Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Влияние апелина на сократимость миокарда при сердечной недостаточности в эксперименте и определение его диагностической и прогностической ценности у больных с хронической сердечной недостаточностью

На правах рукописи

Лакомкин Сергей Владимирович

ВЛИЯНИЕ АПЕЛИНА НА СОКРАТИМОСТЬ МИОКАРДА ПРИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ.

14.01.05 - кардиология 03.03.01 — физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 АПР 2015

Москва - 2015

005567711

005567711

Работа выполнена в отделе заболеваний миокарда и сердечной недостаточности НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова и в лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Терещенко Сергей Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Капелько Валерий Игнатьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор в.н.с. лаборатории клинической кардиологии ФГБУН НИИ физико-химической

медицины ФМБА России Явелов Игорь Семёнович

доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной физиологии

РУДН Северин Александр Евгеньевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Защита состоится « 4 » июня 2015 года в 1330 на заседании диссертационного ученого совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения РФ по адресу: 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д.

15 А.

V на саХге.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Полевая Татьяна Юльевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ап-12-0 и Ап-12-2 - апелины (природный и еинтетаческий пептид второй модификации)

APJ - рецептор к апелииу

AT, - рецептор к ангиотеизину II первого типа

АЦП - аналого-цифровой преобразователь

BNP - мозговой натрийуретический пептид

NT-proBNP - N-терминальный фрагмент мозгового натрийуретического пропептида САД - среднее артериальное давление САС - симпато-адреналовая система

СД (СДЛЖ) - систолическое давление в левом желудочке сердца

СН - сердечная недостаточность

СУЗС - степень утолщения задней стенки

ДД (ДДЛЖ) - диастолическое давление в левом желудочке сердца

ДКМП - дилатациониая кардиомиопатия

ДПП (PEP) - длительность периода предизгнаиия

ДЛИ (DEP) - длительность периода изгнания

dP/dtma„/P - максимальная скорость нарастания давления в ЛЖ отнесённая к давлению при

котором она достигается (индекс сократимости Верагута) иАПФ - ингибитор ангиотензин-превращающего фермента ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЗО - изопротеренол (синтетический агонист Р-адренорецептора)

ИКГ - тетраполярная импедансная кардиография

КДО - конечно-диастолический объем

КСО - конечно-систолический объем

LV-CR-Exp - экспоненциальная константа расслабления

МКМ - микроманометр (внутрисосудистый Милларовский катетер)

МОК - минутный объём крови

МРТ - магнитно-резонансная томография

МСКТ - мультиспиральная компьютерная томография

ОКС — острый коронарный синдром

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения

РААС - ренин-ангиотензин-альдостероновая система

Ss и Sd — площадь поперечного сечения ЛЖ в систолу и диастолу (см2)

ТЭЛА - тромбоэмболия легочной артерии

VTI - интеграл линейной скорости кровотока (см)

ФВ - фракция выброса сердца (%)

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

ХСН — хроническая сердечная недостаточность

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) является исходом многих

сердечно-сосудистых заболеваний. По данным исследований ЭПОХА-ХСН и MONICA распространенность ХСН в популяции достигает 7% (Агеев Ф.Т. и др., 2010). За последние десятилетия произошёл кардинальный пересмотр тактики лечения сердечной недостаточности, стали широко применяться бета-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ) и антагонисты альдостерона, которые влияют непосредственно на патогенез болезни, блокируя ренин-ангиотензин-альдостероновую (РААС) и симпато-адреналовую (САС) системы. Несмотря на это, пятилетняя выживаемость больных с III-IV ФК ХСН остается низкой (25% у мужчин и 38% у женщин) (Терещенко С.Н. и др., 1999, Bonneaux L. и др.) и проблемы её лечения при громадных экономических затратах (100 млрд. долларов в США и Европе ежегодно (Rosamond W., 2007)) далеки от разрешения. Не так давно возникло понятие «диастолическая сердечная недостаточность», которая, как правило, требует отдельных подходов к лечению. Также значимо изменились принципы диагностики СН, в арсенале врачей появились эхокардиография (ЭхоКГ), MPT, МСКТ. Вместе с тем клиницистам необходимы надежные и дешевые биомаркеры, способные определить тяжесть и исход заболевания.

Сейчас для этих целей используются мозговой натрийуретический пептид (BNP) и его N-терминальный фрагмент (NT-proBNP). Хотя эти маркёры обладают высокой чувствительностью, они не лишены важных недостатков. Во-первых, их отличает низкая специфичность, зависимость от функции почек, пола, возраста и др. Во-вторых, у BNP и NT-proBNP есть «серая зона», которая мешает достоверно интерпретировать их показатели. В-третьих, эти пептиды не дают точный прогноз выживаемости больных с ХСН. Всё это заставляет учёных искать новые маркёры, и сейчас активно изучаются такие вещества, как эндотелии-1, тропонины, хромогранин, адипонектин, растворимый ST2-рецептор, матриксные металлопротеиназы, остеопрогерин, белки-лектины, апелин и другие.

Биомаркёры чаще всего задействованы в патологических цепях развития ХСН и поэтому, помимо диагностических свойств, могут рассматриваться в качестве мишеней для терапии или непосредственно являться лекарственными средствами. Это особенно актуально в связи с тем, что существующая патогенетическая терапия ХСН себя исчерпала и необходим поиск новых, желательно безвредных для организма, лекарственных препаратов. Пептид апелин является одним из таких средств. Изначально

он синтезируется во множестве тканей из 77-членного пропептида, который под действием пептидаз делится на более мелкие фрагменты. Высокий уровень пептида обнаружен в тканях сердечно-сосудистой системы. Как было показано, его концентрация в крови менялась на различных стадиях ХСН, в связи с чем проводились попытки использовать апелин как биомаркёр. У апелина есть специфический рецептор APJ, а систему апелин-APJ рассматривают как антагонист системы ангиотензин II - ATj. Пептид является гипотензивным агентом. Недавно было открыто его положительное инотропное действие как на изолированных препаратах, так и на целом организме у животных и человека (Ashley Е.А., 2005 и Japp A.G., 2010). Некоторые исследователи считают его одним из самых мощных инотропных агентов (Szokodi I., 2002 и Maguire J., 2009). Поскольку апелин синтезируется в организме, он обладает малой токсичностью. Опираясь на эти данные, мы решили изучить свойства апелина как маркёра ХСН у людей, создать искусственные модификации пептида, обладающие большей устойчивостью in vivo, и попытаться использовать их для лечения сердечной недостаточности у животных.

Цель работы

Изучить диагностическую и прогностическую ценность концентрации пептида апелина в плазме крови больных ХСН при дилатационной кардиомиопатии и ИБС различных функциональных классов. Оценить влияние апелина-12 и его синтетических аналогов на сократимость миокарда на модели сердечной недостаточности у животных, вызванной изопротеренолом.

Задачи исследования

1. Оценить диагностическую и прогностическую ценность концентрации апелина-12 в крови больных ХСН при ИБС и ДКМП, провести сравнение с другими биомаркёрами ХСН (галектин-3, NT-proBNP и тропонин Т).

2. Изучить действие апелина-12 и его 4-х синтетических аналогов на сократительную функцию сердца неинвазивными (эхокардиография и импедансная кардиография) и инвазивным (катетеризация желудочка сердца Милларовским катетером) методами у здоровых животных.

3. Изучить кардиотропное действие апелина-12 на катехоламиновой модели сердечной недостаточности и отобрать его наиболее эффективный синтетический аналог.

4. Оценить возможность использования неинвазивного метода импедансной кардиографии у животных для оценки сократимости сердца.

Научная новизна

Впервые определено прогностическое значение уровней апелина-12 у больных с ХСН ишемической этиологии и при дилатационной кардиомиопатии различных функциональных классов.

Впервые было показано, что апелин-12 не является маркёром тяжести сердечной недостаточности у больных с ХСН при ДКМП и ИБС.

Впервые были установлены различия в кардиотропном действии апелина-12 и его аналогов, зависящие от способа модификации молекулы. Выяснено, что гипотензивный эффект апелина-12 обусловлен наличием аргинина на Ы-конце молекулы, а замена метионина на норлейцин позволяет снизить эффективную дозу в 6 раз.

Впервые установлено, что модификация молекулы апелина-12 посредством замены аргинина на метиларгинин и метионина на норлейцин (апелин-12-2) оказывает более выраженное кардиотропное действие на сердца животных с ХСН, чем апелин-12. У здоровых животных оно проявлялось улучшением сократимости, а у больных -преимущественным увеличением расслабления миокарда и сопровождалось улучшением гемодинамики.

У крыс впервые была доказана адекватность метода неинвазивной тетраполярной импедансной кардиографии в хроническом опыте для оценки сократимости миокарда на основе сопоставления с катетеризацией сердца и эхокардиографией.

Практическая значимость

Показано, что апелин-12 не является эффективным диагностическим и прогностическим маркером ХСН, вызванной ИБС или ДКМП.

В результате изучения апелина-12 и его 4 синтетических модификаций был отобран аначог апелин-12-2, который обладал наиболее сильным кардиотоническим эффектом. Его действие на сердце было более выражено по сравнению с природным пептидом как у здоровых крыс, так и животных с ХСН. Эти данные позволяют рекомендовать апелин-12-2 для дальнейшей разработки препарата в качестве лекарственного средства лечения ХСН.

Внедрение

Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу лаборатории экспериментальной патологии сердца НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» Минздрава России. На основании полученных результатов эффективности синтетического пептида апелина-12-2 в настоящее время проводятся доклинические исследования данной молекулы в ИЭК «РКНПК».

Апробация работы

Материалы доложены на межотделенческой конференции НИИ клинической кардиологии им. A.JI. Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ по апробации кандидатских диссертаций 02.02.2015 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Материалы работы были доложены и обсуждены на конференциях European conference on heart failure (2012 - Белград; 2013 - Лиссабон; 2014 - Афины), European cardiology congress (2013 - Амстердам), Возможности современной кардиологии в рамках модернизации (2013 - Москва).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 239 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Работа содержит 12 таблиц и 28 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Набор больных осуществляли на базе клинических отделений ФГБУ РКНПК МЗ РФ. В протокол было включено 108 больных (77 мужчин и 32 женщины) в возрасте от 23 до 82 лет (средний возраст 56 лет) с ИБС или ДКМП и развившейся на этом фоне ХСН 1-4 ф.к. по NYHA. У 14 больных ФВ была более 45%, у 94 пациентов менее 40%. Средняя ФВ составила 32,2±8,63%. Характеристика обследованных пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика больных, включённых в исследование.

ФК XCII I II III IV всего

ИБС ДКМП ИБС ДКМП ИБС ДКМП ИБС ДКМП

пол (М/Ж) 6/6 8/1 12/3 12/5 20/7 5/2 5/2 9/5 77/31

Возраст 58,5±94 44,8*9,3 58,2±И,7 44,8±13,5 62,6±11,5 48,9±12,6 69,8±6,5 50,1±153 56,5± 13,9

ИМТ 29,2±4,8 28,3±3,6 29,0±6,2 30,4±5,0 28,9±4,8 26,9±2,5 26,3±4,2 25,7±4,0 28,5± 4,8

Курение (да/нет) 5/7 3/6 11/4 9/8 14/13 2/5 4/10 3/4 51/57

В день поступления у больных проводили забор крови на биомаркёры, а также ЭхоКГ с оценкой систолической и диастолической функции. Телефонный мониторинг пациентов или их родственников осуществляли через один год после включения в исследование с оценкой конечных точек. За конечную точку принимали смерть пациента или госпитализацию по поводу ХСН (рис. 1).

Рисунок 1. Дизайн клинического исследования

ФК: О II III IV I || Hl IV

В протокол не включали пациентов с тяжёлыми сопутствующими соматическими патологиями (печёночная и почечная недостаточность, онкологические и ревматологические заболевания, ХОБЛ II ст. и выше, хронические гепатиты), а также лиц, перенесших в течение последних 3 месяцев ОНМК, ТЭЛА или ОКС. Из работы исключали пациентов, причина ХСН которых не была связана с ДКМП или ИБС (тяжёлые клапанные пороки, перикардиты, гипертоническое сердце и т.п.), и больных с тиреотоксикозом или сахарным диабетом.

Группа контроля состояла из 40 человек (17 мужчин и 23 женщины) и условно разделялась на две подгруппы: от 18 до 35 лет (25 человек, средний возраст 26±2,7) и старше 35 лет (15 человек, средний возраст 57,5±9,7).

Забор крови. Образцы крови забирали у больных натощак сразу после поступления в стационар и осмотра лечащим врачом до назначения медикаментозной, в т.ч. внутривенной диуретической, терапии. 10 мл крови из локтевой вены помещали в пробирку, содержащую раствор ЭДТА (из расчёта 2 мг/мл крови). Пробирку центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 3500 об/мин при температуре +4° С. Надосадок в объёме 0,5 мл разливали в отдельные пробирки типа Eppendorf. Аликвоты замораживали и хранили при температуре -70°С не более 1 месяца с момента взятия крови.

Определение концентрации биомаркеров осуществляли в Отделе нейрогуморальных и иммунологических исследований НИИ кардиологии им. А.Л.

Мясникова РКНПК. Использовались наборы: Enzyme Immunoassay Kit for Apelin-12 (Phoenix Pharmaceuticals, США), Human Galectin-3 Platinum Elisa (eBioscience, США), proBNP II и Troponin T hs (Roche, Швейцария).

Эхокардиографическое исследование пациентов проводили на приборе Philips iE33 с фазированным секторным кардиологическим датчиком S5-1. Определяли конечно-систолический (КСО, мл) и конечно-диастолический (КДО, от) объемы ЛЖ с расчетом ФВ (%). Структуры сердца визуализировали при «В»- и «М»-режимах сканирования по общепринятой методике. Для количественной оценки объемных показателей сократимости сердца применяли метод Симпсона. Диастолическую функцию ЛЖ оценивали по результатам исследования трансмитрального диастолического кровотока в импульсном доплеровском режиме.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Работа выполнена на самцах крыс линии Wistar, которые получали стандартный корм и воду ad libitum. Все процедуры проводили в соответствии с руководством Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. В качестве наркоза использовали кетамин (100 мг/кг). Эксперименты были сделаны на базе лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии и отдела заболеваний миокарда и сердечной недостаточности Института клинической кардиологии ФГБУ РКНПК МЗ РФ.

Методы оценки сердечной деятельности у животных

Эхокардиографию проводили крысам на приборе Philips iE33 датчиком S-12-4 (412 МГц). Оценивали КДО, КСО, толщину задней стенки ЛЖ, площадь поперечного сечения ЛЖ в конце систолы (Ss, см2) и диастолы (Sd, см2), интеграл линейной скорости кровотока (VTI, см) - эквивалент ударного объема, а также ударный объем ЛЖ (УО, мл) и сердечный выброс (МОК, мл/мин).

Импедансная кардиография (ИКГ) - неинвазивный метод, разработанный в прошлом веке, который в модификации В.М. Хаютина (2010) был предложен для оценки сердечной деятельности у людей. В связи с большим различием частоты сокращений у людей и крыс для обработки информации были разработаны собственные программы (автор - Е.В. Лукошкова). Сущность метода заключается в регистрации сопротивления грудной клетки. Кровь обладает наименьшим из всех тканей удельным сопротивлением, поэтому во время сердечного цикла, когда заметно меняется кровенаполнение крупных сосудов (аорты, лёгочной артерии и полых вен), изменяется и сопротивление грудной клетки, что отражается на импедансной кривой Z. На Z-кривой выделяют А-волну (сокращение предсердий), B-волну (закрытие митрального клапана) и С-волну (изгнание крови в аорту). Наиболее важным и надежным показателем сократимости ЛЖ,

получаемым из импедансной кривой, является длительность периода предизгнания - ДПП (PEP). Это интервал времени от вершины зубца R на ЭКГ до точки максимума второй производной Z-сигнала в области нарастания С-волны (d~ZJdt~). Также оценивалась длительность периода изгнания (ДПИ; DEP) - разность между длительностью электромеханической систолы ЛЖ (интервал между вершиной зубца R на ЭКГ и точкой минимума первой производной сигнала давления ЛЖ) и ДПП (рис. 2).

Рисунок 2. Метод определения длительности периода предизгнания (ДПП, PEP) с использованием точки наибольшего ускорения нарастания Z-сигнала (A max) в начале фазы изгнания (метод В.М. Хаютина). Черными кружками показаны точки начала и окончания отсчета времени. Первая - на восходящем участке R-зубца ЭКГ, вторая (метка начала фазы изгнания) -точка максимума второй производной первичного Z-сигнала (d2Z/dt2). На сигнале dZ/dt (первая производная Z-сигнала) эта точка соответствует его наиболее быстрому увеличению, а положение ее на первичном Z-сигнале весьма близко к началу пульсовой волны. На данной записи волны А и В выражены недостаточно чётко, поэтому не обозначены.

Z-сигнал регистрировали с помощью реоплетизмографа РПКА-2-01. Сигналы ЭКГ и АД подавали на «Biograph-4» (Санкт-Петербургский государственный университет аэрокосмического приборостроения). Все сигналы с помощью аналого-цифрового преобразователя (АЦП) записывали на жёсткий диск компьютера.

Катетеризация левого желудочка сердца. Милларовский прецизионный катетер (SciSense Instruments, Канада, диаметр - 0,53 мм) с тензометрическим датчиком на конце вводили через правую сонную артерию в полость левого желудочка сердца. Катетер был связан с усилителем (Hugo Sachs Elektronik, Германия). Другой, полиэтиленовый катетер РЕ-50 (Braintree Scientific Inc., США), связанный с электроманометром (Gould Statham P23Db, США) вставляли через бедренную артерию в брюшную аорту для регистрации среднего артериального давления. Сигналы с помощью усилителя и АЦП также записывали на жёсткий диск компьютера. Измеряли традиционные показатели сократимости - максимальную скорость развития давления (dP/dtmax) и индекс сократимости Bepaiyra (dP/dtmax/P - максимальная скорость нарастания давления в ЛЖ,

Д-пп

R-зубец

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 06 0.Т 00 09 1.0<

отнесённая к давлению, при котором она достигается). Для характеристики процесса расслабления использовали максимальную скорость снижения давления ((1Р/Л,щп), а также производный из неё индекс расслабимости по аначогии с индексом сократимости. Кроме того, вычисляли константы скорости снижения давления в изоволюмической и ауксоволюмической фазах кардиоцикла.

Структурные формулы апелинов.

В лаборатории синтеза пептидов ИЭК РКНПК был синтезирован природный апелин-12 и четыре его синтетических аналога (рис. 3)

Рисунок 3. Структура апелина-12 и его синтетических модификаций.

Название Структурная формула

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Апелин-12-0 Н-Аг§-Рго-Аг§-1_еи-5ег-Н!з-Ьу5-01у-Рго-Ме1-Рго-Р11е-ОН

Апелин-12-1 Н-А^-Рго-Аг§-Ьеи-8ег-Н!з-Ьу5-01у-Рго-1Ч1с-Рго-Р11е-ОН

Апелин-12-2 Н-( е )Агц-Рго-А^-Ьеи-5ег-Н15-Ьу5-01у-Рго-1\1е-Рго-РЬе-ОН

Апелин-12-3 Н-( .\u-Me ) А гй-Рго-А^-Ьеи-5 ег-Из-Ьуэ-Иу-Рго^ I с-Рго-РИе^ 1

Апелин-12-4 Н-Аг"^С-ГС02)-Рго-А^-Геи-5ег-Н1з-Ьу8-С1у-Рго-№е-Рго-РЬе-РШ2

Во всех синтетических апелинах метионин в 10-м положении был заменён на норлейцин. Это повышало устойчивость пептида к хранению и защищало от действия пептидаз крови. В модификациях 2 и 3 аргинин на М-концс заменяли на метиларгинин, а в 4 аналоге - на нитроаргинин. В апелинах 12-3 и 12-4 к фенилаланину на С-конце молекулы присоединяли амидную группу.

Болюсное введение апелинов. Контрольным крысам болюсно вводили Ап-12-0 (п=8) или его синтетические аналоги апелин-12-1 (п=П), Ап-12-2 (п~6), Ап-12-3 (л=7) и Ап-12-4 (и=9). Апелины применяли в дозах 0,01; 0,05; 0,1; 0,3 и 0,5 мг/кг. Все препараты вводили в объёме 0,5 мл физиологического раствора в ярёмную вену, кумулятивно, каждая последующая доза через 10 минут после предыдущей в порядке нарастания. Одновременно регистрировали ЭКГ, ИКГ, давление в ЛЖ с помощью Милларовского катетера и давление в брюшной аорте катетером РЕ-50 в течение всего периода введения препаратов.

Инфузионное введение апелинов. В протокол пклгачали как контрольных, так и больных животных с ХСН. Некоторым больным крысам апелин-12-2 вводили в дозах 2; 10; 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 мин под контролем ЭхоКГ. На следующий день всем больным крысам проводили инфузию пептидов в расширенном диапазоне доз Апелина-12

и Ап-12-2 (0,5; 2; 10; 20 и 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 мин) под контролем ИКГ и катетеризации ЛЖ. На здоровых животных подобного исследования не проводили.

Модель сердечной недостаточности. Изопротеренол, являясь синтетическим катехоламином, стимулирует (3-адренорецепторы, что приводит к перегрузке кардиомиоцитов кальцием и увеличению потребления ими кислорода. При этом часть клеток гибнет и замещается соединительной тканью (Roña G., 1959). Возникает фиброз и кардиосклероз, снижается сократительная функция сердца, развивается ХСН.

Изопротеренол вводили крысам подкожно дважды с перерывом в сутки. Разовые дозы варьировались от 85 до 180 мг/кг, то есть кумулятивные были вдвое выше. Смертность составляла от 15 до 40%. Всем животным через 2 месяца после инъекций изопротеренола проводили контрольную ЭхоКГ для выявления развившейся ХСН. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Средние концентрации биомаркёров в крови больных ХСН представлены в табл. 2.

Функциональный класс ХСН Апелин-12 нг/мл Галектин-3 нг/мл NT-proBNP пкг/мл Тропонин Т пкг/мл

1 0,8±0,35 12,5±4,09 854 [394; 1368] 9,5 [5,2; 12,11

2 0,81±0,29 9,98±3,71 1014 (657; 17591 12,6 [7,9; 261

3 0,68±0,38 10,68±5,95 2770[2093; 4351] 19,6 [12,1; 39,3]

4 0,82±0,35 8,7±4,05 6021 [3059; 78611 33,9(19,6; 45,21

Этиология ХСН

ДКМП 0,7±0,34 11,08±3,34 1807 [743; 38611 14,8 [7,9; 33,81

ИБС 0,81±0,34 10,06±5,4 2137[1029; 36401 19,7 [12,3; 39,31

Средняя концентрация по всей выборке 0,77±0,35 10,4±4,76 2033 [877; 3639] 19,5 [10,7; 37]

Уровень апелина-12 у здоровых добровольцев составил 0,86±0,22 нг/мл, в подгруппе молодых он был 0,9±0,23, а в подгруппе старше 35 лет - 0,78±0,19 нг/мл. Статистически значимых различий между контрольными подгруппами не было (р = 0,058), как и не выявлено достоверных изменений между средними концентрациями у больных 1-4 функциональных классов ХСН (везде р>0,05). Также не обнаружено статистически значимой разницы между уровнем апелина у пациентов с ИБС и ДКМП (р = 0,1). Достоверность прослеживалась лишь при сравнении концентраций пептида у пациентов с 3 ф.к. ХСН и контрольной подгруппой молодых (0,68±0,38 0,9±0,23 нг/мл, р = 0,006), а также больных с ДКМП и молодыми добровольцами (0,7±0,34 Ув 0,9±0,23 р = 0,004).

В то же время уровни ИТ-ргоВКР всей контрольной группы были ниже 100 пкг/мл, а средние концентрации у больных 1-4 ф.к. составляли 854 [394; 1368]; 1014 [657; 1759]; 2770 [2093; 4351]; 6021 [3059; 7861] пкг/мл соответственно. Статистически значимых

отличий концентраций NT-proBNP не было только при сравнении 1 и 2 ф.к. (р = 0,2), что может быть объяснено несколько условными клиническими границами между этими функциональными классами, во всех остальных случаях достоверность была высокой (р<0,001).

Концентрации галектина-3 так же, как и апелина-12, не отражали тяжесть течения сердечной недостаточности. Достоверные различия отмечались лишь при сравнении больных с 1 и 4 ф.к. (р = 0,027), притом у более лёгких пациентов его уровень был несколько выше. Также не было различий между концентрациями биомаркёра у пациентов с ИБС и ДКМП (р = 0,23).

В то же время тропонин Т, измеренный высокочувствительным способом, как и NT-proBNP, отражал тяжесть сердечной недостаточности, однако уступал последнему в чувствительности.

Корреляционный анализ не выявил связи между уровнем апелина-12 и ФВ ЛЖ (г = 0,16; р = 0,13), КДО (г = 0,14; р=0,15) КСО (г = -0,12; р = 0,22), уровнем NT-proBNP в плазме крови (г = -0,13; р = 0,17); возрастом (г = 0,10; р = 0,30), полом (г = -0,18; р = 0,17), курением (г = 0,04; р = 0,6) и индексом массы тела (г = -0,05; р = 0,6).

ROC-анализ показал, что хорошим маркером прогноза был NT-proBNP (AUC 0,729), несколько хуже оказался вч-ТнТ (AUC 0,657). В то же время исходные концентрации апелина-12 и галектина-3 в плазме оказывали слабое влияние на прогноз (AUC 0,573 и 0,566, соответственно).

Таким образом, апелин не проявил себя эффективным маркёром тяжести и прогноза сердечной недостаточности. Причин отрицательного результата может быть несколько. Ряд зарубежных авторов указывают на повышение апелина в крови при лёгкой степени СН с достижением максимума у больных средней тяжести и последующим снижением уровня пептида у тяжёлых пациентов (Chen М., 2003). Следовательно, лёгкие и тяжёлые больные ХСН имеют примерно одинаковые концентрации апелина, что затрудняет его использование в качестве маркёра СН. Вторая причина скрывается в механизмах экспрессии апелина. Системы апелин-APJ и РААС тесно связаны между собой, и повышение активности одной неизменно влечёт снижение активности другой. В свой протокол мы включали пациентов, которые чаще всего длительно получали базовую терапию, в том числе иАПФ или сартаны, поэтому степень активности РААС у всех больных была разной, что не могло не повлиять на экспрессию апелина. Отдельно стоит упомянуть о несовершенстве используемых тест-систем. Их производители обращают внимание на возможные кросс-реакции между апелинами 12, 13 и 36. Даже в контрольных

группах у разных исследователей средние концентрации пептида колебались от 90 до 3580 пкг/мл (Japp А., 2010). ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Метод импедансной кардиографии показал высокую корреляцию (г=0,987) между длительностью периода предизгнания (ДПП), измеренного с помощью артериального микроманометра, и методом импедансной кардиографии (рис. 4).

Рисунок 4. Оценка согласованности результатов измерений длительности периода предизгнания, определяемой по сигналу давления в аорте (ДППАо, МКМ вблизи клапана) и по импедансной кардиограмме (ДПП2): а - тренды ДППАо (черная кривая) и ДПП2 (серая кривая). Стрелки указывают начало инфузии разных доз дофамина: 1 - 20 мкг/кг/мин; 2-15 мкг/кг/мин; 3 -10 мкг/кг/мин. Укорочение ДПП соответствует усилению сократимости; б - корреляция (по Pearson) между ДППг и ДППАо; в - их сопоставление по методу Бланда-Альтмана.

ДПП, мс

100

10 15 20 25

ДППдо, МС

Также наблюдалась сильная корреляционная связь (г = 0,92) между ДПП, измеренным с помощью ИКГ и индексом сократимости Верагута, полученным катетеризацией ЛЖ при введении допамина (10 мкг/кг/мин). Таким образом, неинвазивный метод импедансной кардиографии можно применять для оценки сократимости сердца у животных.

Изопротереноловая модель хронической сердечной недостаточности.

При малых дозах изопротеренола (85 мг/кг дважды) выживали все животные. При повышении однократной дозы ИЗО до 120, 150 и 180 мг/кг выживаемость животных через 2 недели составила 60, 53 и 43%, а количество животных с ХСН из них - 24, 27 и 26,7%.

Морфогистологическое исследование сердец крыс с ХСН показало, что в стенках как левого, так и правого желудочка возникали очаги трансмурального некроза. В

ЛЖ чаще поражалась область верхушки. В сердцах, подвергнутых воздействию ИЗО, была видна клеточная инфильтрация фибробластами и макрофагами, развитие аневризм. Эндокард поражался в большей степени, чем эпикард. У больных животных появлялись и клинические признаки сердечной недостаточности: адинамия, потеря или резкий набор веса, отеки, хриплое дыхание. Эти симптомы нарастати со временем, если животное выживало.

Эхокардиографическое исследование крыс с ХСН. В предварительной серии экспериментов на 61 контрольном животном было установлено, что, в отличие от человека, ФВ ЛЖ крыс была значительно вышей составляла в среднем 84± 1 %. Критерием развития сердечной недостаточности мы считали ФВ менее 70%, при этом средняя ФВ в группе больных животных составила 58±6%. При такой ФВ у крыс наблюдали как клинические симптомы СИ (отёки, гидроторакс, гидроперикард, одышка), так и морфологические признаки СН (рубцы и аневризмы, кардиосклероз).

При использовании матых доз изопротеренола (85 мг/кг дважды) по данным ЭхоКГ наблюдали лишь тенденцию к увеличению объёма ЛЖ и иитеграпа скорости потока (УТ1) без изменения фракции выброса. При использовании больших

кумулятивных доз изопротеренола (240-360 мг/кг) степень поражения миокарда зависела от дозы и длительности (таб. 3). Установлено неуклонное увеличение диастолического и систолического объёма ЛЖ, снижение фракции выброса, а также степени уменьшения площади ЛЖ в систоле, характеризующей сократимость миокарда. Удлинялись изометрические фазы сокращения и расслабления, но укорачивалась длительность фазы наполнения сердца. Минутный объем снижачся гораздо меньше, что говорит о хороших компенсаторных возможностях организма.

Таблица 3. Кардиодинамика сердец крыс, получивших изопротеренол в высоких дозах.

Контроль (п=36) ИЗО-2 (п=11) ИЗО-З (п=15) ИЗО-4 (п=9)

доза (мг/кг) 0 240 300 360

срок - 2 недели 2 недели 2 месяца

Частота сокращений (мин"1) 385 ±8 383 ± 14 381 ±7 349 ± 19

Минутный объём (мл/мин) 97 ±4 88 ±5 73 ±6* 85 ± 8

Конечный диастолический объём (мл) 0,84 ± 0,05 0,92 ± 0,09 1,1 ±0,1* 2,11 ±0,22 **

Конечный систолический объём (мл) 0,14 ±0,02 0,22 ± 0,04 0,23 ± 0,06 0,94 ±0,14

Фракция выброса (%) 84 ± 1 78 ±3 72 ±3** 57 ±4**

УТ1, см 3.51 ±0.13 3,02 ±0,12 * - 3,93 ± 0,2

Площадь ЛЖ в диастоле (ем2) 0,44 ± 0,02 0,46 ± 0,03 0,45 ± 0,03 0,77 ± 0,06 **

Степень уменьшения площади ЛЖ в систоле (%) 66 ±2 61 ±4 57 ± 3 ** 44 ± 3 **

При катетеризации ЛЖ этих животных были получены результаты, принципиально совпадающие с данными гемодинамики (таб. 4). При относительно мало изменённых общих показателях сократительной функции сердца отмечено снижение индексов сократимости и особенно расслабимости миокарда. Степень снижения индексов, характеризующих расслабление, в группе с наибольшей дозой изопротеренола составляла 35% для изоволюмической фазы и 43% для ауксоволюмической фазы. Замедленное расслабление миокарда в начальной фазе наполнения ЛЖ сочеталось с повышенным диастолическим давлением в ЛЖ (таб. 4).

Таблица 4. Функция сердца крыс, получивших изопротеренол в дозах 240-360 мг/кг.

Контроль (6) ИЗО-240 (6) ИЗО-ЗбО (9)

Артериальное давление (мм рт.ст.) 120 ±2 119 ± 10 111 ±5

Частота сокращений (мин1) 425 ±6 388 ± 16 381 ±11 **

Систолическое давление (мм рт.ст.) 144 ±5 139 ± 13 135 ±5

Диастолическое давление (мм рт.ст.) 3 ± 1 5 ± 3 9 ± 2 *

Максимальная скорость развития давления (мм рт.ст./с) 12830 ±800 10910 ±917 10220 + 820*

Максимальная скорость снижения давления (мм рт.ст./с) 10980± 590 7030± 1068 * 7260 ±590 *

Индекс сократимости (с'1) 147 ±6 139 ± 17 117 ± 7 *

Индекс расслабления (с"1) 138 ± 14 86 ± 10 * 90 ± Ц *

Экспоненциальная константа скорости изоволюмического расслабления (с-1) 158± 19 81 ±12* 103 ± 12*

Логистическая константа скорости изоволюмического расслабления (с-1) 408 ± 44 120 ± 13 ** 238 ± 34

Экспоненциальная константа скорости ауксоволгамического расслабления(с-1) 300 ±35 149±11 ** 172±12 *

Константа времени ауксоволюмического расслабления (мс) 3,7 ± 0,6 6,9 ±0,5 ** 6,0 ± 0,4 *

* р< 0.05; ** р < 0.01 по сравнению с контрольной группой

Болюсиое введение апелинов.

Влияние нативного апелина-12 и его синтетических аналогов на гемодинамику и сократимость сердец здоровых животных изучали при помощи одновременной регистрации ИКГ и давления в ЛЖ. Применяли различные дозы пептидов от 10 до 500 мкг/кг в 0,5 мл физиологического раствора. Апелин 12-0 оказывал выраженное гипотензивное действие, характерное для апелинов и связанное с наличием аргинина на М-конце молекулы (рис. 5). При этом показатели сократимости и расслабимости миокарда умеренно снижались, что может быть обусловлено повышением активности Г^О-синтаз ОШетйо, 2001; ЬасЗепаз-Ьорев, 2008) под влиянием апелина.

Рисунок 5. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (+йРМ1тах/Р) и экспоненциальной константы расслабления (ЬУ-СЯ-Ехр) у наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-0.

Апелин 12-0 (0.3 мг/кг) М+ЭЕ

-50-

-4-САД (п=8) —■— с1Р/сйтах/Р А - 1_У-СР-Ехр

-60

-5

0

5

10

15

20

25

МИН

Аналог апелин-12-1, отличавшийся от апелина-12 заменой метионина в 10-м положении на норлейцин, сильно снижал АД, при этом одинаковый гипотензивный эффект достигался уже при дозе в 6 раз меньшей по сравнению с апелином-12, что обусловлено большей устойчивостью к действию аминопептидаз. Метилирование аргинина (Апелин-12-2 и Апелин-12-3) снимало гипотензивное действие пептида, а нитрозилирование аргинина (Апелин-12-4) восстанавливало гипотензивный эффект, однако он был менее выражен и продолжителен. При болюсном введении апелинов положительный инотропный эффект был недолгим и относительно слабо выражен. Кратковременное повышение индекса сократимости было тем больше, чем больше было падение АД, что, по-видимому, представляет компенсаторную реакцию. Апелин-12-2 и Апелин-12-3 за счёт наличия метиларгинина на Ы-конце практически не влияли на АД, поэтому эти синтетические аналоги выглядели более предпочтительными для создания лекарственного средства лечения ХСН. Для дальнейших экспериментов при сердечной недостаточности нами был выбран апелин-12-2, который не влиял на АД и индекс сократимости и лишь кратковременно снижал константу расслабления (рис. 6). При этом было решено использовать инфузионное введение пептидов.

Рисунок 6. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (+(№/Лтах/Р) и экспоненциальной константы расслабления (ЬУ-СЛ-Ехр) у наркотизированных крыс при болюсном введении апелина-12-2.

Апелин 12-2 (0.3 мг/кг) M±SE

мин

Инфузия апелина-12-0 и апелина-12-2 здоровым крысам. Препараты вводили шприцевым насосом в возрастающих дозах от 0,5 до 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 минут. В этом случае эффекты были более стабильны, чем при болюсном введении (рис. 5). Исходные функциональные параметры крыс перед введением апелинов представлены в таб. 5.

Таблица 5. Функциональные параметры исходного состояния сердец крыс контрольной группы и крыс с ХСН перед введением апелина-12 или его аналога. Обозначения: ЧСС - частота сердечных сокращений. АД - среднее давление в аорте. СДЛЖ - систолическое давление в левом желудочке сердца; ДДЛЖ - диастолическое давление в левом желудочке сердца; +йР/с11т„/Р -индекс сократимости Верагута.

Здоровые крысы Крысы с ХСН

Апелин-12 Апелин-12-2 Апелин-12 Апелин-12-2

Количество крыс п=13 п=8 п= 8 п= 8

ЧСС (мин-1) 443 + 8 420+ 10 379+10 364+9

АД (мм рт.ст.) 115 + 3 120+ 1 109+10 113+1

СДЛЖ (мм рт.ст.) 158 + 3 137 + 2 132+9 125+2

ДДЛЖ (мм рт.ст.) 3,4+ 1,6 3,8 + 0,7 8,2+3,8 7,3+0,6

+dP/dt,„ax/P (с-1) 154+11 149 + 6 130+13 123+8

LV-CR-Exp (с1) 14,0+1,2 15,2 + 0,6 69+10 61+3

PEP (мс) 18,0 + 0,7 20,3 + 0,5 18,5+1,5 21,9+1,7

DEP (мс) 99 + 7 107 + 7 64,5+2,4 67,1+2,3

Начальные параметры обеих контрольных групп были близки, за исключением систолического давления (СДЛЖ); в группе с ХСН отмечено значительное повышение ДДЛЖ и снижение индексов сократимости и особенно экспоненциальной константы расслабления по сравнению со здоровыми животными.

Рисунок 7. Изменения показателей функции сердца контрольных животных при инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 (в процентах к исходному уровню; M±SE) при малых дозах 0,5-2 мкг/кг/мин (А) и при максимальном эффекте в диапазоне доз 10-50 мкг/кг/мин (Б). САД - среднее артериальное давление; ЧСС - частота сердечных сокращений; СД - систолическое давление в левом желудочке; +dP/dtmax/P - индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp - экспоненциальная константа расслабления левого желудочка сердца; PEP - длительность периода предизгнания; DEP - длительностьпериода изгнания. Достоверность указана между эффектами Ап-12-0 и Ап-12-2.

23 Апелин 12-0 (п=8) НИ Апелин 12-2 (п=9)

' - pcO.OS ' - р<0.01

1a И

САД ЧСС СД +dP/dtmaji/P LV-CR-

Exp

ЕЩ

DEP

10

PEP DEP

САД

ЧСС од -KiP/dt^/P LV-CR-Exp

При применении больших доз видно, что давление в аорте при введении апелина-12-2 повышалось меньше, чем у природного пептида, а ЧСС, САД, индекс Верагута (13% против 3%) и константа расслабления (9% против 3%) повышались достоверно больше. Временные показатели сократимости у апелина 12-2 были значительно лучше, чем у апелина-12-0 (рис. 7). Преимущество Ап-12-2 перед нативным пептидом в улучшении сократимости и расслабимости сердца было очевидным.

Инфузия апелина-12-0 и апелина-12-2 крысам с ХСН. Аналогичный протокол был применён у крыс с ХСН, вызванной введением изопротеренола.

Рисуиок 8. Изменение функции сердец крыс с ХСН при инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 (в процентах к исходному уровню; М±8Е) при малых дозах 0,5-2 мкг/кг/мин (А) и при максимальном эффекте в диапазоне доз 10-50 мкг/кг/мин (Б). Обозначения те же, что и на рис. 7.

У животных с ХСН малые дозы практически не влияли на показатели сократительной функции сердца, но при больших дозировках апелин-12-2 оказывал отчётливое кардиотропное действие. Он повышал частоту сокращений и систолическое давление в ЛЖ более чем в 2 раза по сравнению с природным апелином (рис. 8). Индекс сократимости не менялся при малых дозах, а при больших концентрациях для апелина-12-2 он был достоверно выше, также и длительность периода предизгнания достоверно укорачивалась вдвое по сравнению с эффектом апелина-12 на больших дозах (-10% против 5%). Константа расслабления под влиянием апелина-12-2 возрастала в 2,5 раза больше, чем у природного апелина-12. Таким образом, если у здоровых крыс оба апелина больше увеличивали сократимость миокарда, то у животных с ХСН сильнее возрастала расслабимость. Действие апелина-12-2 на поражённый миокард было более выражено, чем у апелина-12-0.

Инотропное действие Ап-12-2 проявилось на сердцах с ХСН при инфузии пептида животным с регистрацией эхокардиограммы (рис. 9).

Рисунок 9. Изменения параметров сократимости сердец крыс с ХСН на 10-й минуте инфузии каждой дозы апелина-12-2 по данным эхокардиографии. Обозначения: ФВ - фракция выброса; СУЗС - степень утолщения задней стенки ЛЖ; МОК - минутный объём крови. (и=5).

150-,

140-

130 -

120 -

110

100

2 мкг/кг/мин

10 мкг/кг/мин

50 мкг/кг/мин

р<0.05

ФВ

СУЗС

МОК

Параметры увеличивались при введении возрастающих доз в разной степени. Это неудивительно, потому что у пептидов часто наблюдается «колоколообразная» зависимость на кривых доза-эффект. В наших экспериментах наиболее эффективной была

дозировка 10 мкг/кг/мин, под влиянием которой прирост МОК (20±6%) и ФВ (8±2,8%) были статистически значимы (рис. 9). Степень утолщения задней стенки достоверно возрастала только на дозе 50 мкг/кг/мин (31±11%; р=0,04).

ВЫВОДЫ:

1. Апелин-12 не может служить диагностическим маркёром при ХСН, вызванной ишемической болезнью сердца или дилатациоиной кардиомиопатией.

2. Апелин-12 и гапектин-3, в отличие от МТ-ргоВКР и тропонина Т, не являются эффективными биомаркёрами прогноза ХСН.

3. Природный апелин-12 при болюсном введении оказывает значительное гипотензивное действие у здоровых крыс. Замена метионина на норлейцин в молекуле апелина-12 (апелин-12-1) повышает устойчивость пептида в крови и усиливает гипотензивный эффект в 5-6 раз.

4. Гипотензивное действие апелина-12 и его аналогов (апелина-12-1 и апелина-12-4) обусловлено наличием аргинина на М-конце пептида и фенилаланина на С-конце. Метилирование аргинина на Ы-конце (апелин-12-2 и 12-3) устраняет гипотензивный эффект, а его нитрозилирование (апелин-12-4) лишь укорачивает продолжительность гипотензии.

5. Синтетический аналог апелин-12-2 оказывал более сильное кардиотропное действие по сравнению с нативным апелином-12: у здоровых животных он сильнее повышал сократимость, а у животных с ХСН - расслабимость миокарда, что сопровождалось улучшением кардиодинамики.

6. Импедансная кардиография может быть использована для оценки сократимости сердец у животных в условиях хронического эксперимента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Не рекомендуется определять концентрации апелина-12 и галектина-3 в крови больных ХСН для оценки тяжести и прогноза заболевания. Для этих целей лучше использовать >1Т-ргоВ№ и/или сердечный тропонин.

Положительное инотропное действие апелина-12-2 у животных с ХСН позволяет рекомендовать его для дальнейшей разработки лекарственного средства лечения декомпенсации хронической сердечной недостаточности.

Наружную импедансную кардиографию целесообразно использовать в качестве неинвазивного метода оценки сократительной функции сердца у животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галектин-3 - новый маркер диагностики и прогноза хронической сердечной недостаточности Кардиология. Лакомкин С.В., Скворцов A.A., Горюнова Т.В., Масенко В.П., Терещенко С.II. Журнал «Кардиология» 2012, №3, том 52, стр. 45-52.

2. Неинвазивная оценка сократимости миокарда крыс. Ермишкин В.В., Лукошкова Е.В., Лакомкин В.Л., Абрамов A.A., Колесников В.А., Лакомкин С.В., Капелько В.И. Журнал «Кардиологический вестник» 2013 том VIII(XX), №1, стр. 26-31.

3. Комплексное исследование сердца крыс при поражении изопротеренолом. Капелько В.И., Лакомкин В.Л., Лукошкова Е.В., Грамович В.В., Выборов О.Н., Абрамов A.A., Ундровинас H.A., Ермишкин В.В., Лакомкин С.В., Веселова С.П., Жданов B.C., Ширинский. В.П. Журнал «Кардиология» 2014, № 3, том 54, стр. 46-56.

4. Биомаркёры при сердечной недостаточности: уровень апелина не ассоциирован с наличием и степенью тяжести заболевания. Лакомкин С.В., Терещенко С.Н., Сычёв A.B., Масенко В.П., Ткачёв Г.А., Герасимова О.Н., Сигалович Е.Ю., Данковцева E.H., Затейщиков Д.А. Журнал «Кардиология» 2015, № 2, том 55, 37-41.

5. Influence of Apelin-12 on the contractile heart function of rats with isoproterenol-induced heart failure. Lakomkin S.V., Lukoshkova E.V., Ermishkin V.V., Lakomkin V.L., Abramov A.A., Gramovich V.V., Viborov O.N. European Journal of Heart Failure (supplements), 2012, v.ll, Suppl. 1, ISSN 1567-4215 (Print) ISSN 1878-1314 (Online), P601.

6. Functional improvement of isoproterenol-indiced cardiac failure by apelin-12 and its analog. Lakomkin S.V., Gramovich V.V., Viborov O.N., Lukoshkova E.V., Lakomkin V.L., Undrovinas N.A., Abramov A.A., Tereschenko S.N., Shirinsky V.P., Kapelko V.l. European Journal of Heart Failure, 2013, vol.15, Supplement 1, ISSN 1368-9842 (print) ISSN 18790844 (OUTLINE).

7. Structural modifications of apelin-12 molecule differently affect cardiac function. Lakomkin S.V., Lukoshkova E.V., Lakomkin V.L., Abramov A.A., Bespalova Z.D., Tereschenko S.N., Kapelko V.l. European Heart Journal (2013), 34 (Abstract Supplement), 602, P3254.

8. Apelin-12, Galectin-3, High-sensitivity cardiac troponin-T and NT-proBNP, which biomarker is most strong in HF risk stratification. Lakomkin S.V., Moreev U.V., Ermishkin V.V., Masenko V.P., Tereschenko S.N. European Journal of Heart Failure Supplements (2014) 16 (Suppl. 2) 366-399, P1706.

Подписано в печать 03.04.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 4525-4-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39