Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда (экспериментальное исследование)
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.16
Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
МАТЮКОВ Андрей Александрович
ВЛИЯНИЕ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА ТЕЧЕНИЕ ИНФАРКТА МИОКАРДА (экспериментальное исследование)
14 00 16 - патологическая физиология 14 00 44 - сердечно-сосудистая хирургия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург 2007
003061662
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им акад И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ
доктор медицинских наук, профессор Власов Тимур Дмитриевич доктор медицинских наук, профессор Гриценко Владимир Викторович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ
доктор медицинских наук, профессор Николаев Валентин Иванович (ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»)
доктор медицинских наук, профессор Хубулава Геннадий Григорьевич (Военно-медицинская академия им С М Кирова)
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «21» сентября 200? г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208 090 03 Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акац И П Павлова (197089, г Санкт-Петербург, ул Л Толстого, 6/8)
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им акад И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Автореферат разослан «17» августа 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессоР^^ю^»«"? В Ф Митрейкин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Несмотря на значительные успехи современной медицины, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему остаются главной причиной смер гности и инвалидизации населения (Беленков Ю Н с соавт, 2003, Шахов В П, Попов С В, 2004) Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают спо( обность к регенерации В результате этого погибшие в ходе ишемии кардиомиоциты замещаются соединительной тканью (Репин ВС, Сухих ГТ, 1998) Необратимое повреждение кардиомиоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к наруше нию функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности (Gaudron Р et al, 1993) Используемые в настоящее время консервативные и оперативные методы лечения ишемии миокарда не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин Так, например, у больных с дистальным поражением и диффузными изменениями в коронарных артериях достичь реваскуляризации миокарда с помощью методов хирургической коррекции становится невозможным (Бокерия Л А с соавт, 2004) В связи с этим разрабатываются новые способы регенерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии (Репин В С, 1998, Потапов И В с соавт, 2001, Шевченко Ю Л, 2006) Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирургии является использование клеток костного мозга Данный подход основан на способности клеток костного мозга участвовать в регенерации поврежденного миокарда (Шахов В П , Попов С В , 2004, Chachques J S et al, 2005) В терапии инфаркта миокарда используют различные клетки костного мозга гемопоэтические стволовые клетки (Limbourg F Р et al, 2005), эндотелиальные прогениторные клетки (Katntsis D G, 2005), мезенхимальные стромальные клетки (Tang Y L, 2005), нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (Zhang S, 2004) Применяется как аллогенная, так и аутологичная трансплантация клеток, причем наиболее перспективным считается трансплантация аутологичных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем Наибольшую популярность получила аутотрансплантация мезенхимальных стромальных , и
нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга Растущее чисто экспериментальных работ демонстрирует
положительный эффект трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда (Асеуеэ } Ь et а1, 2005, Р1ао Н е! а1, 2005, вао Ь Я е1 а1, 2006, Кга^пП В еХ а1, 2006, Ме1игт 3 й а1, 2006) Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования Такими являются вопрос о наиболее эффективном типе клеток и вопрос об оптимальном способе введения клеток для восстановления миокарда
Цель исследования.
Изучить влияние аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение острого инфаркта миокарда в эксперименте
Задачи исследования
1 Отработать оптимальный способ получения клеток костного мозга кролика для последующей аутотрансплантации
2 Определить местонахождение трансплантированных клеток в миокарде при различных путях введения
3 Сравнить эффективность трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных' ядросодержащих клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда у кролика
4 Оценить влияние трансплантации различных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда на различных
^ сроках
5 Изучить эффективность различных путей введения клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда
Научная новизна.
Впервые выполнено сравнение различных способов получения клеток костного мозга Впервые на одной модели произведено сравнение влияния трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга при разных путях введения на течение инфаркта миокарда у кролика
Впервые проведена комплексная оценка
морфофункционального состояния миокарда после трансплантации различных клеток костного мозга на основе использования современных инструментальных методов обследования (эхокардиографии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии)
Впервые охарактеризовано состояние миокарда в отдаленные сроки (1 год) после трансплантации клеток костного мозга
Получены новые данные о возможности использования витального флуоресцентного красителя для идентификации трансплантированных клеток в миокарде кролика Разработаны параметры оценки перфузии миокарда кролика методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии
Теоретическая и практическая значимость.
Данные, полученные в исследовании, являются теоретической основой для внедрения клеточных технологий в клиническую практику, так как обосновывают оптимальный вид клеток костного мозга и их способ введения при лечении больных с инфарктом миокарда
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Клетки костного мозга, трансплантированные интрамиокардиально, сохраняются в зоне введения в течение нескольких недель
2 Введение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга оказывает выраженное положительное влияние на морфофункциональное состояние миокарда в разные сроки наблюдения после коронароокюпозии
3 Применение нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга приводит к увеличению размера зоны повреждения и ухудшению функционального состояния миокарда при экспериментальном инфаркте у кроликов
4 Внутривенное введение клеток костного мозга не изменяет течение экспериментального инфаркта миокарда у кроликов
Реализация работы.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и госпитальной хирургии №2 Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акад ИП Павлова Подана заявка №20006124343 (06 07 2006) на изобретение «Способ лечения больных пороками клапанов сердца» (соавт Давыденко В В, Гриценко В В), на которую получено положительное решение (20 06 2007)
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки,
регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004, одиннадцатой межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005, юбилейной студенческой научной конференции, посвященной 100-летию клинической больницы Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии и 80-летию Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии, «Студенческая наука - 2005», Санкт-Петербург, 2005, конкурсе бизнес-идей и научно-исследовательских разработок «Молодые Дерзкие Перспективные», Санкт-Петербург, 2005, научной конференции «Новые технологии в ядерной медицине», Санкт-Петербург, 2006, Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2006, двенадцатом Всероссийском съезде сердечнососудистых хирургов, Москва, 2006, Невском радиологическом форуме «Новые горизонты», Санкт-Петербург, 2007
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 37 отечественных и 126 иностранных источников Работа иллюстрирована 9 таблицами и 39 рисунками
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на кроликах-самцах линии Шиншилла массой 2,7-3,0 кг. Общее количество животных составило 98
Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга. В работе использовали нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (ЯСК) и культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК)
Получение ядросодержащих клеток костного мозга ЯСК получали двумя способами резекционным и пункционным При резекционном способе ЯСК выделяли путем ферментативной диссоциации костномозговой взвеси, полученной в > оде механической обработки резецированных фрагментов подвздошны> костей При пункционном способе выполняли пункцию крыла подвздошной кости, получали 10 мл эксфузата костного мозга, который фракционировали с помощью центрифугирования (1600 g, 20 мин) в градиенте плотности
Перколла (63%) Образовавшееся интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg' (Gibco, США) и осаждали центрифугированием
Получение культуры мезенхималъных стромалъных клеток костного мозга Культуру МСК получали путем культивирования ЯСК, выделенных резекционным и пункционным путем Культивирование ЯСК проводили в среде а-МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл, Invitrogen, Великобритания) в С02-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа в течение 3 недель Смену среды производили через каждые трое суток После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл, ICN, США) Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи 0,25% раствора трипсина (Gibco, США) и ЭДТА (0,02% этилендиаминтетрауксусная кислота, Gibco, США)
Характеристика культур МСК Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат с нитросиним тетразолем, Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и смесью суданов III и IV (BDH, Великобритания) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки
Окрашивание клеток Перед трансплантацией клетки костного мозга окрашивали ядерным флуоресцентным красителем Hoechst (Sigma, США) Для этого перед трансплантацией в клеточную суспензию добавляли флуорохром в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут в С02-инкубаторе на шейкере Из суспензии клеток готовили препараты и изучали на флуоресцентном микроскопе При этом ядра клеток светились ярко-голубым цветом
Подсчет клеток в суспензии и определение их жизнеспособности. Подсчет клеток костного мозга проводили в камере Горяева, а жизнеспособность определяли с помощью окраски трипановым синим (Лабтех, Россия)
Моделирование инфаркта миокарда Всем животным инфаркт миокарда воспроизводился лигированием левой коронарной артерии (Horner et al, 1980, Ytrehus et al, 1994, Zhu et al, 2000) В условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом выполняли левостороннюю торакотомию в четвертом межреберье и перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца Интраоперационная летальность составляла 10%, послеоперационная - менее 2%
Введение клеток животным. Все животные были разделены на
7 групп
1-ая группа - интрамиокардиальное введение ростовой среды а-МЕМ (модифицированная среда Игла, контроль, п = 13),
2-ая группа - интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры МСК (n = 18),
3-я группа - интрамиокардиальная аутотрансплантация ЯСК (n = 18),
4-ая группа - внутривенное введение ростовой среды с-МЕМ (контроль, п=11),
5-ая группа - внутривенная аутотрансплантация культуры МСК (п = 15),
6- ая группа - внутривенная аутотрансплантация ЯСК (n = 18), 7 —ая группа - неоперированные животные (п = 5)
Введение клеток осуществляли 2 путями интрамиокардиально и внутривенно Среднее число клеток составляло 2x106 Интрамиокардиально клетки вводили в 0,4 мл ростовой среды а-МЕМ через 10 минут после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта с помощью инсулинового шприца из 6 точек Внутривенно клетки также вводили в 0,4 мл ростовой среды а-МЕМ через 10 минут после коронароокклюзии в краевую вену уха через периферический катетер Животным контрольной группы либо интрамиокардиально, либо внутривенно вводили только 0,4 мл ростовой среды а-МЕМ
Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. Через 20 суток после трансплантации клеток трех кроликов из каждой группы выводили из эксперимента (такой срок определялся длительностью жизни флуорохрома) Сердце разрезали на 2 части (базальную и апикальную) таким образом, что плоскость разреза проходила на уровне лигатуры перпендикулярно длинной оси сердца Апикальную часть сердца измельчали и подвергали ферментативной диссоциации смесью трипсин-коллагеназы (Sigma, США) Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, наносили на предметное стекло и производили подсчет меченых »леток Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop» (Zeiss, Германия)
Электрокардиография. Электрокардиография (ЭКГ) во всех группах животных выполнялась до операции (норма), через 3 суток, 7 суток, 30 суток после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции) Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ-001 («Красногвардеец», Россия) Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость лентопротяжного механизма — на 50 мм/с Оценку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению.
Ультра туковое исследование сердца. Ультразвуковое эхокардиографичес кое исследование выполнено на эхокамере Sequoia 512 (Acusón, США) с использованием линейного датчика 13 МГц В каждой группе животных эхокардиографическое исследование выполнялось до операции, через 14 суток и 1 год после операции по стандартной методике Эхокардиография проводилась с обязательной параллельной регистрацией ЭКГ-сигнала Из гарастернального доступа по длинной оси левого желудочка (с контролем из этого же доступа по короткой оси левого желудочка) в режиме М-модального сканирования регистрировался конечно - диастолический размер левого желудочка Систолическую функцию левого желудочка регистрировали с помощью 2D - сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях Расчеты фракции выброса по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхокамер Кровоток в аорте оценивали в режиме импульсно-волновой допплерографии
Методика оценки перфузии миокарда. Оценка перфузии выполнялась методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) Использовался радиофармацевтический препарат (РФП) Myoview (Nycomed, Великобритания), меченый технецием-99т РФП в дозе 30-50 МБк вводился в краевую вену уха через периферический катетер Спустя 10-15 минут после инъекции выполнялась ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере Е Cam var (Siemens, Германия) Для количественной оценки уровня перфузии миокарда использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в патологической зоне к таковому в референтной зоне Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значений пикселя в патологической и референтной зонах
Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда. Размер экспериментального инфаркта миокарда определяли с помощью окрашивания срезов серДца 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом (ТТХ) Методика окрашивания ТТХ позволяет на макроскопическом уровне отграничить необратимо поврежденную ткань миокарда от ткани, сохранившей жизнеспособность У животных сразу после эвтаназии (через 12 месяцев после трансплантации клеток) извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины Затем срезы помещали в 1% раствор ТТХ (ICN, США), окрашивающий жизнеспособный миокард с сохраненной активностью НАД-зависимых
ферментов в ярко-красный (кирпичный) цвет, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С и pH 7,4 Окрашенные срезы сердца фотографировали с базальной поверхности цифровой камерой Olimpus 2020 Компьютерную обработку изображений осуществляли с помощью программы Adobe Photoshop Общую площадь рубца вычисляли по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза
Методика измерения дилатации левого желудочка.
Дилатацию левого желудочка оценивали по срезам сердца, окрашенным ТТХ Сфотографированные срезы подвергали компьютерной обработке с помощью программы Adobe Photoshop Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отношение площади просвета левого желудочка к площади миокарда обоих желудочков Полученный индекс дилатации левого желудочка (в отн ед) вычисляли по трем срезам и представляли среднее значение
Гистологическое исследование. После эвтаназии сердце кролика ниже лигатуры разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины -апикальный, средний, базальный Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 суток После фиксации каждый сегмент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори, позволяющему выявить различные виды соединительной ткани При этом коллагеновые волокна приобретали окраску разной интенсивности от голубой до синей Препараты исследовали на микроскопе «Биолам» (Россия)
Количественная оценка васкуляризации. Оценивалась пограничная с рубцом зона В каждом препарате в пяти последовательных полях зрения при увеличении х400 (окраска по Маллори) производился подсчет количества всех сосудов артериол, капилляров, венул, вен и синусов
Статистическая обработка. Для статистической обработки данных использовалась статистическая программа SPSS При небольшом числе наблюдений достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни Все данные представляли в виде "среднее ± стандартное отклонение" и значение р менее 0,05 рассматривали в качестве значимого
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Сравнение способов получения ЯСК. Результаты сравнения резекционного и пункционного способов получения ЯСК представлены в табл 1
Таблица 1
Сравнение способов получения ядросодержащих клеток костного мозга
Признак Резекционный способ Пункционный способ
количество выделенных ЯСК (106/мл) 6,7±1,8 32±4,6
цитохимическая реакция на ЩФ в культуре МСК + -
время, затраченное на выделение ЯСК (мин) 150±15 60±15
инвазивность процедуры ++++ +
Из представленных данных видно, что пункционный способ получения ЯСК по всем признакам имеет преимущество перед резекционным способом В связи с этим ЯСК, полученные резекционным способом, в работе не использовались Характеристика клеток костного мозга. В результате фракционирования эксфузата костного мозга на градиенте Перколла были выделены ЯСК После подсчета и определения жизнеспособности клетки переносили в культуральную чашку диаметром 10 см2 В ходе культивирования было показано, что начиная с 3-4 суток появлялись единичные адгезивные клетки, имеющие вытянутую форму На 7-8 сутки адгезивные клетки формировали колонии, представленные клетками с разными морфологическими свойствами округлые, полигональные и веретиновидные К 12-14 суткам адгезивные клетки формировали монослой, покрывая все дно культуральной чашки Морфологически культура становилась более гомогенной и, в основном, была представлена вытянутыми фибробластоподобными клетками После пересева клетки вновь культивировали до образования монослоя На 2 пассаже мезенхимальные стромальные клетки костного мозга представляли собой гетерогенную популяцию, но в основном имели веретеновидную форму После ферментативной обработки и перевода клеток в суспензионное состояние их размер составлял в среднем 15-20 мкм Общее количество клеток, полученное в результате
культивирования, составляло 2x106 В ходе культивирования на каждом пассаже делался отсев для проведения цитохимических реакций (на ЩФ для выявление клеток остеогенного ряда и на нейтральные липиды для выявления клеток адипоцитарного ряда) В качестве контроля использовали культуры МСК, дифференцированные в остеогенном и адипоцитарном направлениях Для индукции дифференцировки в остеогенном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением p-глицерофосфата натрия (10 мМ, Sigma, США), дексаметазона (100 нМ, Sigma, США) и аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл), для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением дексаметазона (10 нМ), аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и ITS + LA-BSA (инсулин, трансферрин, сепеновая кислота, линейная алкилбензосульфоновая кислота) Результаты цитохимических реакций показали, что культура МСК характеризовалась отсутствием спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки В то же время, проведенные исследования по стимуляции дифференцировки культуры МСК в остеогенном и адипоцитарном направлениях под действием индукторов указывали на их мультипотентность Течение инфаркта миокарда. После дотирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии развивался инфаркт миокарда, который имел закономерное течение и сопровождался характерными патоморфологическими изменениями На 4-е сутки после коронароокклюзии наблюдался некроз кардиомиоцитов с полным разрушением ядер, ограничением зоны некроза выраженным лейкоцитарным валом На 14-е сутки отмечалась постепенная элиминация лейкоцитарной инфильтрации, в умеренном количестве визуализировалась незрелая соединительная ткань с небольшим количеством фибробластов На 21-е сутки визуализировались единичные некротизированные кардиомиоциты, гистологически определялся сформировавшийся рубец с большим количеством фибробластов и коллагена На сроке 1 год определялся рубец, образованный зрелой фиброзной тканью с большим количеством фибробластов и коллагеновых волокон
Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. После интрамиокардиальной трансплантации культуры меченых МСК и ЯСК указанные клетки через 20 суток определялись в миокарде Среднее количество меченых МСК, выявленных в диссоциированном миокарде, составило 9±3%, меченых ЯСК - 13±2% от общего числа трансплантированных клеток После внутривенного введения флуоресцентно окрашенные МСК и ЯСК не идентифицировались в миокарде
Электрокардиография. Во всех группах после коронароокклюзии развивались электрокардиографические признаки острого инфаркта миокарда, которые имели отчетливую закономерную динамику Однако в контрольных группах и в группе животных, которым выполняли интрамиокардиальную трансплантацию ЯСК, регистрировались признаки трансмурального инфаркта миокарда Тогда как в группе животных, которым интрамиокардиально трансплантировали культуру МСК, ЭКГ-данные указывали на развитие субэндокардиального инфаркта миокарда Кроме того, в контрольных группах и в группе животных после интрамиокардиальной трансплантации ЯСК предсердные экстрасистолы возникали значительно чаще (78±10% и 74±7% на 3-й сутки, 19±8% и 24±6% на 7-е сутки после операции), чем в группе животных, которым выполняли интрамиокардиальную трансплантацию культуры МСК (9±3% на 3-й сутки и 8±4% на 7-е сутки после операции) По данным электрокардиографии после внутривенного введения клеток костного мозга разницы в течении инфаркта миокарда по сравнению с контролем выявлено не было Нарушения ритма развивались примерно с одинаковой частотой во всех группах
Ультразвуковое исследование сердца. По данным УЗИ сердца в динамике проанализированы показатели систолической функции сердца фракция выброса (ФВ), размер левого желудочка в диастолу (конечно-диастопический размер - КДР) и скорость кровотока через аортальный клапан (УАо) Динамика изменений показателей систолической функции сердца представлена в табл 2 и 3
Анализ эхокардиографических показателей систолической функции левого желудочка выявил выраженное положительное влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации МСК, проявляющееся в нормализации всех показателей через 1 год после операции В то время как у животных после интрамиокардиальной аутотрансплантации ЯСК, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолическрй функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой После внутривенного введения МСК и ЯСК различий между контрольной и опытными группами выявлено не было
Таблица 2
Показатели систолической функции сердца в контрольной и опытных группах после интрамиокардиальной трансплантации
Величина показателя (М±т)
Группы
л ч 4) н 1-ая (контроль) 2-ая (трансплантация культуры МСК) 3-я (трансплантация ЯСК)
а и: о С исходная 14 суток после ! операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции
ФВ, 64,9 46,7 48,7 61,7 53,1 58,2 59,7 38,8 28,7
% ±4,3 ±3,5 ±3,9 ±4,0 ±4,8* ±3,1* ±3,2 ±2,9** ±4,14
КДР, 14,1 16,8 16,6 14,7 17,3 15,2 14,9 17,9 19,8
мм ±04 ±1,2 ±0,8 ±0,9 ±1,0 ±0,7* ±1,2 ±0,8* ±0,9**
УАо, м/с 94±3 58±6 73±6 96±4 81 ±6* 89±4* 97±5 55±4** 45±3*#
Различия достоверны (р<0,05) - по сравнению с контролем, # - по сравнению со 2-ой группой
Таблица 3
Показатели систолической функции сердца в контрольной и опытных группах после внутривенной трансплантации
Величина показателя (М±т)
Группы
Л ч о Ь 4-ая (контроль) 5-ая (трансплантация культуры МСК) 6-ая(трансплантация ЯСК)
и о С исходная 14 суток после операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции исходная 14 суток после операции 1 год после операции
ФВ, 62,4 41,2 43,1 60,1 42,1 42,9 61,5 45,5 48,0
% ±3,6 ±3,3 ±4,2 ±4,0 ±3,8 ±3,7 ±3,1 ±4,5 ±4,1
КДР, 14,6 17,6 16,8 14,3 17,7 17,6 14,7 16,9 17,2
мм ±0,4 ±1,0 ±1,2 ±0,5 ±1,2 ±1,4 ±0,7 ±1,0 ±0,4
УАо, м/с 92±4 62±3 68±6 95±3 66±5 69±2 91±7 62±5 66±5
Перфузия миокарда. Сводные данные уровня перфузии миокарда представлены в табл 4 и 5 До операции у всех животных нарушений перфузии миокарда выявлено не было, а РФП распределялся равномерно
При количественной оценке перфузионных томосцинтиграмм миокарда кроликов через 10 суток после интрамиокардиального введения клеток костного мозга и в контрольной группе отмечалось снижение перфузии в области передней стенки левого желудочка Через 1,5 месяца после операции во 2-ой и 3-й группах наблюдалось существенное улучшение перфузии К 3-ему месяцу после операции полная нормализация перфузии отмечалась во 2-ой и 3-й группах, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличивался В дальнейшем на сроках 6 и 12 месяцев динамика уровня перфузии не изменялась и показатели перфузии в опытных группах сохранялись достоверно на более высоком уровне, чем в контроле
Таблица 4
Значения уровня накопления РФП после интрамиокардиальной трансплантации меток костного мозга на разных сроках (М±т, отн ед)
Сроки исследования Группы
1-ая (контроль) 2-ая(трансплантация культуры МСК) 3-я (тр ансплантация ЯСК)
до операции (норма) 1,01±0,02 0,98±0,03 1,00±0,01
10 суток после операции 0,59±0,01 0,81±0,01* 0,75±0,03*
1,5 месяца после операции 0,62±0,02 0,92±0,03* 0,89±0,03*
3 месяца после операции 0,61±0,01 1,00±0,02* 0,98±0,01*
6 месяцев после операции 0,64±0,04 0,98±0,02* 0,98±0,03*
1 год после операции 0,61±0,03 1,02±0,04* 0,99±0,0Г
Примечание отн ед = среднее значение накопления РФП в патологической зоне/среднее значение накопления РФП в референтной зоне Различия достоверны (р<0,05) - по сравнению с контролем
Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах изменялись следующим образом через 10 суток после операции во всех группах отмечалась выраженная неравномерность распределения РФП, через 1,5 месяца в контрольной группе неравномерность перфузии наростала, а в опытных группах РФП одинаково распределялся в патологической и референтной зонах миокарда На сроках 3, 6 и 12 месяцев во 2-ой и 3-й группах сохранялось равномерное распределение РФП, в то время как в контрольной группе с увеличением срока наблюдения происходило выраженное увеличение неравномерности перфузии в патологической зоне по отношению к референтной
Таблица 5
Значения уровня накопления РФП после внутривенной трансплантации клеток костного мозга на разных сроках (М±т, отн ед )
Сроки исследования Группы
4-ая (контроль) 5-ая(трансплантация культуры МСК) 6-ая (трансплантация ЯСК)
до операции (норма) 0,99±0,02 1,00±0,01 0,98±0,03
10 суток после операции 0,62±0,02 " 0,60±0,01 0,58±0,02
1,5 месяца после операции 0,59±0,02 0,57±0,03 0,63±0,03
3 месяца после операции 0,61±0,01 0,60±0,02 0,58±0.01
6 месяцев после операции 0,58±0,04 0,64±0,04 0,60±0,03
1 год после операции 0,63±0,02 0,59±0,03 0,60±0,01
Примечание см табл 4
При количественной оценке перфузионных томосцинтиграмм миокарда кроликов на всех сроках наблюдения после внутривенного введения клеток костного мозга и ростовой среды во всех группах отмечалось снижение перфузии в области передней стенки левого желудочка
Достоверных различий между значениями равномерности перфузии в патологической и референтной зонах после внутривенного введения ростовой среды и клеток костного мозга во всех группах на
всех сроках наблюдения выявлено не было У всех животных с увеличением срока наблюдения неравномерность распределения РФП в патологической зоне становилась более выраженной
Морфометрическая характеристика сердец кроликов. Макроскопическое исследование нативных сердец кроликов контрольных групп (без лечения) показало увеличение размеров сердца и наличие аневризмы левого желудочка по сравнению со здоровым сердцем (неоперированные животные) В сердцах кроликов, которым выполнялась интрамиокардиальная трансплантация культуры МСК, в передней стенке левого желудочка выявлялись рубцовые изменения, размеры сердца были незначительно увеличены В группе животных, которым осуществляли интрамиокардиальную трансплантацию ЯСК, размеры сердца значительно превышали размеры здорового сердца, а левый желудочек был аневризматически изменен В сердцах кроликов, которым выполнялась внутривенное введение культуры МСК и ЯСК, также отмечалось увеличение размеров сердца и в передней стенке левого желудочка определялась аневризма
Результаты определения площади рубца после окрашивания срезов сердца кролика ТТХ показали, что в 1-ой группе (контроль) площадь рубца составляла 20,2±1,9% В опытных группах максимальные изменения были выявлены в группе животных, которым выполнялась интрамиокардиальная трансплантация ЯСК общая площадь рубца составляла 35,8±1,6% Положительные изменения были отмечены после интрамиокардиальной трансплантации культуры МСК - площадь рубцовой ткани в этих сердцах соответствовала 6,0±2,6% (рис 1)
Рис 1 Площадь рубца в контрольной группе, после интрамиокардиальной трансплантации культуры МСК (группа 2) и ЯСК (группа 3) Примечание р<0 05 в сравнении с контрольной группой
Результаты определения индекса дилатации левого желудочка показали, что в группе животных, которым интрамиокардиально трансплантировали ЯСК, этот показатель в 2 раза превышал значения контрольной группы (0,34±0,03 и 0,19±0,02) Индекс дилатации левого желудочка сердец кроликов, перенесших интра миокардиальную трансплантацию культуры МСК, был в 2 раза меньше по сравнению с контрольной группой и составлял 0,11±0,02 (рис 2)
Результаты определения площади рубца после внутривенного введения показали, что в контрольной группе площадь рубца составляла 22,4 ± 2,5 % В опытных группах средние значения площади рубца достоверно не отличались от значений в контрольной группе и составляли 24,3±2,0% и 19,9±3,1%, соответственно (рис 3).
-----*—
Ц:
ига
контроль группа 2 группа 3
группыжив отн ых
Рис 2 Индекс дилатации левого желудочка (ЛЖ) в контрольной группе, после интрамиокардиальной трансплантации культуры МСК (группа 2) и ЯСК (группа 3) Примечание * р<0 05 в сравнении с контрольной группой
контроль группа 5 группа е
группы животных
Рис 3 Площадь рубца в контрольной группе, после внутривенного введения культуры МСК (группа 5) и ЯСК (группа 6)
Индекс дилаташш левого желудочка в контрольной группе составлял 0,18=ь0,03 В 5-ой и 6-ой группах животных после внутривенного введения клеток средние значения индекса дилатации составляли 0,22±0,02 и 0,21±0,04, что не имело достоверных отличий от значений индекса в контрольной группе (рис 4)
? оз
ё 025 ^ 02 § о 15
I О 1
* О 05 ? О
контроль группа 5
группы животных
группа 6
Рис 4 Индекс дилатации левого желудочка в контрольной группе, после внутривенного введения культуры МСК (группа 5) и ЯСК (группа 6)
Количественная оценка васкуляризации. Результаты количественной оценки сосудов в пограничной с рубцом зоне после интрамиокардиальной аутотрансплантации показали, что общее количество сосудов в контрольной группе составляло 9±2 в одном поле зрения Во 2-ой группе количество сосудов почти в 2 раза было больше, чем в контроле и составляло 16±3 в одном поле зрения В 3-й группе также отмечалось значительно большее число сосудов по сравнению с контрольной группой, что соответствовало 14±3 в одном поле зрения Анализ количества сосудов в пограничной зоне после внутривенного введения ростовой среды и клеток костного мозга показал, что общее количество сосудов в 4-ой (контрольной) группе составляло 10±3 в одном поле зрения В 5-ой и 6-ой группах количество сосудов достоверно не отличалось от контроля и составляло 8±4 и 11±3, соответственно
Гистологическая характеристика миокарда. Анализ гистологической структуры миокарда кроликов показал, что интрамиокардиальная трансплантация культуры МСК и ЯСК приводила к формированию принципиально иной морфологической структуры миокарда, чем в контрольной группе После трансплантации культуры МСК наблюдалась картина мелкоочагового склероза с последующим восстановлением структуры миокарда Кроме того, в исследуемых препаратах отмечалась повышенная васкуляризация миокарда Интрамиокардиальная трансплантация ЯСК сопровождалась
формированием фиброзной аневризмы с поражением правого желудочка Однако в исследуемых препаратах была отмечена хорошая васкуляризация миокарда, значительно превышающая уровень васкуляризации в контроле (таблица 6)
Таблица 6
Гистологическая характеристика миокарда кроликов контрольной и опытных групп после интрамиокардиальной трансплантации
Признак Группы
1-ая (контроль) 2-ая (трансплантация культуры МСК) 3-я (трансплантация ЯСК)
апикальный сегмент средний сегмент базальный сегмент апикальный сегмент средний сегмент базальный сегмент апикальный сегмент средний сегмент ! | базальный сегмент
аневризма + + + - + - + + +
поражение правого желудочка +
поражение межжелудочковой перегородки +' - - - +
прогрессирующий кардиосклероз + + - - - - +
1группы кардиомиоцитов, сохранившихся в рубце + + + + + + -
«+» - наличие признака, «-» - отсутствие признака
Внутривенное введение культуры МСК и ЯСК не приводило к достоверному изменению морфологического состояния миокарда по сравнению с контрольной группой
Таким образом, результаты наших исследований позволили показать, что аутотрансплантация клеток костного мозга влияет на течение экспериментального инфаркта миокарда
ВЫВОДЫ
1 Пункционный способ получения клеток костного мозга у кролика имеет преимущество перед резекционным в связи с лучшим качеством и большим количеством получаемого материала, меньшей инвазивностью процедуры получения костного мозга и ее технической простотой
2 Через 20 суток после интрамиокардиальной аутотрансплантации меченые мезенхимальные стромальные клетки костного мозга и нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга сохранялись в миокарде, после внутривенного введения меченые клетки костного мозга в миокарде не определялись
3 Интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда приводила к уменьшению площади зоны ишемического повреждения, нормализации показателей систолической функции сердца, а также полному восстановлению перфузии миокарда за счет стимуляции ангиогенеза
4 Положительное влияние интрамиокардиальной трансплантации культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга наблюдалось на сроках от 3 дней до 1 года после лигирования коронарной артерии у кроликов, то есть имело стабильный и долгосрочный терапевтический эффект
5 Интрамиокардиальная аутотрансплантация нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга сопровождалась увеличением размеров зоны ишемического повреждения и ухудшением показателей систолической функции сердца, что сочеталось с активацией ангиогенеза и восстановлением показателей перфузии в условиях экспериментального инфаркта миокарда
6 Внутривенная аутотрансплантация культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга не влияла на морфофункциональное состояние миокарда и показатели его перфузии
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1 Интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры мультипотентных мезенхимальных стромальны к клеток костного мозга может быть использована в лечении больных с острым инфарктом миокарда, а также для стимуляции ангиогенеза при ишемической болезни сердца
2 Аутологичные нефракционированные ядросо держащие клетки костного мозга при интрамиокардиальном введении не могут применяться в острейшую фазу инфаркта миокарда
3 Внутривенное введение различных клеток костного мозга в острейшую фазу инфаркта миокарда является нецелесообразным
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Матюков А.А Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на перфузию ишемгоированного миокарда в эксперименте // Клеточная трансплантология и тканевгш инженерия — 2006.-№3(5) -С42-47
2 Матюков А А, Цупкина Н В , Гриценко В В ,. Власов Т Д , Давыденко В В , Ялфимов А Н, Пинаев Г П Сравнительное влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия - 2007 - Т II, № 1 - С 48-52
3 Давыденко ВВ., Матюков А А , Цупкина Н В , Власов Т Д , Гриценко В В , Кузнецов А А , Аминева X К, Деев Р В , Ялфимов А Н, Пинаев ГП Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда кролика после инфаркта // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия - 2007 -Т II, №2 -С 53-61
4 Давыденко В В , Гриценко В В , Орловский П И , Азовцев Р А, Дегтерева О А, Астафьева О В , Лапекин С В , Матюков А А , Урусова М А Особенности ишемии миокарда у больных пороками клапанов сердца // Регионарное кровообращение и микроциркуляцяя - 2006 - №4 -С 64-68
5 Давыденко В В , Гриценко В В , Афанасьев Б В , Пизин В М, Мочалов О Ю , Дегтерева О А , Матюков А А Иитракардиальная трансплантация мононуклеарных клеток аутологичного постного мозга в комплексном лечении больных пороками клапанов сердца //
Вестник хирургии им ИИ Грекова -2007 -№3 -С 16-21
6 Матюков А А , Гриценко В В , Власов Т Д, Давыденко В В , Тютин Л А , Ялфимов А Н , Иванова А А , Цупкина Н В , Пинаев Г П Оценка степени перфузии ишемизированного миокарда с использованием ОФЭКТ в эксперименте // Бюл НЦССХ им А Н Бакулева - 2006 - Т 7, №5 (Приложение) - С 267
7 Цупкина Н В , Матюков А А , Ялфимов А Н , Савченко О Н , Тютин Л А , Власов Т Д, Гриценко В В , Давыденко В В , Пинаев Г П Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на кровоснабжение ишемизированного миокарда в эксперименте // Тезисы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» Цитология -2006 -Т 48, №9-С 809
8 Гриценко В В , Власов Т Д, Давыденко В В , Матюков А А, Цупкина Н В, Пинаев Г П Влияние интрамиокардиальной трансплантации аутологичных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда // Бюл НЦССХ им А Н Бакулева - 2005 - Т 6, №5 (Приложение) - С 298
9 Ялфимов А Н, Тютин Л А, Савченко О Н, Матюков А А, Давыденко В В , Гриценко В В, Власов Т Д, Цупкина Н В, Пинаев ГП Использование ОФЭКТ с 99тТс-тетрофосмином в оценке влияния трансплантации различных типов клеток на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте // Новые технологии в ядерной медицине материалы науч конф с международным участием — СПб, 2006 - С 59-60
10 Ялфимов АН, Тютин Л А, Савченко ОН, Матюков А А, Давыденко В В , Гриценко В В , Власов Т Д, Цупкина Н В , Пинаев Г П Перфузионная томосцинтиграфия в динамической оценке влияния трансплантации различных типов клеток на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте // Невский радиологический форум "Новые горизонты" сборник научных трудов -СПб, 2007 - С 591
11 Матюков А А , Власов Т Д, Давыденко В В , Цупкина Н В , Пинаев Г П , Ялфимов А Н Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на состояние поврежденного миокарда в разные сроки после инфаркта // Стволовые клетки законодательство, исследования и инновации Международные перспективы сотрудничества Материалы Британско-российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией - М, 2007 - С 10
Подписано в печать 16 08 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел печ л 1,4 Тираж 150 экз Заказ №45
Типография Издательства СПбГУ 199061, г Санкт-Петербург, Средний пр , 41
Оглавление диссертации Матюков, Андрей Александрович :: 2007 :: Санкт-Петербург
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Основные подходы в лечении ишемической болезни сердца.
2.2. Альтернативные подходы в лечении ишемической болезни сердца.
2.2.1. Терапевтический ангиогенез.
2.2.2. Клеточная регенеративная терапия.
2.3. Клеточная терапия в кардиологии.
2.3.1. Использование фетальных кардиомиоцитов в терапии инфаркта миокарда
2.3.2. Использование скелетных миобластов в терапии инфаркта миокарда.
2.3.3. Использование эндотелиальных клеток-предшественников в терапии инфаркта миокарда.
2.3.4. Использование стволовых клеток в терапии инф аркта миокарда.
2.3.4.1. История развития учения о стволовых клетках.
2.3.4.2. Использование эмбриональных стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда.
2.3.4.3. Использование гемопоэтических стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда.
2.3.4.4. Использование мезенхимальных стромальных клеток в терапии инфаркта миокарда.
2.3.4.5. Использование ядросодержащих клеток костного мозга в терапии инфаркта миокарда.
2.3.5 Способы введения клеток.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга.
3.1.1. Получение ядросодержащих клеток костного мозга.
3.1.2. Получение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.
3.1.3. Характеристика культур мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.
3.1.4. Окрашивание клеток.
3.2. Моделирование инфаркта миокарда.
3.3. Введение клеток животным.
3.4. Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде.
3.5. Электрокардиография.
3.6.Ультразвуковое исследование сердца.
3.7. Методика оценки перфузии миокарда.
3.8. Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда
3.9. Методика измерения дилатации левого желудочка.
3.10. Гистологическое исследование.
3.11. Количественная оценка васкуляризации.
3.12. Статистическая обработка.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Сравнение способов получения ядросодержащих клеток костного мозга.
4.2. Характеристика клеток костного мозга.
4.3. Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде кролика.
4.4. Электрокардиография.
4.5. Ультразвуковое исследование сердца.
4.6. Перфузия миокарда.
4.7.Течение инфаркта миокарда у кролика.
4.8. Морфометрическая характеристика сердец кроликов.
4.9. Морфологическая характеристика миокарда.
Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Матюков, Андрей Александрович, автореферат
Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи современной медицины, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему остаются главной причиной смертности и инвалидизации населения (Беленков Ю.Н. с соавт., 2003; Шахов В.П., Попов C.B., 2004). Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе ишемии кардиомиоциты замещаются соединительной тканью (Репин B.C., Сухих Г.Т., 1998). Необратимое повреждение кардиомиоцитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности (Gaudron P. et al., 1993). Используемые в настоящее время консервативные и оперативные методы лечения ишемии миокарда не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин. Так, например, у больных с дистальным поражением и диффузными изменениями в коронарных артериях достичь реваскуляризации миокарда с помощью методов хирургической коррекции становится невозможным (Бокерия J1.A. с соавт., 2004). В связи с этим разрабатываются новые способы регенерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии (Репин B.C., 1998; Потапов И.В. с соавт., 2001; Шевченко Ю.Л., 2006). Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирургии является использование клеток костного мозга. Данный подход основан на способности клеток костного мозга участвовать в регенерации поврежденного миокарда (Шахов В.П., Попов C.B., 2004; Chachques J.S. et al., 2005). В терапии инфаркта миокарда используют различные клетки костного мозга: гемопоэтические стволовые клетки (Limbourg F.P. et al., 2005), эндотелиальные прогениторные клетки (Katritsis D.G., 2005), мезенхимальные стромальные клетки (Tang Y.L., 2005), нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга (Zhang S., 2004). Применяется как аллогенная, так и аутологичная трансплантация клеток, причем наиболее перспективным считается трансплантация аутологичных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем. Наибольшую популярность получила аутотрансплантация мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга. Растущее число экспериментальных работ демонстрирует положительный эффект трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда (Асеуеэ 1.Ь. е1 а1., 2005; Р1ао Н. е1 а1., 2005; Оао Ь.К е1 а1., 2006; Кгаг^гШ В. е1 а1., 2006; Ме1игт I. е1 а1., 2006). Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Такими являются вопрос о наиболее эффективном типе клеток и вопрос об оптимальном способе введения клеток для восстановления миокарда.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: Изучить влияние аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение острого инфаркта миокарда в эксперименте. Задачи исследования:
1. Отработать оптимальный способ получения клеток костного мозга кролика для последующей аутотрансплантации.
2. Определить местонахождение трансплантированных клеток в миокарде при различных путях введения.
3. Сравнить эффективность влияния культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда у кролика.
4. Оценить влияние трансплантации различных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда на различных сроках.
5. Изучить эффективность различных путей введения клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда.
Научная новизна.
Впервые выполнено сравнение различных способов получения клеток костного мозга.
Впервые на одной модели произведено сравнение влияния трансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга при разных путях введения на течение инфаркта миокарда у кролика.
Впервые проведена комплексная оценка морфофункционального состояния миокарда после трансплантации различных клеток костного мозга на основе использования современных инструментальных методов обследования (эхокардиографии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии).
Впервые охарактеризовано состояние миокарда в отдаленные сроки (1 год) после трансплантации клеток костного мозга.
Получены новые данные о возможности использования витального флуоресцентного красителя для идентификации трансплантированных клеток в миокарде кролика.
Разработаны параметры оценки перфузии миокарда кролика методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии.
Теоретическая и практическая значимость.
Данные, полученные в исследовании, являются теоретической основой для внедрения клеточных технологий в клиническую практику, так как обосновывают оптимальный вид клеток костного мозга и их способ введения при лечении больных с инфарктом миокарда.
Положения, выносимые на защиту:
1. Клетки костного мозга, трансплантированные интрамиокардиально, сохраняются в зоне введения в течение нескольких недель.
2. Введение культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга оказывает выраженное положительное влияние на морфофункциональное состояние миокарда в разные сроки наблюдения после коронароокклюзии.
3. Применение нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга приводит к увеличению размера зоны повреждения и ухудшению функционального состояние миокарда при экспериментальном инфаркте у кроликов.
4. Внутривенное введение клеток костного мозга не изменяет течение экспериментального инфаркта миокарда у кроликов.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005; юбилейной студенческой научной конференции, посвященной 100-летию клинической больницы Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии и 80-летию Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии «Студенческая наука - 2005», Санкт-Петербург, 2005; конкурсе бизнес-идей и научно-исследовательских разработок «Молодые. Дерзкие. Перспективные», Санкт-Петербург, 2005; научной конференции «Новые технологии в ядерной медицине», Санкт-Петербург, 2006; Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2006; XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2006; Невском радиологическом форуме «Новые горизонты», Санкт-Петербург, 2007.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Подана заявка №20006124343 (06.07.2006) на изобретение: «Способ лечения больных пороками клапанов сердца» (соавт. Давыденко В.В., Гриценко В.В.), на которую получено положительное решение (20.06.2007).
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 37 отечественных и 126 иностранных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 39 рисунками.
Заключение диссертационного исследования на тему "Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на течение инфаркта миокарда (экспериментальное исследование)"
6. выводы
1. Пункционный способ получения костного мозга у кролика имеет преимущество перед резекционным в связи с лучшим качеством и большим количеством получаемого материала, меньшей инвазивностью процедуры получения костного мозга и ее технической простотой.
2. Через 20 суток после интрамиокардиальной аутотрансплантации меченые мезенхимные стромальные клетки костного мозга и нефракционированные ядро содержащие клетки костного мозга сохранялись в миокарде; после внутривенного введения меченые клетки костного мозга в миокарде не определялись.
3. Интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры мезенхимных стромальных клеток костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда приводила к уменьшению площади зоны ишемического повреждения, нормализации показателей систолической функции сердца, а также полному восстановлению перфузии миокарда за счет стимуляции ангиогенеза.
4. Положительное влияние интрамиокардиальной трансплантации мезенхимных стромальных клеток костного мозга наблюдалось на сроках от 3 дней до 1 года после лигирования коронарной артерии у кроликов, т.е. имело стабильный и долгосрочный терапевтический эффект.
5. Интрамиокардиальная аутотрансплантация нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга сопровождалась увеличением размеров зоны ишемического повреждения и ухудшением показателей сократительной функции сердца, что сочеталось с активацией ангиогенеза и восстановлением показателей перфузии в условиях экспериментального инфаркта миокарда.
6. Внутривенная аутотрансплантация мезенхимных стромальных клеток костного мозга и нефракционированных ядросодержащих клеток костного мозга не влияла на морфофункциональное состояние миокарда и показатели его перфузии.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Интрамиокардиальная аутотрансплантация культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга может быть использована в лечении больных с острым инфарктом миокарда, а также для стимуляции ангиогенеза при ишемической болезни сердца.
2. Аутологичные нефракционированные ядросодержащие клетки костного мозга при интрамиокардиальном введении не могут применяться в острейшую фазу инфаркта миокарда.
3. Внутривенное введение различных клеток костного мозга в острейшую фазу инфаркта миокарда является нецелесообразным.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Матюков, Андрей Александрович
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство.- М.: Медицина, 1990.- 384 с.
2. Беленков Ю.Н., Агеев Ф.Т., Мареев В.Ю. и др. Стволовые клетки и их применение для регенерации миокарда // Журнал сердечная недостаточность.-2003. Т. 4, №4(20). - С.168-173.
3. Берсенев A.B. Аутогенная трансплантация клеток при ишемии нижних конечностей // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005. -№1. - С.40-43.
4. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и др. Первый опыт клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGFi65 человека // Бюллетень НЦССХ им. А.В.Бакулева РАМН. 2004. - Т.5, №4. -С.134-142.
5. Бокерия Л. А., Панченко В. Я., Беришвили И. И. и др. Трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация: опыт 230 операций // Тихоокеанский мед. жур. -2003. Т 1, № 11.-С.5-10.
6. Бокерия Л.А., Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили С.Т., Камардинов Д.Х. Первый опыт применения стволовых клеток костного мозга для регенерационной терапии ишемической болезни сердца // Кардиология. — 2004. Т.44, №9. - С. 16-22.
7. Бокерия Л.А., Беришвили И.И., Бузиашвили Ю.И., Сигаев И.Ю. Трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация. — М.: Медицина, 2001. -142с.
8. Быков В.Л. Цитология и общая гистология: Функциональная морфология клеток и тканей человека. СПб.: СОТИС, 1998. -520 с.
9. Вермель А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике // Клиническая медицина. 2004. - №1. — С.5-11.
10. Давыденко В.В., Мачс В.М. тимулированный ангиогенез новое направление в лечении при ишемических состояниях // Вестн. хрургии. - 2000. -Т. 159, №1 — С.117-120.
11. Давыденко В.В., Мачс В.М., Томсон В.В. и др. Возможность стимуляции ангиогенеза при ишемии препаратом эмриональной мозговой ткани человека: первые экспериментальные результаты // Вестн. хрургии. 2001. - Т. 160, №5 -С.37-40.
12. Деев Р.В. Отечественный опыт изучения эффективности метода «клеточной кардиомиопластики» в эксперименте // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. -№1.- С. 17-18.
13. Дыбан А.П. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине // Медицинский академический журнал. 2002. - Т.2, №3. - С.3-24.
14. Козлов В.А., Смолянинов А.Б., Козлов К.Л., Кириллов Д.А. Аутологичная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток в терапии инфаркта миокарда // Бюллетень НИИ кардиологии им. В.А. Алмазова. 2005. - Т.Ш, №1. - С.36.
15. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Аминева Х.К. и др. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта // Цитология. 2005. - Т.47, №5. - С.404-416.
16. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Аминева Х.К. и др. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток // Цитология. 2004. - Т.46, №12. -С.1043-1054.
17. Куртова A.B., Зуева Е.Е., Немков A.C. Постинфарктная клеточная регенерационная терапия сердечной мышцы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. - №2 (4). - С.35-43.
18. Махнев Д. А. Имплантация эмбриональных кардиомиоцитов в хирургической болезни сердца (экспериментальное исследование): Автореф. дис. канд. мед. наук. СПб., 1999. - 22с.
19. Полежаев J1.B. Состояние проблемы регенерации мышцы сердца // Успехи современной биологии. 1995. - Т.115. - С.198-212.
20. Потапов И.В., Онищенко H.A., Крашенинников М.Е. Клеточная кардиомиопластика (аналитический обзор). — Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. - №2. - с. 46-53.
21. Потапов И.В. Клеточная кардиомиопластика аутогенными клетками костного мозга итоги трех рандомизированных клинических испытаний // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. — Т. II, №1. - С.2223.
22. Репин B.C. Праматерь всех клеток // Наука и жизнь. 2001. - №10. - С15-22.
23. Репин B.C. Эмбриональная стволовая клетка: у истоков лабораторной жизни // Отечественные записки. 2002. - №7. - С.36-3-40.
24. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ, 1998. -250с.
25. Репин B.C. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1998. - Т. 126 (приложение 1) . - С.14-28.
26. Свищев A.B., Черняев A.JL, Журавлев Н.В. Корреляционный анализ органометрических параметров сердца в норме и патологии // Архив патологии. 1979. -№35.-С.24-29.
27. Фрейдлин И.С. Цитокины и межклеточные контакты в противоинфекционной защите организма // Соров. образов, журн. 1996. - № 7.- С.9-25.
28. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М.: Медицина, 1980. - 216с.
29. Шахов В.П., Афанасьев С.А., Попов C.B., Свиридов И.Н. Общие принципы специфической и неспецифической кардиомиопластики с помощью современных клеточных технологий // Бюллетень НИИ кардиологии им. В.А. Алмазова. 2005. - T.III, №1. - С.37-38.
30. Шахов В.П., Попов C.B. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. Томск: STT, 2004. - 170с.
31. Шевченко Ю.Л. Медико-биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии. СПб.: «Наука», 2006. -288с.
32. ШевченкоЮ.Л. Клеточные технологии в кардиологии // Вестник РАМН. -2003. №11. - С.6-10.
33. Шумаков В.И., Онищенко H.A., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов // Вестн. трансплантологии и искусств, органов. 2002.- №4. С.46-53.
34. Aceves J.L., Archundia A., Diaz G. et al. Stem cell perspectives in myocardial infarctions // Rev Invest Clin. 2005. - Vol.57, №2. - P.156-162.
35. Al-Khaldi A. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model //Ann Thorac Surg. -2003. Vol.75, №1. - P.204-209.
36. Asakura A. Stem cells in adult skeletal muscle // Trends Cardiovasc. Med.- 2003. №13. -P.123-128.
37. Assmus B., Schachinger V., Teupe C. et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI) // Circulation. 2002. - Vol.10. - №106. - P.3009-3017.
38. Azarnoush K., Maurel A., Sebbah L. et. al. Enhancement of the functional benefits of skeletal myoblast transplantation by means of coadministration of hypoxia-inducible factor lalpha // J Thorac Cardiovasc Surg. 2005. - Vol.30, №1. -P.173-179.
39. Balsam L.B., Wagers A.J., Christensen J.L. et al. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium // Nature.- 2004. -Vol428, №.8 P.668-673.
40. Battegay, EJ. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects // Mol Med. 1995. - №73. - P.333-346.
41. Blankesteijn W. M., Creemers E Lurgens E . et al. Dynamics of cardiac wound healing following myocardial infarction: observations in genetically altered mice //Acta Physiol Scand. -2001. №173. -P.75-82.
42. Blocklet D., Toungouz M., Berkenboom G. et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection // Stem Cells. 2006. - Vol. 24, №2. - P.333-336.
43. Chachques J.S., Salanson-Lajos C., Lajos C. et al. Cellular cardiomyoplasty for myocardial regeneration // Asian Cardiovasc Thorac Ann. 2005. - Vol.13, №3. -P.287-296.
44. Chen S.L., Fang W.W., Qian J. et al. Improvement of cardiac function after transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in patients with acute myocardial infarction // Chin Med J (Engl). 2004. - Vol.117, №10. - P. 14431448.
45. Cheng X., Liao Y.H, Li B. et al. Changes of rat lymphocyte proliferation and cytotoxic activity after acute myocardial infarction in vitro // Chin J Pathophysiol. -2005. Vol.21, №9. - P. 1848-1850.
46. Cheng X., Liao Y.H., Ge H.X. et al. Thl/Th2 functional imbalance after acute myocardial infarction: coronary arterial inflammation or myocardial inflammation // J Clin Immunol. 2005. - Vol.25, №3. - P.246-253.
47. Dai W., Hale S., Kloner R Stem cell transplantation for the treatment of myocardial infarction // Transpl Immunol. 2005. - Vol.45, №5. - P. 1123-1130.
48. De Carlo M., Milano A. D., Pratali S. et al. Symptomatic improvement after transmyocardial laser revascularization. How long does it last? // Ann. Thorac. Surg. 2000. - Vol.70. - P.l 130-1133.
49. Deng Z.R., Yang C., Ma A.Q. et al. Dynamic changes of plasma VEGF, SDF-1 and peripheral CD34+ cells in patients with acute myocardial infarction // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2006. - Vol.26, №11). - P.637-640.
50. Deten A., Volz H.C., Clamors S. et al. Hematopoietic stem cells do not repair the infarcted mouse heart // Cardiovasc Res. 2005. - Vol.65, №1. - P.52-63.
51. Dobaczewski M., Bujak M., Zymek P. et al. Extracellular matrix remodeling in canine and mouse myocardial infarcts // Cell Tissue Res. 2006. - Vol.324, №3. -P.475-488.
52. Eglitis M.A., Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - Vol.94. -P.4080-4085.
53. Ehrin J. Armstrong, David A. Morrow and Marc S. Sabatine Inflammatory Biomarkers in Acute Coronary Syndromes: Part I: Introduction and Cytokines // Circulation. 2006. - Vol.113. - P.72-75.
54. Eliopoulos N., Al Khaldi A., Beausejour C.M. et al. Human cytidine deaminase as an ex vivo drug selectable marker in gene-modified primary bone marrow stromal cells // Gene Ther. 2002. - № 9. - P.452- 462.
55. Elmadbouh I., Haider H.Kh., Jiang S. et al. Ex vivo delivered stromal cell-derived factor-1 alpha promotes stem cell homing and induces angiomyogenesis in the infarcted myocardium // J Mol Cell Cardiol. 2007. - Vol.42, №4. - P.792-803.
56. Ertl G., Frantz S. Healing after myocardial infarction // Cardiovascular Research. -2005. Vol.66.-P.22-32.
57. Eryilmaz S., Inan M. B., Eren N. T. et al. Coronary endarterectomy with offpump coronary artery bypass surgery // Ann. Thorac. Surg. — 2003. -Vol. 75, №3. -P.865-869.
58. Foley A., Mercola M. Heart induction: embriology to cardiomyocyte regeneration // Trends Cardiovasc. Med. -2004. -№14. -P.121-125.
59. Frangogiannis N.G., Entman M.L. Chemokines in myocardial ischemia // Trends Cardiovasc Med. 2005. - Vol.15, №5. - P. 163-169.
60. Frangogiannis N.G., Smith C.W., Entman M.L. The inflammatory response in myocardial infarction // Cardiovasc Res. 2002. - Vol.53. - P.31 - 47.
61. Frantz S., Ducharme A., Sawyer D. et al. Targeted deletion of caspase-1 reduces early mortality and left ventricular dilatation following myocardial infarction // JMCC. 2003. - Vol.35. - P.685-694.
62. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I. et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues // Transplantation. 1968. - Vol.2, № 6. - P.230-247.
63. Gaudron P., Eilles C., Kugler I. Progressive left ventricular dysfunction after myocardial infarction // Circulation. 1993. - Vol.87. - P.755-762.
64. Ge J., Li Y., Qian J. et al. Efficacy of Emergent Transcatheter Transplantation of Stem Cells for Treatment of Acute Myocardial Infarction (TCT-STAMI) // Heart. -2006. Vol.14, №6. - P.46-59.
65. Graham M. M., Chambers R.J., Davies R. F. Angiographic quantification of diffuse coronary artery disease: reliability and prognostic value for bypass operations //J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999. - Vol.118, №4. - P. 618-627.
66. Hartman R., Whittaker P. The physics of transmyocardial laser revascularization //J. Clin. Laser. Med. Surg. 1997. - Vol.15, №6. - P.255-259.
67. Haunstetter A., Izumo, S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease // Circ Res. 1998. - Vol.82. -P.l 111-1129.
68. Hofmann M., Wollert K.C.,Meyer G.P. et al. Monitoring of bone marrow cell homing into the infarcted human myocardium // Circulation. 2005. - Vol.111, №3. - P.2198-2202.
69. Huang R.C., Yao K., Zou Y.Z. et al. Long term follow-up on emergent intracoronary autologous bone marrow mononuclear cell transplantation for acute inferior-wall myocardial infarction // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006. - Vol.86, №25.-P.l 107-1110.
70. Huss R. Perspectives on the morphology and biology of CD34- negative stem cells. // J Hematother Stem Cell Res. 2000. - №9. - P.783-793.
71. Ianus A., Holz G.G., Theise N.D. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion // J Clin Invest. 2003. - Vol.111.-P.843-850.
72. Jackson K.A., Majka S.M.,Wang H. et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells // J Clin Invest. 2001. -Vol.107. -P.1395-1402.
73. Jordan, J.E., Zhao, Z.Q., Vinten-Johansen, J. The role of neutrophils in myocardial ischemia-reperfusion injury. // Cardiovasc Res. 1999. - Vol.43. - P.860-878.
74. Kahn J., Byk T., Jansson-Sjostrand L. et al. Overexpression of CXCR4 on human CD34" progenitors increases their proliferation, migration, and NOD/SCID repopulation // Blood 2004. - Vol.103. - P.2942-2949.
75. Kajstura J., Cheng W., Reiss K. et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats // Lab Invest. 1996. Vol.74.-P.86-107.
76. Kalka C., Masuda H., Takahashi T. et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization // Proc Natl Acad Sei USA. 2000. - Vol.97. - P.3422-3427.
77. Kan I., Melamed E., Offen E. Integral therapeutic potential of bone marrow mesenchymal stem cells // Curr. Drug. Targ. 2005. - №6. - P.31 -41.
78. Kang W.J., Kang H.J., Kim H.S. et al. Tissue Distribution of 18F-FDG-Labeled Peripheral Hematopoietic Stem Cells After Intracoronary Administration in Patients with Myocardial Infarction // J Nucl Med. 2006. - Vol.47, №8. - P. 1295-1301.
79. Karpov R.S., Popov S.V., Markov V.A. et al. Autologous mononuclear bone marrow cells during reparative regeneratrion after acute myocardial infarction // Bull Exp Biol Med. 2005. - Vol.140, №5. - P.640-643.
80. Katritsis D.G., Sotiropoulou P.A., Karvouni E. et al. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infarcted human myocardium // Catheter Cardiovasc Interv. 2005. - Vol. 65, №3.-P.321-329.
81. Kawamoto A., Gwon H.C., Iwaguro H. et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia // Circulation. 2001. - Vol.103, №5.-P.634-637.
82. Kawamoto A., Asahara T., Losordo D.W. et al. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization// Cardiovasc Radiat Med. 2002. -№3. -P.221-225.
83. Kawamoto A., Tkebuchava T., Yamaguchi J. et al. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia // Circulation. 2003. - Vol. 107, №3. -P.461-468.
84. Kessler P.O., Byrne B.J. Myoblast cell grafting into heart muscle: cellular biology and potential application // Annu. Rev. Physiol. 1999. - Vol. 61. - P.219-242.
85. Kocher A.A, Schuster M.D., Szabolcs M.J. et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function // Nat Med. 2001. -№7. -P.430 -436.
86. Krause U., Harter C., Seckinger A. et al. Intravenous delivery of autologous mesenchymal stem cells limits infarct size and improves left ventricular function in the infarcted porcine heart // Stem Cells Dev. 2007. - Vol. 16, №1. - P.31-37.
87. Krausgrill B., Schwinger R.H., Muller-Ehmsen J. Mesenchymal stem cells for cardiac regeneration // Med Klin (Munich). 2006. - Vol. 101, №22 (Suppl 1). -P.202-206.
88. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo // Nature Med. 2000. - №6. - P. 12291234.
89. Lee M.S., Makkar R.R. Stem-cell transplantation in myocardial infarction: a status report // Ann. Intern. Med. 2004. - Vol.140, №9. - P.729-737.
90. Liao Y., Cheng X. Autoimmunity in myocardial infarction // International Journal of Cardiology. -2007. №1. -P.128-136.
91. Limbourg F.P., Ringes-Lichtenberg S., Schaefer A. et al. Haematopoietic stem cells improve cardiac function after infarction without permanent cardiac engraftment // Eur J Heart Fail. 2005. - №7. - P.722-729.
92. Luttun A., Carmeliet G., Carmeliet P. Vascular progenitors: from biology to treatment // Trends Cardiovasc Med. 2002. - №12. - P.88-96.
93. Marthur A., Martin J.F. Stem cells and repair the heart // Lancet. 2004. - Vol. 364. -P.183-192.
94. Martin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. - № 78. - P.7634-7638.
95. Masuya M., Drake C.J., Fleming P.A.et al. Hematopoietic origin of glomerular mesangial cells //Blood. -2003. Vol.101. -P.2215-2218.
96. Matsumoto R., Omura T., Yoshiyama M. et. al. Vascular endothelial growth factor-expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. - Vol.25, №6. -P.1168-1173.
97. Menard C., Hagege A.A., Agbulut O. et al. Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study // Lancet. 2005. - Vol.366(9490). - P. 1005-1012.
98. Menasche P. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction // J Am Coll Cardiol. 2003. - №41. -P.1078-1083.
99. Min J.Y., Huang X., Xiang M. et al. Homing of intravenously infused embryonic stem cell-derived cells to injured hearts after myocardial infarction // J Thorac Cardiovasc Surg. 2006. - Vol.131, №4. - P.889-897.
100. Min J.Y., Yang Y., Sullivan M.F. et al. Long-term improvement of cardiac function in rats after infarction by transplantation of embryonic stem cells // J Thorac Cardiovasc Surg. -2003. Vol.125, №2. -P.361-369.
101. Min J.Y., Yang Y., Converso K.L. et al. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats // J Appl Physiol. 2002. - Vol. 92, №1. -P.288-296.
102. Mocini D., Staibano M., Mele L. et al. Autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients undergoing coronary artery bypass grafting // Am Heart J. 2006. - Vol. 151, № 1. - P. 192-197.
103. Murry C.E., Soonpaa M.H., Reinecke H. et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts // Nature. 2004. -Vol.428(6983). -P.664-668.
104. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S.et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium // Nature. 2001. - Vol.410. - P.701-705.
105. Pagani F.D., Baker L.S., Hsi C. et al. Left ventricular systolic and diastolic dysfunction after infusion of tumor necrosis factor-alpha in conscious dogs // J Clin Invest. 1992. - №90. - P.389- 398.
106. Parissis J.T., Adamopoulos S., Venetsanou K.F. et al. Serum profiles of C-C chemokines in acute myocardial infarction: possible implication in postinfarction left ventricular remodeling // J Interferon Cytokine Res. 2002. - Vol.22, №2. - P.223-229.
107. Perin B.C. Stem cell therapy for cardiovascular disease // Tex Heart Inst J.-2006. Vol.33, №2. - P.204-208.
108. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells // Science. 1999. - Vol.284. - P.l 168-1170.
109. Piao H., Youn T.J., Kwon J.S. et al. Effects of bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation in acutely infarcting myocardium // Eur J Heart Fail. 2005. - №7. - P.730-738.
110. Pittenger M.F., Martin B.J., Finkel T. Mesenchymal Stem Cells and Their Potential as Cardiac Therapeutics // Circ. Res. 2004. - Vol.95, №1. - P.9-20.
111. Rafii S., Heissig B., Hattori K. Efficient mobilization and recruitment of marrow-derived endothelial and hematopoietic stem cells by adenoviral vectors expressing angiogenic factors // Gene Ther. 2002. - №9. - P.631-641.
112. Ren G., Dewald O., Frangogiannis N.G. Inflammatory mechanisms in myocardial infarction // Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2003. -№2. - P.242-256.
113. Reyes M., Lund T., Lenvik T. et al. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells // Blood. 2001. - Vol. 98. -P.2615-2625.
114. Sakakibara Y., Tambara K., Sakaguchi G. et al. Toward surgical angiogenesis using slow-released basic fibroblast growth factor // Eur. J. Cardiothorac. Surg. -2003. -Vol.24, №1. P. 105-111.
115. Schenk S., Mal N., Finan A. et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor // Stem Cells. 2007. - Vol. 25, №1. -P.245-251.
116. Schachinger V., Assmus B., Britten M.B. et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial // J Am Coll Cardiol. 2004. - Vol.19, №8. -P.1690-1699.
117. Shake J.G., Gruber P.J., Baumgartner W.A. et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects // Ann Thorac Surg. 2002/ - №73. -P.1919-1926.
118. Siepe M., Heilmann C., Samson P. et al. Stem cell research and cell transplantation for myocardial infarction // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005. - №28. -P. 18-24.
119. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans //Circulation. 2002. - Vol.106, №15. - P. 1913-1918.
120. Szmitko P.E., Fedak P.W., Weisel R.D. et al. Endothelial progenitor cells: new hope for a broken heart // Circulation. 2003. - Vol.107. - P.3093-3100.
121. Takashi E., Ashraf M. Pathologic assessment of myocardial cell necrosis and apoptosis after ischemia and reperfusion with molecular and morphological markers // J Mol Cell Cardiol. 2000. - №32. - P.209 -224.
122. Tang Y.L., Zhao Q., Zhang Y.C. et al. Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium // Regul Pept. 2004. - Vol.117, №1. - P.3-10.
123. Tang Y.L., Zhao Q., Qin X. et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction // Ann Thorac Surg. 2005. - Vol.80, №1. - P.229-236.
124. Tang Y.L. Autologous mesenchymal stem cells for post-ischemic myocardial repair 11 Methods Mol Med. 2005. - №112. - P. 183-192
125. Taylor D.A. Cell-based myocardial repair: how should we proceed? // Int. Cardiol. 2004. - №95 (Suppl). - P.8-12.
126. Tomanek R.J., Schatteman G.C. Angiogenesis: new insights and therapeutic potential // Anat Ree. 2000. - Vol.261. - P.126 -135.
127. Thomson J. A., Itskovitzeldor J., Shapiro S. S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. - Vol.282. - P.l 145-1147.
128. Ulrich M.M., Janssen A.M., Daemen M.J. et al. Increased expression of ©bronectin isoforms after myocardial infarction in rats // J Mol Cell Cardiol. 1997. - Vol.29.-P.2533-2543.
129. Urbich C., Dimmeier S. Endothelial progenitor cells: functional characterization // Trends Cardiovasc. Med. 2004. - Vol. 14, №8. -P.318-322.
130. Vandervelde S., Luyn M.J., Tio R.A. et. al. Signaling factors in stem cellmediated repair of infarcted myocardium // Mol Cell Cardiol. 2005. - Vol. 39, №2. -P.363-376.
131. Waksman R., Fournadjiev J., Baffour R. et al. Transepicardial autologous bone marrow-derived mononuclear cell therapy in a porcine model of chronically infarcted myocardium // Cardiovasc Radiat Med. 2004. - №5. - P. 125-131.
132. Wang J.A., Fan Y.Q., Li C.L. et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplanted into damaged rabbit heart to improve heart function // J Zhejiang Univ Sei B. 2005. - №4. - P.242-248.
133. Wang Y., Haider H.Kh., Ahmad N. et al. Evidence for ischemia induced host-derived bone marrow cell mobilization into cardiac allografts // J Mol Cell Cardiol. -2006.- Vol.41, №3. P.478-487.
134. Willems I.E., Arends J.W., Daemen, M.J. Tenascin and fibronectin expression in healing human myocardial scars // J Pathol. 1996. - №179. - P.321-325.
135. Wollert K.C., Meyer G.P., Lotz J. et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial // Lancet. 2004. - Vol.364(9429). - P.141-148.
136. Yamamoto N., Kohmoto T., Gu A. et al. Angiogenesis is enchanced in ischemic canine myocardium by transmyocardial laser revasculari-zation // J. Amer. Coll. Cardiol. 1998. - Vol.31. - P. 1426-1433.
137. Yeh E.T., Zhang S., Wu H.D et al. Transdifferentiation of human peripheral blood CD34+-enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells in vivo // Circulation. 2003. - Vol. 108. - P.2070-2073.
138. Yoon J., Min B.G., Kim Y.H. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model // Acta Cardiol. 2005. - Vol.60. - P.277-284.
139. Zhang G., Nakamura Y., Wang X. et al. Controlled Release of Stromal Cell-Derived Factor-1 alpha In situ Increases C-kit+ Cell Homing to the Infarcted Heart // Tissue Eng. 2007. - № 22. - P.1236-1244.
140. Zhang J., Chen J., Liao Y.H. et al. Myocardial inflammation and remodeling driven by cardiac myosin specific-T lymphocytes // J Hong Kong Coll Cardiol. -2005. №13. — P.130.
141. Zhang S., Jia Z., Ge J. et al. Purified human bone marrow multipotent mesenchymal stem cells regenerate infarcted myocardium in experimental rats // Cell Transplant. 2005. -№10. -P.787-798.
142. Zhang S., Zhang P., Guo J. et al. Enhanced cytoprotection and angiogenesis by bone marrow cell transplantation may contribute to improved ischemic myocardial function // Eur J Cardiothorac Surg. 2004. - №2. - P. 188-195.
143. Zhang S., Jia Z., Guo J. et al. Transplantation of bone marrow cells upregulated vascular endothelial growth factor and its receptor and improved ischemic myocardial function // Beijing Da Xue Xue Bao. 2003. - Vol.35, №4. - P.429-433.
144. Zhang S., Guo J., Zhang P. et al. Long-term effects of bone marrow mononuclear cell transplantation on left ventricular function and remodeling in rats // Life Sci. 2004. - Vol.74, №23. -P.2853-2864.
145. Zhang Y.M., Hartzell C., Narlow M. et al. Stem cells derived cardiomyocytes demonstrate arrythmic potential // Circulation. -2002. Vol.106, №10. - P.1294-1299.