Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Антитела к глутамату при нейродегенеративных повреждениях мозга

На правах рукописи

003434409

ГОРБАТОВ ВИКТОР ЮРЬЕВИЧ

АНТИТЕЛА К ГЛУТАМАТУ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ МОЗГА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010

2 5 20:0

003494409

Работа выполнена в лаборатории нейроиммунопатологии Учреждения Российской АМН Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН.

Научные руководители: доктор медицинских наук

Давыдова Татьяна Викторовна доктор биологических наук Романова Галина Александровна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Малышев Игорь Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Воронина Татьяна Александровна

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова

Автореферат разослан «2/ » 2010 года

Защита диссертации состоится «¿^Г"» 2010 года в ^

часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, улица Балтийская, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Нейродегенеративные заболевания ЦНС, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, ишемические повреждения мозга в связи со старением населения занимают все большую долю в структуре заболеваемости в развитых странах мира. Затраты на их терапию сопоставимы с затратами на сердечно-сосудистые и онкологические заболевания. К наиболее тяжелым последствиям нейродегеративных расстройств ЦНС можно отнести прогрессирующее снижение когнитивных функций, проявляющее в развитии деменции, приводящее больных к выраженной социальной дезадаптации, невозможности самообслуживания, резкому снижению качества жизни, не только самих больных, но их родственников. Наиболее частой причиной деменции в пожилом возрасте является болезнь Альцгеймера, сосудистые ишемические нарушения и др. (Гаврилова С.И., 2002; Дамулин И.В., 2002; Яхно Н.Н., Преображенская И.С., 2002; Ritchie R., Lovestone S., 2002; Sikstrom S„ 2007). Деменции альцгеймеровского типа встречаются в возрасте 65-69 лет в 1,4-5% случаев, а к 80-90 годам жизни уже в 29,8% случаев (Jorn A. et al., 1987; Evans D. et al., 1989). По данным НЦПЗ РАМН до 4,5-5,0% населения Москвы страдают деменциями альцгеймеровского типа (Гаврилова С.И., 2002). В связи с быстро увеличивающимся количеством больных с нейродегенеративными заболеваниями, связанными с развитием прогрессирующего слабоумия, изучение механизмов развития когнитивных расстройств и поиск новых подходов к их профилактике и патогенетической терапии представляет собой актуальную проблему современной медицины и имеет важное социально-экономическое значение.

Современные представления о нейробиологических и патофизиологических механизмах развития болезни Альцгеймера - хронического нейродегенеративного заболевания пожилого и старческого возраста, характеризующегося церебральной атрофией, связывают с отложением фибриллярного Р-амилоидного белка в виде с сенильных бляшек и перерождением нейрофибрилл с образованием нейрофибриллярных клубков, развитием оксидативного стресса, ведущих к нарушению холинергической нейтротрансмиссии и связанных с ее нарушением развитием когнитивного дефицита (Гаврилова С.И., 1999, Дамулин И.В., 2002). В последнее десятилетие получены убедительные доказательства, свидетельствующие о вовлеченности в нейродегенеративный процесс, лежащий в основе болезни Альцгеймера, не только холинергической системы, но и других нейротрансмиттерных систем, в том числе глутаматергической, по последним данным играющей ключевую роль в механизмах развития этого заболевания (Fransis Р.Т., 2004; Hynd M.R. et al., 2004). Нарушение глутаматергической системы также играет основную роль в механизмах развития нейродегенерации, связанной с ишемическими повреждениями мозга и развитием сосудистых деменций (Гусев Е.И.,Скворцова В.И., 2001; Гомазков О.А.,2009; Meldrum B.S., 2000; Salinska Е. et al., 2005). Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором в ЦНС, участвующим во многих процессах в мозге, включая и когнитивные функции (Danysz W. et al., 2000; Mark L.P. et al. 2001).

Избыточная активация глутамата оказывает нейротоксическое действие, обуславливая из-за длительного притока кальция гибель кортикальных и субкортикальных нейронов, что в итоге ведет к основному проявлению деменций -развитию прогрессирующего слабоумия. Одним из механизмов регуляции уровня глутамата могут быть антитела к нему, вырабатывающиеся на его избыточное длительное высвобождение ЦНС, а также антитела к глутаматным рецепторам, впервые выявленные при острых ишемических инсультах (Гусев Е.И., Скворцова В.И.,2001).

В настоящее время не вызывает сомнения наличие тесной взаимосвязи и взаимодействия между двумя интегративными системами организма - нервной и иммунной (Девойно JI.B., Ильюченок Р.Ю., 1993; Корнева Е.А., 1993; Акмаев И.Г., 2002; Крыжановский и др., 2003; Морозов С.Г., 2005; Евсеев В.А., 2007; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л., 2009; Besedovsky H.G. et al., 1985; Blalock J.E., Smith E.M., 1985 и др.). Иммунная система реагирует образованием антител не только на высокомолекулярные вещества, но также и на низкомолекулярные вещества, в частности нейромедиаторы, что было убедительно продемонстрировано в работах И.Е.Ковалева и О.Ю.Полевой (1985), В.А.Евсеева (2007). В последнее время показано образование антител к нейромедиаторам и установлено защитное действие антител к серотонину на моделях алкоголизма (Давыдова Т.В. и др.., 1987-2001; Евсеев В.А. и др.., 1993-2005), наркомании (Башарова JI.A. и др., 1993; Евсеев В.А. и др.,1996), паркинсонизма (Крыжановский Г.Н. и др., 1991-1996), антител к глутамату при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003), нейропатическом болевом синдроме (Кукушкин М.Л., Игонькина С.И, Евсеев В.А., Ветрилэ Л.А., 2006). У больных болезнью Альцгеймера показано образование аутоантител к дофамину, норадреналину, серотонину, глутамату (Грудень М.А. и др., 2007; Давыдова Т.В. и др., 2006, 2007; Мягкова М.А. и др. 2001, 2003). Антитела к нейромедиаторам становятся объектом исследований в аспектах проблемы дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий (Крыжановский Г.Н., 2002; Евсеев В.А., 2007), составляющих основу различных нейропсихических нарушений при таких патологических процессах как болезнь Альцгеймера, ишемических повреждений головного мозга, психоэмоциональном стрессе. Особое внимание привлекает в этих процессах роль глутамата, исследуемая с помощью антител к нему.

Все вышеизложенное указывает на актуальность исследования роли антител к глутамату в механизмах развития нейродегенеративных расстройств ЦНС при болезни Альцгеймера и ишемических повреждениях мозга.

Цель исследования заключалась в изучении образования аутоантител к глутамату при болезни Альцгеймера и ишемических повреждениях мозга, выяснении их роли в развитии мнестических расстройств при моделировании экспериментальной болезни Альцгеймера и очагового ишемического повреждения префронтальной коры мозга.

Задачи исследования:

1. Исследовать образование аутоантител к глутамату у больных болезнью Альцгеймера.

2. Исследовать образование аутоантител к глутамату у больных с острым церебральным ишемическим инсультом.

3. Исследовать образование аутоантител к глутамату на Р-амилоидной модели болезни Альцгеймера и на модели очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом префронтальной коры.

4. Исследовать влияние интраназального введения антител к глутамату на выработку УРПИ у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.

5. Исследовать влияние интраназального введения антител к глутамату на сохранение УРПИ у животных с ишемическим повреждением мозга, вызванным двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры.

Научная новизна. Выявлены различия в содержании аутоантител к глутамату в сыворотках крови у больных с различными формами болезни Альцгеймера. Наиболее низкий уровень аутоантител к глутамату в сыворотке крови был обнаружен у больных с ранним началом болезни Альцгеймера. Впервые установлена взаимосвязь между тяжестью деменции при болезни Альцгеймера и содержанием аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных. Показано, что при умеренной тяжести деменции в сыворотках крови регистрируется наиболее высокий уровень аутоантител к глутамату. У больных с острым ишемическим инсультом выявлена усиленная продукция антител к глутамату. На экспериментальных моделях болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента А(325-35 |3-амилоидного белка в гигантоклеточные ядра Мейнерта, и ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры выявлено повышенное содержание аутоантител к глутамату в сыворотках крови животных. Впервые показано улучшение выработки УРПИ после интраназального введения антител к глутамату у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента Ар25-35. Впервые показано, что интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению УРПИ у крыс с ишемическими повреждениями мозга, вызванными двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры. Впервые выявлено защитное действие антител к глутамату в условиях усиленной продукции глутамата при остром и хроническом нейродегенеративном повреждении мнестических функций мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Получены свидетельства участия антител к глутамату в условиях усиленной продукции глутамата в нормализации нарушений памяти при остром и хроническом нейродегенеративном повреждении мозга, что расширяет существующие в настоящее время представления о дизрегуляционных механизмах нейроиммунных взаимодействий при

нейродегенеративной патологии. Полученные данные позволяют рассматривать антитела к глутамату как один из нейроиммунных маркеров для уточнения диагноза, выявления тяжести и прогнозирования течения болезни Альцгеймера и ишемического церебрального инсульта. Полученные результаты в дальнейшем могут являться основой для разработки иммунотерапии острых и хронических нейродегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие болезни Альцгеймера и острого ишемического церебрального инсульта сопровождается повышенным содержанием аутоантител к глутамату в сыворотках крови.

2. Интраназальное введение антител к глутамату улучшает выработку УРПИ у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента А025-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта.

3. Интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению УРПИ, выработанного до ишемического повреждения префронтальной коры крыс.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на Пятой Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2008); на Международной конференции «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» (Санкт-Петербург, 2007);

на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 72 отечественных и 153 иностранных источника. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 15 рисунков.

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенные исследования включали в себя клинический и экспериментальный разделы. Клинико-иммунологические наблюдения были проведены на 70 больных (женщинах) с болезнью Альцгеймера и 20 больных острым церебральным инсультом (8 мужчинах и 12 женщинах). Возраст больных составил от 65 до 95 лет. Контрольной группой были 52 психически здоровых добровольца (46 женщин и 6 мужчин) того же возраста.

В экспериментах использовались беспородные крысы и крысы линии Вистар. Во всех экспериментах использовали только самцов. В работе было использовано 75 крыс линии Вистар массой 280 - 330 г и 60 беспородных крыс массой 200 - 220 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. При работе с крысами соблюдались требования, утвержденные в УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

Для определения содержания аутоантител к глутамату в сыворотке крови у больных болезнью Альцгеймера (БА) кровь из локтевой вены брали в большинстве случаев однократно до лечения, у больных с острым церебральным инсультом три раза: в первые сутки при поступлении в больницу, на 7 сутки и на 21 сутки пребывания в стационаре. У контрольной группы здоровых добровольцев того же возраста кровь брали однократно.

У крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера кровь для определения антител к глутамату брали из хвостовой вены на 7, 15 и 21 сутки после билатерального введения нейротоксического фрагмента р-амилоидного белка A(i25-35 в п. Basalis magnocilluraris, а у крыс с ишемическим повреждением мозга при декапитации через 1 час, 4 и 7 суток после воспроизведения двустороннего фотохимического тромбоза сосудов прёфронтальной коры.

Антитела к глутамату определяли общепринятым методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в 96-луночных полистероловых плоскодонных планшетах (фирмы «Costar», USA). В качестве тест-антигена использовали конъюгат глутамата с бычьим сывороточным альбумином (БСА), синтезированным с помощью бифункционального реагента глутаральдегида (Seguela P. et al., 1984). Оптическую плотность в каждой лунке определяли при длине волны 492 нм с использованием Mini-reader (DYNATECH). Уровень антител к глутамату выражали в условных единицах активности — показателем, представляющим отношение оптической плотности сыворотки крови каждого обследуемого человека или животного к среднему значению сывороток крови здоровых доноров или интактных животных. Если значение этого отношения превышало 1, делали вывод о наличии антител в сыворотках крови.

Циркулирующие иммуиные комплексы определяли общепринятым методом преципитации в полиэтиленгликоле (П.В.Бариновский, В.С.Давилишина, 1983).

В работе использовали полученные в лаборатории нейроиммунопатологии УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии (руководитель - профессор ВА.Евсеев) антитела к глутамату. Антитела к глутамату получали иммунизацией кроликов по стандартной схеме, в качестве антигена использовали конъюгат глутамата с БСА, синтезированный с помощью бифункционального реагента глутаральдегида (Seguela P. et. al., 1984). В экспериментах использовали антитела к глутамату, очищенные от БСА методом аффинной хроматографии с использованием активированной бромцианом сефарозы (фирма «Sigma»). Титр антител к глутамату, определяемый методом иммуноферментного анализа, составил не менее 1:1 ООО.

В экспериментах водный раствор антител к глутамату во всех случаях вводили интраназально однократно через 1 час после операции в дозе 250-300 мкг/кг в объеме 10 мкл, в качестве контроля использовали у-глобулин от интактных кроликов в той же дозе и растворитель дистиллированную воду в том же объеме.

Моделирование болезни Альцгеймера проводили путем билатерального введения нейротоксического фрагмента Р-амилоидного белка Ар25.з5 (фирма "Sigma") в п. Basalis magnocilluraris в количестве 2 мкл раствора 0,4x10"9М (Harkany Т., O'Mahony S., et al. 1998). Выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проводили через 14 суток после оперативного вмешательства по стандартной методике (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств, 2005). Оценку двигательной активности у крыс в открытом поле осуществляли по стандартной методике в автоматизированном тесте по программе «AutoTrack» в системе «Opto-Varimex» («Columbus Instruments»),

Очаговое ишемическое повреждение префронтальной коры (поля Frl и Fr2) вызывали методом фотохимического тромбоза (Watson В. et al., 1985). У животных по стандартной методике до воспроизведения двустороннего ишемического повреждения мозга вырабатывали УРПИ. Сохранение рефлекса проверяли на 8 сутки после воспроизведения двустороннего фотохимического тромбоза. У животных также оценивали в автоматизированном тесте двигательную активность в открытом поле.

Статистическую обработку результатов проводили по алгоритмам программ "Primer" и "Statistica 6.0" с проверкой соответствия распределения эмпирических данных нормальному закону по критерию Колмогорова-Смирнова и проверкой равенства генеральных дисперсий в двух сравниваемых выборках. При сравнении нескольких независимых выборок, в которых распределение эмпирических данных соответствовало нормальному закону, применяли однофакторный дисперсионный анализ ONE WAY ANOVA с последующим сравнением средних значений в рядах дисперсионного комплекса по тесту Стъюдента-Ньюмана-Кеулса. При сравнении нескольких независимых выборок, в которых распределение эмпирических данных не соответствовало нормальному закону, применяли однофакторный непараметрический дисперсионный анализ по методу Крускалла-Уоллиса (Н-критерий) и с последующим post-hoc анализом по U-критерию Манна-Уитни. Данные представлены в виде М±т. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

АУТОАИТИТЕЛА К ГЛУТАМАТУ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ РАССТРОЙСТВАХ ЦНС

Аутоантитела к глутамату при болезни Альцгеймера.

Исследования по изучению образования аутоантител к глутамату проведены совместно с кандидатом медицинских наук Н.И.Воскресенской в 28 геронтологическом отделении Московской психиатрической больницы №1 им. Н.А.Алексеева (руководитель отделения - О.А.Доронина).

Наблюдения проведены на 70 больных женщинах больных болезнью Альцгеймера в возрасте от 65 до 95 лет. Исследуемая группа больных БА состояла из 17 больных с ранним началом БА, из 37 больных с поздним началом БА и 16 больных БА смешанного типа и 40 психически здоровых женщин того же возраста. Диагноз БА устанавливали на основании психиатрического, неврологического и психологического обследования, а также компьютерно-томографического исследования и магнитно-резонансной томографии головного мозга. При постановке диагноза использовали критерии ADRDA и МКБ 10-го пересмотра (ВОЗ. 1994). У больных БА при обследовании также использовалась шкапа MMSE (mini-mental state examination), который отражает ориентировку в месте и времени, концентрацию и внимание, память, речь, письмо. При этом проведенный скрининг по шкале MMSE у больных с когнитивными нарушениями выявил тяжелые нарушения ниже 10 баллов у 30 человек (в 42,8%). Выявленные когнитивные нарушения в 32,9 % (23 человека) наблюдались в виде умеренных расстройств (11-19 баллов) и в 24,3 % случаях (17 человек) - в виде легких расстройств (20-27 баллов).

В сыворотках крови больных БА обнаружено повышенное содержание аутоантител к глутамату (1,7±0,06 усл.ед.) по сравнению с их содержанием в сыворотках крови контрольной группы (1,0±0,09 усл.ед.) обследованных психически здоровых женщин того же возраста. У больных БА аутоантитела к глутамату были выявлены в 93% случаев. У психически здоровых обследованных женщин того же возраста они встречались в 13% случаев. Различий по частоте встречаемости аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных с ранним и поздним началом БА, а также у больных с БА смешанного типа выявлено не было. Наибольшее содержание аутоантител к глутамату в сыворотках крови было зарегистрировано у больных с поздним началом БА (1,8±0,07 усл.ед.). Уровень антител к глутамату в сыворотках крови в группе больных с ранним началом БА был наиболее низким (1,4±0,07 усл.ед.) и отличался от уровня аутоантител в группе с поздним началом БА (р<0,001). В группе больных БА смешанного типа уровень аутоантител к глутамату в сыворотках крови составил 1,60+0,01 усл.ед.. С целью изучения образования аутоантител к глутамату у больных БА в процессе развития заболевания была

исследована взаимосвязь между тяжестью развития деменции у больных с БА и содержанием аутоантител к глутамату в сыворотках крови.

Наиболее высокий уровень аутоантител к глутамату в сыворотках крови наблюдался у больных с умеренными проявлениями деменции, по сравнению с больными с «мягкой» и тяжелой формами деменции. Так, у больных с умеренной деменцией содержание аутоантител к глутамату в сыворотках крови составляло 1,9±0,07 усл.ед., в то время как содержание этих аутоантител в сыворотках крови больных мягкой и тяжелой деменцией было равно 1,1±0,05 и 1,4±0,08 усл.ед. соответственно. В сыворотках крови больных БА с разной тяжестью развития деменции было изучено содержание иммунных комплексов. У больных БА в сыворотках крови было зарегистрировано повышенное содержание иммунных комплексов, которое составило 32,9±3,9 усл.ед., в то время как в контрольной группе обследованных женщин того же возраста оно было равно 18,8±1,6 усл.ед. (р<0,001). Наибольшее содержание иммунных комплексов было обнаружено в сыворотках крови больных БА с «мягкой» деменцией (41,1±2,9 усл.ед.). У больных БА с умеренной и тяжелой деменцией содержание иммунных комплексов в сыворотках крови составило 26,3±2,2 усл.ед. и 19,3±1,8 усл.ед. соответственно. Вероятно, низкий уровень аутоантител к глутамату у больных с «мягкой» деменцией связан с нахождением определенного количества этих аутоантител в составе иммунных комплексов.

Таким образом, в результате проведенных наблюдений у больных БА выявлено повышенное содержание аутоантител к глутамату в сыворотках крови и установлены различия в продукции антител при различных ее формах. Так, при БА с ранним началом в сыворотках крови больных обнаружен наиболее низкий уровень аутоантител к глутамату. В то время как при смешанной форме БА и при позднем начале болезни Альцгеймера в сыворотках крови содержание аутоантител к глутамату выше, причем при позднем начале БА значительно выше, чем при раннем начале заболевания. Полученные различия в содержании антител к глутамату сыворотках крови больных с различными формами болезни Альцгеймера возможно могут свидетельствовать о различных механизмах развития, лежащих в их основе и о клинической гетерогенности БА. В результате проведенных наблюдений также была выявлена динамика образования аутоантител к глутамату у больных БА в зависимости от тяжести развития деменции. Пик образования аутоантител к глутамату наблюдался у больных с умеренными проявлениями деменции. Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы, свидетельствующими, что в этот период заболевания, характеризующейся развитием умеренной деменции, показано наиболее активное аутоантителообразование к другим нейротрофическим факторам, в частности к белку SlOOb, и нейромедиаторам серотонину, дофамину (Gruden М. et.al., 2007).

Аутоантитела к глутамату при остром ишемическом церебральном инсульте.

Исследования по изучению образования аутоантител к глутамату у больных с острым ишемическим церебральным инсультом проведены совместно с ведущим научным сотрудником функциональной нейрохимии (руководитель - профессор В.В.Шерстнев) УРАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина кандидатом биологических наук М.А. Грудень.

Наблюдения проведены на больных острым первичным ишемическим атеротромботическим церебральным инсультом, начиная с первых суток заболевания. По локализации очага поражения исследуемая группа распределилась на правополушарные (8 человек), левополушарные (12 человек) и вертебро-базилярные инсульты (2 человека). Анализ объема очага поражения при компьютерной томографии головного мозга обследуемых пациентов выявил очаговое поражение, которое имело объем до 40 см3. По степени выраженности неврологического дефекта по шкале NIH (National Institutes of Health (USA) Stroke Scale - NIH Stroke Scale) у обследуемых больных констатировался диапазон от 0 до 17 баллов, при этом больные были перманентно распределены в группы больных тяжелого состояния (по шкале NIH > 12 баллов) - 2 пациента, в группу средней степени тяжести (6-11 баллов) - 6 пациентов и т.н. легкие пациенты (0-5 баллов) - 12 пациентов.

Проведенный скрининг по шкале MMSE у больных с когнитивной дисфункцией у 14 человек (в 70%) выявлены легкие когнитивные расстройства (2427 баллов по шкале MMSE) и у 30% (6 человек) в виде умеренных расстройств (11-20 баллов).

В сыворотках крови больных с острым ишемическим церебральным инсультом на 1, 7 и 21 сутки развития инсульта обнаружено повышенное содержание аутоантител к глутамату, которое составило 1,8+0,12 усл.ед., 2,2+0,11 усл.ед. и 2,0+0,12 усл.ед. соответственно. В сыворотках крови контрольной группы обследованных добровольцев содержание аутоантител к глутамату составило 1,0+0,04 усл.ед. (р<0,05). Аутоантитела к глутамату у больных с острым ишемическим церебральным инсультом были выявлены в 100% случаев, в то время как у здоровых обследованных того же возраста они встречались в 12% случаев. На 7 сутки от начала развития острого ишемического церебрального инсульта обнаружен наиболее высокий уровень аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных по сравнению с первыми сутками заболевания. К 21 суткам заболевания уровень аутоантител к глутамату в сыворотках крови остается высоким, но незначительно снижается по сравнению с 7 сутками заболевания.

Несмотря на небольшое количество обследованных больных с острым церебральным ишемическим инсультом они были разделены в зависимости от результатов проведенного MMSE теста на группу больных с легкими когнитивными расстройствами (24-27 баллов по шкале MMSE) и на группу больных с умеренными когнитивными расстройствами (11-20 баллов). Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Заштрихованные столбики - группа больных с легкими когнитивными нарушениями, темные столбики - группа больных с умеренными когнитивными нарушениями.

* р<0,05 по сравнению с группой больных с легкими когнитивными нарушениями.

Рис. 1 Содержание аутоантител к глутамату в сыворотке у больных с легкими и умеренными когнитивными нарушениями при остром церебральном ишемическом инсульте

Как видно из рисунка содержание аутоантител к глутамату в группе больных с легкими когнитивными нарушениями выше, чем в группе больных с умеренными когнитивными нарушениями, что наиболее заметно в первые сутки развития инсульта, когда уровень аутоантител существенно выше у больных с легкими когнитивными нарушениями.

Полученные данные хорошо согласуются с данными других исследователей, свидетельствующими об образовании нейротропных аутоантител в эти же сроки развития инсульта (аутоантитела к белку вЮОЬ, вРАР, МР-65, ФРН, к глутаматным рецепторам). Эти данные показывают, что для больных с хорошим и удовлетворительным восстановлением функций ЦНС после перенесенного инсульта типичен рост сывороточного содержания нейротропных аутоантител продолжительностью до 3-5 недель (Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, 2001; А.Б.Полетаев, 2008). Возможно, транзиторное повышение продукции аутоантител к антигенам нервных клеток и нейротрофическим факторам обуславливается возрастающими потребностями в более интенсивном связывании и удалении избыточно образуемых продуктов распада в нервной ткани. По всей вероятности усиленная продукция аутоантител к глутамату у больных с острым ишемическим церебральным инсультом является реакцией иммунной системы на повреждение ткани мозга глутаматом.

Подводя итоги клинических наблюдений можно прийти к заключению, что антитела к глутамату могут служить нейроиммунным маркером для уточнения диагностики, выявления тяжести и прогнозирования течения острых и хронических нейродегенеративных повреждений мозга, в частности болезни Альцгеймера, острого церебрального ишемического инсульта.

Роль аутоантител к глутамату, которые образуются в организме при болезни Альцгеймера и остром церебральном ишемическом инсульте в настоящее время не ясна. В последнее время показано защитное действие антител к глутамату при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003, Евсеев В.А., 2007),

нейропатическом болевом синдроме (Кукушкин М.Л., Игонькина С.И, Евсеев В.А., Ветрнлэ Л.А., 2006), экспериментальном паркинсоническом синдроме, вызванном введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Давыдова Т.В., Фомина В.Г., Горбатов В.Ю., 2008), психоэмоциональном стрессе (Евсеев В.А., Захарова И.А., Ветрилэ Л.А., 2009).

В связи с этим особый интерес представляло изучить в эксперименте роль антител к глутамату при расстройствах памяти, которые являются основным проявлением болезни Альцгеймера. При острых церебральных ишемических инсультах также часто наблюдаются расстройства памяти, связанные с повреждением соответствующих областей мозга. В связи с этим экспериментальные исследования были связаны с изучением роли антител к глутамату при расстройствах памяти, вызванных введением нейротоксического фрагмента А(525-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта и вызванных ишемическим повреждением префронтальной коры головного мозга.

ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ НА ВЫРАБОТКУ УРПИ У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА

Введение Ар25-з5 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, проявляющиеся в развитии нарушений памяти у животных (йюуапеШ Ь. е1 а1., 1995; Нагкапу Т. е( а!., 1998). Эта экспериментальная модель была интересна для исследований в связи с тем, что эти фрагменты р-амилоида обладают нейротоксическими свойствами, которые реализуются через различные механизмы: через усиление эксайтотоксических свойств глутамата, нарушение гомеостаза ионов кальция, усиление оксидативного стресса, индукцию апоптоза и энергетическое истощение клеток (Нагкапу Т., 2000). Все эти процессы взаимосвязаны, но, по крайней мере, в эксайтотоксичности и нарушениях гомеостаза кальция непосредственное участие принимает глутаматергическая система, а остальные два реализуются с участием последней. В связи с вышеизложенным, было интересно попытаться прервать цепь развития нейрональных дегенеративных нарушений, вызываемых развитием эксайтоксического каскада, запускаемого глутаматом, и приводящих к развитию мнестического дефицита, с помощью антител к глутамату. Антитела к глутамату вводили интраназально в дозе 300 мкг/кг через час после проведения стереотаксической операции по двустороннему введению нейротоксического фрагмента Ар25.з5 в гигантоклеточные ядра Мейнерта, когда как предполагалось, начинают запускаться связанные с глутаматом нейротоксические эффекты. Интраназальный путь введения антител к глутамату позволяет доставить их быстро непосредственно в мозг (Talengaonkar в., К^Ьга Р.Я., 2004). Вводимая доза антител к глутамату (Глу-АТ) была выбрана по работам, связанным с введением пептидных веществ (Романова Г.А. и др., 2006).

В качестве теста на нарушения памяти была выбрана способность крыс к обучению УРПИ, который исследовали на 14 сутки после двустороннего введения

нейротоксического фрагмента Ар25.35 в базальные гигантоклеточные ядра Мейнерта, когда наблюдаются выраженные нарушения обучения и памяти у животных на этой модели (Нагкапу Т. е1 а1., 1998).

Крысы были разделены на пять групп: И - интактные, ЛО ложнооперированные; Ар25.з5+Н20 - крысы с двусторонним введением нейротоксического фрагмента Р-амилоидного белка Ар25-35> которым через 1 ч после операции вводили интраназально по 10 мкл дистиллированной воды; АР25_з5+Глу-АТ — животные, которым по той же схеме вводили интраназально водный раствор Глу-АТ в дозе 300 мкг/кг; Ар25.з5+углобулин - животные, которым в качестве контроля вводили водный раствор кроличьего углобулина от интактных животных по той же схеме и в той же дозе. Выработку УРПИ проводили через 14 суток после проведения операции введения нейротоксического фрагмента Ар25_з5. После окончания исследования выработки УРПИ проводили изучение двигательной активности у животных всех подопытных групп.

В результате проведенных экспериментов выявлены существенные различия между пятью исследуемыми группами по показателю ЛП2: Н(4,1Ч=74)=20,'46253, р=0,0004, а также по показателю АЛП: Н(4;Ы=74)=23,56948, р=0,0001.

1 - интактые крысы,

2 - ложнооперированные крысы,

3 - крысы с введением АР25-35,

4 - введение А(¡25-з5+Глу-А Т,

5 - введение А025-з5+7-глобулин *р<0,05 по сравнению с введением А025-з5

Рис.2 Влияние интраназального введения антител к глутамату на выработку УРПИ при экспериментальной БА, вызванной введением А(¡¡5-35 в базальные ядра Мейнерта

Как видно из рисунка 2 у крыс на 14 сутки после билатерального введения в мозг АР25-35 развились значительные нарушения памяти, выражающиеся в уменьшении степени запоминания (АЛП) по сравнению с контролем по ТЛ-критерию (р<0,05).

При выработке УРПИ электрошок в контроле запомнили 70% крыс, в то время как у опытных крыс - только 25% животных, что свидетельствует об амнестическом эффекте Ар25-з5- При интраназальном введении Глу-АТ крысам через час после введения Ар25.35 было показано, что через 14 суток при выработке УРПИ степень запоминания (АЛП) у них не отличалась от контрольных животных и они запомнили электрошок в 77% случаев. Интраназальное введение Глу-АТ уменьшало мнестический дефицит, вызванный введением в ядра Мейнерта Ар25.35, более чем в четыре раза. Интраназальное введение у-глобулина крысам в качестве контроля через

час после введения А(325-35 не оказало влияния на запоминание ими электрошока. Запоминание электрошока у этих животных было зарегистрировано в 28% случаев. По показателям ЛП2 и АЛП крысы, которым вводили интраназально у-ппобулин, не отличались от животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.

При проведении специальных экспериментов по изучению влияния интраназального введения Глу-АТ на выработку УРПИ у интактных крыс было установлено отсутствие эффекта Глу-АТ на мнестические функции. Так, введение Глу-АТ здоровым крысам не приводило к изменению степени запоминания (ДЛП) по сравнению с контрольными животными, и он составлял 147,8±26,2 с и 142,4±30,7 с соответственно.

При исследовании двигательной активности животных было выявлено снижение горизонтальной активности у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера. У крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, которым вводили интраназально антитела к глутамату в дозе 300 мкг/кг и нормальный кроличий у-глобулин горизонтальная двигательная активность не отличалась от интактных и ложнооперированных животных (рисунок 3). Вертикальная двигательная активность существенно не различалась во всех исследуемых группах животных.

1- интактные крысы,

2-ложнооперированные крысы,

3 - крысы с введением АР25-35,

4 - крысы с введением А/325.з5+Гл)'-АТ

5 - крысы с введением Ар25.з5+у-глобулнн

Рис.3 Влияние интраназального введения антител к глутамату на горизонтальную двигательную активность крыс при экспериментальной БА, вызванной введением АР25-35 в базальные ядра Мейнерта

У крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера была изучена индукция аутоантител к глутамату. Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из таблицы у крыс на 7 сутки после двустороннего введения нейротоксического фрагмента АР25-35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта в сыворотках крови обнаружены аутоантитела к глутамату, уровень которых не изменялся до 15 суток и к 21 суткам практически не отличался от уровня у интактных и ложнооперированных животных. Получен интересный факт, свидетельствующий о существенно более высоком содержании аутоантител к глутамату у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, получавших интраназально антитела к глутамату.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было подтверждено описанное ранее нарушение воспроизведения УРПИ при двустороннем введении в гигантоклеточные ядра Мейнерта нейротоксического фрагмента [3-амилоидного белка А-Р25-35 (Нагкапу Т. е1 а1., 1998). Экспериментально установлено улучшение воспроизведения УРПИ у крыс через 24 часа после обучения при интраназальном введении антител к глутамату через час после введения нейротоксического фрагмента А(325-з5 в ядра Мейнерта. Интраназальное введение у-глобулина через час после введения АР25-35 не приводило к коррекции нарушений памяти. Было также установлено отсутствие эффекта антител к глутамату на выработку УРПИ у интактных крыс. Таким образом, антитела к глутамату оказывают защитный эффект на нарушения памяти в условиях избыточной продукции глутамата и не оказывают эффекта на память у здоровых животных.

Таблица 1

Содержание аутоантител к глутамату на различных сроках развития экспериментальной БА, вызванной введением А[¡25-35 в базальные ядра Мейнерта.

Группа животных Содержание Глу-АТ в сыворотке крови, усл.ед.

7 сутки 15 сутки 21 сутки

Интактные крысы (п=15) 1,0±0,01 1,0±0,01 1,0±0,01

Ложнооперированные крысы (п=15) 1,1 ±0,03 0,96±0,02 1,00±0,02

Крысы с введением АР25-35 (п=15) 1,2±0,02* 1,2±0,01* 1,1 ±0,05

Крысы с введением Ар25-з5+Глу-АТ (п=15) 1,5±0,06*# 1,2±0,01 * 0,95±0,04

Крысы с введением АР25-з5+У-глобулин (п=15) 1,2±0,01 1,2±0,06* 1,05±0,04

Примечание: * р<0,05 по сравнению с интактными животными, # р<0,05 по сравнению с с введением А 025-35-

ВЛИЯНИЕ АНТИТЕ К ГЛУТАМАТУ НА СОХРАНЕНИЕ УРПИ У КРЫС С ОСТРЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ ПОВРЕЖДЕНИЕМ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ

МОЗГА

Все исследования по изучению продукции антител к глутамату и их роли при ишемических повреждениях мозга проводились совместно с сотрудниками лаборатории по изучению ишемических повреждений мозга с.н.с. к.м.н. Ф.М.Шаковой и м.н.с. Ю.Н.Квашенниковой.

В качестве экспериментальной модели ишемического повреждения головного мозга была выбрана хорошо разработанная модель двустороннего ишемического

повреждения префронтальной коры мозга крыс методом фотохимического тромбоза (Watson В.D.,1998). Ранее было показано (Романова Г.А. и др.), что фотохимически индуцируемый двусторонний тромбоз кровеносных сосудов в префронтальной области коры головного мозга крыс приводит к формированию ишемического очага, при этом в очаге установлено повышенное содержание глутамата (Романова Г.А., 2002). Такое повреждение префронтальной коры приводит к значительным нарушениям памяти, в частности, к потере выработанного условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) (Романова Г.А., и др., 1998, Романова Г.А., 2002).

Все взятые в эксперимент животные были разделены на две части. У первой части крыс изучали образование аутоантител к глутамату в сыворотке крови после воспроизведения двустороннего ишемического инфаркта префронтальной коры головного мозга через 1 час, на 4 и 8-ые сутки после операции.

Вторая часть крыс была разделена на четыре группы: JTO (п=10) -ложнооперированные; Иш+Н20 (п=12) — крысы с двусторонним ишемическим инфарктом префронтальной коры головного мозга, которым через 1 ч после операции вводили интраназально по 10 мкл дистиллированной воды (п=10); Иш+Глу-АТ (п=10) - животные, которым по той же схеме вводили интраназально водный раствор Глу-АТ в дозе 250 мкг/кг; Иш+уГЛ (п=10) - животные, которым в качестве контроля вводили водный раствор кроличьего у-глобулина от интактных животных по той же схеме и в той же дозе.

Взятие крови у крыс осуществляли через час после операции, на 4 и 8 сутки. При исследовании содержания аутоантител к глутамату в сыворотках крови крыс с фокальным ишемическим очагом в префронтальной коре через час, на 4 т и 8 сутки после операции фототромбоза в сравнении с контрольными ложнооперированными и интактными крысами были выявлены существенные различия между исследуемыми группами: H(4,N=31)= 17,54946, р=0,0015. Полученные результаты представлены на рисунке 4.

1 - интактные,

2 - ложнооперированные,

3-1 час после ишемии,

4-4 сутки после ишемии,

5-7 сутки после ишемии. *р<0,05 по сравнению с интактными животными.

Рис. 4 Антитела к глутамату при двустороннем фототромбозе префронтальной коры мозга крыс

Как видно из рисунка уровень аутоантител к глутамату в сыворотках крови интактных и ложнооперированных животных не различался. Через 1 час после фотохимического повреждения фронтальной коры мозга уровень аутоантител к глутамату не отличался от их уровня у контрольных животных и сохранялся на этом уровне и на 4 сутки после операции. На 8-ые сутки в сыворотке крови крыс с фотохимическим двусторонним тромбозом кровеносных сосудов префронтальной области коры головного мозга резко возрастало содержание аутоантител к глутамату, что связано с реакцией иммунной системы на усиленную продукцию глутамата при развитии ишемического повреждения и проявляется повышенной выработкой антител.

Во второй части работы было изучено влияние антител к глутамату на сохранение УРПИ, выработанного до нанесения ишемического повреждения коры. В качестве способа доставки антител к глутамату в головной мозг был выбран, как в предыдущем разделе работы, интраназальный путь введения антител. Антитела к глутамату вводили в острый период эксайтотоксичности глутамата, когда еще очень низок уровень эндогенных аутоантител к глутамату, т.е. через 1 час после проведения операции по воспроизведению фотохимического тромбоза сосудов коры.

Интраназальное введение антител к глутамату в дозе 250 мкг/кг через 1 час после операции способствовало сохранению уровня УРПИ у крыс с двусторонним фототромбозом префронтальной коры до уровня у интактного контроля при проверке сохранения УРПИ на 8 сутки после ишемического повреждения. Интраназальное введение у-глобулина от интактных кроликов не оказывало влияния на потерю выработанного до ишемии УРПИ. Результаты представлены на рисунке 5.

350

300

и 250 Ч

| 200 £ 150 £ 100 50

X Г1!

1 - интактные,

2 - ложнооперированные,

3 - ишемическое повреждение,

4 - интраназальное введение Глу-А Т+ишемическое повреждение,

5 - интраназальное введение гамма-глобулина + ишемическое повреждение

*р <0,05 по сравнению с интактными.

группы ЖИВОТНЫХ

Рис. 5 Влияние интраназального введения антител к глутамату на сохранение УРПИ у крыс с двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры мозга

У животных после проверки сохранения УРПИ исследовали также двигательную активность в открытом поле. На 9-й день после воспроизведения ишемического повреждения префронтальной коры во всех экспериментальных группах не было выявлено существенных различий в горизонтальной и вертикальной

двигательной активности, что согласуется с ранее полученными данными (Шакова Ф.М., 2004).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено усиленное образование аутоантител к глутамату у животных с двусторонним ишемическим повреждением префронтальной области коры головного мозга к 8-ым суткам после операции. Показано, что антитела к глутамату при их интраназальном введении через час после операции ликвидируют нарушения памяти у крыс с ишемическим повреждением префронтальной коры головного мозга. Интраназальное введение гамма-глобулина через час после операции не приводило к коррекции нарушений памяти. Антитела к глутамату проявляют защитный антиамнестический эффект в условиях избыточного высвобождения глутамата.

Подводя итоги экспериментальных исследований на двух моделях острого и хронического нейродегенеративного повреждения мозга можно прийти к выводу, что антитела к глутамату оказывают однотипный защитный эффект на нарушения памяти в условиях избыточной продукции глутамата. Антитела к глутамату являются эндогенными защитными факторами, вырабатывающимися в организме в ответ на избыточную продукцию глутамата, ведущую к гибели нейронов. Усиленная продукция антител к глутамату начинается не с первых часов повреждения, а позже к 7 суткам, как показано на двух моделях нейродегенеративных повреждений головного мозга. В связи с этим интраназальное введение антител к глутамату в начальном периоде избыточной продукции глутамата, ведущей к дегенерации нейронов, оказалось высокоэффективным для восстановления способности у животных к обучению в тесте УРПИ. Можно предположить, что в механизмах действия антител к глутамату лежит их способность снижать избыточное содержание глутамата в структурах мозга, в частности в префронтальной коре, гипоталамусе, гипокампе, ядрах Мейнерта и тем самым защищать нейроны от гибели. В исследованиях В.А.Евсеева и сотрудников (2006-2009) показано, что системное введение антител к нейромедиаторам (дофамину, серотонину) может изменять содержание нейромедиаторов в структурах мозга.

При болезни Паркинсона, другом хроническом нейродегенеративном заболевании, наряду с повреждением нигростриатной дофаминергической системы, недостаточность которой играет ключевую роль в патогенезе этого заболевания, нарушение глутаматергической нейротрансмиссии, как показано в настоящее время, также является одним из существенных механизмов, лежащих в основе гибели нейронов при этом страдании (Магаева C.B., Кучеряну В.Г., Карабань И.Н., 2002; Meldrum В.S., 2000). В последнее время было показано, что как предварительное, так и одновременное интраназальное введение антител к глутамату мышам С57В1/6 с паркинсоническим синдромом, вызванным введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), приводило к ослаблению выраженности признаков синдрома (Давыдова Т.В. и др., 2008). Наибольший эффект антител к глутамату проявлялся в ослаблении таких признаков паркинсонического синдрома как тремор и ригидность. Антитела к глутамату вызывали также увеличение скорости

перемещения животных в открытом поле, что свидетельствует об ослаблении брадикинезии у мышей С57В1/6 с МФТП индуцированным паркинсоническим синдромом. Таким образом, антитела к глутамату и при экспериментальном паркинсоническом синдроме, вызванном введением МФТП, оказывают защитное действие, уменьшая его развитие.

Таким образом, полученные данные можно рассматривать как одно из экспериментальных доказательств защитного действия антител к глутамату при острых и хронических нейродегенеративных повреждениях мозга. В настоящее время установлено, что антитела к глутамату оказывают защитный эффект при других формах нейропатологии: при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003), нейропатическом болевом синдроме (Кукушкин М.Л., и др., 2006), психоэмоциональных стрессорных реакциях (Евсеев В.А. и др., 2009).

В целом, полученные данные позволяют надеяться, что в дальнейшем антитела к глутамату могут найти свое место при разработке иммунологических подходов к патогенетической терапии острых и хронических нейродегенеративных повреждений головного мозга, а также других форм нейроиммунопатологии.

ВЫВОДЫ

1. Развитие болезни Альцгеймера и острого ишемического церебрального инсульта характеризуется повышенным содержанием в сыворотках крови аутоантител к глутамату.

2. Продукция аутоантител к глутамату различается при разных формах болезни Альцгеймера. Раннее начало заболевания сопровождается меньшим содержанием аутоантител к глутамату по сравнению с поздним началом и смешанной формой болезни Альцгеймера.

3. Продукция аутоантител к глутамату зависит от тяжести развития болезни Альцгеймера. Уровень аутоантител к глутамату при «мягкой» деменции в сыворотках крови больных не отличается от группы возрастного контроля. Существенное увеличение содержания аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных наблюдается в период умеренной деменции, при развитии тяжелой деменции их уровень снижается.

4. На модели болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-Э5 в гигантоклеточные ядра Мейнерта мозга крыс, и на модели очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры крыс, выявлено увеличение содержания аутоантител к глутамату в сыворотках крови животных.

5. Однократное интраназальное введение антител к глутамату улучшает воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания у крыс на модели болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта.

6. При очаговом ишемическом повреждении мозга крыс, вызванном двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры, однократное интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению условного рефлекса пассивного избегания, выработанного до повреждения коры у крыс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Давыдова Т.В., Воскресенская Н.И., Горбатов В.Ю., Фомина В.Г., Доронина О.А., Максунова И.В. Особенности образования аутоантител к глутамату при деменциях альцгеймеровского типа // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 147. - № 4. - С.385-387.

2. Давыдова Т.В., Воскресенская Н.И., Фомина В.Г., Доронина О.А., Максунова И.В., Горбатов В.Ю. Антитела к глутамату - возможный нейроиммунный маркер деменций альгеймеровского типа. И Патогенез. - 2008. - № 2. - С. 2830.

3. Давыдова Т.В., Романова Г.А., Горбатов В.Ю., Шакова Ф.М., Квашенникова Ю.Н., Фомина В.Г. Влияние антител к глутамату на память крыс с экспериментальными острыми и хроническими нейродегенеративными повреждениями мозга // Патогенез. - 2008. - № 1. - С.5-9.

4. Davidova T.V., Voskresenskaya N.I., Fomina V.G., Vetrile L.A., Gorbatov V.Yu., Doronina O.A., Maksunova I.V. Glutamate antibodies and Alzheimer's disease. Interaction of the nervous and immune systems in health and disease. 2007, May 31-June 2 2007. - Abstracts. - P. 19.

5. Davydova T.V., Voskresenskaya N.I., Fomina V.G., Vetrile L.A., Gorbatov V.Yu., Doronina O.A. Glutamate antibodies - neuroimmune marker of glutamate disorders in Alzheimer's disease // CESKA A SLOVENSKA PSYCHIATRIE JOURNAL OF CZECH AND SLOVAK PSYCHIATRY. XIV WORLD CONGRESS OF PSYCHIATRY. 20-25 SEPTEMBER 2008 PRAGUE, CZECH REPUBLIC. Abstacts. 2008. - Vol.104. - suppl. 2. - P.985.

6. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Горбатов В.Ю., Квашенникова Ю.Н., Давыдова Т.В. Антитела к глутамату при экспериментальном очаговом ишемическом повреждении коры головного мозга крыс. // Патогенез,- 2008. - №2,- С. 58.

7. Горбатов В.Ю., Квашенникова Ю.Н. Антитела к глутамату при экспериментальном очаговом ишемическом повреждении коры головного мозга крыс // Тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 2008. - С.110.

8. Горбатов В.Ю., Фомина В.Г., Давыдова Т.В. Влияние антител к глутамату на память крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера // Нейроиммунология. - 2009,- Т. 8. - №1. -С.26-27

9. Романова Г.А., Шакова Ф.М., Горбатов В.Ю., Квашенникова Ю.Н., Давыдова Т.В. Антитела к глутамату при экспериментальном ишемическом повреждении головного мозга // Нейроиммунология. - 2009. - Т. 8. - №1. - С. 89

Gorbatov Victor Yurievich GLUTAMATE ANTIBODIES IN BRAIN NEURODEGENERATIVE DISORDERS

Changes in the level of glutamate autoantibodies in blood serum were investigated in patients with Alzheimer's disease and ischemic cerebral insults. Generated glutamate autoantibodies were measured by ELISA in patient blood sera. Alzheimer's disease and ischemic insults were accompanied by the increase in level of glutamate autoantibodies in blood sera. Distinctions in glutamate autoantibodies level were revealed at early and late onset of Alzheimer's disease. Moderate alterations in cognitive functions in Alzheimer's disease patients correlated with high levels of glutamate antibodies.

In experimental part of work was shown, that bouth acute ischemic damage of prefrontal areas of the cortex and chronic damage induced of injection beta-amyloid protein neurotoxic fragment AP25-35 in n. Basalis magnocilluraris cause disorders in memory. Intranasal injection of glutamate antibodies in doses 250-300 mkg/kg over hour after damage leads to restoration of learning ability and reproduction of passive avoidance reflex aquired before ischemic damage.

Заказ № 41-а/02/10 Подписано в печать 10.02.2010 Тираж 120 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Актуальность исследования. Нейродегенеративные заболевания ЦНС, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, ишемические повреждения мозга в связи со старением населения занимают все большую долю в структуре заболеваемости в развитых странах мира. Затраты на их терапию сопоставимы с затратами на сердечно-сосудистые и онкологические заболевания. К наиболее тяжелым последствиям нейродегеративных расстройств ЦНС можно отнести прогрессирующее снижение когнитивных функций, проявляющее в развитии деменции, приводящее больных к выраженной социальной дезадаптации, невозможности самообслуживания,, резкому снижению качества жизни, не только самих больных, но их родственников. Наиболее частой причиной деменции в пожилом возрасте является болезнь Альцгеймера, сосудистые ишемические нарушения и др. (Гаврилова С.И., 2002; Дамулин И.В., 2002; Яхно H.H., Преображенская И.С., 2002; Ritchie R., Lovestone S., 2002; Sikström, S., 2007). Деменции альцгеймеровского типа встречаются в возрасте 65-69 лет 1,4-5,% случаев, а к 80-90 годам жизни уже в 29,8% случаев (Jörn А. et al., 1987; Evans D. et al., 1989). По данным НЦПЗ РАМН до 4,5-5,0% населения Москвы страдают деменциями альцгеймеровского типа (Гаврилова С.И., 2002). В связи с быстро увеличивающимся количеством больных с нейродегенеративными заболеваниями, связанными с развитием прогрессирующего слабоумия, изучение механизмов развития когнитивных расстройств и поиск новых подходов к их профилактике и патогенетической терапии представляет собой актуальную проблему современной медицины и имеет важное социально-экономическое значение.

Современные представления о нейробиологических и патофизиологических механизмах развития болезни Альцгеймера -хронического нейродегенеративного заболевания пожилого и старческого возраста, характеризующегося церебральной атрофией, связывают с отложением фибриллярного ^-амилоидного белка в виде сенильных бляшек и перерождением нейрофибрилл с образованием нейрофибриллярных клубков, развитием оксидативного стресса, ведущих к нарушению холинергической нейтротрансмиссии и связанных с ее нарушением развитием когнитивного дефицита (Гаврилова С.И., 1999, Дамулин И.В., 2002). В последнее десятилетие получены убедительные доказательства, свидетельствующие о вовлеченности в нейродегенеративный процесс, лежащий в основе болезни Альцгеймера, не только холинергической системы, но и других нейротрансмиттерных систем, в том числе глутаматергической, по последним данным играющей ключевую роль в механизмах развития этого заболевания (Fransis Р.Т., 2004; Hynd M.R. et al., 2004). Нарушение глутаматергической системы также играет основную роль в механизмах развития нейродегенерации, связанной с ишемическими повреждениями мозга и развитием сосудистых деменций (Meldrum B.S., 2000; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Salinska Е. et al., 2005гГомазков О.А.,2009). Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором в ЦНС, участвующим во многих процессах в мозге, включая и когнитивные функции (Danysz W. et al., 2000; Mark L.P. et al. 2001). Избыточная активация глутамата оказывает нейротоксическое действие, обуславливая из-за длительного притока кальция гибель кортикальных и субкортикальных нейронов, что в итоге ведет к основному проявлению деменций - развитию прогрессирующего слабоумия. Одним из механизмов регуляции уровня глутамата могут быть антитела к нему, вырабатывающиеся на его избыточное длительное высвобождение в ЦНС, а также антитела к глутаматным рецепторам, впервые выявленные при острых ишемических инсультах (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).

В настоящее время, не вызывает сомнения наличие тесной взаимосвязи и взаимодействия между двумя интегративными системами организма -нервной и иммунной (Besedovsky H.G. et al., 1985; Blalock J.E., Smith E.M., 1985; Девойно JI.B., Ильюченок Р.Ю., 1993; Корнева Е.А., 1993; Акмаев

И.Г., 2002; Крыжановский и др., 2003; Морозов С.Г., 2005; Евсеев В.А., 2007; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л., 2009 и др.). Иммунная система реагирует образованием антител не только на высокомолекулярные вещества, но также и на низкомолекулярные вещества, в частности нейромедиаторы, что было убедительно продемонстрировано в работах И.Е.Ковалева и О.Ю.Полевой (1985), В.А.Евсеева (2007). В последнее время показано образование антител к нейромедиаторам и установлено защитное действие антител к серотонину на моделях алкоголизма (Давыдова Т.В. и др., 1987-2001; Евсеев В.А. и др., 1993-2005), наркомании (Башарова Л.А. и др., 1993; Евсеев В.А. и др., 1996), паркинсонизма (Крыжановский Г.Н. и др., 1991-1996), антител к глутамату, при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003), нейропатическом болевом синдроме (Кукушкин М.Л., Игонькина С.И, Евсеев В.А., Ветрилэ Л.А., 2006). У больных болезнью Альцгеймера показано образование аутоантител к дофамину, норадреналину, серотонину, глутамату (Мягкова М.А. и др. 2001, 2003; Грудень М.А. и др., 2007; Давыдова Т.В. и др., 2006, 2007). Антитела к нейромедиаторам становятся объектом исследований в аспектах проблемы дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий (Крыжановский Г.Н., 2002; Евсеев В.А., 2007), составляющих основу различных нейропсихических нарушений при таких патологических процессах как болезнь Альцгеймера, ишемических повреждений головного мозга, психоэмоциональном стрессе. Особое внимание привлекает в этих процессах роль глутамата, исследуемая с помощью антител к нему.

Все вышеизложенное указывает на актуальность исследования роли антител к глутамату в механизмах развития нейродегенеративных расстройств ЦНС при болезни Альцгеймера и ишемических повреждениях мозга.

Цель исследования заключалась в изучении образования аутоантител к глутамату при болезни Альцгеймера и ишемических повреждениях мозга, выяснении их роли в развитии мнестических расстройств при моделировании экспериментальной болезни Альцгеймера и очагового ишемического повреждения префронтальной коры мозга.

Задачи исследования:

1. Исследовать образование аутоантител к глутамату у больных болезнью Альцгеймера.

2. Исследовать образование аутоантител к глутамату у больных с острым церебральным ишемическим инсультом.

3. Исследовать образование аутоантител к глутамату на р-амилоидной модели болезни Альцгеймера и на модели очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом префронтальной коры.

4. Исследовать влияние интраназального введения антител к глутамату на выработку УРПИ у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.

5. Исследовать влияние интраназального введения антител к глутамату на сохранение УРПИ у животных с ишемическим повреждением мозга, вызванным двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры.

Научная новизна. Выявлены различия в содержании аутоантител к глутамату, в сыворотках крови у больных с различными формами болезни Альцгеймера. Наиболее низкий уровень аутоантител к глутамату в сыворотке крови был обнаружен у больных с ранним началом болезни Альцгеймера. Впервые установлена взаимосвязь между тяжестью деменции при болезни Альцгеймера и содержанием аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных. Показано, что при умеренной тяжести деменции в сыворотках крови регистрируется наиболее высокий уровень аутоантител к глутамату. У больных с острым ишемическим инсультом выявлена усиленная продукция антител к глутамату. На экспериментальных моделях болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента А(325-35 Р-амилоидного белка в гигантоклеточные ядра Мейнерта, и ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры, выявлено повышенное содержание аутоантител к глутамату в сыворотках крови животных. Впервые показано улучшение выработки УРПИ после интраназального введения антител к глутамату у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35. Впервые показано, что интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению УРПИ у крыс с ишемическими повреждениями мозга, вызванными двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры. Впервые выявлено защитное действие антител к глутамату в условиях усиленной продукции глутамата при остром и хроническом нейродегенеративном повреждении мнестических функций мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Получены свидетельства участия антител к глутамату в условиях усиленной продукции глутамата в нормализации нарушений памяти при остром и хроническом нейродегенеративном повреждении мозга, что расширяет существующие в настоящее время представления о дизрегуляционных механизмах нейроиммунных взаимодействий при нейродегенеративной патологии. Полученные данные позволяют рассматривать антитела к глутамату как один из нейроиммунных маркеров для уточнения диагноза, выявления тяжести и прогнозирования течения болезни Альцгеймера и ишемического церебрального инсульта. Полученные результаты в дальнейшем могут являться основой для разработки иммунотерапии острых и хронических нейродегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие болезни Альцгеймера и острого ишемического церебрального инсульта сопровождается повышенным содержанием аутоантител к глутамату в сыворотках крови.

2. Интраназальное введение антител к глутамату улучшает выработку УРПИ у крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта.

3. Интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению УРПИ, выработанного до ишемического повреждения префронтальной коры мозга крыс.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на Пятой Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2008); на Международной конференции «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» (Санкт-Петербург, 2007); на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

ВЫВОДЫ

1. Развитие болезни Альцгеймера и острого ишемического церебрального инсульта характеризуется повышенным содержанием в сыворотках крови аутоантител к глутамату.

2. Продукция аутоантител к глутамату различается при разных формах болезни Альцгеймера. Раннее начало заболевания сопровождается меньшим содержанием аутоантител к глутамату по сравнению с поздним началом и смешанной формой болезни Альцгеймера.

3. Продукция аутоантител к глутамату зависит от тяжести развития болезни Альцгеймера. Уровень аутоантител к глутамату при «мягкой» деменции в сыворотках крови больных не отличается от группы возрастного контроля. Существенное увеличение содержания аутоантител к глутамату в сыворотках крови больных наблюдается в период умеренной деменции, при развитии тяжелой деменции их уровень снижается.

4. На модели болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта мозга крыс, и на модели очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры крыс, выявлено увеличение содержания аутоантител к глутамату в сыворотках крови животных.

5. Однократное интраназальное введение антител к глутамату улучшает воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания у крыс на модели болезни Альцгеймера, вызванной введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в гигантоклеточные ядра Мейнерта.

6. При очаговом ишемическом повреждении мозга, вызванном двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры, однократное интраназальное введение антител к глутамату способствует сохранению условного рефлекса пассивного избегания, выработанного до повреждения коры у крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема изучения фундаментальных механизмов нейродегенеративных повреждений головного мозга становится в настоящее время одной из важнейших проблем для нейробиологии, патофизиологии и медицины. По существующим представлениям к развитию острых и хронических нейродегенеративных расстройств ЦНС могут приводить нарушения функционирования различных механизмов: нейрофизиологических, нейромедиаторных, молекулярных (Гаврилова С.И., 1999; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Salinsnska Е. Et al.; Fransis Р.Т. et al.; Law A., Gauthier S., Quirion R., 2001; Won S.J., Kim D.Y., Gwang B.J., 2002; Дамулин И.В., 2002; Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 2005; Гомазков О.А., 2009), ведущих к регуляторной дезинтеграции и дизрегуляции нервной системы (Крыжановский Г.Н., 2002, 2009).

В последние десятилетия внимание исследователей сосредоточено на изучении роли глутамата, основного возбуждающего нейромедиатора в ЦНС, обеспечивающего множественный ответ нейрона на разнообразные физиологические и биохимические стимулы. В основе вариабельности ответа нейрона на различные стимулы, реализуемые через глутамат, лежит целая система глутаматных рецепторов. Хорошо известно, что глутамат при избыточном его высвобождении оказывает нейротоксическое действие на кортикальные и субкортикальные нейроны и ведет их к гибели. Наиболее уязвимыми оказываются нейрональные структуры, связанные с обеспечением высших физиологических процессов, в частности когнитивных функций, при ишемических, нейродегенеративных и стрессорных повреждениях мозга.

Сегодня ни у кого не вызывает сомнения наличие тесной взаимосвязи и взаимодействия между двумя интегративными системами организма -нервной и иммунной (Besedovsky H.G. et al., 1985; Blalock J.E., Smith E.M., 1985; Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю., 1993; Корнева Е.А., 1993; Акмаев И.Г., 2002; Крыжановский и др., 2003; Морозов С.Г., 2006; Евсеев В.А., 2007;

Девойно JI.B., Идова Г.В., Альперина Е.Л., 2009). При нейродегенеративных процессах в мозге иммунная система, с одной стороны, играет важную роль, осуществляя регуляцию провоспалительных процессов через цитокины. Так, при болезни Альцгеймера на постмортальном материале показано значительное увеличение содержания ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а (Grammas Р., Ovase R., 2001) в микрососудах мозга. В клинических исследованиях у больных ишемическими инсультами в первые часы от начала заболевания была установлена увеличенная продукция провоспалительных цитокинов типа ИЛ-1 и ИЛ-6. Установлена положительная корреляция между изменением уровня ИЛ-6 в плазме крови и динамикой состояния больного (Clark W.M., Lutser H.L., 2001). В экспериментах на крысах, подверженных окклюзионному воздействию с последующей реперфузией, обнаружена увеличенная экспрессия ИЛ-8 и ФНО-а в ишемизированных участках мозга (Beech J.S. et al., 2001).

С другой стороны, на любые количественные и качественные изменения, происходящие в организме, иммунная система реагирует выработкой антител, причем не только на высокомолекулярные вещества, но и на низкомолекулярные вещества, в частности нейромедиаторы, что было убедительно продемонстрировано в работах И.Е.Ковалева и О.Ю.Полевой (1985). В последнее время показано образование антител к нейромедиаторам и установлено защитное действие антител к серотонину на моделях алкоголизма (Давыдова Т.В. и др., 1987-2001; Евсеев В.А. и др., 1993-2005), наркомании (Башарова Л.А. и др., 1993; Евсеев В.А. и др., 1996), паркинсонизма (Крыжановский Г.Н. и др., 1991-1996), антител к глутамату при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003), нейропатическом болевом синдроме (Игонькина С.И. и др., 2006), эмоциональных стрессорных реакциях (Евсеев В.А. и др., 2009). У больных болезнью Альцгеймера показано образование аутоантител к дофамину, норадреналину, серотонину, глутамату (Мягкова М.А. и др. 2001, 2003; Грудень М.А. и др., 2007; Давыдова Т.В. и др., 2006, 2007). При ишемических повреждениях мозга в сыворотках крови больных выявлены антитела к глутаматным рецепторам (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Базарова В.Г., Гранстрим O.K., Дамбинова C.B., 2002). Особое внимание в настоящее время привлекают антитела к самому глутамату при острых и хронических нейродегенеративных повреждениях мозга, при которых глутамат играет ключевую патогенетическую роль.

Материалы проведенных клинических наблюдений свидетельствуют о том, что как при острых (острый церебральный ишемический инсульт), так и при хронических (болезнь Альцгеймера) нейродегенеративных повреждениях мозга в сыворотках крови больных выявляется усиленная продукция антител к глутамату. Наибольший уровень антител к глутамату в сыворотках крови зарегистрирован у больных с острым церебральным ишемическим инсультом и у больных с поздней формой развития болезни Альцгеймера. У больных с раним началом болезни Альцгеймера, в сыворотках крови выявлено значительно меньше антител к глутамату, чем при позднем начале заболевания. Полученные различия в содержании антител к глутамату в сыворотках крови больных с различными формами болезни Альцгеймера и острым церебральным инсультом могут свидетельствовать о различных механизмах развития патологического процесса, лежащих в их основе. Известно, что эксайтотоксичность глутамата может развиваться как по классическому острому пути, так и по медленному метаболическому пути (Rothman S.M., Olney J.W., 1986). При «острой» эйксайтоксической нейродегенерации наблюдается усиленная продукция возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата. В то время как при «медленной» эксайтотоксической нейродегенерации свободного глутамата выделяется значительно меньше. При раннем начале БА преобладает второй путь эксайтоксичности глутамата и поэтому у этих больных в сыворотках крови обнаруживаются не высокие уровни антител к глутамату. При остром церебральном ишемическом инсульте и, возможно, при позднем начале болезни Альцгеймера, когда наблюдаются цереброваскулярные повреждения характерные как для атеросклеротического процесса, так и для болезни Альцгеймера, глутаматная эксайтотоксичность развивается по классическому острому пути.

В результате проведенных клинических наблюдений, также выявлена динамика образования аутоантител к глутамату у больных болезнью Альцгеймера, в зависимости от тяжести развития заболевания. Пик продукции аутоантител к глутамату наблюдается у больных с умеренными проявлениями деменции. Полученные данные согласуются с результатами, свидетельствующими, что в этот период заболевания, характеризующейся развитием умеренной деменции, показано также наиболее активное антителообразование к другим нейротрофическим факторам, в частности к белку SlOOb, нейромедиаторам серотонину, дофамину (Gruden М. et.al., 2007).

Наибольшее содержание антител к глутамату в сыворотке крови больных с острым ишемическим инсультом наблюдалось на 7 сутки развития инсульта. Результаты проведенных исследований совпадают с данными других исследователей, свидетельствующих об образовании нейротропных аутоантител в эти же сроки развития инсульта (аутоантитела к белку SlOOb, GFAP, МР-65, ФРН), антител к глутаматным рецепторам. Эти данные показывают, что для больных с хорошим и удовлетворительным восстановлением функций ЦНС после перенесенного инсульта типичен рост сывороточного содержания нейротропных ауто-АТ продолжительностью до 3-5 недель (Е.И.Гусев, В.И. Скворцова, 2001; А.Б.Полетаев, 2008). Возможно, транзиторное повышение продукции различных аутоантител к антигенам нервных клеток обуславливается возрастающими потребностями в более интенсивном связывании и удалении избыточно образуемых продуктов распада в нервной ткани. По всей вероятности усиленная продукция антител к глутамату у больных с острым ишемическим церебральным инсультом является реакцией иммунной системы на эксайтотоксическое повреждение ткани мозга глутаматом и наряду с антителами к глутаматным рецепторам носит защитный характер для уменьшения нейродегенеративных повреждений при этом заболевании.

Подводя итоги клинических наблюдений, можно придти к заключению, что антитела к глутамату могут служить нейроиммунным маркером для уточнения диагностики, выявления тяжести и прогнозирования течения острых и хронических нейродегенеративных повреждений мозга, в частности, болезни Альцгеймера, острого церебрального ишемического инсульта.

Основной симптомокомплекс, развивающейся при болезни Альцгеймера, характеризуется развитием когнитивных нарушений, в частности, нарушений памяти.

Для выяснения участия антител к глутамату в механизмах развития мнестических нарушений при хронических и острых нейродегенеративных повреждениях мозга были использованы две хорошо разработанные и наиболее часто используемые в экспериментальной практике модели: (3-амилоидная модель болезни Альцгеймера, вызванная билатеральным введением в гиганто-клеточные ядра Мейнерта нейротоксического фрагмента [3-амилоидного белка А(325-3 5 и модель очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры. Известно, что основной симптом, развивающийся при воспроизведении этих экспериментальных моделей, характеризуется расстройством памяти.

В качестве модели хронического нейродегенеративного повреждения мозга, связанной, с развитием нарушений памяти, была выбрана (3-амилоидная модель болезни Альцгеймера. Введение нейротоксического фрагмента амилоидного белка А(325-з5 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта, которым принадлежит важная роль в процессах памяти (А1Ыз1оп АХ., 2004), вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, проявляющие в развитии различных дефицитарных форм нарушения когнитивных функций у животных (ОюуапеШ Ь. е1 а1., 1995; Нагкапу Т. е1 а1., 1998). Эта модель была интересна для наших исследований в связи с тем, что фрагмент [3-амилоида АР25-35 обладает нейротоксическими свойствами, которые реализуются через различные механизмы: через усиление эксайтотоксических свойств глутамата, нарушение гомеостаза ионов кальция, усиление оксидативного стресса, индукцию апоптоза и энергетическое истощение клеток (Нагкапу Т., 2000). Все эти процессы взаимосвязаны, но, по крайней мере, в эксайтотоксичности и нарушениях гомеостаза кальция непосредственное участие принимает глутаматергическая система, а остальные два реализуются с участием последней. В связи с вышеизложенным, было интересно попытаться прервать цепь развития нейрональных дегенеративных нарушений, вызываемых развитием эксайтоксического каскада, запускаемого глутаматом, и приводящих к развитию когнитивного дефицита, с помощью антител к глутамату. Антитела к глутамату вводили интраназально в дозе 300 мкг/кг через час после проведения стереотаксической операции по двустороннему введению нейротоксического фрагмента АР25-35 в ядра Мейнерта, когда как предполагалось начинают запускаться связанные с глутаматом нейротоксические эффекты.

В качестве показателя нарушения памяти была выбрана способность крыс к обучению УРПИ. Известно, что на 14 сутки после двустороннего введения нейротоксического фрагмента АР25-35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта наблюдаются выраженные нарушения обучения и памяти у животных (Нагкапу Т. е1 а1., 1998).

Полученные результаты показали, что при экспериментальной болезни Альцгеймера, вызванной билатеральным введением нейротоксического фрагмента АР25-35 в гиганто-клеточные ядра Мейнерта, однократное интраназальное введение антител к глутамату через час после операции, оказывает выраженный антиамнестический эффект.

У животных на 14 сутки после билатерального введения в мозг АР25-35 развились значительные нарушения памяти, выражающиеся в уменьшении

ЛП2 и АЛЛ по сравнению с контрольными животными. Интраназальное введение антител к глутамату крысам через час после введения А(325-35 обусловило сохранение степени запоминания (АЛЛ) при выработке УРПИ на уровне контрольной группы животных. Интраназальное введение у-глобулина через час после введения А(325-з5 не приводило к коррекции нарушений памяти.

В качестве модели острого нейродегенеративного повреждения мозга, приводящего к развитию нарушений памяти, была выбрана модель очагового ишемического повреждения мозга, вызванного двусторонним фототромбозом сосудов префронтальной коры.

Фронтальная кора выполняет важную роль в организации сложных форм поведения (Лурия А.Р., 2000). Префронтальная кора вместе с гиппокампом играет ключевую роль в процессах обучения и памяти, а ее локальное повреждение приводит к избирательному нарушению когнитивных функций мозга, в частности расстройств памяти, без сопутствующих расстройств мышечного тонуса, двигательной координации и общего поведения животных (Романова Г.А.,2003).

В работе была использована модель фототромбоза сосудов префронтальной области коры головного мозга крыс, преимуществом которой является неинвазивность и возможность выбора нужной локализации повреждения, что позволяет получить экспериментальный аналог острого церебрального ишемического инсульта, сопровождающийся стойким очаговым морфологическим дефектом мозговых структур (Watson et.al., 1985; Викторов И.В., Барсков И.В., 1991; Романова Г.А. и др., 1994).

Нарушения мнестической деятельности головного мозга исследовали при помощи условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). УРПИ представляет собой простую оборонительную реакцию, с помощью которой можно исследовать основные закономерности формирования, хранения и воспроизведения условных рефлексов (Буреш Я. и др., 1991, Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000). В работах Г.А.Романовой и сотрудников показано, что при локальном ишемическом повреждении префронтальной коры головного мозга существенно нарушаются выработанные до повреждения условные рефлексы, а если повреждение коры предшествует выработке условных рефлексов, то нарушается и обучаемость животных.

Инсульт сопровождается не только прямым, непосредственным повреждением нервной ткани, но и вторичными повреждениями вследствие отсроченных метаболических и нейрохимических процессов, в которых глутамату отводится одна из ключевых ролей. Избыточное высвобождение глутамата начинается с первых часов и продолжается в течение нескольких дней. Для уменьшения нейротоксического эффекта глутамата были применены антитела к глутамату, полученные при гипериммунизации коньюгатом глутамата с бычьим сывороточным альбумином кроликов. Для быстрой доставки антител в мозг был выбран интраназальный путь их введения (Talengaonkar S., Mishra P.R., 2004). Вводимая доза антител к глутамату была выбрана по работам, связанным с введением пептидных веществ (Романова Г.А. и др., 2006).

Полученные результаты показали, что при ишемическом повреждении префронтальной коры однократное интраназальное введение антител к глутамату в дозе 250 мкг/кг через час после проведения операции оказывает выраженный антиамнестический эффект.

У животных с острым ишемическим повреждением префронтальной коры, введение антител к глутамату обусловило сохранение ЛП УРПИ, выработанного до фототромбоза сосудов коры, на уровне достоверно не отличающимся от этого показателя в контрольной группе ложнооперированных крыс. В группе крыс с ишемией префронтальной коры, получавших по той же схеме дистиллированную воду (растворитель для антител), и в группе крыс с введением у-глобулина от нормальных кроликов исследуемый показатель значительно снижался.

Таким образом, антитела к глутамату обеспечивают сохранение памятного следа у животных, перенесших ишемическое повреждение префронтальной коры. По-видимому, защитный эффект антител к глутамату может быть обусловлен связыванием глутамата антителами к нему и не возможностью глутамату реализовать свое эксайтотоксическое действие на нейроны.

При проведении экспериментов по изучению влияния интраназального введения антител к глутамату на сохранение степени запоминания (АЛЛ) при выработке УРПИ у интактных крыс не было получено эффекта по сравнению со здоровыми контрольными животными. Антитела к глутамату у нормальных животных не оказали влияния на мнестические функции.

Подводя итоги экспериментальных исследований можно придти к выводу, что антитела к глутамату оказывают протективный эффект только на нарушения памяти в условиях избыточной продукции глутамата. Антитела к глутамату являются эндогенными защитными факторами, вырабатывающимися в организме в ответ на избыточную продукцию глутамата и активацию глутаматного каскада, ведущего к гибели нейронов и развитию нейродегенеративных повреждений мозга. Однако следует отметить, что усиленная продукция антител к глутамату начинается не с первых часов повреждения, а позже к 7 - 8 суткам, как показано на двух используемых в работе моделях нейродегенеративных повреждений головного мозга. В связи с этим интраназальное введение антител к глутамату в начальном периоде активации глутаматного каскада, ведущего к дегенерации нейронов, оказалось высокоэффективным для восстановления способности у животных к обучению в тесте УРПИ. Можно предположить, что в механизмах действия антител к глутамату лежит их способность снижать избыточное содержание глутамата в структурах мозга, в частности в префронтальной коре, гипоталамусе, гиппокампе, ядрах Мейнерта и тем самым защищать нейроны от гибели. В исследованиях В.А.Евсеева и сотрудников (2006-2009) показано, что системное введение антител к нейромедиаторам (дофамину, серотонину) может изменять содержание нейромедиаторов в структурах мозга.

Полученные данные можно рассматривать как одно из экспериментальных доказательств защитного действия антител к глутамату при развитии нарушений памяти при острых и хронических нейродегенеративных повреждениях мозга.

Следует отметить, что при болезни Паркинсона, другом хроническом нейродегенеративном заболевании, наряду с повреждением нигростриатной дофаминергической системы, недостаточность которой играет ключевую роль в патогенезе этого заболевания, нарушение глутаматергической нейротрансмиссии, как показано в настоящее время, также является одним из существенных механизмов, лежащих в основе гибели нейронов при этом страдании (Магаева C.B., Кучеряну В.Г., Карабань И.Н., 2002; Meldrum B.S., 2000). В последнее время было показано, что как предварительное, так и одновременное интраназальное введение антител к глутамату мышам С57В1/6 с паркинсоническим синдромом, вызванным введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), приводило к ослаблению выраженности признаков синдрома (Давыдова Т.В., Фомина В.Г., Горбатов В.Ю. и др., 2008). Наибольший эффект антител к глутамату проявлялся в ослаблении таких признаков паркинсонического синдрома как тремор и ригидность. Антитела к глутамату вызывали также увеличение скорости перемещения животных в открытом поле, что свидетельствует об ослаблении брадикинезии у мышей С57В1/6 с МФТП индуцированным паркинсоническим синдромом. Таким образом, антитела к глутамату и при экспериментальном паркинсоническом синдроме, вызванном введением МФТП, оказывают защитное действие, уменьшая его развитие.

Таким образом, антитела к глутамату в условиях усиленной продукции глутамата оказывают защитное действие при развитии нарушений памяти при острых и хронических нейродегенеративных повреждениях мозга, при паркинсоническом синдроме, вызванном введением МФТП (Давыдова Т.В., Фомина В.Г., Горбатов В.Ю. и др., 2008), при экспериментальной эпилепсии (Карпова М.Н. и др., 2003), нейропатическом болевом синдроме (Кукушкин

М.Л., и др., 2006), эмоциональных стрессорных реакциях (Евсеев В.А. и др., 2009).

Полученные результаты позволяют надеяться, что в дальнейшем антитела к глутамату могут найти свое место при разработке иммунологических подходов к патогенетической терапии острых и хронических нейродегенеративных повреждений головного мозга, а также других форм нейропатологии. 1