Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Белки CRABP в опухолях человека различного гистогенеза

На правах рукописи

ФАВОРСКАЯ ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

БЕЛКИ СЯАВР В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА РАЗЛИЧНОГО ГИСТОГЕНЕЗА

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

15/:/'!; ЕЦ

005547888

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

(директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. Михаил Иванович Давыдов)

кандидат биологических наук, заведующая лабораторией регуляции клеточных онкогенов НИИ Канцерогенеза

доктор биологических наук, заведующий лабораторией клеточной микробиологии ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ.

доктор биологических паук, профессор, заведующая отделением прогноза

эффективности консервативного лечения ФГБУ «Московский научно-исследовательский

онкологический институт имени П. А. Герцена» Минздрава РФ.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «?4> ¿CtCt/J1 2014 года в ^^часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru.

Научный руководитель: Зборовская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Логунов Денис Юрьевич

Сергеева Наталья Сергеевна

Автореферат разослан «_»_2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета /

доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин

/ / /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Процессы, происходящие при опухолевой прогрессии от возникновения первичной опухоли до образования очагов вторичного роста, метастазов, очень разнообразны, многочисленны и затрагивают различные аспекты жизнедеятельности клетки. Несмотря на накопление многочисленных данных о молекулярных изменениях, возникающих при малигнизации, картина происходящего остается фрагментарной, а многие лежащие в основе злокачественной трансформации механизмы остаются непонятыми. В связи с этим, выявление и исследование ключевых белков и сигнальных путей, регулирующих процессы опухолевой трансформации и прогрессии, является актуальной задачей современной онкологии и молекулярной биологии.

Данное исследование посвящено изучению роли белков CRABP1 и CRABP2 в прогрессии опухолей человека. Белки CRABP относятся к семейству внутриклеточных белков, связывающих жирные кислоты. Основные функции данных белков опосредованы их способностью взаимодействовать с ретиноевой кислотой (РК) в цитоплазме клетки. Известно, что РК играет важную роль в процессах канцерогенеза, оказывает антипролиферативное действие на опухолевые клетки, может вызывать апоптоз, а также стимулировать дифференцировку. Считается, что белки CRABP участвуют в формировании клеточного ответа на действие РК. Несмотря на то, что участие РК в процессах канцерогенеза достаточно хорошо охарактеризовано, роль белков CRABP в этих процессах остается малоизученной.

Ранее в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка (линии HET-SR и HET-SR1) было обнаружено, что белок CRABP 1 участвует в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток мезенхимального происхождения. Так, на линии HET-SR, характеризующейся низкой туморогенностью и отсутствием эндогенной экспрессии CRABP1, было показано, что гиперэкспрессия данного гена вызывала повышение туморогенности указанной линии. При этом на линии HET-SR1, характеризующейся высокой туморогенностью и наличием эндогенной экспрессии

С1ЫВР1, показано, что подавление экспрессии данного гена вызывает снижение туморогенности, а также метастатического потенциала. Эти данные являются одним из первых экспериментальных свидетельств участия белка СЯАВР1 в процессах канцерогенеза.

Кроме того, по литературным данным, изменение экспрессии С11АВР1 характерно для ряда опухолей человека. Причем такие изменения нередко коррелируют с клинико-морфологическими показателями и могут служить прогностическими факторами. Однако следует отметить, что данные об экспрессии С11АВР1 в новообразованиях человека противоречивы. Изменения носят разнонаправленный характер в зависимости от типа опухоли. Так, при раке пищевода, раке печени, раке толстой кишки и серозном и светлоклеточном раке яичников отмечается снижении экспрессии СЯАВР1. В то время как в образцах глиом и аденокарцином эндометрия наблюдается повышение его экспрессии, которое зачастую коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Все эти данные говорят о вовлеченности СЯАВР1 в процессы канцерогенеза и поднимают вопрос об участии данного белка в прогрессии опухолей человека.

Данная работа посвящена изучению влияния белка СЯАВР1 на свойства опухолевых клеток человека мезенхимального происхождения. Помимо этого, проведен анализ экспрессии СЯАВР! в опухолях человека, как мезенхимального, так и эпителиального происхождения.

Таким образом, данная работа представляется чрезвычайно актуальной, поскольку направлена на установление роли СЯАВР1 в формировании агрессивного фенотипа опухолевых клеток человека. В целом, настоящее исследование представляет большой научный интерес, как с точки зрения фундаментальной науки, так и клинической онкологии.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение роли белка СЯАВР1 в прогрессии мезенхимальных опухолей человека, а также исследование экспрессии СЯАВР в опухолях человека различного гистогенеза.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи.

1. Изучить влияние экзогенной экспрессии CRABP1 на туморогенность линии НТ-1080 в эксперименте in vivo.

2. Исследовать клеточные характеристики полученных линий in vitro, потенциально связанные с опухолевой прогрессией (скорость пролиферации, клоногенность, миграционная активность).

3. Исследовать влияние гиперэкспрессии мутантной формы CRABP1 ЮЗЫ, не способной связывать PK, на туморогенность in vivo и клеточные характеристики in vitro.

4. Изучить влияние гиперэкспрессии CRABP1 и CRABP1 R131A на транскрипционную активность рецепторов ретиноевой кислоты - белков RAR.

5. Оценить влияние экспрессии CRABP1 на профиль экспрессии генов в клетках линии НТ-1080.

6. Провести анализ продукции белка CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком человека.

7. Провести исследование экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах HMPJI. Проанализировать результаты с учетом гистологического типа, степени дифференцировки опухоли, а также наличия регионарных метастазов.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данном исследовании выявлено участие CRABP1 в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток человека. На модели клеточной линии фибросаркомы человека НТ-1080 показано, что гиперэкспрессия CRABP1 вызывает повышение туморогенности in vivo, что является одним из первых экспериментальных свидетельств стимулирующего влияния белка CRABP1 на прогрессию опухолей человека. Помимо этого, в работе получены данные, свидетельствующие о существовании дополнительной функции у белка CRABP1, не связанной с его способностью взаимодействовать с ретиноевой кислотой. Следует отметить, что в литературе отсутствуют данные о других функциях белка CRABP1. Кроме того, в рамках работы впервые исследована продукция белка CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком и показано, что она характерна для всех исследованных образцов данного вида опухоли. Также впервые проведено

исследование совместной экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах немелкоклеточного рака легкого, в ходе которого выявлено частое повышение экспрессии обоих генов в опухолевой ткани, а также установлено существование положительной корреляции между их экспрессией.

Данная работа в первую очередь имеет фундаментальное значение с точки зрения установления роли CRABP1 в процессах канцерогенеза. Кроме того, дальнейшее изучение дополнительной функции данного белка расширит понимание о функционировании CRABP1 в клетке. Результаты, полученные в исследовании, также перспективны с точки зрения поиска прогностических маркеров течения онкологических заболеваний и мишеней для таргетной терапии опухолей.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 15 ноября 2013 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, онкогеномики, механизмов канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Материалы работы неоднократно докладывались на конференциях, в том числе на VII Всероссийском съезде онкологов (2013 г., Санкт-Петербург, Россия), 5lh ЕМВО meeting (2013 г., Амстердам, Нидерланды), 40th congress of International society of oncology and biomarkers (2012 г., Иерусалим, Израиль), Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (2011 г., Киев, Украина). По результатам диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и 6 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков, 11 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов исследования», «Выводы», «Список использованной литературы», «Приложение». Глава «Список использованной литературы» содержит 214 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование, сайт-направленный мутагенез, трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток псевдовирусными частицами, анализ количества мРНК методом ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, выделение и исследование белковых фракций с помощью Вестерн-блот анализа, анализ динамики роста клеток, тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность), тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, анализ транскрипционной активности белков RAR, исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа, иммуногистохимический анализ, определение туморогенности клеточных линий, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуждение

Данная работа направлена на изучение роли CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа опухолевых клеток человека. В качестве модели для исследования была выбрана клеточная линия фибросаркомы человека НТ-1080, имеющая мезенхимальное происхождение, поскольку влияние CRABP1 на опухолевую прогрессию in vivo впервые было выявлено на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка, также имеющих мезенхимальное происхождения (линии HET-SR и HET-SR1). На первом этапе работы была проведена оценка влияния гиперэкспрессии CRABP1 в клетках линии НТ-1080 на туморогенность в тестах in vivo, а также анализ характеристик полученных клеток в экспериментах in vitro. Далее для изучения потенциальных механизмов влияния CRABP1 на агрессивность опухолевых клеток в полученных линиях был проанализирован профиль экспрессии генов. На заключительном этапе работы проведен анализ экспрессии CRABP1 в образцах бифазных синовиальных саркомах человека и образцах немелкоклеточного рака легкого.

1. Получение линии НТ-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A и анализ транскрипционной активности белков RAR в полученных клеточных линиях

Для изучения влияния CRABP1 на свойства клеток, ассоциированные с опухолевой прогрессией, ген был гиперэкспрессирован в клетках линии НТ-1080, где его экспрессия отсутствует. Для этого получен ретровирусный вектор pLXSN, несущий кодирующую последовательность мРНК CRABP1 человека. Далее, с помощью ретровирусной инфекции была получена линия НТ-1080 CRABP1, характеризующаяся стабильной продукцией изучаемого белка (рис.1). Кроме того, была получена линия НТ-1080 с гиперэкспрессией мутантного белка CRABP1 R131A (рис.1). Из литературы известно, что такая замена приводит практически к полной потере связывания РК. Использование в экспериментах линии с экспрессией данной мутантной формы позволяет оценить значение взаимодействия с РК для оказываемых белком CRABP1 эффектов.

CRABP1 (3-актин

Рисунок 1. Анализ экспрессии CRABP1 и CRABP1 R131A в полученных клеточных линиях методом Вестерн-блот анализа.

На первом этапе работы мы оценили влияние гиперэкспрессии CRABP1 и его мутантной формы в линии НТ-1080 на РК-зависимую активацию белков RAR. Известно, что РК оказывает свои основные эффекты на клетки посредством связывания с ядерными рецепторами семейства RAR, которые являются лиганд-зависимыми транскрипционными факторами. В данном эксперименте мы оценили транскрипционную активность белков RAR в полученных клеточных линиях при добавлении РК. Анализ проводили с помощью люциферазной репортерной системы. Для этого была получена генетическая конструкция на основе вектора pGL3-basic, в

8

которой ген люциферазы светлячка находится под контролем промотора, содержащего последовательность RARE. Это последовательность, которую распознают рецепторы PK - белки RAR. Клетки изучаемых линий трансфицировали полученным вектором, а также плазмидой pRL-TK, содержащей люциферазу Renilla, для внутреннего контроля. Эксперимент проводили в присутствии транс-ретиноевой кислоты (ATRA) в концентрации 10"8 М. Через сутки по интенсивности люминесценции определяли уровень транскрипционной активности белков RAR. Результаты эксперимента представлены на рис. 2.

f «он

ZS 2 с

| <

J

rfT

Рисунок 2. Транскрипционная активность рецепторов PK - белков RAR, в производных линиях на основе НТ-1080 в присутствие 0,01 мкМ ATRA. Активаг^я люциферазы на графике отражает увеличение относительной активности люциферазы в присутствие A TRA по сравнению с исходным уровнем люминесценции без добавления A TRA.

В результате эксперимента было установлено, что транскрипционная активность белков RAR в полученных линиях не отличалась. Примечательно, что не только мутантная форма, но и CRABP1 дикого типа не влиял на активность основных эффекторов PK, рецепторов RAR, в линии НТ-1080. Необходимо отметить, что такой результат не противоречит литературным данным. Так было показано, что гиперэкспрессия CRABP1 в ряде клеточных линий (COS-7 и CV-1) также не приводила к изменению транскрипционной активности рецепторов PK. При этом введение CRABP1 в линию AMC-HN-7 вызывало снижение активности белков RAR.

Таким образом, влияние CRABP1 на транскрипционную активность белков RAR может отличаться в зависимости от типа клеток.

2. Исследование туморогенности полученных линий НТ-1080 с гнперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 ЮЗЫ

Ранее в наших исследованиях на трансформированных эмбриональных фибробластах сирийского хомяка линии HET-SR было показано, что гиперэкспрессия CRABP1 повышает туморогенность в экспериментах in vivo. В связи с этим, изучение влияния белка CRABP1 на биологические свойства мезенхимальных опухолевых клеток человека было решено начать с оценки данной характеристики полученных клеточных линий. Для оценки туморогенности суспензию клеток исследуемой клеточной линии в трех разведениях (1х106, ЗхЮ5 и 5х104 клеток) вводили подкожно бестимусным мышам. Далее, спустя 3 недели, оценивали наличие сформировавшихся в местах введения клеток опухолей. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1. Туморогенность производных линий НТ-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и CRABP1 ЮЗЫ

Клеточная линия Количество животных Колич« развились п ство животных, у которых >пухоли при определенной [швивочной дозе Значение Р

ixlO6 клеток ЗхЮ5 клеток 5х104 клеток

НТ-1080 pLXSN 14 9/14 (64%) 5/14 (36%) 0/14 (0%)

НТ-1080 CRABP1 14 14/14 (100%) 9/14 (64%) 3/14 (21%) 0,01

НТ-1080 CRABP1 R131A 10 10/10(100%) 8/10 (80%) 2/10 (20%) 0,006

Как видно из таблицы 1 линии НТ-1080 CRABP1 и НТ-1080 CRABP1 R131A характеризовались более высокой туморогенностью по сравнению с контрольной линией НТ-1080 рЬХЭЫ. Эти различия статистически значимы. При введении максимальной прививочной дозы 1х106 клеток, в случае линий с гиперэкспрессией СВЛВР1 и мутантной формы СМВР1 ЮЗЫ, опухоли развились у всех животных, тогда как в контрольной группе опухоли сформировались только в 64% случаев. При введении минимальной прививочной дозы 5x104, опухоли сформировались только у животных, которым прививали линии НТ-1080 CRABP1 и НТ-1080 CRABP1 R131A, в случае введения клеток контрольной линии в такой дозе опухоли отсутствовали.

10

В делом, в ходе эксперимента показано, что гиперэкспрессия CRABPI в линии НТ-1080 приводила к повышению ее туморогенности. Кроме того, экспрессия мутантной формы CRABP1, не взаимодействующей с РК, вызывала сходное усиление туморогенности. Таким образом, способность белка CRABP1 повышать туморогенность в экспериментах in vivo не зависела от его способности взаимодействовать с РК. Поскольку способность связывать РК является единственной описанной на сегодняшней день функций данного белка, полученные данные позволяют предположить существование других функций у CRABP1 в клетке, нарушение регуляции которых в трансформированных клетках может приводить к формированию более агрессивного фенотипа.

3. Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in

vitro

Анализ степени выраженности ряда признаков трансформированных клеток, таких как скорость пролиферации, миграционная способность клеток, способность к росту в бедном микроокружении и др. позволяет косвенно судить об уровне агрессивности опухолевой клеточной линии в целом. Для оценки влияния CRABP1 на формирование злокачественного фенотипа трансформированных клеток, а также в поисках потенциального механизма повышения туморогенности в присутствии данного белка, мы провели оценку ряда таких характеристик полученных линий in vitro.

Исследование динамики роста показало, что введение CRABP1 и его мутантной формы не вызывало изменения скорости пролиферации линии НТ-1080 (рис.ЗА). Гиперэкспрессия CRABP1 и CRABPI R131A также не приводила к изменению клоногенности изучаемой линии (рис.3 Б).

HT-1080 pLXSN НТ-1060 CRABP1 HT-1080 CRABP1 R131A

Дии

.о«*

ч

8. о

Рисунок 3. А - динамика роста полученных клеточных линий. Б - анализ клоногенности полученных клеточных линий.

Анализ миграционной активности клеток линии НТ-1080 в зависимости от статуса экспрессии CRABP1 выявил, что гиперэкспрессия CRABP1 вызывала достоверное повышение способности клеток к миграции в камерах Бойдена (рис.4). Повышение подвижности клеток косвенно свидетельствует о формировании более агрессивного фенотипа у клеток линии НТ-1080 при введении CRABP1.

Примечательно, что введение мутантной формы CRABP1 R131A приводило к сходному усилению миграционной активности. Таким образом, влияние CRABP1 на данную характеристику клеток также не зависело от способности взаимодействовать с РК и говорит в пользу существования дополнительной функции у белка CRABP1 в клетке.

о

Рисунок 4. Анализ миграционной активности изучаемых клеточных линий в камерах Бойдена.* - Р<0,05.

В целом анализ свойств опухолевых клеток полученных линий показал, что гиперэкспрессия С RA BP 1 в линии НТ-1080 вызывает повышение туморогенности in vivo и миграционной способности in vitro. При этом данные эффекты не зависят от способности CRABP1 взаимодействовать с PK.

4. Исследование профиля экспрессии генов в изучаемых клеточных линиях с помощью MicroArray анализа

Анализ литературных данных не позволяет предположить потенциальные механизмы влияния CRABP1 на свойства клеток линии НТ-1080, поскольку связывание PK - единственная известная функция данного белка. В связи с этим для поиска возможных механизмов такого влияния был проанализирован профиль экспрессии генов в линиях НТ-1080 pLXSN и НТ-1080 CRABP1 с помощью MicroArray анализа. Для этого использовали микрочип Nimblegen Roche HG18_12xl35k. Профиль экспрессии генов в каждой клеточной линии анализировали в четырех повторах. Изменение экспрессии гена учитывали, когда абсолютная экспрессия в клеточных линиях отличалась в >1,3 раз и при р<0,05.

В результате эксперимента обнаружено, что в линии НТ-1080 CRABP1 по

сравнению с линией НТ-1080 pLXSN статистически достоверно изменилась

экспрессия более 100 генов. Среди них мы обнаружили ряд генов (таблица 2),

изменение экспрессии которых по литературным данным может давать

13

преимущество при выживании трансформированных клеток и росте опухолевого узла в ткани и, как следствие, к повышению туморогенности клеточной линии в эксперименте in vivo. Такое преимущество может быть обусловлено различными механизмами, среди которых повышение «стволовости» клеточной линии, а также повышение устойчивости к индукции апоптоза. Результаты MicroArray анализа косвенно свидетельствуют о вкладе обоих предполагаемых механизмов.

Как видно из таблицы 2 гиперэкспрессия CRABP1 в клетках линии НТ-1080 приводила к изменению экспрессии ряда генов, регулирующих дифференцировку и задействованных в поддержании стволовости, таких как SATBI, RFX1, WNT10B. Особый интерес вызывает изменение повышение экспрессии SATB1 и снижение RFX1. Показано, что SATB1 участвует в регуляции стволовости и подавляет дифференцировку клеток. Повышенная экспрессия данного гена показана для целого ряда опухолей человека и ассоциируется с агрессивностью опухоли и прогрессией заболевания. RFXI является негативным регулятором самообновления стволовых клеток, для ряда опухолей выявлено эпигенетическое снижение его экспрессии.

Кроме того, в линии НТ-1080 CRABP1 мы также выявили изменения, приводящие к ослаблению индукции апоптоза. Так гиперэкспрессия CRABP1 вызвала повышение экспрессии генов ANKHD1 и INSIG2, которые по данным литературы участвуют в подавлении апоптоза в опухолевых клетках.

Помимо этого, мы выделили ряд генов, изменение экспрессии которых по литературным данным может сопровождаться приобретением более агрессивного фенотипа и способствовать опухолевой прогрессии. Так, в линии с гиперэкспрессией CRABP1 отмечается повышение экспрессии HAS2 и ADORA2B. HAS2 участвует в синтезе гиалуроновой кислоты и модификации внеклеточного матрикса. По данным многочисленных исследований, она может стимулировать опухолевую прогрессию и влияет на туморогенность опухолевых клеточных линий.

Таблица 2. Изменения экспрессии генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, в линии НТ-1080 с гиперэкспрессией СИАВР1 по сравнению с контрольной линией

Название гена Изменение экспрессии в HT-1080 CRABPJ по сравнению с НТ-1080 pLXSN Функция гена/ участие в канцерогенезе

SATB1 (special AT-rich sequence-binding protein-1) 1,47 Регулирует дифференцировку клеток. Экспрессия повышена во многих опухолях человека и ассоциирована с агрессивным фенотипом.

WNT10B (wingless-type MMTV integration site family, member 10B) 1,31 Задействован в регуляции стволовости и коммитирования клеток. Экспрессия повышена в ряде опухолей человека.

HAS2 (hyaluronan synthase 2) 1,36 Регулирует синтез гиалуроновой кислоты. Повышенная экспрессия характерна для многих опухолей человека и ассоциирована с агрессивным фенотипом.

ADORA2B (adenosine A2b receptor) 1,35 Регулирует пролиферацию опухолевых клеток, участвует в процессах инвазии и ангиогенеза

ANKHD1 (ankyrin repeat and KH domain containing 1) 1,35 Задействован в регуляции клеточного цикла и апоптоза.

1NS1G2 (insulin induced gene 2) 1,33 Способен подавлять апоптоз. Экспрессия повышена в ряде опухолей человека.

RFX1 (regulatory factor X, 1 (influences HLA class II expression)) 0,75 Задействован в регуляции стволовости клеток. Экспрессия снижена в ряде опухолей человека.

В целом, исследование профиля экспрессии генов в изучаемых клеточных линиях, помогло нам выявить целый спектр CRABP1-зависимых молекулярных изменений, которые потенциально могут дать преимущество при выживании клеток в тканях. Возможно, одним из них или их комплексом и обусловлено повышение туморогенности линий НТ-1080 при экспрессии CRABP1 в эксперименте in vivo.

5. Исследование экспрессии CRABP1 в образцах бифазиых синовиальных сарком человека

Поскольку в предыдущих экспериментах было выявлено участие CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа мезенхимальной опухолевой линии НТ-1080, на следующем этапе работы мы провели оценку экспрессии CRABP1 в образцах мезенхимальных опухолей человека. В качестве модели была выбрана синовиальная саркома (СС) человека, как одна из наиболее часто встречающихся опухолей мягких тканей. В настоящем исследовании проведен анализ продукции белка CRABP1 в бифазных СС с помощью иммуногистохимического исследования (ИГХ). Работа проводилась совместно с сотрудником Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН Г.Ю. Чемерис. В работе использовали послеоперационный материал от 10 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом бифазная СС из архива Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Примеры окраски образцов представлены на рисунке 5.

В ходе исследования была выявлена продукция белка CRABP1 во всех исследованных образцах, при этом окружающая условно нормальная ткань не окрашивалась (Рис. 5А). Примечательно, что позитивная реакция отмечалось только в мезенхимальном компоненте бифазных сарком, в клетках эпителиального компонента ИГХ-окрашивания не наблюдалось (Рис. 5Б). В 2 случаях были окрашены образцы метастазов СС в легкое. Они состояли только из веретеноклеточного мезенхимального компонента. В клетках метастазов опухоли также отмечалась продукция белка CRABP1 (Рис.5В).

Рисунок 5. ИГХ-окрашивание белка СЯАВР1 в образцах бифазных синовиальных сарком. А - пример отсутствия окрашивания в окружающей условно нормальной ткани. Б - пример окрашивания бифазной СС, видно окрашивание только мезенхимапьного компонента опухоли. В - образец метастаза бифазной СС в легкое.

Следует отметить, что полученные результаты согласуются с литературными данными. Так, было показано, что экспрессия СЯАВР1 на уровне мРНК характерна для СС. Кроме того, ранее в нашей лаборатории было установлено, что продукция белка СИАВРI характерна и для монофазного типа СС. В целом, имеющиеся данные позволяют предположить убиквитарный характер экспрессии изучаемого гена в СС человека. Возможно, ген СЯАВР1 вовлечен в патогенез данного вида опухолей мягких тканей.

6. Исследование экспрессии СЯАВР1 и СЯАВР2 в образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека

На следующем этапе работы мы оценили экспрессию СЯАВР1 в образцах НМРЛ, одной их самых распространенных злокачественных эпителиальных опухолей человека. Анализ экспрессии гена СЯАВР1 проводили с помощью ПЦР в реальном времени с использованием TaqlVlan-зoндoв. Помимо СЯАВР1 в данной выборке проанализирована экспрессия СЯАВР2. Белки СЯАВР1 и СЯАВР2 имеют сходное строение (гомология составляет 74%). Однако по данным литературы эти белки оказывают скорее противоположное влияние на эффекты РК. В связи с этим, совместный анализ их экспрессии представляет научный интерес.

Всего было проанализировано 48 образцов НМРЛ, 24 из которых относились к плоскоклеточному раку легкого и 24 - к аденокарциномам легкого. У каждого пациента был взят образец опухолевой и условно нормальной ткани легкого. Все образцы проходили двойную гистологическую верификацию в Отделе

патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, а также охарактеризованы в соответствии с ТИМ-классификацией седьмого пересмотра (версия 2007 г.).

Данные об изменениях экспрессии СЯАВР1 и СЯАВР2 в выборке образцов НМРЛ представлены на рисунке 6.

С[?АВР1 СКАВР2

Рисунок 6. Экспрессия СЯАВР1 и СЯАВР2 в образцах НМРЛ. N=48.

Мы обнаружили, что в 42% образцов НМРЛ по сравнению с условно нормальной тканью повышена экспрессия СЯАВР1. В большинстве оставшихся случаев уровни мРНК СЯАВР1 в опухолевой и нормальной ткани не отличались. Снижение экспрессии СЯАВР1 отмечалось редко, всего в 3 случаях (6%). Кроме того, в 56% образцов в опухолевой ткани отмечалось повышение экспрессии СЯАВР2. Снижение уровня мРНК СЯАВР2 наблюдалось в 13% образцов НМРЛ.

Также мы проанализировали изменение экспрессии СЯАВР1 и СЯАВР2 в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли. Было обнаружено, что относительная экспрессия СЯАВР2 достоверно чаще снижена в образцах опухолей, полученных от пациентов с метастатическим поражением лимфатических узлов. Как видно из таблицы 3, все случаи снижения экспрессии СЯАВР2 приходятся на группу с метастазами в лимфоузлах. Это говорит о возможной вовлеченности СЯАВР2 в процессы метастазирования.

Кроме того, мы оценили наличие корреляционной связи между изменениями экспрессии СЯАВР1 и СЯАВР2. Для этого был рассчитан коэффициент корреляции Спирмена. Результаты расчета представлены в таблице 4.

Таблица 3. Относительная экспрессия СКАВР2 в группах образцов в зависимости от статуса поражения лимфатических узлов

Наличие регионарных метастазов Экспрессия СИАВР2

Снижена Повышена или равна

рИО (отсутствие поражения) 0/21 (0%) 21/21 (100%)

р№ (наличие поражения) 6/27 (22%) 21/27 (78%)

Таблица 4. Корреляционный анализ изменений экспрессии С1ЫВР1 и СРАВР2 в образцах НМРЛ

Количество Коэффициент Значение Р

образцов корреляции Спирмена

Вся выборка НМРЛ 48 0,39 <0,05

Гистологический тип

Аденокарцинома 24 0,43 <0,05

Плоскоклеточный рак 24 0,35 НЗ

Степень дифференцировки

Низкая 24 0,05 НЗ

Высокая и умеренная 24 0,60 <0,01

НЗ - не значимо

Мы обнаружили, что между изменениями уровней мРНК СЯАВР1 и СЯАВР2 в образцах НМРЛ существует слабая (0,39), но статистически достоверная положительная корреляционная связь. Кроме того, были получены интересные результаты при анализе групп опухолевых образцов с разной степенью дифференцировки клеток. В группе с высокой и умеренной степенью дифференцировки выявлена наиболее сильная корреляционная связь. Коэффициент корреляции Спирмена намного превышал таковой в общей выборке рака легкого и составлял 0,60, р=0,002. При этом в группе опухолей с низкой степенью дифференцировкой клеток корреляционная связь между уровнями относительной экспрессии СЯАВР1 и СВАВР2 отсутствовала.

В целом, в ходе проведения скрининговых исследований установлено, что экспрессия СЯАВР 1 может повышаться в опухолях человека как мезенхимального, так и эпителиального происхождения.

***

В заключение следует отметить, что в данной работе выявлено существенное влияние белка CRABP1 на свойства мезенхимальных опухолевых клеток человека: его гиперэкспрессия в линии фибросаркомы человека НТ-1080 приводила к достоверному повышению туморогенности в эксперименте in vivo. Данное исследование является одним из первых экспериментальных свидетельств участия белка CRABP1 в прогрессии опухолей человека. Полученные данные открывают широкие перспективы для дальнейших исследований, как влияния CRABP1 на формировании агрессивного фенотипа опухолей различного генеза, так и для фундаментальных исследований, направленных на изучение положения данного белка во внутриклеточных сигнальных каскадах и поиск дополнительных функций белка CRABP1, не связанных со способностью взаимодействовать с РК. Исследования в этой области также перспективны с точки зрения поиска прогностических маркеров течения онкологических заболеваний и мишеней для таргетной терапии опухолей.

выводы

1. Впервые показано, что экзогенная экспрессия CRABPI в клетках линии фибросаркомы человека НТ-1080 приводит к повышению их туморогенности в эксперименте in vivo и стимулирует миграционную активность в условиях in vitro.

2. Гиперэкспрессия мутантной формы CRABPI R131A, не способной взаимодействовать с ретиноевой кислотой, вызывает сходное повышение туморогенности и миграционной активности клеток линии НТ-1080, что свидетельствует о независимости наблюдаемых эффектов от связывания белка CRABPI с ретиноевой кислотой.

3. Выявлено, что экзогенная экспрессия CRABPI дикого типа и его мутантной формы CRABPI R13IA в клетках линии НТ-1080 не влияет на транскрипционную активность основных рецепторов ретиноевой кислоты -белков RAR.

4. Установлено, что гиперэкспрессия CRABPI вызывает изменение экспрессии около 100 генов в клетках линии НТ-1080. Среди них выявлен ряд генов, активно участвующих в процессах канцерогенеза.

5. Проведен анализ экспрессии CRABPI в образцах бифазных синовиальных сарком человека. Обнаружено, что продукция белка CRABPI наблюдается во всех исследованных образцах первичных опухолей, а также их метастазах.

6. Показано, что экспрессия CRABPI и CRABP2 повышена в образцах HMPJI в 42% и 56% соответственно. Между экспрессией обоих генов существует положительная корреляционная связь, наиболее сильная при высокой и умеренной дифференцировке клеток опухоли.

Список печатных работ, опубликованных в журналах, рекомендованных

ВАК РФ

1. Кашкин К.Н. Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека / К.Н. Кашкин, Е.А. Мусаткина, А.В. Комельков, И.А. Фаворская, Е.В. Трушкин, В.А. Шлепцова, Д.А. Сахаров, Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев, М.В. Зиновьева, О.В. Ковалева, И.Б. Зборовская, А.Г. Тоневицкий, Е.Д. Свердлов // Доклады академии наук. - 2010. - Т. 430. - № 3. - С. 412-415.

2. Каинов Я.А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка / Я. А. Каинов, И.А. Фаворская, Е.Е. Антошина, Т.Г. Горькова, А.В. Комельков, Е.М. Чевкина // Российский биотерапевтический журнал. -2011.- Т. 10. - №2. - С. 37-44.

3. Каверина Н.В. Влияние метилирования промотора KISS1 на подавление экспрессии гена в клетках рака молочной железы и метастазов в головном мозге / Н.В. Каверина, И.В. Уласов, И.А. Фаворская, И.Б. Зборовская, А.Ю. Барышников, З.Г. Кадагидзе // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. -2011. -№4.-С. 17-23

4. Kashkin K.N. Genes potentially associated with cisplatin resistance of lung cancer cells / K.N. Kashkin, E.A. Musatkina, A.V. Komelkov, E.A. Tonevitsky, D.A. Sakharov, T.V. Vinogradova, E.P. Kopantsev, M.V. Zinovyeva, I.A. Favorskaya, Y.A. Kainov, V.N. Aushev, I.B. Zborovskaya, A.G. Tonevitsky, E.D. Sverdlov // Dokl Biochem Biophys. - 2011. - 438. - P. 147-150.

5. Чевкина Е.М. Экспрессия CRABP1 и CRABP2 в саркомах мягких тканей / Е.М. Чевкина, И.А. Фаворская, Я.А. Каинов, Г.Ю. Чемерис, А.В. Комельков, Н.А. Дьякова // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. -2013- №1.- С. 4753.

6. Kainov Y. CRABP1 provides high malignancy of transformed mesenchymal cells and contributes to the pathogenesis of mesenchymal and neuroendocrine tumors / Y. Kainov, I. Favorskaya, V. Delektorskaya, G. Chemeris, A. Komelkov, A. Zhuravskaya, L. Trukhanova, E. Zueva, B. Tavitian, N. Dyakova, I. Zborovskaya, E. Tchevkina // Cell Cycle. - 2014. - 13(10). Article in press.

Тезисы конференций

1. Zborovskaya I. Underlying molecular alterations in progression of NSCLC / I. Zborovskaya, K. Arkhipova, K. Lactionov, B. Polotsky, D. Yudin, I. Favorskaya, E. Musatkina, M. Kochetkova, O. Kovaljova, V. Mochalnikova, E. Stepanova, B. Ahmedov, A. Telezhkina // Anticancer Research. - 2008. - 28. - 5C. - P. 3550.

2. Ковалева О.В. Сравнительный анализ экспрессии белков RalA, Arf6 и Birc5 при немелкоклеточном раке легкого / О.В. Ковалева, А.В. Книжник, В.В. Мочальникова, И.А. Фаворская, И.Б. Зборовская // Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы

развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии», 16—17 сентября 2009, Томск, -С. 114-115.

3. Kainov Y. Role of CRABP1 protein in the formation of high-metastasis phenotype of RSV-transformed fibroblasts of Syrian hamsters / Y. Kainov, I. Favorskaya, L. Trukhanova, A. Zhuravskaya, A. Komelkov, E. Chevkina // Abstracts of the Eurasian Forum on Cancer Diagnostics. 9-10 June 2011, Kyiv, Ukraine. - p. 26.

4. Kainov Y. CRABP1 Stimulates Tumorigenicity and Metastasis of RSV-transformed Fibroblasts / Y. Kainov, I. Favorskaya, L. Trukhanova, G. Chemeriz, A. Komelkov, E. Tchevkina // Tumor Biology: Abstracts of the 40th congress of International society of oncology and biomarkers. - 2012. - V.33, SI. — p.86.

5. Фаворская И.А. Участие CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа трансформированных мезенхимальных клеток человека / И.А. Фаворская, Я.А. Каинов, A.B. Комельков, Е.М. Чевкина, И.Б. Зборовская // Материалы VII Всероссийского съезда онкологов. Вопросы онкологии. -2013. - Т. 59. -Приложение к №3. - С. 137-138.

6. Kainov Y. CRABP1 is ubiquitously expressed in synovial sarcomas and promotes tumorigenicity and metastatic activity of transformed mesenchymal cells / Y. Kainov, I. Favorskaya, G. Chemeris, N. Dyakova, A. Komelkov, E. Tchevkina // Abstracts of the 5th EMBO meeting, Amsterdam, Netherlands. - 2013. - p. 139-140.

Подписано в печать:

17.04.2014

Заказ № 9962 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru