ-АТ для последующего гидролитического расщепления соответствующих субстратов [Leatherbarrow R.J.,1989], а также при синтезе ИГ в В-клет-ках [Макс Э.Е.,1987]. Возможна посттрансляционная ковалентная модификация ИГ, в том числе за счет присоединения единичных молекул энзимов, либо кофакторов, в области шарнирного участка за счет S-H групп [Кульберг А.Я., 1985]. Следует отметить, что вышеизложенные теории не только не противоречат одна другой, но и служат дополнением друг друга.

В сыворотке крови антительные фракции по всей видимости способствуют инактивации антигенов, проникающих со слизистых оболочек гастродуоденальной зоны в кровяное русло. Выходя на поверхность слизистой оболочки данные фракции антител возможно участвуют в усилении местного иммунитета, в удалении с поверхности слизистой желудка и ДПК продуктов распада тканей (остатков клеток и их ядерного аппарата, различных белковых компонентов). Отсюда возможно эти фракции иммуноглобулинов обладают защитным действием.

Вместе с тем данные фракции ИГ, по всей видимости, могут участвовать и в поддержании воспалительного процесса путем возможного непосредственного повреждающего действия на слизистую

оболочку гаотродуоденальной зоны. Об этом свидетельствует достаточно высокий уровень БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции ИГ и AT к АГ слизистой оболочки ДПК и ДНК в период существования язвы, его снижение при закрытии дефекта и отсутствие у клинически обследованных здоровых лиц. Нельзя исключить и влияние продуктов распада IgG (Fab- и F(ab)2-фрагментов), направленных к АГ слизистой оболочки, как индукторов реакции воспаления [Кульберг А.Я., 1985; Сапроненков П.М.1987], что подтверждается нашими исследованиями. Fab-фрагменты, полученные путем расщепления IgG больных язвенной болезнью папаином, сохраняли ДНК-азную и БАПНА-амидазную активность. Кроме этого, IgG-фракции могут способствовать поддержанию воспалительного процесса путем активации комплемента и опосредованного К-клетками цитолиза [Blecher М. .1984].

Таким образом фракция ИГ здоровых лиц обладала низкой ДНК-азной активностью и не обладала БАПНА-амидазной. Достоверно определялась протеолитическая и эндонуклеазная активность препаратов поликлональных IgG у больных язвенной болезнью желудка и ДПК. Самую высокую ферментативную активность имели препараты ИГ больных язвенной болезнью ДПК в фазе обострения. БАПНА-амидазная и ДНК-азная активность фракции IgG зависела от пола, возраста больных, локализации язвенного дефекта, фазы заболевания и степени тяжести процесса. Фракция IgG больных язвенной болезнью содержала антитела к антигенам слизистой оболочки ДПК и ДНК. Фракция сывороточных IgG, обладающая БАПНА-амидазной и ДНК-азной активностью, может принимать участие в патогенезе и оказывать влияние на течение язвенной болезни. Ее показатели могут использоваться как дополнительный критерий при определении степени тяжести язвенного процесса в клинической практике.

ВЫВОДЫ

1. Фракция сывороточных IgG ускоряет распад белковых соединений по аминокислотам аргинин-лизин у всех больных язвенной болезнью и гидролиз дезоксирибонуклеиновой кислоты у 91,0% больных данной патологией.

2. У больных язвенной болезнью возрастает активность фракции IgG сыворотки крови, БАПНА-амидазная - до 0.216+0,018 пКат и ДНК-азная - до 0,288+0,019 пКат, по сравнению со здоровыми лицами (0,019+0,003 пКат и 0,046+0,007 пКат соответственно).

3. Пол, возраст больных, локализация язвенного дефекта, фаза заболевания и степень тяжести процесса влияют на уровень БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции сывороточных IgG.

4. У больных язвенной болезнью появляются сывороточные антитела класса G к антигенам слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и дезоксирибонуклеиновой кислоте соответственно в фазе обострения у 88,6% и 83,3%, в фазе ремиссии - у 56,3% и 60,0% больных (р<0,0001), а также у 30,0% здоровых лиц.

5. При лечении больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе обострения препаратами тагаметом, ацилоком, метаци-ном, висмутом и винилином не происходит достоверного (р>0,05) изменения БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции полик-лональных IgG.

6. Улучшить диагностику язвенной болезни позволяет использование показателей БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности фракции IgG в качестве дополнительного диагностического критерия при определении степени тяжести язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в любой день нахождения больного в стационаре.

7. У больных язвенной болезнью определяются прямые взаимосвязи показателей ДНК-азной и БАПНА-амидазной активности фракции IgG с уровнем сывороточных антител к антигенам слизистой оболочки дуоденальной зоны и признаками, характеризующими тяжесть болезни (степень активности процесса, фаза заболевания), что свидетельствует о значении подобных иммуноглобулинов в патогенезе и их влиянии на течение язвенной болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения эффективности тестирования биологических объектов, обладающих ДНК-азной активностью, рекомендуется использовать новый способ, позволяющий количественно определять ДНК-азную активность в препаратах иммуноглобулинов, сыворотках, а также в других биологических объектах, выявляющий до 1,25 пг биологически активного вещества в пробах с коэффициентом вариации равным 7,08% и превышающий по чувствительности спиртовой и вискозиметрический методы в 10 раз (р<0.01).

2. Для очистки фракции IgG целесообразно использовать разработанный способ и устройство для его осуществления, позволяющий обеспечивать высокий выход фракции иммуноглобулинов и получать препараты иммуноглобулинов класса G (Gt, Gz,G4) без примесей IgA и других белковых соединений.

- 16 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гидролиз бензоиларгинин-р-нитроанилида поликлональными антителами / Москалев К. В., Конорев М.Р., Азаренок К.С., Генералов И.И. // Реферативный журнал. Иммунология. Аллергология. -Витебск, 1990. - 13 е.- Деп. в ВИНИТИ 21.08.90, N4731 - В90.

2. Выбор метода очистки каталитических иммуноглобулинов для исследования их роли при инфекционной патологии / Конорев М.Р., Козловский И.В., Генералов И. И., Карлович Г.А., Жильцов И.А. // Вопросы патогенеза и терапии инфекционных и паразитарных заболеваний. - Витебск, 1993. - С. 60-63.

3. Конорев М.Р., Генералов И.И. Протеолитическая активность иммуноглобулинов при заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки // Здравоохранение Беларуси.-1994.-N3.-С.13-15.

4. Конорев М.Р. Коррекция тагаметом ферментативной активности поликлональных иммуноглобулинов класса G при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Актуальные проблемы современной медицины. - Витебск, 1994. - Т. 2. - С. 41-42.

5. Konorev M.R., Generalov I.I. BAPNA-amidase IgG activity of patients with duodenal ulcer // Immunobiology. - 1995. -Vol.194, N1-3. - P. 338.

6. Конорев M.P., Генералов И.И. Иммунологические признаки обострения язвенной болезни и профилактика ее рецидивов // Проблемы профилактической медицины. - Витебск, 1995. - С. 54-56.

7. Сопоставление уровня БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности IgG с наличием антител к антигенам слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и ДНК у больных язвенной болезнью / Конорев М.Р. , Генералов И. И., ОкуличВ.К., Жаворонок C.B. //Иммунодиагностика и иммунотерапия: тез. докл. 1-й Международ, конференции. - Витебск, 1995. - С. 80.

8. Способ определения ДНК-азной активности иммуноглобулинов / Голубева А.Г., Генералов И.И., Конорев М.Р., Новиков Д.К. // Актуальные проблемы экологической и клинической иммунологии. Часть 2. - Минск. 1995. - С. 6-9.

9. Конорев М.Р., Генералов И.И. Диагностическое значение сывороточных IgG, обладающих БАПНА-амидазной и ДНК-азной активностью, у больных язвенной болезнью // Иммунодиагностика и иммунотерапия: тез. докл. 1-й Международ, конференции. - Витебск, 1995. - С. 79-80.