Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние белка CRABP1 на биологические характеристики трансформированных клеток мезенхимального происхождения, ассоциированные с опухолевой прогрессией

4844249

На правах рукописи

КАИНОВ Ярослав Андреевич

ВЛИЯНИЕ БЕЛКА С ЛАВР 1 НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИЕЙ

Специальность 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 АПР 2011

Москва 2011

4844249

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Чевкина Елена Максимовна

Доктор медицинских наук Харатишвшш Теймураз Кобаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

Доктор биологических наук

Карпухин Александр Васильевич Красильников Михаил Александрович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгсльгардта РАН

Защита диссертации состоится «_/£.» 2011 года в IЧ " часов

на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан « » ¡¿¿¿у?Г*Ч-2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Опухолевая прогрессия - сложный и многоступенчатый процесс, включающий в себя развитие первичной опухоли и распространение опухолевых клеток по организму, что приводит к образованию очагов вторичного роста в отдаленных органах. Именно этот процесс, называемый метастазированием, является основной причиной гибели пациентов с онкологическими заболеваниями. Безусловно, идентификация и функциональный анализ ключевых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и мета-стазирования, является одной из важнейших фундаментальных задач молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. При этом основные знания о механизмах опухолевой профессии касаются, в основном, трансформированных клеток и опухолей эпителиального происхождения. В этой ситуации особо актуальными являются исследование особенностей прогрессии опухолей мезенхимальной природы (в частности мягкотканных сарком) и механизмов, обеспечивающих их высокий метастатический потенциал.

Одним из основных подходов к изучению механизмов опухолевой прогрессии являются исследования на экспериментальных моделях. Одной из таких моделей является панель клеточных линий мезенхимального происхождения - фибробластов сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса, принципиально отличающихся между собой по уровню органоспецифического метастазирования в легкие при введении экспериментальным животным. Основным достоинством этой модели является возможность проведения теста на спонтанную метастатическую активность (СМА) на иммунокомпетентных животных, который позволяет смоделировать все этапы прогрессии от возникновения первичной подкожной опухоли до пролиферации ее клеток в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Таким образом, данная модель представляется чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров метастазирования.

Ранее Зуевой Э. Ш. при сравнении профилей экспрессии двух клеточных линий из описанной выше панели - низкометастазной НЕТ-БЯ и высокометастазной НЕТ-ЭМ с помощью двумерного гель-электрофореза были получены первичные данные, свидетельствующие о принципиальном различии в уровне продукции клеточного белка СКАВР1. Данный белок локализуется в цитоплазме, его основная функция заключается в связывании ретиноевой кислоты (РК) и, предположительно, снижении ее транскрипционной активности. В последнее время значительно возрос интерес к изучению механизмов регуляции РК в процессе возникновения и роста солидных опухолей. Стимуляция метаболизма ретиноевой кислоты может

снижать уровень клеточной дифференцировки, что является одним из показателей опухолевой прогрессии на клеточных моделях, а также служит клиническим признаком агрессивности новообразований и часто коррелирует с неблагоприятным медицинским прогнозом.

Изменение экспрессии CRABP1 характерно для ряда новообразований человека, таких как опухоли молочной железы, аденокарциномы эндометрия, немелкокпеточный рак легкого, рак яичников и нейрогенные опухоли, и, по некоторым немногочисленным наблюдениям, может коррелировать с неблагоприятным медицинским прогнозом. При этом молекулярные механизмы участия данного белка в процессах канцерогенеза практически не изучены. Данные о роли CRABP1 в процессе метастазирования на сегодняшний день в научной литературе отсутствуют.

Данная работа посвящена изучению влияния белка CRABP1 на процесс опухолевой прогрессии и метастазирования на экспериментальной модели клеточных линий мезенхи-малыюго происхождения. Также в работе впервые проведен первичный анализ экспрессии данного гена в коллекции образцов мягкотканных сарком человека.

Таким образом, данное исследование представляется чрезвычайно актуальным, поскольку позволяет выявить роль CRABP1 в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток и обнаружить ряд связанных с этим процессом молекулярных изменений, а также сопоставить эти данные с результатами, полученными при исследовании клинического материала.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение роли белка CRABP1 в регуляции ключевых биологических характеристик трансформированных клеток мезенхимального происхождения, ассоциированных с опухолевой прогрессией in vitro и in vivo.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные

задачи:

1. Выявить корреляцию между экспрессией CRABP1 и уровнем спонтанной метастатической активности клеточных линий панели RSV -трансформированных фибробластов сирийского хомяка;

2. Гиперэкспрессировать кодирующую последовательность мРНК CRABP1 хомяка в низкометастазной клеточной линии HET-SR; исследовать влияние экзогенного CRABP1 на туморогенность и спонтанную метастатическую активность клеток данной линии;

3. Получить производные высокометастазной клеточной линии HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1 и изучить их туморогенность, а также экспериментальную и спонтанную метастатическую активность;

4. Провести сравнительный анализ основных клеточных характеристик полученных линий in vitro: динамики пролиферации, миграционной активности, клоногенности и

способности к неприкрепленному росту, а также экспрессии ряда протеаз, разрушающих внеклеточный матрикс (uPA, ММР-2, ММР-9, ММР-13) и маркеров клеточной дифференцировки (CD24, RALDH1, RARp и CYP26A1);

5. Получить мутантную форму CRABP1, не связывающую ретиноевую кислоту, и изучить влияние экспрессии данной конструкции на туморогенность низкометастазноп клеточной линии HET-SR;

6. Провести анализ экспрессии CRABP1 в образцах злокачественных опухолей мягких тканей человека.

Научная новизна и практическая значимость исследования Одним из важнейших результатов данной работы является тот факт, что экспрессия CRABPI важна для формирования метастатического фенотипа ряда клеточных линий мезен-химального происхождения. Это является первым экспериментальным доказательством про-мотирующего влияния CRABP1 на процесс опухолевой прогрессии, что делает полученные в представленной работе данные уникальными. Также полученные в работе результаты расширяют представления о роли CRABP1 в канцерогенезе. В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о влиянии CRABP1 на многие характеристики неопластических клеток. В частности, впервые показано, что экспрессия CRABP1 стимулирует туморогенность клеточных линий HET-SR и HET-SR1. Также продемонстрировано влияние CRABP1 на экспрессию ММР-13 и ММР-14. Впервые показана гиперэкспрессия CRABP1 в образцах злокачественных фиброзных гистиоцитом человека.

Работа имеет в первую очередь фундаментальное теоретическое значение. Полученные данные о роли CRABP1 в опухолевой прогрессии и процессе метастазирования могут быть использованы при дальнейшем его изучении, как на модельных системах, так и в клинических исследованиях. Возможно, что такие исследования приведут к открытию новых диагностических маркеров и мишеней для таргетной терапии опухолей.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 24 февраля 2011 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов канцерогенеза и генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях: «Cáncer Degradóme Symposium» в 2008 г. (Лондон, Англия), «Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cáncer» в 2009 г (Греция, Спецес), «Методы культивирования клеток» в 2009 г. (Санкт-Петербург), Beatson international cáncer conference "Microenvironment, motility and metástasis" в 2009 г. (Глазго, Шотландия). По результатам диссертационной работы опубликованы 3 научные статьи и 6 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 6 таблиц. Состоит из глав: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы». Глава «Список использованной литературы» содержит 17В источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В работе использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование, сайт-направленный мутагенез, трансфекция эука-риотических клеток, инфицирование клеток псевдовирусными частицами, подавление экспрессии генов с помощью малых шпилечных РНК, анализ количества мРНК методом ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, выделение и анализ белковых фракций с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса (субстрат-специфическая зимография в ПААГ), анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» in vitro (wound healing assay), тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногекносгь), тест на обргвование колоний в полужидкой среде, тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, определение туморогенно-сти клеточных линий, экспериментальной метастатической активности (ЭМА) и спонтанной метастатическоей активности (СМА) клеток на лабораторных животных, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуждение 1. Исследование экспрессии CRABP1 в линиях с различным метастатическим потенциалом

Одной из моделей для поиска новых сигнальных путей и конкретных белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии и метастазирования, является панель эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса (рис. 1А). Все линии данной панели характеризуются высоким уровнем туморогенности, но принципиально различаются по уровню органоспецифического метастазирования в легкие в тесте на спонтанную метастатическую активность (СМА) при подкожном введении клеток (рис. 1Б). В тесте на СМА исследуемые клетки проходят все этапы процесса метастазирования -возникновение первичной подкожной опухоли, интравазию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Используемая модель позволяет исследовать метастатическую активность клеток на иммунокомпетент-

пых животных, что наиболее адекватно отражает процесс метастазирования, происходящий в естественных условиях. Поскольку все линии имеют общее происхождение и достаточно схожие профили экспрессии большинства генов, изучение различий между высоко- и низко-метастазными клеточными линиями весьма перспективно с точки зрения изучения молекулярных механизмов метастазирования.

В данной работе использовались низкометастазная (Н/М) линия HET-SR, исходно вы-сокометастазные (В/М) линии HET-SR1 и HET-SR8 и В/М линия HET-SR-2SC, полученная в ходе селекции клеток HET-SR in vivo (после двух последовательных подкожных введений животным и последующего отбора клеток из метастазов в лимфоузлы). Описываемая панель линий получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина и ранее была подробно охарактеризована.

СМА

Эмбриональные фибробласты сирийского хомяка

Введение клеток подкожно

RSV инфекция

\ 1

HET-SR | HET-SR-f| [ HET-SR-8 |

селекция in vivo

— ; ■

высокая СМА [ | Низкая СМА

Рисунок 1. А - панель исходных клеточных линий RSV-трансформированных фиброб-ластов сирийского хомяка с разным уровнем спонтанной метастатической активности; Б -Схема эксперимента по изучению спонтанной метастатической активности (СМА) клеток in vivo.

Ранее при сравнении профилей экспрессии белков в высоко- и низкометастазных линиях методом двумерного гель-электрофореза Зуевой Э.Ш (Институт Кюри, Париж, Франция) обнаружено отсутствие продукции CRABPI в Н/М линии HET-SR и высокий уровень данного белка в В/М линии HET-SR 1. Этот факт поставил вопрос о возможном участии CRABP1 в приобретении трансформированными клетками агрессивного фенотипа.

На первом этапе исследования мы подтвердили данные двумерного гель-электрофореза. Для этого в линиях HET-SR и HET-SR1 экспрессия CRABP1 была проанализирована с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блот анализа (рис. 2). Из представленных данных мы заключили, что экспрессия CRABP1 характерна только для высокометастазной линии HET-SR1, при этом отличия наблюдаются как на уровне мРНК, так и на уровне продукции

белка CRABP1.

на

CRABP1

RPLPO

CRABP1

(3-actin

НЕТ-ЭН НЕТ-БМ НЕТ-ЭЯ НЕТ-ЗН1

А Б

Рисунок 2, Сравнение экпрессии СЯАВР1 в линиях НЕТ-ЗЯ и НЕТ-ЯШ. Данные полуколичественного ОТ-ПЦР (А) и Вестерн-блот анализа (Б).

Для подтверждения возможной корреляции между продукцией белка С1МВР1 и уровнем метастатической активности был проведен анализ экпрессии данного белка в других высокометастазных линиях трансформированных фибро-бластов хомяка (рис. 3). 115

100-

<в 75-

250:

75

Crabpl P-actin

ч*

-V*

Л"

с?

я?

4-

л?

Рисунок 3. Экспрессия CRABP1 в высокометастазных линиях исследуемой панели. А - Спонтанная метастатическая активность изучаемых линий (указано среднее число метастазов на животное); Б - Вестерн-блот анализ продукции белка CRABP1.

Оказалось, что CRABP1 экпрессируется на высоком уровне во всех высокометастазных линиях данной панели. Важно отметить, что повышение продукции этого белка характерно для линии HET-SR-2SC, полученной из низкометастазной линии HET-SR методом селекции in vivo. Полученные данные свидетельствуют о корреляции между экпрессией CRABP1 и уровнем спонтанной метастатической активности исследуемых клеточных линий н позволяют предположить, что белок CRABP1 функционально участвует в формировании злокачественного клеточного фенотипа в данной модели.

2. Получение линии HET-SR с гиперэкспрессией CRABP1 и изучение ее свойств

in vivo

Для изучения влияния CRABP1 на свойства клеток, ассоциированные с опухолевой рогрессией, ген был гиперэкспрессирован в клетках низкометастазной линии HET-SR, где его экспрессия отсутствует. Для этого получен ретровирусный вектор pLXSN, несущий коди-

рующую последовательность мРНК CRABPI хомяка. Поскольку геном сирийского хомяка не секвенирован, амплификация и молекулярное клонирование проводилось в двух независимых повторах. Полученная последовательность была секвенирована и опубликована в открытой базе последователностей GenBank (регистрационный номер GQ139546.1). Далее, с помощью ретровирусной инфекции была получена линия HET-SR CRABP1, характеризующаяся ста-

Рисуиок 4. Вестерн-блот анализ экспрессии CRABPI е производных линии HET-SR. В качестве положительного контроля использовсиш лизат линии HET-SR1.

в данной раооте проведен анализ т vivo двух основных клеточных характеристик линии HET-SR CRABPI -туморогенности и спонтанной метастатической активности. Для изучения туморогенности суспензия исследуемой клеточной линии в четырех последовательных разведениях (использовались «дозы» в 2x104, 2x103, 2x102 и 2х 101 клеток) прививалась подкожно каждому экспериментальному животному в места сочленения лап с туловищем (рис.5А). Затем, по прошествии двух месяцев в исследуемых группах анализировалось наличие сформировавшихся в местах введения клеток опухолей. В каждом эксперименте использовали не менее 10 животных для каждой группы. Как видно из рисунка 5Б, линия HET-SR CRABPI характеризуется статитистически достоверным повышением туморогенности по сравнению с линией HET-SR pLXSN. Так, у всех животных с подкожно введенной линией HET-SR CRABPI на месте введения максимальной дозы - 2x104 клеток развивались опухолевые узлы, в то время как в контрольной группе обнаруживались животные без опухолей, что свидетельствует о том, что даже максимальные количества вводимых клеток контрольной линии не прививались. Опухоли после введения 2x103 клеток линии HET-SR CRABPI также развивались у хомяков гораздо чаще. Опухоли на месте введения животным дозы в 2хЮ2 клеток развивались только в случае подкожного введения линии HET-SR CRABPI и отсутствовали у хомяков с введенными клетками HET-SR pLXSN.

бильной продукцией изучаемого белка (рис.4).

CRABP1

p-actin

HET-SR1 HET-SR HET-SR LXSN CRABP1

2x10'

А

НЯ 3 опухоли

! А 2 опухоли

I I 1 опухоль

I I нет опухоли

НЕТ-В[* НЕТ-БЯ р!_Х8М СЦАВР1

Рисунок 5. А - Схема эксперимента по оценке уровня туморогенноспш клеток исследуемых линий, Б - Туморогенноспш производной линии НЕТ-ЯЯ с гиперэкспрессией СЯАВР1. (здесь и далее * -р<0,05)

Анализ СМА для каждой линии также проводили на 10 экспериментальных животных не менее чем в трех повторах. Для определения количества метастазов животных усыпляли, легкие фиксировали в формалине. Далее легочную ткань заливали в парафин и готовили гистологические срезы толщиной 5-6 мкм. Определение количества метастазов проводилось микроскопически посредством гистологического исследования ткани легкого (90 срезов на каждый образец). На рисунке 6А представлен пример микроскопического анализа среза ткани легкого, окрашенного гематоксилином и эозином, с метастатическим поражением.

ЧШ

лШШ

Паренхима легкого ч

N1*- ¿¿•ШШШё.

НВ 111

жя

ШШш

ш1

58ч

Рисунок 6. А - Срез ткани легкого с метастатическим поражением, окрашенный гематоксилином и эозином, Б - Спонтанная метастатическая активность производных линии НЕТ-5Я с гиперэкспрессией СИАВР1. Указано число гистологически верифицированных метастазов на 90 срезов.

Клетки низкометастазной линии НЕТ-БЯ с гиперэкспрессией СЯАВР1 образуют большее количество легочных метастазов после подкожного введения, чем контрольная ли-

ния (Рис. 6Б). Однако только в трех экспериментах из пяти это отличие было статистически достоверно (р<0,05), в двух других экспериментах исследуемые выборки значимо не отличались (р<0.1). Таким образом, можно говорить лишь о тенденции к повышению СМА при гиперэкспрессии CRABP1 в линии HET-SR.

3. Получение производных линии HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1 и изучение их свойств ш vivo

На следующем этапе исследования в высокометастазной линии HET-SR1 была подавлена экспрессия эндогенного CRABP1. Для этого нами были получены лентивирусные конструкции на основе вектора pLKO.l puro, кодирующие предшественники малых шпилечных РНК к кодирующей последовательности мРНК CRABP1 хомяка. В качестве контроля использовался вектор pLKO.l puro, кодирующий малую шпилечную РНК к последовательности eGFP (pLKO.l shGFP). Далее с помощью лентивирусной инфекции были получены три поликлональные клеточные линии, производные HET-SR1, со сниженной продукцией белка CRABP1. Наибольшая эффективность подавления экспрессии CRABP1 наблюдалась для шпилечной конструкции shB. В дальнейших экспериментах были использованы клеточные линии HET-SR1 shA и HET-SR1 shB, так как в них эффект подавления экспрессии был наиболее выражен (Рис. 7).

Клеточные линии HET-SR1 shA и HET-SR1 shB были охарактеризованы с точки зрения их туморогенности и СМА. Обе линии оказались менее туморогенны по сравнению с контролем, и это отличие статистически достоверно (рис. 8А). Так, подавляющее число животных в контрольной группе характеризовались наличием опухолей, образовавшихся после подкожного введения 2х102 клеток. В то же время, в группах животных, которым вводились клетки со сниженной экспрессией CRABP1, опухоли на месте введения 2x102 опухолевых клеток образовывались у значительно меньшего количества животных, а при введении 2х 101 клеток рост подкожных опухолей не наблюдался.

А Б

Рисунок 7. Анализ экспрессии СКЛВР1 в производных линии ПЕТ-$К1. А- Весшерн-блош В качестве положительного котроля использовали лизат линии НЕТ-5К1. Б - Результаты депситометрического обсчета.

Сравнение СМА исследуемых линий показало, что линии НЕТ-ЗИЛ бЬА и НЕТ-ЭИЛ зЬВ характеризуются сниженным уровнем метастазирования в легкие. При этом уровень такого снижения был выраженнее в случае линии НЕТ-8Я1 эЬВ и коррелировал со степенью подавления экспрессии СРЛВР1 (Рис. 8Б). Таким образом, в линии НЕТ-8Я1 экспрессия СКАВР1 функционально связана с высокометастазным фенотипом. Направленное подавление продукции белка С11АВР1 приводит к статистически достоверному снижению туморогенно-сти и спонтанной метастатической активности данной клеточной линии.

Поскольку литературные данные об участии СКАВР1 в процессе метастазирования на сегодняшний день отсутствуют, данное исследование является первым экспериментальным свидетельством подобной функции этого белка.

Рисунок 8. А - Туморогенность производных линии ПЕТ-ЯШ со сниженной экспрессией С11АВР1. Б - Спонтанная метастатическая активность производных линии НЕТ-$К1 со сниженной экспрессией СЯАВР!. Указано число гистологически верифицированных метастазов на 90 срезов.

4. Изучение активности и экспрессии протеаз, разрушающих внеклеточный метрике

Поскольку способность расщеплять компоненты внеклеточного матрикса является важной характеристикой опухолевых клеток, коррелирующей с процессом метастазирования, мы провели анализ активности и экспрессии ряда секретируемых протеаз, участвующих в разрушении внеклеточного матрикса. Анализ желатиназной активности в кондиционированных средах показал, что изучаемые клеточные линии характеризуются сходным уровнем активности ММР-2, а активность ММР-9 наблюдается только в производных линии НЕТ-вЯ (Рис. 9). Однако активность этой металлопротеиназы низка и не зависит от статуса экспрессии СЯАВР1. Наиболее интересным результатом, полученным в ходе данного эксперимента, является снижение коллагеназной активности в производных линии НЕТ-8Ю с подавленной экспрессией СИ4ВР1.

К сожалению, метод желатиназной зимографии не позволяет идентифицировать, какая именно коллагеназа- ММР-1, ММР-8 или ММР-13 - активна в линии НЕТ-5Я1 из-за сходной молекулярной массы данных ферментов. Для идентификации конкретной коллагеназы мы исследовали экспрессию мРНК всех трех ферментов и установили, что, вероятнее всего, это ММР-13, поскольку она экспрессируется в линии НЕТ-БИЛ и во всех ее производных на высоком уровне, в то время, как экспрессия ММР-1 и ММР-8 не детектируется (Рис. 10). Следует отметить, что высокая экспрессия и активность ММР-13 коррелирует с высоким уровнем инвазивности опухолей и является фактором неблагоприятного медицинского прогноза при опухолях головы и шеи, раке молочной железы и толстой кишки. Таким образом, полученные данные об активности ММР-13 в изучаемых линиях согласуются с литературными данными.

Парадоксально, но уровень экспрессии мРНК ММР-13 в линиях НЕТ-БЮ вЬА и НЕТ-БЮ 511В несколько выше, чем в контрольной линии, что не соотносится с данными об активности данной протеазы в желатиназной зимографии. Для объяснения этого факта, мы изучили экспрессию ММР-14, другой матриксной металлопротеиназы, которая, согласно литературным данным, играет ключевую роль в активации ММР-13, за счет протеолиза ее неактивного предшественника. Анализ экспрессии методом ОТ-ПЦР выявил выраженное снижение количества мРНК ММР-14 в линиях с подавленной экспрессией СМВР1 (Рис. 10).

Известно, что экспрессия ММР-13 и ММР-14 может активно регулироваться ретиное-вой кислотой. При этом экспрессия ММР-13 позитивно регулируется РК и ее производными, в то время как для ММР-14 характерна негативная регуляция. Подавление продукции С11АВР1 может приводить к снижению метаболизма РК и, соответственно, усилению транскрипции гена ММР-13 и подавлению ММР-14. Снижение экспрессии ММР-14, в свою очередь, препятствует протеолитической активации предшественника ММР-13, что и приводит к уменьшению активности данной протеазы в желатиназной зимографии. Этот механизм, безусловно, является гипотетическим и требует экспериментального подтверждения.

Рисунок 9. Желатиназная зимография кондиционирован-ММР-2 ных сред, полученных при куль-

ММР-1,8,13

ММР-9

тивировании изучаемых кле-

точных линии.

ММР-13

ММР-9

матриксных металлопротеи-наз в изучаемых линию: (ОТ-

ПЦР). В качестве положительного контроля использована кДНК из линии рака простаты

Рисунок 10. Экспрессия

ММР-8

ММР-1

- RPLP0

СО

РСЗ.

Важно отметить, что изначально в линиях HET-SR и HET-SR1 экспрессия ММР-14 коррелирует с их метастатической активностью. Кроме того, по литературным данным, экспрессия этой металлопротеиназы высока в линии HET-SR-2SC, что позволяет предположить ее функциональный вклад в формирование метастатического фенотипа изучаемых линий.

5. Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro Для выявления потенциальных механизмов участия белка CRABP1 в формировании злокачественного фенотипа мы исследовали ряд ассоциированных с метастатическим потенциалом характеристик полученных клеточных линий in vitro. Перечень исследованных клеточных характеристик и суммарные данные об их изменении in vivo и in vitro схематически представлены в таблице I.

В случае производных низкометастазной линии HET-SR не удалось установить значимых изменений в основных исследуемых клеточных свойствах.

Подавление экспрессии CRABP1 в высокометастазной линии HET-SR1 также не привело к изменению динамики пролиферации и способности к колониеобразованию в тесте на клоногенность, однако усиливало способность линии НЕТ-SRl к формированию колоний в полужидкой среде. Этот результат представляется сложно интерпретируемым, поскольку в подавляющем числе работ эта характеристика коррелирует с более злокачественным фенотипом различных опухолевых клеток. При этом, феноменологически, в нашей модельной системе наблюдается обратная корреляция между данной клеточной характеристикой и спонтанной метастатической активностью изучаемых линий: способность к формированию колоний в метилцеллюлозе высока у исходной низкометастазной линии HET-SR и низка у НЕТ-SRl. Соответственно, снижение экспрессии CRABP1 в высокометастазной клеточной линии приводит к стимуляции данной характеристики до уровня низкометастазной клеточной линии, что коррелирует с уровнем снижения спонтанной метастатической активности.

Таблица 1. Сравнительный анализ измепий клеточных характеристик изучаемых линий.

HET-SR pLXSN HET-SR CRABP1 HET-SR1 sliGFP I1ET-SR1 ShA HET-SR 1 shB

Экспрессия CRABP1 (-) (+); (+) (-) (-)

Туморогенность (-) » (-) (-)

СМА (-) (+)? (+) (-) (-)

ЭМА количество метастазов Н/Д Н/Д (+)■ (+) (+)

ЭМА размер метастазов н/д Н/Д (+) (-) (-)

Клоногенность (-) (-) (+) (+) (+)

Рост в полужидкой среде (+) (+) „ (-) (+) (+)

Миграция в «ране в монослое» (-) (-) (+) ' (+) (+)

Миграция в камерах Бойдена (-) (-) (+) 1р|М -у (++)

Активность коллагеназ (-) (-) (+) (-)

Экспрессия ММР-13 (-) (-) (+) III

Экспрессия ММР-14 (-) (-) ■иди

(+) (-) Н/Д

Высокая выраженность признака Усиление выраженности по сравнению с контролем Низкая выраженность признака Данные отсутсвуют

Снижение экспрессии CRABP1 вызывает усиление миграционной активности линии HET-SR1 в камерах Бойдена по градиенту ростовых факторов, однако не приводит к изменению миграционных свойств в тесте на «зарастание раны» in vitro. Исходя из этих данных, можно предположить, что подавление CRABP1 не влияет непосредственно на миграционные свойства линии HET-SR1, а повышает ее чувствительность к факторам роста, что и опосредует усиленную миграцию по градиенту сыворотки в камерах Бойдена, однако это предположение носит гипотетический характер и требует дальнейшего экспериментального под-

тверждения.

6. Изучение экспрессии отдельных ретиноид-респонсивых генов и маркеров клеточной дифференцировки

Единственной известной на сегодняшний день функцией белка СЯАВР1 является связывание ретиноевой кислоты (РК) и регуляция ее метаболизма. Поскольку РК - выраженный дифференцировочный агент, мы предположили, что изменение экспрессии СЯАВР1 в изучаемых линиях должно влиять на экспрессию РК-респонсивных генов и, как результат, на уровень клеточной дифференцировки, и именно этот механизм может являться основным в СЯАВР1 -опосредованной стимуляции туморогенности и метастазирования. Для проверки этой гипотезы на первом этапе мы проанализировали экспрессию ряда РК-респонсивных генов и маркеров дифференцировки в полученных линиях (Рис. 11).

Рисунок 11. Экпрессия ряда РК-респонсивных генов и маркеров дифференцировки в изучаемых линиях (ОТ-ПЦР). В качестве положительного контроля для СУР26А1 использована кДИК из линии рака простаты РСЗ.

В первую очередь, мы исследовали экспрессию широко известного маркера дифференцировки CD24. Этот поверхностный антиген экспрессируется в различных опухолях человека и зачастую ассоциирован с низким уровнем дифференцировки и агрессивным фенотипом опухолей, а также низким уровнем пятилетней выживаемости онкологических больных. Мы установили, что в нашей экспериментальной модели экспрессия данного антигена коррелирует с высокометастазным фенотипом, и уровень мРНК CD24 существенно выше во всех производных линии HET-SR1. Однако подавление экспрессии CRABP1 в линии НЕТ-SR1, равно как и гиперэкспрессия CRABP1 в линии HET-SR, не приводило к изменению количества мРНК CD24.

В данных линиях мы также не обнаружили изменения экспрессии таких первичных РК-респонсивных генов, как RARfi и CYP26A1. RAR(? является рецептором ретиноевой кислоты, уровень его экспрессии является одним из факторов, опосредующих клеточный ответ на действие РК. Промотор гена RARfi несет RARE (РК-зависимый респонсивный элемент), и поэтому транскрипция мРНК RARfi усиливается по принципу положительной обратной связи в ответ на попадание в клетку ретиноевой кислоты. CYP26A1 - это белок семейства цито-

<9 or ar

к и S Uj « A! Ц/

А» ш t 4-

i-

хромов Р450, основной функцией которого является метаболическая инактивация ретнное-вой кислоты. Его экспрессия стимулируется в ответ на аппликацию РК за счет наличия целого ансамбля RARE-элементов в промоторе гена. В производных клеточных линий HET-SR и HET-SR1 экспрессия гена RARfi обнаруживается на низком уровне, а экспрессии CYP26AI отсутствует, при этом как подавление, так и гиперэкспрессия CRABP1 не приводит к достоверному изменению количества мРНК как RAR/1, так и CYP26A1

Модуляция экспрессии CRABP1 в линиях HET-SR и HET-SR1 также не сказалась на количестве мРНК RALDH1, клеточного фермента, участвующего в синтезе РК из ее предшественников. Экспрессия данного гена характерна для производных линии HET-SR и отсутствует в производных линии HET-SR1. Поскольку из литературы известно, что РК негативно регулирует транскрипцию данного гена, мы ожидали увидеть повышение количества мРНК RALDH1 в ответ на гиперэкспрессию CRABPI, однако, экспрессия RALDH1 оказалась одинакова в линиях HET-SR pLXSN и HET-SR CRABP1.

Таким образом, нам не удалось обнаружить зависимых от CRABP1 изменений в экспрессии генов, регулируемых ретиноевой кислотой. Безусловно, нами проанализирована лишь небольшая группа подобных генов, что не позволяет сделать однозначных выводов о вляиния CRABP1 на метаболизм и транскрипционные функции РК. Однако подобные результаты поставили вопрос о том, насколько функции белка CRABP1, связанные с ретиноевой кислотой, важны для стимулирования туморогенности и метастатической активности изучаемых линий.

7. Получение мутантной формы CRABP1, неспособной связывать РК и изучение ее туморогенности ш vivo

В связи с тем, что на сегодняшний день единственной достоверно известной функцией белка CRABP1 является связывание ретиноевой кислоты, нами было решено исследовать важность данной белковой активности для формирования злокачественного фенотипа опухолевых клеток в нашей модели. Дня этого была получена мутантная форма данного белка, связывающая РК с низкой аффиностыо. Показано, что замена аргинина на аланин в 131 положении (активном центре) CRABP1 вызывает более чем двадцатикратное повышение Kd комплекса CRABP1-PK, что, по сути, приводит к полной потере ее связывания. С помощью сайт-направленного мутагенеза нами получена последовательность, кодирующая мутаптный белок CRABPI R131A. Эта последовательность была клонирована в ретровирусный вектор pLXSN, после чего с помощью ретровирусной инфекции получены поликлональные клеточные линии, стабильно экспрессирующие мутантный белок CRABPI R131A и CRABP1 дикого типа (wt) (Рис. 12А). Далее мы проверили, насколько повышение туморогенности клеток низкометастазной линии HET-SR зависит от способности CRABP1 взаимодействовать с РК.

С1*АВР1

Р-асйп

/

£

#

Со £

9

г ° §

1 б

— 3 опухоли

I ] 2 опухоли

I 1 опухоль

I I нет опухоли

нет-эр? нет-эя нет-б!* рцсэм сяавр1 славр1 т М31А

Рисунок 12. А - Вестерн-блот анализ экспрессии СЯАВР1 в производных линии ПЕТ-ЯК. Б - Сравнение туморогенности производных линии НЕТ-ЯН.

Анализ показал, что обе исследуемые линии оказались значимо более туморогенны по сравнению с контролем (Рис.12Б). Так, при подкожном введении клеток контрольной линии НЕТ-БИ. рЬХБЫ опухоли развиваются менее чем у половины экспериментальных животных, тогда как в случае линий НЕТ-БЯ С11АВР1 м и НЕТ-БЯ С11АВР1 Ш31А опухоли развиваются у подавляющего числа животных. При этом туморогенность линии НЕТ-БИ. с гиперэк-прессией мутантной формы СЯАВР1 Я131А статистически не отличалась от таковой в случае гиперэкпрессии С11АВР1 дикого типа. На основании этих данных можно утверждать, что способность белка СЯАВР1 связывать РК не является необходимой для стимуляции туморо-геннности низкометастазной клеточной линии НЕТ-БЯ. Этот факт имеет важное теоретическое значение, поскольку позволяет предположить наличие у белка СЯАВР1 неких биологических функций, не требующих взаимодействия с РК. Важно отметить, что на сегодняшний день в литературе отсутствуют данные о подобных внутриклеточных функциях данного бел-

8. Изучение экспрессии СЯАВР1 в образцах мезенхимальных опухолей мягких тканей человека

Поскольку в предыдущих экспериментах нами была установлена активная роль белка СЯАВР1 в формировании высокометастазного фенотипа трансформированных фибробла-стов хомяка, мы решили исследовать характер изменений экпрессии данного гена при развитии мягкотканых сарком человека. В данной работе впервые проведен анализ экспрессии гена С1ЫВР1 в образцах мезенхимальных опухолей мягких тканей с помощью метода ПЦР в реальном времени с использованием ТачМап-зондов. Всего проанализировано 28 образцов, 10 из которых представляли собой липосаркомы, 7 - злокачественные фиброзные гистиоци-томы (ЗФГ), 6 - синовиальные саркомы и 5 - злокачественные шванномы.

В изучаемой выборке мезенхимальных опухолей мы зафиксировали все возможные варианты изменения относительной экспрессии тенаСЯАВР1 (Рис. 13). В целом, изменения в

экспрессии СКАВР1 по сравнению с нормальными тканями характерно для 60% злокачественных опухолей мягких тканей человека. При этом характер выявленных изменений был связан с гистологическим типом новообразования. Так, повышение экспрессии СЯАВР1 характерно только для синовиальных сарком и злокачественных фиброзных гистиоцитом, в то время как в образцах липосарком и злокачественных шванном нами обнаружено только снижение относительной экспрессии данного гена по сравнению с условной нормой. Из данных научной литературы известно, что экспрессия СРАВР1 характерна для синовиальных сарком, данные о повышенной относительной экспрессии данного гена в тканях ЗФГ в литературе отсутствуют.

относительная экспрессия

■ повышена

ЗФГ и синовиальные саркомы

Липосаркомы и шванномы

Рисунок 13. Анализ экспрессии CRABP1 « образцах опухолей мезепхимального происхождения.

Следует отметить, что практически все случаи повышения экспрессии CRABP1 относились к быстрорастущим и рецидивирующим опухолям. К сожалению, размер выборки не позволил нам установить достоверных корреляций между характером изменений экспрессии CRABP1 и клинико-морфологическими параметрами опухолей. Проведенный анализ является первичным и, несмотря на то, что полученные данные представляют определенный интерес, для получения более достоверных результатов необходимы дополнительные исследования с использованием больших выборок клинических образцов.

*А*

В заключение можно сказать, что белок CRABP1 оказывает существенное влияние на такие важнейшие биологические характеристики трансформированных клеток, как туморо-генность и метастатическая активность. Данное исследование является одним из первых экс-

периментальных подтверждений функциональной роли данного белка в процессах опухолевой прогрессии. Дальнейшее изучение механизмов участия данного белка в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток может быть перспективным с теоретической точки зрения, поскольку позволит охарактеризовать положение данного белка во внутриклеточных сигнальных каскадах, а также, возможно, приведет к обнаружению новых функциональных свойств СЯАВР1, не опосредованных его способностью связывать ретиноевую кислоту. Дальнейшие исследования в этой области также могут помочь в обнаружении новых прогностических факторов, важных для медицинской онкодиагностики, или же выявить новые потенциальные мишени для лекарственной терапии злокачественных новообразований.

выводы

1. Обнаружена прямая корреляция между экспрессией СРЛВР1 и уровнем спонтанной метастатической активности ЯБУ-трансформированных фибробластов сирийского хомяка;

2. Гиперэкспрессия СИАВР! в низкометастазной клеточной линии НЕТ-БЯ вызывает значительное повышение ее туморогенности;

3. Подавление экспрессии эндогенного СА4ВР1 в высокометастазной клеточной липни НЕТ-БШ приводит к достоверному снижению туморогенности и спонтанной метастатической активности, а также к уменьшению количества легочных макрометастазов при внутривенном введении клеток;

4. Снижение экспрессии СЯАВР1 в линии НЕТ-БИ стимулирует направленную миграционную активность клеток в камерах Бойдена и их способность к колониеобразованию в полужидкой среде;

5. Производные линии НЕТ-8Я1 с подавленной экспрессией С&4ВР1 характеризуются уменьшением экспрессии ММР-14 и снижением активности секретируемых коллагеназ;

6. Гиперэкспрессия мутантной формы С11АВР1 Я131А, неспособной связывать ретиное-вую кислоту, повышает туморогенность низкометастазной клеточной линии НЕТ-БЯ наравне с гиперэкспрессией СЯАВР1 дикого типа;

7. Показано изменение экспрессии СКАВР1 в 60% исследованных образцов злокачественных опухолей мягких тканей человека; повышение экспрессии СЯАВР1 наблюдается в 46% случаях синовиальных сарком и ЗФГ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыбко В.А. Активность протеиназ внеклеточного матрикса в экспериментальной модели опухолевой прогрессии /Книжник А.В., Каинов Я.А., Комельков А.В., Чев-кина Е.М. // Вестник РОНЦ. - 2008,- Т. 19. - № 4. - С. 16-32.

2. Я.А. Каинов. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка /И.А. Фаворская, Е.Е. Антошипа, Т.Г. Горькова, А.В. Комельков, Е.М.Чевкина. //Российский Биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10. - № 2. - С. 37-44.

3. Каинов Я. А. Белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABPI) в патогенезе острого промиелоцитарного лейкоза и других неопластических процессов /Зборовская И. Б. //Технологии живых систем. - 2011. - Т.8. - №3. - С. 28-35.

4. А.В. Книжник. Модуляторы активности фосфолипазы D белки RalA и Arfó: влияние на различные характеристики трансформированных клеток /В.А. Рыбко, Я.А. Каинов, А.В. Комельков, Е.М. Чевкина. //Цитология. - 2008. - Т. 50. - №9. - С. 807.

5. Kainov Y. Modulation of extracellular matrix remodelling system associated with different metastatic phenotype of v-src transformed cells /Rybko V., Tchevkina E., Knizhnik A., Komelkov A. //abstracts of EACR/FEBS advanced lecture course "Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cancer", 16-24 August, Greece. - 2009. - P.43.

6. Knizhnik A. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer/Rybko V., Kovaleva O., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. //abstracts of Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis", Scotland, 5-8 July. -2009. - P. 98.

7. Tchevkina E.M. Extracellular Proteases Activity In Tumor Progression Experimental Model /Knizhnik A.V., Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. // Anticancer Research. -2008. - 28, 5C. - P. 3513.

8. Knizhnik A.V. ARF6 and ECM protease activity in hamster tumor progression experimental model /Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. and Tchevkina E.M. //abstracts of Cancer Degradóme Symposium, London, UK, 8-9 October 2008. - P. 28.

9. Knizhnik A. Arf6 participates in modulation of cell metastatic activity in vivo /Rybko V., Aushev V., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. //abstracts of European Small GTPase meeting,, Umea, Sweden, 29-31 August. - 2007. - P. 59.

Подписано в печать:

23.03.2011

Заказ № 5217 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Опухолевая прогрессия - сложный, многоступенчатый процесс, включающий в себя развитие первичной опухоли и распространение опухолевых клеток по организму, что приводит к образованию узлов вторичного роста опухоли в отдаленных органах. Именно этот процесс, называемый метастазированием, чаще всего приводит к гибели больного. Процессы, приводящие к формированию метастатического фенотипа трансформированных клеток, очень разнообразны и одновременно взаимосвязаны и затрагивают самые разные аспекты клеточной жизнедеятельности. Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, картина событий, происходящих в процессе малигнизации, достаточно противоречива и фрагментарна. Идентификация и функциональный анализ ключевых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и метастазирования, безусловно, является одной из важнейших фундаментальных задач молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.

Злокачественные опухоли мягких тканей (ОМТ) составляют 2% от всех зарегистрированных злокачественных новообразований и характеризуются большим разнообразием форм, что затрудняет их исследование. Следует отметить, что данные опухоли, как правило, развиваются у лиц молодого возраста, что часто приводит к потере трудоспособности. Одним из отличительных свойств ОМТ является повышенная частота рецидивирования и метастазирования, а также характер метастазирования - преимущественно гематогенный и трансплантационный. С точки зрения молекулярных изменений опухоли мягких тканей на сегодняшний день охарактеризованы довольно плохо, хотя очевидно, что они отличаются по спектру молекулярных нарушений от опухолей органного и эпителиального происхождения. Также мало освещен вопрос о факторах прогрессии этих новообразований. Исследование особенностей прогрессии сарком и механизмов, обеспечивающих их высокий метастатический потенциал, является чрезвычайно актуальным и представляет собой фундаментальную проблему, решение которой может способствовать успешному прогнозированию течения заболевания и развитию таргетной терапии.

Одним из основных подходов к изучению механизмов метастазирования и опухолевой прогрессии являются исследования на экспериментальных моделях. Одной из таких моделей является панель клеточных линий мезенхимального происхождения - фибробластов сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса, принципиально отличающихся между собой по уровню органоспецифического метастазирования в легкие при введении экспериментальным животным. Основным достоинством этой модели является возможность проведения теста на спонтанную метастатическую активность (СМА) на иммунокомпетентных животных. Данный тест позволяет смоделировать все этапы прогрессии - возникновение первичной подкожной опухоли, интравазию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Таким образом, данная модель представляется чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров метастазирования.

Ранее Зуевой Э. Ш. при сравнении профилей экспрессии двух клеточных линий из описанной выше панели - низкометастазной НЕТ-8Я и высокометастазной НЕТ-БЮ с помощью двумерного гель-электрофореза были получены первичные данные, свидетельствующие о принципиальном различии в уровне продукции клеточного белка, связывающего ретиноевую кислоту - СЯАВР1. Основной функцией этого белка является участие в модуляции клеточного ответа на действие ретиноевой кислоты. Изменение экспрессии CRABP1 характерно для ряда новообразований человека, таких как опухоли молочной железы, аденокарциномы эндометрия, немелкоклеточный рак легкого, рак яичников и нейрогенные опухоли, и, по некоторым сведениям, может коррелировать с неблагоприятным медицинским прогнозом. При этом молекулярные механизмы участия данного белка в процессах канцерогенеза практически не изучены. На сегодняшний день в научной литературе отсутствуют данные о роли этого белка в процессе метастазирования.

Целью данной работы было изучение роли белка CRABP1 в регуляции ключевых биологических характеристик трансформированных клеток мезенхимального происхождения, ассоциированных с опухолевой прогрессией in vitro и in vivo.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Выявить корреляцию между экспрессией CRABP1 и уровнем спонтанной метастатической активности клеточных линий панели RSV -трансформированных фибробластов сирийского хомяка;

2. Гиперэкспрессировать кодирующую последовательность мРНК CRABP1 хомяка в низкометастазной клеточной линии HET-SR; исследовать влияние экзогенного CRABP1 на туморогенность и спонтанную метастатическую активность клеток данной линии;

3. Получить производные высокометастазной клеточной линии HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1 и изучить их туморогенность, а также экспериментальную и спонтанную метастатическую активность;

4. Провести сравнительный анализ основных клеточных характеристик полученных линий in vitro: динамики пролиферации, миграционной активности, клоногенности и способности к неприкрепленному росту, а также экспрессии ряда протеаз, разрушающих внеклеточный матрикс (uPA, ММР-2, ММР-9, ММР-13) и маркеров клеточной дифференцировки (CD24, RALDH1, RAR(3 и CYP26A1);

5. Получить мутантную форму С11АВР1, не связывающую ретиноевую кислоту, и изучить влияние экспрессии данной конструкции на туморогенность низкометастазной клеточной линии НЕТ-БЫ;

6. Провести анализ экспрессии С ЛАВР 1 в образцах злокачественных опухолей мягких тканей человека.

выводы

1. Обнаружена прямая корреляция между экспрессией СЯАВР1 и уровнем спонтанной метастатической активности Я8У-трансформированных фибробластов сирийского хомяка;

2. Гиперэкспрессия СЯАВР1 в низкометастазной клеточной линии НЕТ-8Я вызывает значительное повышение ее туморогенности;

3. Подавление экспрессии эндогенного СЯАВР1 в высокометастазной клеточной линии НЕТ-БЮ приводит к достоверному снижению туморогенности и спонтанной метастатической активности, а также к уменьшению количества легочных макрометастазов при внутривенном введении клеток;

4. Снижение экспрессии СЯАВР1 в линии НЕТ-БШ стимулирует направленную миграционную активность клеток в камерах Бойдена и их способность к колониеобразованию в полужидкой среде;

5. Производные линии НЕТ-БЮ с подавленной экспрессией СЯАВР 1 характеризуются уменьшением экспрессии ММР-14 и снижением активности секретируемых коллагеназ;

6. Гиперэкспрессия мутантной формы СЯАВР 1 ЯША, неспособной связывать ретиноевую кислоту, повышает туморогенность низкометастазной клеточной линии НЕТ-8Я наравне с гиперэкспрессией СЯАВР 1 дикого типа;

7. Показано изменение экспрессии СЯАВР! в 60% исследованных образцов злокачественных опухолей мягких тканей человека; повышение экспрессии СЯАВР 1 наблюдается в 46% случаях синовиальных сарком и ЗФГ.

1.8 Заключение

Безусловно, на сегодняшний день белок СЫАВР1 недостаточно хорошо охарактеризован с точки зрения его функционирования. Данные о его роли в формировании клеточного ответа на воздействие РК противоречивы и, несмотря на их многообразие, не позволяют однозначно судить об его участии в РК-опосредованных дифференцировочных программах и процессах метаболизма РК. Схожая ситуация наблюдается и при анализе сведений об участии этого белка в патогенезе неопластических заболеваний. Изменение экспрессии СКАВР1 характерно для гемобластозов и солидных новообразований разнообразного происхождения, однако механизмы, позволяющие этим изменениям играть роль в опухолевой прогрессии, практически не установлены и, несомненно, представляют теоретический и практический интерес.

Исследования, посвященные влиянию белка С11АВР1 на метаболизм РК, тем более актуальны, если принять во внимание, что терапия ретиноевой кислотой представляет собой один из первых и, безусловно, ярких примеров успешной генонаправляемой дифференцировочной терапии в лечении острых лейкозов. Подобные исследования открывают новые возможности для применения так называемой «транскрипционной терапии», являющейся частью современного перспективного направления, каковым является генотерапия рака.

2. Материалы и Методы

2.1 Клеточные линии

В качестве экспериментальной модели для данного исследования использовались эмбриональные фибробласты сирийского хомяка (Mesocricetus auratus\ трансформированные вирусом саркомы Рауса штамма Шмидт-Руппин D: HET-SR, HET-SR-1, HET-SR-8 и HET-SR-2SC. Для получения ретро- и лентивирусных частиц использовались линии эпителиальных клеток GP293 (Clonetech) и 293FT (Invitrogen) (производные линии НЕК-293 - линии эмбриональных клеток почки человека). Все клеточные линии культивировали в С02-инкубаторе при +37 °С, 5% СОг- В качестве среды для культивирования использовали среду DMEM с 0,294 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (РАА Laboratories), 0,1 мг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина.

2.2 Выделение нуклеиновых кислот

2.2.1 Выделение плазмидной ДНК

Отдельная колония клеток E.coli, содержащая трансформированные плазмидой клетки, перекалывалась с культуральной чашки с LB-агаром с ампициллином (50 мкг/мл) в 10 мл среды LB с ампициллином той же концентрации и выращивалась в течение ночи при +37 °С при интенсивном перемешивании (200 об/мин). Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток методом щелочного лизиса.

Бактерии осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин, +4 °С). Осадок клеток ресуспендировали в 150 мкл раствора 1 и инкубировали 5 мин на льду. Затем добавляли 400 мкл лизирующего раствора 2, содержимое пробирки аккуратно перемешивали и инкубировали на льду 5 мин до полного лизиса клеток. После этого вносили 250 мкл раствора 3, пробирку немедленно встряхивали 5-6 раз и центрифугировали 15 мин при 10000-15000g для отделения осадка, содержащего геномную ДНК бактерий, связанных с ней компонентов клеточной стенки и выпавших в осадок белков. Надосадочную жидкость переносили в новые пробирки и добавляли 500 мкл изопропилового спирта. Содержимое пробирок центрифугировали 10 мин при 10000-15000 g. Надосадочную жидкость удаляли, осадок промывали 70% этиловым спиртом и подсушивали. Осадок растворяли в 200 мкл раствора РНКазы А (100-200 мкг/мл) в воде и инкубировали при +37 °С 15-30 мин для деградации бактериальной РНК.

После инкубации к раствору добавляли равный объем смеси фенола-хлороформа в соотношении 1:1. Производили интенсивное перемешивание с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 15000 g. Верхнюю водную фазу аккуратно переносили в новую пробирку, и процедуру повторяли. Затем к отобранной водной фазе добавляли равный объем хлороформа, пробирку тщательно встряхивали и проводили пятиминутное центрифугирование при 15000 g. Надосадочную жидкость отбирали и переосаждали плазмидную ДНК 2,5 объемами 96% этилового спирта в присутствии 0,1М NaCl, смесь охлаждали 20 мин при -20 °С и центрифугировали 10 мин. при 10000-15000 g. Осадок промывали 70% этиловым спиртом, высушивали и растворяли в 50 мкл воды. Концентрация плазмидной ДНК определялась на спектрофотометре NanoDrop ® ND-1000 («NanoDrop Technologies Inc.», США).

2.2.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов опухолевых тканей

За день до эксперимента исследуемые клетки высаживали на 60 мм чашку Петри в количестве 5x105 клеток. На следующий день для выделения тотальной РНК клетки лизировали на чашке в 1 мл Trizol-reagent (Invitrogen). В случае опухолевых тканей образец, замороженный в жидком азоте, гомогенезировали в 1 мл Trizol-Reagent. В дальнейшем процедура выделения не отличалась. К лизату добавляли 200 мкл хлороформа, затем центрифугировали 15 мин при 12000 g при +4 °С. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку и осаждали добавлением равного объёма изопропилового спирта с последующим центрифугированием 15 мин при 12000 g при +4°С. Осадок РНК промывали 1 мл 70% этилового спирта на DEPC-обработанной воде, подсушивали на воздухе и растворяли в соответствующем объеме DEPC-обработанной деионезированной воды. Концентрации растворов РНК и качество их спектров определяли на спектрофотометре NanoDrop ® ND-1000 («NanoDrop Technologies Inc.», США). Далее использовались образцы РНК, для которых соотношение А260/А280 составляло не менее 1.8-2.0.

2.2.3 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей Для выделения ДНК из агарозных гелей использовали 1% смесь агароз [0.75% легкоплавкой агарозы (Nu Sieve GTG) и 0.25% обычной агарозы (GibcoBRL)]. После электрофоретического разделения ДНК полоску геля из легкоплавкой агарозы, содержащую нужный фрагмент (объемом около 100 мкл), переносили в микропробирку, плавили при +70 °С в течение 3-4 мин и затем быстро замораживали в жидком азоте. После этого содержимое пробирки оттаивали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 15000 g для удаления из раствора агарозы.

2.3 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях Процентное содержание агарозы (GibcoBRL) в буфере ТАЕ (см. список использовавшихся растворов и сред), оптимальное для разделения фрагментов ДНК в геле, определяли в соответствии с длинами анализируемой ДНК: 0,6% - 1 - 20 т.п.н., 0,9% - 0,5 - 7 т.п.н., 1,2% - 0,4 - 6 т.п.н., 1,5% - 0,2 - 3 т.п.н., 2,0% - 0,1 - 2 т.п.н. Гель содержал 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Перед нанесением на гель к образцу ДНК добавляли буфер для нанесения (1/6 объема образца) (см. список растворов и сред).

Разделение фрагментов ДНК проводилось с учетом расстояния между электродами при максимальном напряжении 5 В/см. ДНК в геле регистрировали по флюоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны от 240 до 360 нм. Для анализа размера ДНК использовались маркеры молекулярного веса фирм Fermentas, Invitrogen.

2.4 Молекулярное клонирование

2.4.1 Получение компетентных клеток Е. coli

В работе использовали штамм бактерий Е. coli DH5ot. Замороженный бактериальный сток разводился в 100, 1000 и 10000 раз. Разведения рассевали на чашки с LB-агаром без ампициллина в асептических условиях. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 °С. На следующий день выбирали чашку с примерно 10000 отдельных колоний. Бактерии смывали 2,5-3 мл среды LB без ампициллина. Далее суспензию клеток переносили в 300 мл среды SOB, содержащей ЮмМ MgSÜ4, до оптической плотности OD6oo=0,05. Суспензия клеток инкубировалась при +37 °С в шейкере (200-250 об/мин) примерно в течение 50-60 мин до достижения оптической плотности OD600=0,15, после чего немедленно помещали в ледяную баню на 10 мин. Клетки собирали центрифугированием при 4000 g, 10 мин при +4 °С, образовавшийся осадок клеток ресуспендировали в 150 мл ледяного раствора RF1. Клетки осаждали повторным центрифугированием в тех же условиях. После повторного центрифугирования осадок ресуспендировали в 15-30 мл ледяного раствора RF2. Затем клеточная суспензия делилась на аликвоты по 100 мкл, которые помещали в охлажденные стерильные микропробирки и замораживали в жидком азоте.

Для оценки степени компетентности полученных клеток проводили трансформацию разными количествами плазмиды pBS2SKM. Компетентность клеток составляла 10"6 - 10~8 мкг/мкл плазмиды.

2.4.2 Трансформация компетентных клеток E.coli

К 100 мкл компетентных клеток на льду добавляли аликвоту лигазной смеси или плазмидной ДНК (до 10 мкл) и инкубировали 30 мин на льду. После этого клетки подвергали тепловому шоку (+42 °С, 90 сек) и снова инкубировали на льду 5 мин. Затем к клеткам добавляли 1 мл среды LB без ампициллина и проводили инкубацию при +37 °С в течение 60 мин. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 g 10 мин. Осадок клеток в остаточном объеме 100 мкл высевали на чашки Петри с LB-агаром и 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение 16-24 часов при +37 °С. Плазмидную ДНК клонов анализировали с помощью рестрицирующих эндонуклеаз, ПЦР in situ, а также секвенированием.

2.4.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами

Гидролиз ДНК рестрицирующими эндонуклеазами проводили с использованием ферментов разных фирм в условиях, рекомендуемых производителями. Обычно реакционная смесь содержала рестрикционный буфер (1/10 от общего объема), необходимое количество ДНК и рестриктаз, бычий сывороточный альбумин (до концентрации 1 мг/мл) и деионизированную воду до конечного объема 20 мкл. Рестрикцию проводили при оптимальной для фермента температуре (обычно +37 °С) в течение 1-2 часов. Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.

2.4.4 Реакция лигирования

Реакцию лигирования «липких» концов плазмидной ДНК проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем (1-2 единицы на 20 мкл лигазной смеси). Выделенные из геля векторную ДНК и клонируемый фрагмент лигировали в молярном соотношении 1:2-1:3. Реакция проводилась при +16 °С в течение часа, либо при +4 °С в течение ночи. Полученную смесь использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli. Перед трансформацией лигазу инактивировали инкубацией в течение 10 мин при +65 °С.

2.4.5 Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК

Для клонирования кодирующей последовательности гена CRABP1 сирийского хомяка использовали праймеры, подобранные на консенсусные последовательности, фланкирующие кодирующую область мРНК CRABP1 у мыши и крысы - CRABP1 cloning F 5'TATCTCGAGACCATGCCCAACTTC3' и CRABP1 cloning F - 5'TAAGG^rCCGGССАССТТТАСТССЗ'.(рестриктиые сайты выделены курсивом, части отжигающиеся на мРНК подчеркнуты). В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК из линии HET-SR1, т.к. мРНК CRABP1 экспрессируется там на высоком уровне. Амплификацию проводили в присутствии высокоточной полимеразы PFX (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Очистку ПЦРного продукта и выделение рестриктных фрагментов из агарозного геля проводили с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Секвенирование плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems

2.4.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК

Предшественники малых шпилечных РНК к кодирующей последовательности CRABP1 были заклонированы в лентивирусный вектор pLKO.l puro по сайтам Agel и EcoRI. В данной работе использовались следующие последовательности малых шпилечных РНК: shA 5' TCTATATCAAGACATCCACCACTCGAGTGGTGGATGTCTTGATATAGAT TTTG3'; ShB 5' CACAAGAATTTATGTCCGGGACTCGAGTCCCGGACAT AAATTCTTGTGTTTTTG3', shC 5' CGGACGC AAGTGCAGGAGTTTCTCG AGAAACTCCTGCACTTGCGTCCGTTTTTG3' (смысловая и антисмысловая последовательность подчеркнуты). Для клонирования каждого конструкта синтезировали олигонуклетоиды (F и R для каждой конструкции), модифицированные липкими концами для соответствующих рестриктных сайтов. Олигонуклеотиды отжигали друг на друге при 95 °С в эквимолярном соотношении в течение 10 минут. Затем проводили киназную реакцию 20 пмолей полученной смеси в присутствии киназы Т4 (Fermentas) согласно протоколу производителя. Полученные конструкции использовали для молекулярного клонирования. Секвенирование плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems 2.4.7 Сайт-направленный мутагенез Для получения мутантного белка Crabpl R131A использовался обратный праймер Crabpl R131A R: GCCGG^rCCGGCCACCTTTACT CCCGGACATAAATTGCTGTGCACA (кодон с мутацией подчеркнут, рестриктный сайт выделен курсивом) и праймер pLXSN F (см. таблицу 1). В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pLXSN, несущую кодирующую последовательность мРНК CRABP1 сирийского хомяка. Амплификацию проводили в присутствии высокоточной полимеразы PFX (Invitrogen) согласно протоколу производителя. После амплификации проводили очистку ПЦР-продукта в агарозном геле. Выделение из агарозного геля проводили с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Секвенирование плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems 2.5 Обратная транскрипция РНК

Для получения одноцепочечных кДНК в реакцию брали 2 мкг суммарной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I согласно протоколу производителя (1ед на 1 мкг РНК) (Fermentas). Два мкг тотальной РНК смешивали с 80 пмоль random 9 праймера в общем объеме 25 мкл. Реакционная смесь инкубировалась 2 мин при +70°С. Затем к смеси на льду добавлялось 25 мкл смеси «RT-MIX» (см. список использовавшихся растворов и сред).

Полученная смесь инкубировалась при +37°С в течение 5 мин. Затем в смесь добавлялось 200 ед. ревертазы MMuLV (Fermentas). Полученная смесь инкубировалась при +42°С в течение одного часа, затем проводилась инактивация ревертазы при +70°С в течение 10 минут. Объем пробы доводился до 200 мкл. Пробы хранились при -20°С.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Матрицей для полимеразиой цепной реакции служила геномная или плазмидная ДНК или кДНК. Реакционная смесь включала: 10 пмоль 5' и З'праймеров, 2 мМ М§С12, 0,125 мкМ сГЫТРв, амплификационный буфер (Силекс), 1-2 ед. Тая-ДНК полимеразы (Сиб-Энзим). Реакционная смесь проходила необходимое число циклов денатурации (95 °С), отжига (14 °С в зависимости от СС/АТ состава праймера и его длины) и полимеризации (72 °С).

Последовательности праймеров, использованных для проведения ПЦР, а также условия проведения реакций и размер продуктов приведены в таблице 1. Температура отжига коротких праймеров рассчитывалась по стандартной методике: 4 °С для О- и С- нуклеотидов, и 2 °С для А- и Т-нуклеотидов. Количество циклов, при котором происходила амплификация каждого из фрагментов, подбирали экспериментально. Поскольку геном сирийского хомяка не секвенирован, праймеры подбирали на консервативные последовательности исследуемых мРНК человека, крысы и мыши. Выравнивание мРНК и подбор праймеров осуществляли в программе УесЮгШТ (1пукго§еп). В качестве референсного гена для выравнивания внесенного в реакцию количества транскриптов использовали рибосомальный белок ЯРЬРО.

Название гена Последовательность Оптима льная 10 отжига Размер продук та, п.о. рЬХБЫ Прямой Обратный 5' - СССТТСААССТССТСОТТСО - 3' 5' - ТТТССАСАССТООГГССТОА - 3' 56°С

ЫРЬРО Прямой Обратный 5' - ОООСОАССЛХЮААОТССААС - 3' 5' - ОТТСТГССССАТСАССАССАС - 3' 59°С 158

СКАВР1 Прямой Обратный 5' - ССАССОАОААТТТСОАСОАО - 3' 5' - ТССОАССТТСААОТТСАТСТ - 3' 56°С 173

ММР-1 Прямой Обратный 5' - СААОТССОСТАТТТСАААОО - 3' 5' - САТСАТАССТССАОТАСАТС - 3' 59°С 190

ММР-9 Прямой Обратный 5' - ААСАОССТСТАСССТТСОТС - 3' 5' - ТССТАСТСГСССТССАССАС - 3' 60°С 296

ММР-8 Прямой Обратный 5' - ТООАСССААТООААТССТТС - 3' 5' - ОАТвСССГСТССАОА АОТАС - 3' 60°С 401

ММР-13 Прямой Обратный 5' -ТАААОАСАОАТТСТТСТООСО - 3' 5^-CCATTПTCTCATAGACAGCATC-3^ 60°С 408

ММР-14 Прямой Обратный 5' - ССССААвСАСАТТААвОАвС - 3' 5' - ОСОТСТСААСААОААОАСАС - 3' 60°С 496 иРА Прямой Обратный 5' - ТОАТТТСССААТТАООААОТС - 3' 5' ~ АОТв Ав в АТТвС АТС А АСТ АО- 3' 59°С 447

С024 Прямой Обратный 5' - ТСОСАСГССТССТАСССАС - 3' 5' - СОТТТСТГССССГСАОТСТС - 3' 60°С 211

КАЬШ1 Прямой Обратный 5' - ААОАССССТТОСАТТОТС - 3' 5' - ТССТТОТСААТСТСАССС- 3' 60°С 239

Сур26А1 Прямой Обратный 5' - АТССАСССАСТАААОСААТС - 3' 5' - СТТСАОАвСААСССОАААС - 3' 60°С 279

Прямой Обратный 5* - ТТААТСТОТООАОАССОС - 3' 5' - ССАТГСАТССАООААТТТС - 3' 60°С 220