Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Влияние антител к глутамату на экспрессию генов программируемой гибели клеток головного мозга на модели болезни Альцгеймера.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ (<НА УЧНО-ИССЛЕДОВА ТЕЛЬСКНЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПА ТОЛОГИИ И ПА ТО ФИЗИОЛОГИИ" РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НА УК

На правах рукописи УДК 577.112.384.4+616.894

04201364009

КОЛОБОВ ВИТАЛИЙ ВИКТОРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА НА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

14.03.03 - патологическая физиология 03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук Давыдова Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, профессор

Немцова Марина Вячеславовна

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

/

ВВЕДЕНИЕ..........................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............12

1.1 Кпинико-морфологические особенности болезни Альцгеймера . . 12

1.2 Нейротоксичность глутамата.................18

1.3 Феномен программируемой гибели клеток в нервной ткани. ... 23

1.4 Роль нейроиммунных взаимодействий в патогенезе болезни Альцгеймера........................28

1.5 Экспериментальные модели болезни Альцгеймера........35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............42

2.1 Патофизиологические методы исследования..........42

2.1.1 Объекты исследования.................42

2.1.2 Модель экспериментальной болезни Альцгеймера.....44

2.1.3 Условный рефлекс пассивного избегания................45

2.2 Иммунологические методы исследования...........46

2.2.1 Получение конъюгированного антигена глутамат-белок . . 46

2.2.2 Получение антител к глутамату..........................47

2.3 Биохимические методы исследования.............47

2.3.1 Выделение белков..................47

2.3.2 Определение концентрации белков......................48

2.3.3 Определение удельной активности каспазы-3.......49

2.4 Молекулярно-генетические методы исследования........51

2.4.1 Выделение рибонуклеиновых кислот..........51

2.4.2 Определение концентрации РНК............52

2.4.3 Удаление примесей геномной ДНК из образцов РНК .... 52

2.4.4 Обратная транскрипция................53

2.4.5 Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени..................53

2.4.6 Агарозный гель-электрофорез..............57

2.5 Статистические методы...................58

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВЕДЁННЫХ АНТИТЕЛ

К ГЛУТАМАТУ НА АКТИВНОСТЬ КАСПАЗЫ-З В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА........................59

3.1 Особенности активности каспазы-3 в префронтальной коре. ... 61

3.2 Особенности активности каспазы-3 в гипоталамусе.......63

3.3 Особенности активности каспазы-3 в гиппокампе........64

3.4 Обсуждение региональных различий ферментативной активности каспазы-3.........................65

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВЕДЁННЫХ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА......70

4.1 Экспрессия гена Casp3 в церебральных структурах.......73

4.2 Экспрессия гена Aifml в церебральных структурах.......75

4.3 Экспрессия гена Вах в церебральных структурах........77

4.4 Экспрессия гена Dffb в церебральных структурах........ 78

4.5 Экспрессия гена Parpl в церебральных структурах....... 79

4.6 Сравнительный анализ профиля экспрессии генов ключевых эффекторов программируемой гибели в нервной ткани при использовании антител к глутамату..............81

ГЛАВА 5. ЭФФЕКТЫ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ПАМЯТИ У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА.................. 88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................98

ВЫВОДЫ....................................................106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ. ... 107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................108

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Болезнь Альцгеймера (БА), характеризующаяся нарушением когнитивных функций, снижением памяти и интеллекта, является комплексным мультифакториальным заболеванием, в патогенез которого вовлечено множество процессов, контролируемых значительным числом генов. Среди молекулярно-генетических гипотез, объясняющих развитие БА, амилоидная гипотеза, основанная на индукции бета-амилоидом (Ар) окислительного стресса, является наиболее разработанной [Hardy, Higgins, 1992; Varadarajan et al., 2001; Butterfield, Castegna, 2003; Nunomura et al., 2007]. A(3 приводит к ингибированию тканевых окислительных систем [Keller et al., 1998], активации микроглии [Siegel, Zalcman, 2009], запуску эндосомально-лизосомальной сигнальной системы клеток [Cataldo et al., 1996]. При окислительном стрессе происходит структурная модификация белков, приводящая к нейрональной гибели при БА [Castegna et al., 2002; Butterfield, Castegna, 2003].

Механизмы нейрональной гибели, которые ведут к появлению когнитивных нарушений при БА, в настоящий момент находятся на стадии обсуждения, однако ведущую роль в гибели отводят апоптозу [Jellinger, Stadelmann, 2001; Ayala-Grosso et al., 2002; Kermer et al., 2004]. Усиление апоптоза в нервных клетках головного мозга установлено при спорадических и семейных формах БА [Eckert et al., 2003]. Одним из механизмов нейротоксичности р-амилоидных пептидов является сверхэкспрессия проапоптотического белка Вах [Clementi et al., 2006], увеличенное содержание которого обнаружено в сенильных бляшках в гиппокампе при БА [MacGibbon et al., 1997; Su et al., 1997].

Накопление Ар нарушает протеасомную деградацию и приводит к активации каспаз [Blandini et al., 2006], которые являются эффекторными молекулами как внешнего, так и внутреннего (митохондриального) путей

тг ___ ллла! т-г . . . _ .. 1 . . ___ ____ 1

структурах головного мозга топографически ассоциируется с

нейрофибриллярными клубками и сенильными бляшками [Su et al., 2001]. Каспаза-3 активирует ß-полипептид ДНК-фрагментирующего фактора [Liu et al, 1997], что приводит к внутринуклеосомной фрагментации наследственного материала с образованием коротких фрагментов в 180-300 пар нуклеотидов.

В качестве эффекторных молекул при нейрональной гибели могут выступать также поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 и апоптоз-индуцирующий фактор [Waxman, 2007; Fujikawa, 2010; Abêti et al, 2011]. Так, поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 формирует поли(АДФ-рибозо)полимеры, которые перемещаются из ядра в митохондрии, приводя к высвобождению апоптоз-индуцирующего фактора [Abêti et al, 2011], который перемещается в ядро и совместно с неидентифицированной эндонуклеазой фрагментирует ДНК на крупные фрагменты в 50 тысяч пар нуклеотидов [Fujikawa, 2010].

Многочисленными работами отечественных и зарубежных учёных доказано наличие тесной взаимосвязи и взаимодействия между двумя интегративными системами организма - нервной и иммунной [Корнева, 1993; Крыжановский и др., 2002; Магаева, Морозов, 2005; Евсеев, 2007; Девойно и др., 2009; Phelps, Korneva, 2008; Siegel, Zalcman, 2009]. Получены убедительные свидетельства того, что иммунная система реагирует образованием антител не только на высокомолекулярные вещества, но также и на низкомолекулярные вещества, в частности, нейромедиаторы - серотонин, глутамат, ГАМК и дофамин [Евсеев, 2007]. В процессе биотрансформации нейромедиаторов образуются реакционно способные метаболиты (хиноны, семихиноны, эпоксиды), которые при ковалентном связывании с белками сыворотки крови образуют естественные конъюгированные антигены, индуцирующие продукцию аутоантител, реагирующих с нейротрансмиттерными эпитопами конъюгата [Ковалёв, Полевая, 1985]. Другой возможный путь формирования естественных антител к нейромедиаторам связан с механизмом сетевой идиотип-антиидиотип регуляцией иммунного ответа в соответствии с концепцией К. Йерне [Jerne, 1974]: посредством последовательных каскадных процессов аутоантитело к рецептору превращается в антиидиотипическое

антитело 2-го порядка, способное связываться с лигандом-нейромедиатором.

К настоящему времени установлено защитное действие антител к серотонину на моделях алкоголизма [Давыдова и др., 1987, 2005; Евсеев и др., 2001, 2007], наркомании [Евсеев и др., 1996], паркинсонизма [Крыжановский и др., 1994; Крыжановский, 2009], а также антител к глутамату (АТ-Глу) при экспериментальной эпилепсии [Карпова и др., 2003], нейропатическом болевом синдроме [Евсеев и др., 2008], экспериментальном паркинсоническом синдроме [Давыдова и др., 2008], экспериментальной Б А [Горбатов и др., 2010] и ишемических повреждениях префронтапьной коры головного мозга [Романова и др., 2010, 2012а, 2012Ь]. Антитела к нейромедиаторам становятся объектом исследований в аспектах проблемы дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий [Крыжановский, 2002; Евсеев, 2007], составляющих основу различных нейропсихических нарушений при нейропатологических процессах, в частности, при БА.

Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором в ЦНС, участвующим во многих процессах в мозге, включая и когнитивные функции [Danysz et al, 2000]. При посмертном исследовании головного мозга больных БА ряд авторов отмечает патологические изменения глутаматергических нейронов [Braak, Braak, 1994]. В настоящее время известно, что при БА наблюдается вовлечение глутаматершческой системы с нарушением гомеостаза глутамата, а также изменениями в работе глутаматных NMDA-рецепторов [Harkany et al., 2000; Bi, Sze, 2002; Francis, 2003; Hynd et al, 2004a, 2004b; Ye et al, 2004; Parson et al, 2007; Revett et al, 2013]. Установлено, что АТ-Глу проявляют антиамнестические свойства на поздней стадии экспериментальной БА [Горбатов и др., 2010].

Предполагается, что АТ-Глу могут влиять на программируемую гибель нейронов и глии при нейродегенеративных повреждениях мозга посредством вовлечения в функционирование глутаматергической системы интегративных структур головного мозга - префронтапьной коры, гипоталамуса и гиппокампа, составляющих вместе с базальными ядрами Мейнерта структуру центрального аппарата регуляции функций иммунной системы [Магаева, 2012].

Целью исследования явилось изучение влияния антител к глутамату на процессы программируемой гибели в структурах головного мозга на экспериментальной модели болезни Альцгеймера.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности изменений ферментативной активности каспазы-3 в префронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе у крыс на модели болезни Альцгеймера, вызванной билатеральным введением нейротоксина А(325-з5 в базальные крупноклеточные ядра Мейнерта.

2. Исследовать влияние антител к глутамату в условиях их интраназального введения на ферментативную активность каспазы-3 в структурах головного мозга крыс на экспериментальной модели болезни Альцгеймера в динамике (на 1, 3 и 14 сутки).

3. Провести анализ экспрессии генов ключевых эффекторов генетически детерминированной гибели клеток головного мозга - гена каспазы-3 Casp3, гена апоптоз-индуцирующего фактора Aifml, гена Вс12-ассоциированного X белка В ах, гена (3-полипептида ДНК-фрагментирующего фактора Dffb и гена поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 Parpl - в префронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе на модели болезни Альцгеймера.

4. Оценить влияние антител к глутамату в условиях их интраназального введения на транскрипционную активность вовлечённых в программируемую гибель клеток нервной ткани генов Casp3, Aifml, Box, Dffb и Parpl в префронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе на модели экспериментальной болезни Альцгеймера.

5. Изучить эффекты антител к глутамату в условиях их интраназального введения на выработку условного рефлекса пассивного избегания в ранний и поздний периоды развития (3-амилоидной модели болезни Альцгеймера.

Научная новизна. В работе впервые комплексно исследовано влияние интраназально введённых антител к глутамату на ферментативную активность каспазы-3 в структурах мозга: префронтальная кора, гиппокамп, гипоталамус в ранний (1 и 3 сутки) и поздний (14 сутки) периоды развития экспериментальной БА, вызванной введением А(325-35 в крупноклеточные ядра Мейнерта, с параллельной оценкой в указанных структурах головного мозга экспрессии ключевых генов программируемой гибели (Афп1, Вах, СазрЗ, Е)$Ь, Рагр1). Впервые продемонстрировано, что гипоталамус в отношении определяемых параметров является индифферентным отделом головного мозга.

Получены новые данные о том, что в период максимального увеличения активности каспазы-3 в префронтальной коре и гиппокампе - на 3 сутки - паттерн экспрессии ключевых генов программируемой гибели клеток (Афп1, Вах, СазрЗ, ЩЬ, РагрТ) гетерогенно изменяется, стимулируя гибель клеток. На основании этого выдвинуто предположение о развитии в префронтальной коре и гиппокампе различных вариантов программируемой гибели клеток на 3 сутки р-амилоидной модели БА, развитию которых препятствуют интраназально введённые АТ-Глу.

Впервые установлен факт стойкого сохранения условного рефлекса пассивного избегания - и на 3, и на 14 сутки - после введения АТ-Глу при экспериментальной БА. Тогда как в группах животных, не получавших интраназально АТ-Глу или получавших у-глобулин, фиксировали характерные нарушения памяти.

Теоретическая и практическая значимость. Впервые получено подтверждение влияния АТ-Глу в условиях их интраназального введения на экспрессию ряда генов программируемой гибели и, соответственно, регуляцию процессов программированной клеточной гибели, а также на ферментативную активность каспазы-3 в префронтальной коре и гиппокампе и нормализации мнестических нарушений при хроническом нейродегенеративном повреждении мозга - БА, что расширяет существующие в настоящее время представления о дизрегуляционных механизмах нейроиммунных взаимодействий при нейродегенеративной патологии. Полученные результаты в дальнейшем могут

являться основой для разработки новых фармакологических средств иммунотерапии нейродегенеративных заболеваний. Научно-теоретические положения работы могут быть использованы в учебно-педагогическом процессе в высших учебных заведениях медицинского и биологического профиля.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антитела к глутамату в условиях их интраназального введения подавляют повышение активности каспазы-3 в структурах головного мозга на экспериментальной модели болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в базальные крупноклеточные ядра переднего мозга.

2. Антитела к глутамату в условиях их интраназального введения приводят к снижению дифференцированно повышенной экспрессии ключевых генов программируемой гибели клеток в разных отделах головного мозга у крыс в ранний период развития болезни Альцгеймера на р-амилоидной модели.

3. Антитела к глутамату в условиях их интраназального введения проявляют антиамнестический эффект у крыс в ранний и поздний период развития экспериментальной модели болезни Альцгеймера.

Апробация. Основные результаты работы доложены и обсуждены на следующих научно-практических конференциях:

• на 24th European College of Neuropsychopharmacology Congress (Франция, Париж, сентябрь 2011 г);

• на научно-практической конференции с международным участием "Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга" (Ростов-на-Дону, октябрь 2011 г);

• на международной конференции "Programmed Cell Death in Biology and Medicine" (Москва, июнь 2012 г);

• на II международной междисциплинарной конференции "Modern Problems in Systemic Regulation of Physiological Functions" (Турция, Бодрум, июнь 2012 г);

• на всероссийской молодёжной конференции "Актуальные проблемы биологии и химии" (Пущино, июль-август 2012 г);

• на VII российской конференции с международным участием "Нейроиммунопатология" (Москва, ноябрь 2012 г);

• на П всероссийской научной конференции молодых учёных "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, ноябрь 2012 г);

• на XVI всероссийской медико-биологической конференции молодых учёных (с международным участием) "Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, апрель 2013 г), где устный доклад удостоен диплома Ш степени как лучший устный доклад в медико-биологической секции;

• на IV международном симпозиуме "Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease" (Санкт-Петербург, июнь 2013).

Работа апробирована 27 марта 2013 года в ФГБУ "НИИ общей патологии и патофизиологии" РАМН на межлабораторной конференции с участием лабораторий нейроиммунопатологии, общей патологии нервной системы, ишемических повреждений мозга, эпилептогенеза, фундаментальных и клинических проблем боли.

Личный вклад соискателя. Автором произведён анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации и планирование экспериментов. Представленные в диссертации результаты получены лично автором: им полностью проведены биохимические и молекулярно-биологические эксперименты, а также статистическая и графическая обработка экспериментального материала. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых ведущая роль автора была определяющей. Автор сформулировал выводы и опубликовал научные работы, отражающие основные результаты диссертационной работы.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 18 рисунков и 11 таблиц; состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов, библиографического списка, включающего 88 отечественных и 288 иностранных источников.

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 19 научных работ, в том числе 13 тезисов д�