Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Исследование крыс OXYS как модели болезни Альцгеймера. Патогенетические механизмы развития

На правах рукописи г

СТЕФАНОВА Наталья Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ КРЫС ОХУв КАК МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

" 7 ОКТ 2015

Новосибирск -2015

005563088

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор, научный руководитель ФГБНУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики»

доктор биологических наук ведущий научный сотрудник лаб. функциональной биохимии нервной системы Ф1БУН Институт выси.'ей червной деятельности и нейрофизиологии >.'.Ч

доктор биологических наук главный научный сотрудник лаб. экспериментальных моделей патологии когнитивной деятельности ФГЬНУ «Научно-исследоззтельский институт физиологии и фундаментальней медицины»

Колосова Наталия Гориславовна Ляхович Вячеслав Валентинович

Онуфриев Михаил Валерьевич Лоскутона Лилия Владимировна

Ведущая организации: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

£Р

Защита состоится «46 »0Ша.'ьЬь 2015 г. з {0_ часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 ''при' ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины» по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2. Тел. (383) 333- 64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ и на сайте http://centcrceTn.ru/nauchnaya с1еуа1е1по51/с1158еПасюппу; яоуеЬ'

Автореферат разослан «2-Ъ

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

» (лит.

15^ 2015 г.

/С&Я-, Пальчикова Наталья Александрозна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) — самое распространенное нейродегенеративное заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофнческих изменений мозга и, в конечном счете, смерти в течение 3-9 лет после установления диагноза (0иегйи1Ь, ЬаРег1а, 2010). Эффективных способов профилактики и лечения БА нет, заболеваемость растет по мере увеличения продолжительности жизни и постарения населения развитых и развивающихся стран. По данным ВОЗ, в мире более 35 миллионов человек страдают БА, а к 2050 году, по прогнозам, таких больных будет >115 миллионов (Мог1еу е1 а1., 2012). В этой связи исследования фундаментальных механизмов БА и разработка основанных на их знании способов профилактики и лечения заболевания приобрели особую актуальность.

Согласно доминирующей гипотезе «амилоидного каскада» центральным событием в патогенезе БА становится накопление нейротоксических форм пептида: амилоида-р (АР), приводящее к образованию амилоидных бляшек, гиперфосфорилированию тау-белка и формированию нейрофибриллярных клубков, синаптической недостаточности, гибели нейронов, воспалению, митохондриальной дисфункции и окислительному стрессу (Мог1еу е1 а1., 2012). Однако в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что в патогенезе наиболее распространенной спорадической формы БА (-95% всех случаев заболевания) гиперпродукция АР не выступает в роли инициирующего фактора (Кге^с, Кпиеве1, 2013). Более того, приводятся убедительные доказательства того, что механизмы патогенеза ранней - наследственной формы - и поздней - спорадической формы БА -могут быть различными (51ипоЬага е1 а1., 2014). Так, если причиной токсического накопления Ар в мозге больных наследственной формой, БА становится нарушение процессинга белка предшественника амилоида-р (АРР), то у больных спорадической формой БА накопление Ар может быть опосредовано синаптическими процессами.

Механизмы старения и патогенез нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, тесно связаны с митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом —, нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Более того, дисфункция митохондрий рассматривается как один из ключевых, факторов, инициирующих развитие БА. Согласно гипотезе «мигохондриального каскада» (8\уеп11о\у, КаЬп, 2004), снижение синтеза АТФ и окислительный стресс приводят к чрезмерной продукции АР, который, в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы. Запуск «порочного круга» нейродегенерации приводит к гиперфосфорилированию тау-белка, дисфункции синапсов, воспалению, апоптозу и становится маркерным, финальным событием в патогенезе БА.

Снижение клеточных функций при старении и развитии БА сопряжено с изменением экспрессии многочисленных генов. Обнаружение мутаций генов АРР, РЯЕЫ! и Р5£Л'2 определило значительный успех в изучении патогенеза наследственной формы БА, на которую приходится около 5% всех случаев заболевания. Несмотря на выявленные ассоциации с полиморфизмами в ряде генов, конкретные молекулярно-генетические механизмы развития спорадической формы БА, перехода физиологических возрастных изменений мозга в патологический процесс, остаются не ясными. Такая ситуация обусловлена невозможностью

исследовать эти вопросы на людях, тем более - ранние доклинические стадии развития БД, а также отсутствием адекватных биологических моделей заболевания. Лавинообразно нарастает количество генетических моделей БА, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход приближает к пониманию вклада крнкретногЬ гена в развитие наследственной формы БА, но не воспроизводит все фенотипические проявления спорадической формы БА - комплексного заболевания полигенной природы.

Степень разработанности проблемы. Уникальной генетической моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний является линия крыс ОХУБ, созданная в ИЦиГ СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор вели по ранней спонтанной катаракте, сцепленно с которой животные унаследовали комплекс признаков преждевременного старения, в том числе - ускоренное старение мозга (КоЫоуа с1 а]., 2009; Колосова и др., 2014; ЯГеГапоуа Л а1., 2010). На фенотипическом уровне оно проявляется формированием уже к возрасту 3 мес. пассивного типа поведения, повышенной тревожности, нарушением способности к обучению на фоне нейродегенеративных изменений, выявленных методами магниторезонансной томографии (Колосова и др., 2011). О снижении когнитивных функций у молодых крыс . ОХУЭ свидетельствует и нарушение формирования длительной лосттетанической потенциации (Береговой и др., 2011). Механизмы ускоренного старения мозга крыс ОХУБ остаются неясными, но комплексное проявление признаков преждевременного старения и развитие возрйстзависимых заболеваний уже в молодом возрасте предполагает общие молекулярно-генетические основы. Методом С?ТЬ-анализа были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у крыс ОХУБ катаракты, ретинопатии и особенностей поведения (КогЬоНпа е1 а1., 2012). Функциональная аннотация локусов выявила «обогащение» района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе - с метаболическим путем БА. Это обстоятельство наряду с характерными для крыс ОХУЯ фенотип ическими проявлениями послужило основанием для изучения в настоящей работе механизмов ускоренного старения мозга этих животных и анализа возможной их связи с патогенезом БА. Их знание является необходимым условием доказательства соответствия линии критериям модели спорадической формы БА и перспективности ее использования для исследования патогенеза заболевания и поиска новых терапевтических мишеней для профилактики БА. Как перспективный нейропротектор, потенциально способный влиять на «горячие точки» патогенеза БА, нами был исследован антиоксидант пластохинонил-децил-трифенилфосфоний (БкСМ, «ионы Скулачева»), эффективность которого доказана в профилактике и лечении целого ряда ассоциированных со старением заболеваний (Бакеева и др., 2008; Нероев и др, 2008-Уаув (й а1., 2014).

Цель исследования - изучить механизмы ускоренного старения мозга крыс ОХУ5, их возможную связь с патогенезом болезни Альцгеймера и оценить эффекты антиоксиданта вкС?! на некоторые функции мозга у этих животных.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить связь манифестации фенотипических проявлений ускоренного старения мозга крыс ОХУв (поведенческих, нарушения способности к обучению и

памяти) с изменениями структурно-функциональных параметров пирамидных нейронов и синапсов гиипокампа и префронтальной коры головного мозга. ,

2. Определить уровень и локализацию маркеров болезни Альцгеймера в гиппокампе и префронтальной коре крыс ОХУБ и Вистар (контроль) разного возраста: Ар пептида, его предшественника белка АРР, тау-белка и его фосфорилированной формы.

3. Провести сравнительное ультраструкгурное исследование гиппокампа.крыс ОХУЯ и Вистар разного возраста, определить активность цитохром с оксидазы как маркера активности IV комплекса дыхательной цепи для оценки вклада изменений структурно-функционального состояния митохондрий мозга в развитие нейродегенеративных изменений.

4. Исследовать методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) изменения транскриптома префронтальной коры мозга крыс ОХУЭ и Вистар с возрастом и определить межлинейные различия в экспрессии генов.

5. Провести функциональную аннотацию дифференциально экспрессирующихся генов и выявить вероятные метаболические пути, с изменениями которых ассоциировано ускоренное старение мозга крыс ОХУБ. , ,.,

6. Исследовать влияние приема антиоксиданта 8кС}1 на развитие и прогрессию, нейродегенеративных процессов у крыс ОХУБ.

Научная новизна. Впервые установлено, что ускоренное старение мозга крыс ОХУв ассоциировано с развитием ключевых патогенетических и «клинических» признаков спорадической формы Б А. Показано, что формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и снижение способности, к обучению у крыс ОХУБ к возрасту 3-4 мес. по времени совпадает с развитием в гиппокампе и префронтальной коре деструктивных изменений нейронов, синаптической . недостаточности, дисфункции митохондрий и гиперфосфорилирования тау-белка. , Нарушения поведения и когнитивных способностей у крыс ОХУв с возрастом усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений нейронов и их гибели, снижения плотности синапсов и активных зон их контактов, дисфункции митохондрий, гиперфосфорилирования тау-белка, повышения к возрасту 12 мес. уровня АРиз в гиппокампе и префронтальной коре и образования амилоидных бляшек в мозге. При этом усиленное накопление Ар в мозге с возрастом становится, вторичным событием при развитии у крыс ОХУв признаков БА.

Впервые методом массового параллельного секвенирования (1ША-5еч) исследован профиль экспрессии генов в префронтальной коре крыс ОХУв., На основании сравнения транскриптома коры мозга крыс Вистар и ОХУБ разного возраста определены гены, экспрессия которых изменяется с возрастом и при . развитии признаков БА у крыс ОХУв. Установлено, что развитие признаков БА у. крыс ОХУБ происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900; генов, их прогрессия - более 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2* гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. С возрастом в префронтальной коре крыс Вистар изменяется экспрессия 499 генов, в то время как у крыс ОХУ8 — более чем 5500 генов, включая 333 гена, общих для крыс ОХУБ и Вистар. Функциональная. аннотация изменения экспрессии генов в префронтальной коре крыс ОХУв с возрастом выявила их «обогащение» 85 генами из метаболического пути БА, связанными с процессингом

АРР, агрегацией и деградацией Ар, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами.

Впервые установлено, что способность антиоксиданта SkQl не только предупреждать и замедлять формирование фенотипических проявлений ускоренного старения мозга (нарушения поведения и снижение когнитивных функций), но и снижать их выраженность на стадии активной прогрессии у крыс OXYS связана с его влиянием на ключевые признаки БА. Показано, что SkQl предупреждает и/или замедляет деструктивные изменения нейронов, снижение плотности синапсов, гиперфосфорилирование тау-белка и усиленное накопление Ар в мозге крыс OXYS, существенно улучшая структурно-функциональные параметры митохондрий.

Теоретическая и практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели спорадической формы болезни Апьцгеймера, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных с заболеванием нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных нарушений функций мозга и развития БА. Выявленные в работе эффекты SkQl на крысах OXYS и Вистар демонстрируют высокий нейропротекгорный потенциал антиоксиданта, перспективность его использования в профилактике старения мозга и развития характерных для болезни Апьцгеймера нейродегенеративных процессов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Линия крыс OXYS соответствует основным критериям модели спорадической формы болезни Апьцгеймера и может быть рекомендована для исследований этиологии и патогенеза этого заболевания, а также для изучения эффективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику.

2. Развитие патогенетических признаков болезни Апьцгеймера у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия - более чем 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. Как и у людей с болезни Альцгеймера, развитие признаков заболевания у крыс OXYS ассоциировано с изменением в префронтальной коре мозга активности метаболического пути болезни Альцгеймера - экспрессии 85 вовлеченных в него генов.'

3. Антиоксидант SkQl способен замедлять развитие и снижать выраженность ключевых признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, существенно снижая выраженность деструктивных изменений митохондрий мозга.

Апробация результатов. Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, представлены и обсуждены на: 2-ой Международной конференции «Homo sapiens liberatus» (Москва, 2015), 9th International Conférence on Bioinformatics of Genome Régulation and Structure/System Biology (BGRS\SB-2014: Новосибирск, 2014), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014), llth International Conférence AD/PD (Флоренция, Италия, 2013), FENS Featured Régional Meeting (Прага, Чехия, 2013), FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2012, 2013), 2nd international

conference «Genetics of Aging and Longevity» (Москва, 2012), 7-м Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012), III съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), Ш международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Postgenome-2012: Казань, 2012), 8th FENS Forum of Neuroscience (Барселона, Испания, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 534 источника (из них 29 отечественных и 505 иностранных). Работа изложена на 262 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 59 рисунков и 2 приложения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе ЦКП «Генофонды экспериментальных животных» ИЦиГ СО РАН на крысах-самцах линий OXYS и Вистар в возрасте от 20 дней до 24 мес. в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных». Профилактический прием SkQl (250 нмоль/кг массы тела 6 раз в неделю) оценивали на крысах OXYS и Вистар (п=30) с возраста 1,5 до 23 мес. В 3 мес. исследовали поведение, а в 4 мес. часть крыс (п=15) - забита для гистологических и молекулярных исследований. В 13-15 мес. оценивали поведение крыс. В 23 мес. оставшиеся крысы (п=12-15) забиты для молекулярных исследований. Лечебный прием (250 нмоль/кг 6 раз в неделю) оценивали на крысах OXYS и Вистар (п=20-25) с возраста 12 до 18 мес.

Исследование поведения крыс проводили в стандартных тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» (моторно-исследовательская активность, тревожность), «восьмирукавный радиальный лабиринт» и водный тест Морриса (способность к обучению, память).

Методы гистологического исследования. Мозг фиксировали в 10% р-ре формалина на фосфатном буфере (PBS), pH 7.4 (24 ч), обезвоживали в спиртах, заливали в парафин. Сагиттальные срезы мозга (5 мкм) окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым. В CAI, САЗ, зубчатой извилине гиппокампа подсчитывали нейроны с очаговым, тотальным хроматолизом, гиперхромные сморщенные нейроны, гиперхромные без сморщивания. Данный фрагмент работы выполнен с участием аспиранта кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России К.Ю. Максимовой.

Методы электронно-микроскопического исследования. Кусочки гиппокампов фиксировали в р-ре параформальдегида (4%) и глютаральдегида (0,5%) на основе 0,2 М какодилатного буфера (pH 7,4); постфиксировали в 2% р-ре четырехокиси осмия на холоде (3 ч), обезвоживали в спиртах, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие серебристые и бледно-золотистые срезы наносили на сетки-подложки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. С помощью сетки Автандилова определяли удельную площадь органелл в нейронах (в % от общей площади цитоплазмы). Для оценки плотности синапсов (плоских, положительно и отрицательно искривленных,

гипертрофированных и перфорированных) фотографировали по 15 полей зрения (50 мк м2) пирамидного слоя CAI поля с 5 срезов. Разделяли синапсы по длине активной зоны контакта на очень мелкие (100-200 нм), мелкие (200-300 нм), средние (300-500 нм), крупные (500-700 нм) и очень крупные (> 700 нм). Данный фрагмент работы выполнен с участием аспиранта кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГЪОУ ВПО СибГМУ Минздрава России К.Ю. Максимовой и ведущего научного сотрудника лаборатории морфологии и функции клеточных структур ИЦиГ СО РАН к.б.н. Е.В. Киселевой.

Иммуногистохимические методы. Мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS, pH 7.4 (48 ч), затем - в 30% р-ре сахарозы (~ 48 ч) при 4°С и хранили при -80°С. Сагиттальные срезы мозга (20 цш) изготавливали в криостате при -20°С. Срезы монтировали на предметные стекла, инкубировали с первичными антителами к Synapsin I, PSD95, Aßl-42, АРР, Tau, Tau [Т181] (Abeam, США) при +4°С (16 ч) и со вторичными антителами (1 ч), промывали в PBS, наносили монтирующую среду с DAPI для окрашивания ядер. Препараты анализировали с помощью оптического микроскопа AXIOPLAN 2 (Zeiss, Германия).

Исследования методами вестерн-блот анализа, дот-блот анализа и нммунно-ферментного анализа. Гиппокампы и префронтальную кору выделяли на льду, хранили при - 80°С. Белок выделяли лизирующим буфером (50 мМ Tris-HCl pH 7.4; 150 мМ NaCl; 1% Triton х-100; 1% Sodium deoxycholate; 0.1% SDS; 1 мМ EDTA, ингибиторы протеаз) в соотношении 1/4. Для саркозил-растворимой и нерастворимой фракций образцы гомогенизировали в буфере (100 мМ MES pH 6.8; 750 мМ NaCl; 1 мМ EGTA; 0,5 мМ MgS04; 1 M дитиотреитола, ингибиторы протеаз), центрифугировали (11000 g, 20 мин). Супернатант центрифугировали (100000 g, 1 ч). Осадок инкубировали в 1% р-ре саркозила (30 мин), центрифугировали (100000 g, 30 мин). Нерастворимый осадок ресуспензировали в буфере для экстракции (10 мМ Tris-HCl pH 7.4; 10% сахарозы; 850 мМ NaCl; 1 мМ EGTA) в соотношении 1/10, центрифугировали (15000 g, 20 мин). Супернатанты инкубировали в 1% р-ре саркозила (1 ч), центрифугировали (100000 g, 45 мин). Осадки (саркозил-нерастворимые белки) ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl pH 7.4. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда. Белки разделяли электрофорезом в 10-12% ПААГ в трис-глициновом буфере (25 мМ Tris, 190 мМ глицин, 0,1% SDS), переносили на нитроцелюлозную мембрану. После блокирования 5% обезжиренным молоком (1 ч), мембраны инкубировали 1 ч с первичными антителами к Synapsin I, PSD95, ßActin (Abeam, США), МОАВ-2 (Millipore, США) или 16 ч - к AßW2, АРР, Tau, Tau [Т181] (Abeam, США) и 30 мин - со вторичными антителами (Abeam, США). Интенсивность свечения оценивали с помощью ImageJ. Содержание Aß оценивали иммуноферментным анализом (ИФА), используя наборы human/rat Aß (1-42) и Aß (140) ELISA kit Wako (Wako, Япония). Данный фрагмент работы выполнен с участием научного сотрудника сектора молекулярных механизмов старения ИЦиГ СО РАН к.б.н. H.A. Муралевой.

Исследование активности фермента цитохром-С оксидазы. Образцы ткани в буфере (250 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 70мМ KCl в PBS, ингибиторы протеаз) гомогенизировали, центрифугировали (800 g, 10 мин). Супернатант центрифугировали (15000 g, 20 мин), осадок (митохондриальная фракция) ресуспендировали в буфере (50 мМ Tris pH 7.4, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0,2% Triton-X, 0,3% NP-40), хранили при -80°С. Активность цитохром с оксидазы определяли набором Complex IV Assay Kit

(Abeam, США) согласно протоколу производителя. Данный фрагмент работы выполнен с участием научного сотрудника сектора молекулярных механизмов старения ИЦиГ СО РАН к.б.н. Н.А. Муралевой.

Исследование методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq). RNA-seq проводили на крысах OXYS и Вистар в возрасте 5 и 18 мес. Приготовление кДНК библиотек и секвенирование на платформе Illumina Genome Analyzer Пх проведено в соответствии с протоколами Illumina для RNA-seq (ОАО «Геноаналитика»). Для каждого образца было получено -40 млн прочтений (ридов) длиной 50 пуклеотидов. Риды картировали на референсный геном Rattus norvégiens (версии Rnor_5.0.76) с помощью программы TopHat (v2.0.10) (Trapnell et al., 2012). Функциональную аннотацию групп ДЭГ проводили с помощью Web-инструмента DAVID и WebGestalt при порогах значимости обогащения (EASE) р<0.05. Данный фрагмент работы выполнен с участием ОАО «Геноаналитика» и научного сотрудника сектора молекулярно-генетических механизмов белок-нуклеиновых взаимодействий ИЦиГ СО РАН к.б.н. НИ Ершовым.

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Использовали факторный дисперсионный анализ (ANOVA) с post-hoc сравнениями групповых средних (Newman-Keul test). Как независимые факторы рассматривали генотип, возраст, препарат. Данные представлены как mean ± SEM. Результаты считали статистически значимыми при р<0.05.

РАЗВИТИЕ КЛЮЧЕВЫХ ПРИЗНАКОВ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА У КРЫС OXYS

Нарушения поведения н памяти v кпые OXYS. Ранние проявления БА: эмоциональные изменения, нарушения памяти на недавние события, трудности в запоминании информации, по сути, не отличаются от характерных для стареющих людей и животных изменений (de Calignon et al., 2012). Прогрессия БА сопровождается двигательными нарушениями и значительным ухудшением памяти. Изменения с возрастом поведения и способности к обучению крыс OXYS и Вистар (контроль) в настоящем исследовании оценивали в возрасте 1,4 и 18 мес.

Моторно-исследовательская активность в тесте «открытое поле» - количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек - с возрастом снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS скорость этих изменений выше. В результате в возрасте 4 и 18 мес. количество пересеченных квадратов и стоек у них меньше, чем у крыс Вистар, а показатели тревожности - латентный период выхода в центр и количество дефекаций — напротив, были выше.

В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» активность крыс OXYS и Вистар с возрастом также снижалась: количество выходов в центр, вертикальных стоек и заходов в закрытые рукава уменьшалось. Тревожность, напротив, росла: количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, снижалось, а количество дефекаций росло. При этом в возрасте 4 и 18 мес. количество заходов в закрытые и выходов в открытые рукава, стоек и выглядываний у крыс OXYS было меньше, чем у Вистар, что свидетельствует о более высоком уровне тревожности и сниженной активности.

Оценка референтной памяти - способности к обучению в восьмирукавном лабиринте — показала, что уже в возрасте 4 мес. у крыс OXYS она ниже, чем у крыс Вистар. Об этом свидетельствует увеличенный процент ошибки памяти - отношения

числа входов в неподкрепляемые рукава к общему числу посещенных рукавов (%) - в первые семь дней обучения. Но к 8 -10 дню обучения крысы ОХУБ запоминали рукава с кормом и меньше входили в рукава без него. К 18 мес. нарушение способности к обучению у крыс ОХУБ нарастало: процент ошибок во все дни тестирования у них был больше, чем у крыс Вистар. Количество входов в рукава (моторно-исследовательская активность) было меньше у 4- и 18-мес. крыс ОХУЭ во все дни обучения.

В водном тесте Морриса референтную память крыс ОХУЭ и Вистар оценивали в возрасте 4, 12 и 18 мес. У крыс Вистар способность к обучению с возрастом не менялась, а у крыс ОХУБ снижалась и в 18 мес. они обучались существенно хуже, чем крысы Вистар (рис. 1). При этом только в первые три дня на нахождение невидимой платформы крысы ОХУБ затрачивали больше времени, чем крысы Вистар, а на 4-й и 5-й день обучения они уже не отличались от крыс Вистар по такому показателю, как латентный период нахождения невидимой платформы. Оценка формирования памяти по такому показателю как время, проведенное в целевом секторе лабиринта, где в дни обучения находилась платформа, показала, что 18-мес. крысы ОХУ8 проводили вдвое меньше времени, чем крысы Вистар (см. рис. 1).

Рис. 1. Способность к обучению и формирование памяти в водном тесте Морриса у крыс Вистар и OXYS разного возраста. Латентный период (ЛП) нахождения невидимой платформы крысами Вистар (А) и OXYS (Б) и время, проведенное в секторе (В). *- достоверные различия по сравнению с 4-мес. крысами OXYS, # - межлинейные различия.

Таким образом, с возрастом уровень тревожности растет, а моторно-исследовательская активность, способность к обучению и память снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Различия между крысами OXYS и Вистар появились к возрасту 4 мес., а к 18 мес. усилились.

Синаптическая недостаточность и нейродегенеративные изменения в мозге крыс OXYS. Синаптическая недостаточность и гибель нейронов - наиболее ранние события при развитии БА. Изменение с возрастом популяции пирамидных нейронов CAI и САЗ полей гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS и Вистар оценивали в возрасте 20 дней, 5 и 15 мес. Максимальной популяция нейронов крыс OXYS и Вистар была в 20 дней, при этом межлинейные различия в их количестве отсутствовали. К возрасту 5 мес. количество нейронов в CAI и САЗ снижалось -втрое у крыс обеих линий, в зубчатой извилине — только у крыс Вистар (на 15%). В 5 мес. у крыс OXYS плотность нейронов в гиппокампе была выше, а к 15 мес. - снижалась: в CAI — на 26%, в САЗ — на 49% и в зубчатой извилине - на 21%, и была ниже, чем у крыс Вистар. У крыс Вистар с возраста 5 до 15 мес. плотность нейронов в САЗ снижалась на 20%, а в CAI и зубчатой извилине, напротив, увеличилась на 18% и

20%, соответственно. Таким образом, у крыс OXYS в возрасте 5 мес., а у крыс Вистар

- в 15 мес. в гиппокампе присутствуют признаки усиления нейрогенеза, которые могут рассматриваться как компенсаторная реакция: в этом возрасте у животных соответствующих линий выявляются признаки умеренных когнитивных нарушений на фоне деструктивных изменений нейронов, исследованию которых посвящен следующий раздел работы.

Исследование цитоархитекгоники гиппокампа и префронтальной коры мозга месячных крыс OXYS и Вистар не выявило различий в относительном количестве нейронов с признаками деструкции. В возрасте 4 мес. количество нейронов с признаками дегенерации: обратимо измененных - гиперхромных нейронов без сморщивания и с признаками очагового хроматолиза, а также необратимо измененных

- гиперхромных сморщенных и нейронов с признаками тотального хроматолиза, - в гиппокампе и коре мозга крыс OXYS было больше, чем у крыс Вистар. К возрасту 18 мес. различия нарастали (рис. 2). В возрасте 4 мес. у крыс OXYS значительно изменена структурная организация органелл нейронов CAI поля. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭПР) изогнуты, фрагментированы, выявляются участки с расширенными цистернами, лишенными свободных единичных рибосом и полисом - типичной картины тотального хроматолиза. Митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму - признаки, указывающие на их набухание. В отдельных областях ядерной мембраны число пор увеличено, перинуклеарное пространство расширено. В некоторых нейронах определяются участки скопления липофусцина.

А^ 50 с дн Вистар Б . Вистар 4 мес Г í OXYS 4 мес

ШАй Tz*

р Вистар 18 мес ^^ OXYS 18 мес

/ Ш * * А» *

Возраст, мес Л w У ,

Рис. 2. (А) Удельное содержание нейронов с дегенеративными (обратимыми и необратимыми) изменениями в префронтальной коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS в 4 и 18 мес. ЗИ — зубчатая извилина. (Б) Примеры пирамидных нейронов коры мозга крыс (стрелки -гиперхромные нейроны). Увелич. - об. 100, ок. 10. * - межлинейные различия.

К 18 мес. изменения структурной организации органелл у крыс OXYS прогрессируют. Оболочка ядра многих нейронов образует глубокие складки, увеличивается число ядерных пор, отек ядерной мембраны. Встречается гипертрофия ядрышек, увеличение в них гранулярного компонента. В комплексе Гольджи отмечается расширение и фрагментация цистерн. Лизосомы имеют различную величину, интенсивно и гомогенно прокрашены. Во многих нейронах отмечаются вакуоли, фаголизосомы различных размеров и формы (рис. 3). В 4 мес. в нейронах CAI крыс OXYS удельная площадь митохондрий и ЭПР меньше, а площадь вакуолей и лизосом больше, чем у крыс Вистар. К 18 мес. разница нарастает: площадь

митохондрий становится в 3, а ЭПР - в 2,5 раза меньше, площадь лизосом и вакуолей -в 1,4 и 2 раза больше, чем у крыс Вистар. Площадь комплекса Гольджи с возрастом снижается у крыс обеих линий.

Рнс. 3. Пирамидные нейроны гиппокампа крысы Вистар (А) и крыс ОХУЭ (Б, В) в 18 мес. (Б) Гипертрофия и усложнение формы ядра с инвагинацией ядерной оболочки (1), смещение ядрышка на периферию ядра (2). (В) Высокое содержание липофусцина (1).

Как показал анализ синаптоархитектоники в CAI поле, в возрасте 4 мес. плотность синапсов у крыс OXYS на 21% выше, чем у Вистар за счет увеличения доли симметричных (функционально незрелых) синапсов (табл. 1), что может быть связано с увеличением популяции нейронов - адаптивно-компенсаторной реакции на развитие нейродегенеративных процессов. У крыс Вистар в 4 мес. преобладали неперфорированные плоские (40%) и положительно искривленные (39%) синапсы, т.е. основная популяция синапсов имела умеренную эффективность передачи импульса. Для крыс OXYS этого возраста характерны проявления гиперактивного функционального состояния синапсов: увеличение доли положительно искривленных (в стадии экзоцитоза) контактов, вдвое - перфорированных и гипертрофированных и снижение, более чем вдвое, отрицательно искривленных контактов (в стадии эндоцитоза).

Таблица 1

Численная плотность межнейронных синапсов поля CAI гиппокампа (на 100 мкм2)

Крысы Возраст мес. Численная плотность, всего Симметричные синапсы Ассиметричные синапсы

Всего Плоские + иск - иск

Вистар 4 7.95±0.31 0.54±0.12 7.41±0.30 3.18±0.45 3.10±0.31 1.13±0.18

OXYS 4 9.62±0.39* 1.67±0.21" 7.95±0.30 2.79±0.34 4.73±0.35* 0.43±0.11"

Вистар 18 9.16±0.47" 1.28±0.23" 7.88±0.45 2.44±0.33 4.50±0.35" 0.93±0.19

OXYS 18 5.82±0.44#- 1.29±0.18 4.53±0.46*" 1.98±0.31 1.74±0.26*" 0.81±0.20

+ иск и — иск — положительно и отрицательно искривленные синапсы; # - межлинейные различия, * - достоверные изменения показателей с возрастом.

Количество активных зон синаптических контактов у 4-мес. крыс ОХУ8 больше чем у Вистар, прежде всего, за счет увеличения доли наиболее функционально активных зон среднего размера (300-500 нм). Но при этом у них присутствовали признаки деструктивных изменений: просветление и набухание цитоплазмы, изменение размеров и формы синаптических пузырьков, появление вакуолей, увеличение размеров митохондрий. С возрастом доля синаптических терминалей с выраженной деструкцией («размытостью» контуров мембраны, деструкцией и исчезновением синаптических пузырьков, разрушением митохондрий) у крыс ОХУБ увеличивается. В гиппокампе 18-мес. крыс Вистар выявлялись изменения, сходные с теми, что наблюдаются у 4-мес. крыс ОХУв: увеличивается популяция синапсов как компенсаторная реакция на развивающиеся при старении нейродегенеративные процессы (см. табл. 1). Но при этом у крыс Вистар увеличилась доля положительно искривленных контактов, что свидетельствует об устойчивом активном состоянии синапсов. К 18 мес. у крыс ОХУБ происходят изменения, свидетельствующие о снижении эффективности передачи сигнала. Плотность синапсов снижается на 40% за счет уменьшения доли ассиметричных (функционально зрелых) синапсов: количество отрицательно и положительно искривленных контактов снижается более чем вдвое (см. табл. 1), снижается и количество активных зон контакта. Также уменьшается количество синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, выявляются признаки дезорганизации синаптических везикул (рис. 4). Такие прогрессивные изменения с возрастом синаптоархитектоники нейронов гиппокампа свидетельствуют о нарушении у крыс ОХУ8 синаптической пластичности.

Рис. 4. Примеры активных зон синаптического контакта в гиппокампе 18-мес. крыс Вистар (А) и варианты признаков дезорганизации синаптических везикул у крыс ОХУ8 (Б): уменьшение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, скопления большими группами вблизи от мембраны.

Важным звеном регуляции синаптической пластичности являются основной белок постсинаптического уплотнения Р50-95 и синапсин 1 — фибриллярный фосфопротеин, участвующий в регуляции процесса выброса нейромедиаторов. Снижение уровня этих пре- и постсинаптических белков в мозге больных БА рассматривается как маркерное событие (Оу1уБ е1 а1., 2004). Исследование на 3-, 12- и 24-мес. крысах показало, что с возрастом уровень синапсина 1 и Р8Э-95 снижался у крыс обеих линий и был у крыс ОХУБ ниже, чем у Вистар в гиппокампе - во всех возрастных группах, в префронтальной коре - в возрасте 12 и 24 мес. (рис. 5).

В целом анализ состояния нейронов и синапсов гиппокампа и коры мозга крыс ОХУв разного возраста свидетельствует о том, что ускоренное строение их мозга — изменение поведенческого стереотипа и снижение способности к обучению — происходит на фоне нейродегенеративных изменений и нарушения функциональной активности синапсов. Такие результаты, а также обогащение ассоциированных с формированием пассивного типа поведения локусов на 1 хромосоме крыс ОХУ8

генами, связанными с метаболическим путем БА (КогЬоНпа й а1., 2012), позволили предположить, что ускоренное старение мозга крыс ОХУв может быть связано с нарушением процессинга АРР. Об этом свидетельствуют и накопление Ар в сетчатке крыс ОХУ8 и изменение в ней с возрастом экспрессии генов, связанных с процессингом АРР (КогЬеушкоуа е1 а1., 2013).

Рис. 5. Уровень PSD-95 и синапсина I в гиппокампе (А, В, Д) и префронтальной коре (Б, Г, Е) крыс OXYS и Вистар в возрасте 3, 12 и 24 мес. (вестерн-блот анализ). (Ж) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 18-мес. крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к PSD-95 (зеленый) и синапсину I (красный). DAPI (синий) — ядра. Масштаб — 5 цт. * - межлинейные различия, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

Накопление Aß пептида с возрастом и его локализация в мозге крыс OXYS.

Накопление Ар - ключевого маркера БА - обусловлено нарушением баланса между его секрецией и клиренсом в результате изменения процессинга АРР (Mawuenyega et al., 2010). В возрасте 3 мес. уровень АРР в гиппокампе и коре у крыс Вистар и OXYS не различался. С возрастом он увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS -значительнее (рис. 6) и в возрасте 13 и 23 мес. уровень АРР в гиппокампе и коре был выше, чем у крыс Вистар.

Рис. 6. Уровень АРР в гиппокампе (А) и

префронтальной коре (Б) крыс OXYS (о), выше чем у крыс Вистар (в) в 13 и 23 мес. по данным вестерн-блот анализа. # - межлинейные различия, л-достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

87 kDa 42 kDa

Змее 13 мес. 23 мес.

3 мес 13 мес. 23 мес

В результате расщепления АРР Р- и у-секретазами образуются естественные продукты метаболизма АРР - Ар пептиды длиной 36-43 аминокислоты (Querfurth and LaFerla, 2010). Преобладают пептиды Api^ а доля наиболее токсичного Ар|^,2 составляет 5-10%. Мы оценили в гиппокампе и коре крыс разного возраста

содержание растворимой фракции APi^2 и Afi|_,0 методами ИФА (табл. 2). Повышенное отношение Ар42/Ар40 рассматривается как объективный диагностический показатель БА (Wolfe, 2007). В возрасте 3 мес. уровень АР1-42 в гиппокампе и коре не различался у крыс Вистар и OXYS.

Таблица 2

Уровень АР|.40и АР|^2В гиппокампе и коре мозга крыс ОХУЭ и Вистар разного _возраста_

Гиппокамп (п=6-8) Префронтальная кора (п=6-8)

[ Линия Возраст мес. Aß 1-40 (пг/мг ткани) Aß, .42 (пг/мг ткани) Aß42:Aß40 Aß 1.40 (пг/мг ткани) Aß,.42 (пг/мг ткани) Aß42:Aß40

Q 3 32,4±2,4 27,5±3,4 0,8±0,1 45,3±2,7 30,7±3,9 0,7±0,1

Н о 5 12 62,3±2,8" 47,2±6,9" 0,7±0,1 69,5±5,1" 56,6±5,7" 0,8±0,1

m 24 68,9±4,6+ 75,1±12,1"+ 1,1 ±0,3 65,4±3,5+ 72,5±3,6+ 1,1±0,1

3 25,1±1,8* 32,9±4,5 1,3 ±0,2* 43,3±1,1 33,6±5,4 0,8±0,1

>< X 12 48,6±4,5*" 79,6*7,0** 1,7±0,1 * 52,0±7,2 103,5±9,1** 2,1±0,1*#

24 72,9±4,0" 142,4±10,0"** 2,0±0,2*+ 77,6±4,6"+ 176,9±12,5*"+ 2,3±0,3*"

Различия достоверны: *— по сравнению с крысами Вистар; — между 3 и 12 мес. одной линии; ~ — между 12 и 24 мес. одной линии; + — между 3 и 24 мес. одной линии.

С возрастом он увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS — значительнее, ив 12 и 24 мес. был выше, чем у крыс Вистар. Уровень Ар^о также повышался с возрастом, но межлинейных различий по этому показателю в коре выявлено не было, а в гиппокампе 3-й 12-мес. крыс OXYS он был ниже, чем у крыс Вистар. В результате соотношение Aßi^/Aßi^o с возрастом выросло только у крыс OXYS и было в коре выше, чем у крыс Вистар, в возрасте 12 и 24 мес., а в гиппокампе - и в 3 мес. (см. табл. 2).

Специфичность накопления Aß в мозге крыс OXYS исследовали, используя антитела, иммунореактивные с Aß,_42 и не детектирующие APP. Усиленное накопление Aßi^ в гиппокампе крыс OXYS с возрастом подтвердили результаты дот-блот анализа и иммуногистохимии. Уровень растворимого олигомерного Aß|_42 в гиппокампе оценивали в возрасте 7, 12 и 24 мес., используя антитела иммунореактивные с Aßi^2, но не с Aßi^,0 и APP. С возрастом уровень Aßi_42 в гиппокампе увеличивался у крыс обеих линий и был выше у крыс OXYS.

Локализацию Aß и характер его накопления с возрастом в мозге крыс OXYS определяли методами иммуногистохимии в 3, 7, 15—18 и 24 мес. Интенсивность сигналов Aß в мозге 3-мес. крыс Вистар и OXYS не различалась. С возрастом внутриклеточное содержание Aß в гиппокампе и коре крыс обеих линий росло, но у крыс OXYS ускоренными темпами. При этом только у крыс OXYS была обнаружена нехарактерная для грызунов внеклеточная агрегация Aß. В возрасте 3-7 мес. она наблюдалась в редких случаях в коре, но в 15-18 и 24 мес. амилоидные бляшки детектировались в коре (рис. 7), гиппокампе, таламусе, гипоталамусе и стволе головного мозга.

Рис. 7. Агрегация Aß в мозге крыс OXYS. (А, Б, Е—3, К) и (М) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга крыс OXYS специфичными антителами к Aß (AßM2 и МОАВ-2). (В, Г) Примеры амилоидных бляшек в мозге крыс OXYS, окрашенных Конго красный (Kongo Red) и Сириус красный (Sirius Red). (И—JI) Примеры агрегации фибриллярной формы Aß, детектированные Тиофлавином-С (Thio-S). (Н) Пример накопления Aß в кровеносном сосуде головного мозга крыс OXYS; окрашивание Тиофлавином-С (Thio-S). Ядра окрашены DAPI (синий, М). Масштаб - 50 рт (Д-Ж); 20 рт (А, В) и (3-К); 10 рт (Б, Г. Л,М).

Гиперфосфорнлирование тау-

белка_в_гиппокампе_и

префронтальной коре головного мозга крыс OXYS. Не менее важным, чем накопление Aß, маркером БА является повышение уровня тау-белка и его усиленное фосфорилирование. В гиппокампе и коре крыс OXYS уровень тау-белка и его фосфорилированной формы Т181 (фосфо-Т181) увеличивался с возрастом и был выше в 3, 13 и 23 мес., чем у крыс Вистар (рис. 8). Уровень растворимой фракции тау-белка у крыс OXYS также увеличивался с возрастом. Пропорция нерастворимой фракции тау-белка была выше у 3-, 12- и 24-мес. крыс OXYS. Уровень растворимой фракции фосфо-Т181 в гиппокампе крыс OXYS был ниже в возрасте 3 мес., а нерастворимой фракции выше в 3, 12 и 24 мес., чем у крыс Вистар.

Рис. 8. Уровень тау-белка (А-Г) и фосфо-Т181 (А, Б, Д, Е) в префронтальной коре и гиппокампе крыс OXYS (о) выше, чем у крыс Вистар (в) в возрасте 3, 13 и 23 мес. # - достоверные межлинейные различия, А достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

д ли 1-42 ВХШШШШШтЯВШЁ МОР&2 tuJ

д л * 1* МОАВ-2 'Щ

Е 1 ' Ж » • МЛлб-;

у т

3 * и s К ' a

Л 4 м 9 н О

О В О 3 о

мес 23ь

Таи Tauph.T18 ß-Actin

Кора В О 6 О R О

А1ш

13 мес. 23 мес.

3 мес 13 мес 23 мес Ц Вистар

■loXYS

Змее. 13 мес. 23 мес.

6"

13 мес. 23 мес.

13 мес. 23 мес.

Важно, что пропорция нерастворимой фракции фосфо-Т181 3-, 12- и 24-мес. крыс ОХУБ была выше, чем у крыс Вистар. С возрастом показатель увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс ОХУв ускоренными темпами. Таким образом, уровень тау-белка и его фосфорилированной формы в мозге крыс ОХУБ выше, чем у крыс Вистар уже в возрасте 3 мес.

Дисфункция митохондрий в мозге крыс OXYS при развитии признаков болезни Альцгеймера. Как один из ключевых факторов, инициирующих развитие БА, рассматривается дисфункция митохондрий (Swerdlow et al., 2014). Нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий ранее были выявлены в печени, сетчатке, мышцах и миокарде крыс OXYS (Колосова и др., 2014) и рассматриваются как один из ключевых факторов их преждевременного старения. В настоящей работе установлено, что уже в возрасте 4 мес. в нейронах CAI поля гиппокампа крыс OXYS присутствуют значительные изменения структурной организации митохондриального аппарата: снижена удельная площадь митохондрий, часть из них имеет светлый обводненный матрикс и округлую форму - признаки набухания, выявляются митохондрии

----гантелевидной или

Б сферической формы с

частичной фрагментацией крист (рис. 9).

Рис. 9. Примеры структурного состояния митохондрий (А) и их удельная площадь (Б) в нейронах CAI поля крыс Вистар и OXYS в возрасте 4 и 18 мес.

Вистар

4 мес.

18 мес

В возрасте 18 мес. площадь митохондрий у крыс OXYS втрое меньше, чем у Вистар, на ультраструктурном уровне в отдельных митохондриях матрикс электронно-плотный, гомогенный, контур наружной и внутренней мембран неровный, кристы выявляются по периферии (см. рис. 9). В синаптических терминалях у крыс OXYS существенно чаще, чем у Вистар OXYS

крыс Вистар отмечалось накопление очень крупных митохондрий (рис. 10) и митохондрий с деструктивными изменениями (набухание и разрушение).

Рис. 10. Примеры структурного состояния митохондрий в

синаптических терминалях нейронов CAI поля 18-мес. крыс Вистар и OXYS. Очень крупные митохондрии (стрелки) в аксонах нейронов крыс OXYS. Масштаб - 2 рт.

Снижение активности фермента комплекса IV дыхательной цепи митохондрий цитохром с оксидазы - один из ключевых показателей нарушения функциональной активности митохондрий в мозге при БА. В гиппокампе ее активность с возрастом снижалась у крыс обеих линий и у крыс ОХУЭ была ниже, чем у Вистар в возрасте 20 дней, 4 и 24 мес. (рис. 11).

Рис. 11. Активность фермента цитохром с оксидазы в гиппокампе и коре крыс Вистар и ОХУБ. ОП - оптическая плотность Различия достоверны между: * крысами Вистар и ОХУв; * 20-дневн. и 24-мес. крысами одной линии; + 4- и 24-мес. крысами одной линии.

В коре крыс Вистар активность цитохром с оксидазы с возрастом не изменялась, у крыс ОХУ8 — снижалась, но только в 24 мес. становилась ниже, чем у крыс Вистар. Таким образом, развитие нейродегенеративных изменений в мозге крыс ОХУ.З сопряжено со структурно-функциональными изменениями митохондрий.

Суммируя, можно заключить, что ускоренное старение мозга крыс ОХУ8 ассоциировано с патогенезом спорадической формы БА развитием ключевых признаков заболевания (рис. 12).

Рис. 12. Динамика развития характерной для БА патологии у крыс ОХУ8. В поле С А1 гиппокампа с возраста 20 дней до 12 мес. происходит 50%-е уменьшение числа нейронов. С 3 до 23 мес. в гиппокампе содержание

фосфорилированного тау белка увеличивается на 102%, а Ар|.4о - на 333%.

АНАЛИЗ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИИ ТРАНСКРИПТОМА ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫС ОХУв И ВИСТАР

Анализ изменений транскриптома, предшествующих и сопутствующих фенотипическим проявлениям старения и развитию связанных с ним заболеваний, -продуктивный подход к поиску молекулярных мишеней - генов, вовлеченных в их этиологию и патогенез. Выясняя природу развития признаков БА у крыс ОХУ8, мы исследовали транскриптом префронтальной коры их мозга на разных стадиях заболевания (в возрасте 5 и 18 мес.) методом массового параллельного секвенирования.

Анализ данных секвенирования транскриптома (1ША-8ед). Количество картированных прочтений (ридов) и дифференциальную экспрессию оценивали программными пакетами I ГГ8ед/[)Е8ец и НТ8ец/ОЕ8ец2. Для 1)1-,8ес| количественной мерой экспрессии гена является сумма всех однозначно выравненных прочтений, которые пересекаются с геном. При заданной глубине секвенирования в коре крыс экспрессируется: согласно ПГ.8ец ~15 200 и ~21 200 генов - согласно БК8ес]2. При этом перекрытие списков экспрессирующихся генов составило 100%, поэтому для дальнейшего анализа транскриптома использовали данные ОЕ8ея2. Максимальное количество ридов равнялось 2 687 083, среднее значение уровня экспрессии по всем детектированным генам - 1 422 рида.

Выявлены межлинейные различия в экспрессии более 2000 генов (при р<0.01). В возрасте 5 мес. экспрессия 923 генов в коре крыс ОХУв отличалась от таковой у крыс Вистар: 537-х генов - повышена и 386 - снижена. К возрасту 18 мес. количество дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) в коре крыс ОХУв и Вистар выросло вдвое - до 2103. Экспрессия 1156 генов была повышена и 947 - снижена (рис. 13). Межлинейные различия в экспрессии для 309 генов сохранялись в обеих возрастных группах: у 168 генов она была повышена, у 141 - снижена.

5 мес ]. 18 мес. | Вистар| ОХУБ|

повышенным, по сравнению с крысами Вистар, уровнем мРНК в 5 и 18 мес. и пересечения между группами генов. (Б) Количество генов, снизивших и повысивших уровень мРНК с возрастом у крыс ОХУЯ и Вистар, и пересечения между группами генов.

Функциональный анализ обогащения транскриптома коры терминами генных онтологий показал, что и в 5, и 18 мес. у крыс ОХУ8 повышен уровень экспрессии генов, ассоциированных с ответом на циклические органические соединения, регуляцией размера кровеносных сосудов и вазодилатации, ответом на эндогенные стимулы, с аутофагией. Независимо от возраста среди генов со сниженным уровнем мРНК в коре крыс ОХУЭ присутствовали ассоциированные с процессингом фагосомы, эндоцитозом, клеточной адгезией, главным комплексом гистосовместимости, каталитической активностью, иммунным ответом и структурной организацией миелиновых волокон.

С возрастом в коре крыс Вистар изменилась экспрессия 499 генов: 293 -повысилась, 206 - снизилась (см. рис. 13). У крыс ОХУ8 изменилась экспрессия 5606 генов: экспрессия 2985 - повысилась и 2621 - снизилась. При этом у крыс обеих линий с возрастом однонаправлено изменили экспрессию всего 333 гена: 191 ген ее повысил, 142 гена - снизили.

Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов.

На рис. 14 представлены термины генных онтологий (Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии генов с возрастом у крыс Вистар и при развитии признаков БА у крыс OXYS. Несмотря на межлинейные различия в наборе генов, экспрессия которых изменяется с возрастом, они объединяются в сходные категории: фосфорилирование, активность протеинкиназ, нейрогенез, синаптическая пластичность, воспаление. У крыс Вистар с возрастом снижается экспрессия генов, участвующих в развитии нейрона (Nrep, Slitrk3, Lppr4, Pvrll, Robo2 и др.), активности протеинкиназ (Met, Kit, Trib2, EphaS, Acvrlc, Ntrk3 и др.). К 18 мес. у крыс Вистар повышается экспрессия генов, связанных с воспалительным ответом (Clqa, СуЪа, С4Ь, СЗ и др.), глиогенезом (SoxlO, Gsn, Nkx6-2 и др.), ответом на повреждение (Tf, Gfap, Assi, Piek, Cst3, Itgb2 и др.).

Крысы OXYS Крысы Вистар

Рис. 14. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие гены, экспрессия которых изменяется с возрастом в коре мозга крыс OXYS и Вистар (р<0.05).

У крыс OXYS изменяется экспрессия 122 генов, связанных с развитием нейрона (Nrtn, Uchll, Cspg4, Pip5klc, Llcam, Cnp, Apod, Htra2 и др.), 81 гена - с регуляцией нейрогенеза (Ache, Lztsl, Efna3, Cspg4, Timp2, Mif и др.), 64 генов - с аксоногенезом (Сек, Stkll, Uchll, Ephb3, Unc5b, Unc5a и др.), 84 генов - с синаптической трансмиссией (CItb, Cplxl. Adora2a, Clstn3, Syt3, Grik4 и др.). Изменения экспрессии 220 генов в коре крыс OXYS с возрастом ассоциированы с процессами фосфорилирования (Cspg4, Adorai, МарЗк4, МарЗкЯ Prkaca, Мар2к7, Matk и др.), 180 генов - с активностью протеинкиназ (Itpka, Magedl, Mark4, Grkô, Mtor, Tnk2, Gsk3a и др.), 110 генов - с внутриклеточным транспортом белков (Cita, Cltb, Aplbl, Ap2sl, Hps4 и др.), 128 - с цитоскелетным связыванием белков (Maea, Hiplr, Crocc, Vapb, Mtssll, Pacsinl и др.), 50-е организацией митохондрий (Sept4, Oxall, Timm50, Timml3, Fisl, Mrpll2, Sharpin, Tomm40 и др.), 71-е убихинон-связанными катаболическими процессами (Uchll, Ube2g2, Manlbl, Bapl, Uspl9 и др.). Снижается у крыс OXYS экспрессия генов, участвующих в делении органелл (Sept2, Pds5b, Dnmll, Pds5a, Tmem215, Katnal, Uspl6 и др.) и их слиянии (Mfnl, Cav2, Vav3, Gnai3, Cyp26cl. Gnail, Vamp7, Usol, Eeal и Vcpipl). Повышается экспрессия 35 генов, участвующих в процессах организации микротрубочек (Kifc2, Kif22, Spg7, Crocc, Uchll, Tubb5, Tubgl, ТиЬЬЗ и др.), 39 генов - в олигомеризации белка (Prkcz, Traf2,

Ache, КспаЪ2, Stkll, Aldoc, Lnxl, Mif и др.), 17 генов - в глиогенезе (SoxlO, Adora2a, Cspg4, Hdacll, и др.) и 72 генов, связанных с апоптозом (Ppard, Dedd, Fastk, Casp9, Bag3, и др.).

Анализ групп ДЭГ в коре крыс OXYS и Вистар с возрастом (базы данных KF.GG pathway и Wikipathways) выявил ассоциации с сигнальными путями, контролирующими транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и подвижность клеток, воспаление, апоптоз и другие процессы. У крыс Вистар наиболее значимые изменения экспрессии генов с возрастом связаны с активацией сигнального пути рецептора В-клеток (Rpsókal, Cardll, Zap70, Blrtk, Rps6, Fcgr2b) и Т-клеток (Cd4, Card!I, Zap70), IL-5 сигнального пути (Itgam, Rpsókal, Itgb2), системы комплемента. Общими для крыс обеих линий были изменения экспрессии генов, связанных с МАРК-, Инсулин-, Нейротрофин-, EGFR1- и mTOR-сигнальными путями, однако представленность генов и значимость (по показателю p-value) их изменений выше у крыс OXYS. Изменения экспрессии генов с возрастом в коре мозга крыс OXYS также ассоциированы с G Protein-, EGFR1-, Chemokine-, ErbB-, Wnt- и Calcium-зависимыми сигнальными путями, что характерно и для больных БА (Winkler and Fox, 2013).

Более того, функциональная аннотация ДЭГ (р<0.01) с помощью биоинформатической системы WebGestalt показала представленность в коре крыс OXYS 62 генов из метаболического пути БА (p-value=2.58e-14; adjP=3.25e-13). Для более полной оценки вклада изменения экспрессии генов при прогрессии у крыс OXYS признаков БА, была проведена функциональная аннотация ДЭГ при уровне значимости р<0.05 с поправкой на множественные сравнения. Согласно KEGG pathway, значимые изменения экспрессии 85 генов в коре крыс OXYS с возрастом связаны с путем БА (p-value=6.39e-18; adjP=8.27e-17; рис. 15), из них 27 генов имели сниженную и 58 -повышенную экспрессию.

Функциональная аннотация с помощью базы данных DAVID ДЭГ в коре крыс OXYS генов, вовлеченных в путь БА, показала, что прогрессия признаков БА у них происходит на фоне связанного с процессингом Aß повышения экспрессии генов ß- и у-секретаз и App. Изменяется экспрессия генов, ассоциированных с Notch-сигнальным путем, играющим важную роль в нейропластичности. Также ДЭГ, вовлеченные в путь БА, у крыс OXYS группируются в следующие категории (термины генных онтологий): клеточный цикл, внутриклеточный транспорт, ответ на гипоксию, клеточный ответ на стресс, ответ на гормональные и эндогенные стимулы. Значительные изменения экспрессии генов связаны с функциями митохондрий и синаптической пластичностью. Прогрессия признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне повышения экспрессии генов, связанных с фосфорилированием, регуляцией каспаз и киназной активности и апоптозом.

Как и у больных БА (Winkler and Fox, 2013), у крыс OXYS с возрастом изменяется экспрессия генов, ассоциированных с другими нейродегенеративными заболеваниями: болезнью Хантингтона, болезнью Паркинсона и боковым амиотрофическим склерозом, что предполагает общие механизмы их развития. У крыс OXYS выявлено 47 ДЭГ, общих для метаболического пути БА и этих заболеваний. Подавляющее большинство из них связаны с комплексами дыхательной цепи митохондрий, дисфункция которых рассматривается как один из ключевых факторов риска нейродегенеративных заболеваний (Witte et al., 2010). Общими для БА, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза являются также гены регуляторы апоптоза - Casp3, Casp9 и С'ус.ч, для БА и болезни Хантингтона

- транскрипты фосфолипазы С (Р1сЫ и Р1сЬ4), ген Gnaq, участвующий в регуляции ядерных метаболических процессов, и рецептор глутамата Grinl. Обобщение анализа результатов для 85 ДЭГ. вовлеченных в путь БА представлено на рис. 16.

(красные звездочки) в префронтальной коре крыс OXYS вовлечены в путь БА.

На рис. 17 и 18 представлены основные биологические процессы (Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии генов в коре крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар. Анализ ДЭГ в 5 мес. показал, что на ранней стадии развития признаков БА у крыс OXYS изменена экспрессия генов, участвующих в регуляции клеточной пролиферации, внутриклеточном сигнальном каскаде. Экспрессия генов Wnt-зависимого сигнального пути, ответа на внеклеточный стимул, фосфатазной активности, ответа на окислительный стресс, регуляции фосфорилирования аминокислот, дефосфорилирования, транспорта анионов и ионов калия, дифференциации миелоидных клеток, регуляции иммунных процессов повышена.

В 5 мес. у крыс OXYS снижена экспрессия генов, участвующих в организации миелиновых оболочек (Crocc, Hausl, Nefh, Сир, Tubgcp2), при этом повышена регуляция формирования микротрубочек (P2rx4, Adora2b, Agt, Pde5a, Gucyla3). И в 5,

ив 18 мес. у крыс OXYS повышена экспрессия генов, ассоциированных с аксоногенезом, ответом на гипоксию и гормональный стимул, клеточной адгезией, связыванием ионов кальция.

В 18 мес. гены с повышенной экспрессией у крыс OXYS группируются в категории (термины генных онтологий): развитие нейрона (Fgf'rl, Pip5klc, Grinía, Ephb2, Lingol и др.), организация цитоскелета (Fgdl, Ablim2, Pdlim7, Bcarl, Srf, Ptk2b, Obsll и др.), внутриклеточный транспорт белков (Ramp3, Aspscrl, Aplml, Ipol3, Hps4. Pml, Cacnbl и др.), миграция клеток (Plat, Ppard, Efnbl, Bcarl, Itga3. Pf4, Kit, Mmpl4 и др.), регуляция синаптической трансмиссии (Plat, Sncg, Ncdn, Gnai2, Grik5 и др.), связывание нейромедиаторов (Kisslr, Chrm4, Grin2b, СИгтЗ, Chrml, Chrnb2, Grin3b, Grin3a и др.), глиогенез (Ascii, Ptk2b, Agt, Nab2, Phgdh, Relu, Cls, Mmpl4, Eif2bl и Smarca4). Изменена экспрессия генов, участвующих в фосфорилировании, цитоскелетном связывании белков, апоптозе. Экспрессия генов, связанных с клеточным циклом (Nbn, Ттет215, Hausl, Cdc73, Ccngl, Zkscar¡5, Katnal, Npml, Uspló и др.), морфогенезом митохондрий (Mfn2, Mfnl и Col4a3bp) снижена.

I Снижение I Повышение

Структурная организация миелиновых оболочек МНС class I белковый комплекс Регуляция Wnt сигнального пути Формирование нервных трубочек Аксон

Регуляция дифференциации миелоидных клеток Регуляция иммунных процессов Транспорт анионов Дефосфорилирование Транспорт ионов капия Регуляция фосфорилирования аминокислот Ответ на окислительный стресс Ответ на гипоксию Позитивная регуляция иммунных процессов Активность фосфатазы Ответ на внеклеточный стимул Клеточная адгезия Ответ на гормональный стимул Связывание ионов кальция Внутриклеточный сигнальный каскад Регуляция клеточной пролиферации

Число генов

Рис. 17. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие межлинейные различия в экспрессии генов в коре крыс Вистар и OXYS в 5 мес. (р<0.05).

Процесс БА

Другие НДЗ

Синоптическая функция

Синаптическая пластичность

Аксоны, дендриты

СО термин

то05010 Болезнь Альцгеимера

гпо05016 Болезнь Хантингтона то05012 Болезнь Паркинсона то05014 Боковой амиотрофическии склероз

<Ю 0060078 Регуляция постсинаптического потенциала ОО 0007268 Синаптическая трансмиссия ОО 0045202 Синапс

00:0014069 Поете инаптическая плотность

то04720 Допговременная потенциация то04730 Долговременная депрессия 00:0016595 Глугамат связывание 00:0048167 Регуляция синаптической пластичности

GO 0030425 Дендрит

то04360 Аксон деятельность GO:0043197 Дендритные шипики GO 0030424 Аксон

Чиспо генов

P-value

р«10*" §Ш£ 1

P<10*

p*10--t

p<10--e

p<tO*

p<10-

p<00t

p«0 05

Нейроны

Сигнальные пути

Митохондриальные повреждения

Клеточный цикл

Фосфорилирование

Тау-белок

I G0 0043005 Проекция нейрона

гпо04020 Ca- сигнальный путь mo04912 GnRH сигнальный путь mo04370 VEGF сигнальный путь то04722 Нейротрофин сигнальный путь

WP358 МАРК сигнальный путь то04910 Инсулин сигнальныи путь mo04310 Wnt сигнальный путь

WP199 Detta-Notch сигнальный путь гпо04012 ЕгЬВ сигнальный путь гпо04062 Хемокин сигнальный путь WP135 IL-6 сигнальный путь

moOlöO Окислительное фосфорилирование WP59 Дыхательная цепь митохондрий 00 0015986 Транспорт АТФ

GO 0006091 Генерация метаболитов предшественников GO 0006812 Транспорт катионов GO 0046034 АТФ метабопические процессы GO 0003954 Активность NADH дегидрогеназы G0.0004129 Активность цитохром с оксцдазы 00:0016491 Активность оксидоредуктаз G0 0005743 Внутренняя мембрана митохондрий

j GO 0007049 Клеточный цикл I GOOO22402 Процессы клеточного цикла

то04210 Апоптоз GO 0012501 Программируемая клеточная гибель GO 0042981 Регуляция апоптоза GO 0006917 Индукция апоптоза

G0 0006793 Метабопические процессы GO 0016310 Фосфорилирование G0 0042325 Регуляция фосфорилирования

| G0 0050321 Тау-белок кинаэная активность | 00:0045859 Регуляция киназной активности

11 6

| GO 0055085 Трансмембранный транспорт Транспорт белков G0 0022857 Транспортная активность

21 ■ 25

GO:0010033 Ответ на органические субстанции GO 0070482 Ответ на окислительные уровни Другие процессы GO 0001666 Ответ на гипоксию

GO 0003824 Каталитическая активность G0 0006508 Протеолиз

Рис. 16. Обобщение анализа результатов 85 ДЭГ в префронтальной коре крыс OXYS вовлеченных в путь БА, согласно базам данных DAVID, KEGG pathway и Wikipathways.

Рис. 18. Значимые термины генных

онтологий (Gene

Ontology), объединяющие межлинейные различия в экспрессии генов в префронтапьной коре крыс Вистар и OXYS в 18 мес. (р<0.05).

Морфогенез митохондрий Регуляция синаптической пластичности Связывание микротрубочек Глиогенез

Связывание нейромедиаторов Аксоногенез

Регуляция синаптической трансмиссии Ответ на гипоксию Синаптическая трансмиссия Миграция клеток Внутриклеточный транспорт белков Организация цитоскелета Клеточная гибель Развитие нейрона Цитоскелетное связывание белков Клеточная адгезия Клеточный цикл Ответ на гормональный стимул Протеин киназа активность Связывание ионов кальция Фосфорилирование

Число генов

В целом результаты исследования транскриптома свидетельствуют о различиях в механизмах и скорости возрастных изменений мозга при нормальном темпе старения и при развитии характерных для БА нейродегенеративных процессов. Манифестация и развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне изменения экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах нейрональной пластичности, иммунной системы и апоптоза, ассоциированы с фосфорилированием белков, гипоксией, Са2+ гомеостазом. Прогрессия с возрастом признаков БА у крыс OXYS, как и у людей с этим заболеванием, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути БА - экспрессии генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий.

ВЛИЯНИЕ НА МАНИФЕСТАЦИЮ И ПРОГРЕССИЮ ПРИЗНАКОВ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА АНТИОКСИДАНТА 8к(}1

Для проверки связи механизмов ускоренного старения мозга крыс ОХУв с патогенезом БА, исследовали влияние на развитие и прогрессию признаков БА антиоксиданта 8к01, терапевтическая эффективность которого как нейропротектора была впервые доказана нами ранее (Stefanova е1 а1., 2010) и подтверждена коллегами (Карау е1 а!., 2013).

Влиянне 8кР1 на развитие признаков болезни Альцгеймера у крыс ОХУ8

Влияние 8к01 на поведение и способность к обучению крыс ОХУ8 и Вистар. Анализ поведения в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в 3 мес. показал, что прием 8к01 с возраста 1,5 мес. замедлил рост тревожности у крыс ОХУ8 - повысил количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, и не повлиял на крыс Вистар. С возрастом тревожность крыс растет: в 13 мес. крысы Вистар и ОХУв проводили меньше времени в открытых рукавах и больше — в закрытых рукавах. Прием 8к01 замедлил рост тревожности - увеличил время,

проведенное в открытых рукавах у крыс Вистар в 4,4, а у крыс ОХУ8 - в 3 раза по сравнению с контрольными крысами соответствующей линии.

С возрастом моторно-исследовательская активность снижается у крыс обеих линий и в 13 мес. количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек в тесте «открытое поле» становится меньше, чем в 3 мес., при этом у крыс ОХУЭ обеих возрастных групп она меньше, чем у крыс Вистар. Прием вкС) 1 замедлил ее снижение: на фоне его приема с возраста 1,5 мес. в 3 мес. у крыс ОХУЭ количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек было больше, чем в контроле; в возрасте 13 мес. количество квадратов было больше, чем в контроле как у принимавших 8к(21 крыс ОХУ8, так и у Вистар, у которых он увеличил также количество стоек.

Влияние 8к(}1 на способность к обучению в восьмирукавном радиальном лабиринте оценивали в возрасте 3 мес. Процент ошибки референтной памяти в 1-й, 24-й и 5-7-й дни тестирования был больше у крыс ОХУБ (рис. 19), но к 8-10 дням обучения они запоминали рукава с кормом и меньше входили в рукава без него. 8к(21 значимо не повлиял на способность к обучению крыс обеих линий, однако начиная со второго дня обучения принимавшие его крысы ОХУБ по проценту ошибки уже не отличались от крыс Вистар (см. рис. 19). Согласно зависимым парным сравнениям, процент ошибки у крыс ОХУЭ не различался ни по одному из десяти дней, что свидетельствует о нарушении способности к обучению и памяти. У принимавших 8кС>1 крыс ОХУ8, как и у контрольных и принимавших его крыс Вистар, процент ошибки достоверно снижался к 2-4 дням обучения. Число входов в рукава -показатель моторно-исследовательской активности - было меньше у крыс ОХУ8 во все дни обучения, а прием 8кС>1 не влиял на него у крыс обеих линий.

Рис. 19. Влияние приема 8кС>1 с 1,5 до 3 мес. на

способность к

обучению и память крыс ОХУ8 и Вистар в восьмирукавном радиальном лабиринте. (А)

Ошибка

референтной памяти (%) и (Б) число входов в рукава. * -межлинейные различия.

В водном тесте Морриса 16-мес. крысы ОХУ8 обучались хуже, чем крысы Вистар. В первые три дня на нахождение невидимой платформы — показатель пространственной памяти - крысы ОХУЭ затрачивали больше времени, а на 4-й и 5-й день обучения они уже не отличались от крыс Вистар. вкСН не повлиял на способность к обучению крыс Вистар, которая у них оставалась такой же, как в возрасте 3 мес. 8к(}1 не повлиял значимо и на способность к обучению крыс ОХУв, но на фоне его приема латентный период нахождения ими невидимой платформы достоверно не отличался от такового у крыс Вистар.

Таким образом, профилактический прием 8к<31 с возраста 1,5 мес. замедлил рост тревожности, снижение моторно-исследовательской активности с возрастом у крыс

Вистар и OXYS. Важно, что SkQl не влиял на поведение молодых крыс Вистар. SkQl существенно замедлил снижение с возрастом способности к обучению и памяти крыс OXYS, причиной которых становятся нейродегенеративные изменения мозга. В этой связи далее провели оценку влияния SkQl на развитие дегенеративных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS.

Влияние SkQl на развитие деструктивных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS. Оценка влияния профилактического приема SkQl на структурное состояние пирамидных нейронов гиппокампа крыс OXYS проведена в 4 мес. В этом возрасте в CAI и САЗ полях гиппокампа и зубчатой извилине контрольных крыс OXYS выявлялись гиперхромные нейроны без сморщивания и с признаками очагового хроматолиза (обратимо измененные), гиперхромные сморщенные нейроны и с признаками тотального хроматолиза (необратимо измененные). Соответственно, удельное содержание неизмененных нейронов в CAI и САЗ полях контрольных крыс OXYS меньше, чем у крыс Вистар (табл. 3). SkQl предупредил развитие дегенеративных изменений нейронов крыс OXYS: удельное содержание неизмененных нейронов в CAI и САЗ полях у принимавших его крыс OXYS было больше (см. табл. 3), а обратимо и необратимо измененных нейронов всех изучаемых регионов было меньше, чем у контрольных животных и не отличалось от показателей крыс Вистар (см. табл. 3).

Таблица 3

Морфологическая характеристика пирамидных нейронов полей CAI, САЗ гиппокампа и зубчатой извилины крыс Вистар и OXYS и крыс OXYS, получавших SkQl с 1,5 до 4

мес. Данные представлены в процентах от общего количества нейронов на 1 мм2

Регион Нейроны, % Вистар (п=5) OXYS (п=5) OXYS + SkQl (n=5)

CAI Н 94,3±3,3 87,5±1,6* 96,3±0,3*

ОИ 4,9±0,5 9,9±1,5" 3,2±0,3*

НИ 0,8±0,1 2,6±0,4* 0,5±0,1*

САЗ Н 92,1±1,1 84,6±0,8" 95,2±0,4*

ОИ 6,5±1,1 11,2±0,8" 3,9±0,4*

НИ 1,4±0,3 4,1±0,5* 0,9±0,2*

Зубчатая извилина Н 96,2±2,2 94,6±1,2 96,7±4,3

ОИ 3,0±0,2 4,2±0,2» 2,5±0,1*

ни 0,8±0,15 1,2±0,1" 0,8±0,1*

Н - неизмененные нейроны, ОИ и НИ - обратимо и необратимо измененные нейроны, соответственно. # - межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата.

Морфометрический анализ средней площади тел и ядер нейронов CAI и САЗ полей гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS и Вистар показал их снижение в поле CAI 4-мес. крыс OXYS на 25% и 38%, соответственно. Прием SkQl предупредил развитие дегенеративных изменений нейронов в поле CAI: средняя площадь тел и ядер нейронов была больше, чем в контроле и не отличалась от таковой у крыс Вистар.

Влияние SkQl на ключевые маркеры болезни Альцгеймера. Для оценки влияния профилактического приема SkQl на ключевые маркеры Б А исследовали их содержание в гиппокампе и префронтальной коре мозга 23-мес. крыс OXYS и Вистар, получавших антиоксидант с возраста 1,5 мес.

Содержание АРР и Afl¡^2- По данным вестерн-блот анализа уровень АРР в гиппокампе и коре 23-мес. крыс OXYS выше, чем у крыс Вистар (рис. 20). SkQl

замедлил увеличение с возрастом содержания АРР в гиппокампе и коре крыс ОХУв до уровня крыс Вистар и не влиял на его уровень в мозге крыс Вистар. Уровень растворимой фракции АР|_42 в гиппокампе и коре 23-мес. крыс ОХУЭ (данные ИФА) выше, чем у крыс Вистар (см. рис. 20). Прием 8кСД замедлил накопление с возрастом Ар|.42 в гиппокампе и коре крыс обеих линий, в результате у крыс ОХУв его содержание было на уровне крыс Вистар.

Гиппокамп Б Префронтальная кора

. — —-87 кДа

Вистар ОХУЭ Вистар ОХУ2 Е > ОХУ5 Вистар ОХУБ

Рис. 20. Прием вк01 с 1,5 до 23 мес. замедлил накопление с возрастом АРР и АРм2 в гиппокампе и префронтальной коре крыс ОХУ8 и Вистар. Уровень АРР в гиппокампе (А) и коре (Б) 23-мес. контрольных и получавших БкСН крыс ОХУБ и Вистар (п= 6) по данным вестерн-блот анализа. Уровень А|3|_42 в гиппокампе (В) и коре (Г) 23-мес. контрольных и получавших 8кС)1 крыс ОХУв и Вистар (п= 10) по данным ИФА. # -межлинейные различия, * достоверный эффект препарата.

Таким образом, впервые показана способность БкСН замедлять накопление с возрастом АРР и АР|_42 в мозге крыс как при

^ оисшр ил Т о [шицр улы

«физиологическом» старении крыс

Вистар, так и при развитии признаков БА у крыс ОХУЭ.

Содержание тау-белка и его фосфорилированной формы. Уровень тау-белка и его фосфорилированной формы Т181 (фосфо-Т181) в гиппокампе и префронтальной коре 23-мес. контрольных и принимавших с 1,5 до 23 мес. 8к(31 крыс ОХУ8 и Вистар. Уровень тау-белка и фосфо-Т181 в гиппокампе и коре был выше у крыс ОХУ8. Прием 8кС>1 замедлил повышение с возрастом уровня тау-белка и фосфо-Т181 в гиппокампе и коре только крыс ОХУ8 до уровня у крыс Вистар.

Таким образом, профилактический прием 8к<31 замедлил манифестацию фенотипических проявлений признаков БА. развитие нейродегенеративных изменений и увеличение ключевых маркеров заболевания в префронтальной коре и гиппокампе: АРР, АР|.42 и гиперфосфорилированной формы тау-белка.

Исследование влияния 8кО! на прогрессию признаков болезни Альцгеймера

у крыс ОХУ8

Влияние приема 8к(}1 (с возраста 12 до 18 мес.) на поведение, способность к обучению и память крыс ОХУ8 и Вистар оценивали, начиная с 17 мес. В приподнятом крестообразном лабиринте количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, было меньше у крыс ОХУ8. 8к(21 не повлиял на эти показатели у крыс обеих линий. Количество заходов в закрытые рукава у крыс ОХУ8 было меньше, а прием 8к(31 их повысил. В тесте «открытое поле» количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек было меньше у крыс ОХУ8. Прием 8к<31 не влиял на моторно-исследовательскую активность крыс обеих линий.

Способность к обучению в восьмирукавном радиальном лабиринте в 17 мес. была ниже у крыс OXYS: процент ошибки референтной памяти во все дни тестирования был больше. Прием SkQl не повлиял на способность к обучению крыс OXYS и улучшил ее у крыс Вистар: у принимавших его крыс процент ошибок во 2-4 и 8-10 дни был меньше, чем в контроле. Согласно зависимым парным сравнениям процент ошибки у контрольных и принимавших SkQl крыс OXYS не различался ни по одному из 10 дней, что указывает на значительные нарушения в формировании долговременной памяти. У контрольных крыс Вистар процент ошибки также не изменялся за время обучения, а у принимавших SkQl - снижался уже ко 2- 4-му дню обучения. Количество входов в рукава было меньше у крыс OXYS во все дни обучения. Прием SkQl не влиял на этот показатель у крыс обеих линий.

В водном тесте Морриса латентный период нахождения невидимой платформы во время обучения был больше у 17,5-мес. крыс OXYS во все пять дней обучения (рис. 21). Прием SkQl не повлиял на способность к обучению крыс Вистар и улучшил её у крыс OXYS: уменьшил латентный период нахождения платформы на 3-й и 4-й день обучения. Проверка долговременной памяти (6-день) показала, что крысы OXYS, принимавшие SkQl, проводили больше времени в секторе, в котором в дни обучения находилась платформа (см. рис. 21).

Рис. 21. Влияние приема SkQl с 12 до 18 мес. на способность к обучению и память в тесте Морриса. (А)

Способность к

обучению (латентный период нахождения невидимой платформы) и (Б) память (время, проведенное в секторе без платформы) крыс - достоверный эффект препарата.

Таким образом. SkQl существенно не повлиял на уровень тревожности и моторно-исследовательскую активность 17-месячных крыс OXYS и Вистар, но значительно улучшил способность к обучению и память у крыс обеих линий.

Влияние SkQl на дегенеративные изменения нейронов и плотность синапсов в гиппокампе крыс OXYS при прогрессии признаков БА.

Светомикроскопическое исследование выявило значительные нарушения структурной организации пирамидных нейронов полей CAI и САЗ гиппокампа и зубчатой извилины у 18-мес. крыс OXYS: набухание нейронов, очаговый и тотальный хроматолиз, гомогенизация ядра и цитоплазмы, распад ядра и ядрышка, клетки-тени, гиперхромные несморщенные и сморщенные клетки. Удельное содержание неизмененных нейронов полей CAI, САЗ и зубчатой извилины гиппокампа крыс OXYS было меньше (табл. 4), а содержание необратимо измененных нейронов (гиперхромные сморщенные и с признаками тотального хроматолиза), напротив, было больше (см. табл. 4). Доля обратимо измененных нейронов (гиперхромные без сморщивания и с признаками очагового хроматолиза) также больше у крыс OXYS (см. табл. 4). Прием SkQl с 12 до 18 мес. замедлил прогрессирование с возрастом дегенеративных изменений нейронов гиппокампа крыс OXYS: удельное содержание

2 3 4

Дни обучения Вистар и OXYS. # - межлинейные различия,'

Вистар

OXYS

имеющих признаки дегенерации нейронов всех изучаемых регионов было меньше, чем в контроле, и не отличалось от показателей крыс Вистар (см. табл. 4).

Таблица 4

Морфологическая характеристика пирамидных нейронов полей CAI, САЗ гиппокампа и зубчатой извилины крыс Вистар и OXYS и крыс OXYS, получавших SkQl с 12 до 18 мес. Данные представлены в процентах от общего количества нейронов на 1мм2

Регион Нейроны, % Вистар (п=5) OXYS (п=5) OXYS + SkQl (n=5)

CAI Н 80,4±1,6 64,1±1,7* 85,8*0,7*

ОИ 10,1 ±0,8 19,6*0,9* 8,3±0,6*

НИ 9,5±1,0 16,4±0,9* 5,9±0,4*

САЗ Н 80,2±1,9 70,6*1,4* 84,4±0,8*

ОИ 11,1±1,1 15,6±0,5* 8,9±0,6*

НИ 8,6±0,9 13,9*1,2* 6,8±0,4*

Зубчатая извилина Н 82,3±1,1 72,6*2,0" 80,9*0,6*

ОИ 10,5±0,9 16,8±1,6" 12,8*0,8

НИ 7,2±0,2 10,6*0,7" 6,3*0,6*

Н - неизмененные нейроны, ОИ и НИ - обратимо и необратимо измененные нейроны, соответственно. # - межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата.

Средняя площадь тел и ядер нейронов поля CAI у 18-мес. крыс OXYS была на 8% и 15%, соответственно, меньше, чем у крыс Вистар. В САЗ поле площадь тел нейронов была на 24% меньше у крыс OXYS. Прием SkQl увеличил площадь тел нейронов в поле САЗ и зубчатой извилине гиппокампа крыс OXYS. Также больше, чем в контроле, у принимавших SkQl крыс OXYS была площадь ядер нейронов CAI и САЗ полей.

Далее мы оценили влияние SkQl на состояние ультраструктуры пирамидных нейронов CAI поля гиппокампа крыс OXYS. В 18 мес. у крыс OXYS выявлены значительные изменения структурной организации органелл (рис. 22). Прием SkQl замедлил прогрессию деструктивных изменений нейронов (см. рис. 22): у получавших антиоксидант крыс OXYS отмечено значительное улучшение ультраструктуры ядра, комплекса Гольджи, митохондриального аппарата. Цистерны ЭПР приобретают характерную для нормы правильную параллельную ориентацию. Удельная площадь митохондрий в нейронах 18-месячных крыс OXYS снижена втрое, ЭПР - в 2,5 раза, площадь лизосом больше в 1,4 раза, вакуолей - вдвое, чем у крыс Вистар. Больше у крыс OXYS и площадь комплекса Гольджи (табл. 5). Прием SkQl замедлил снижение площади митохондрий и ЭПР, а площадь лизосом и вакуолей у принимавших SkQl крыс OXYS была меньше (см. табл. 5).

Таблица 5

Влияние приема SkQl с возраста 12 до 18 мес. на удельную площадь органелл в

цитоплазме пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа крыс OXYS

Линия крыс Митохонд-рии (%) Лизосомы (%) Комплекс Гольджи (%) ЭПР (%) Вакуоли (%)

Вистар 10,3*0,16 8,3*0,19 1,05*0,04 27,4*0,51 3,97±0,34

OXYS 3,1*0,1" 11,9*0,39" 1,20*0,04" 11,2*0,33" 8,23±0,4*

0XYS±SkQl 7,8*0,16* 9,4*0,25* 1,08*0,05 18,1*0,42* 6,81*0,38*

# - межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата.

Вистар OXYS OXYS+SkQ1

Рис. 22. Прием SkQ 1 с 12 до 18 мес. замедлил дегенеративные изменения нейронов гиппокампа крыс OXYS. Пирамидные нейроны крыс Вистар (А, Г) и OXYS (Б, Д) и принимавших SkQl крыс OXYS (В, Е). Высокое содержание липофусциновых гранул (стрелки) (Б), усложнение формы ядра с инвагинацией ядерной оболочки (стрелка), митохондрии (м) с признаками набухания и частичной фрагментацией крист (Д) в цитоплазме нейронов поля CAI гиппокампа контрольных крыс OXYS. Масштаб-0.2 pin (А-В), 1.4 рт (Г-Е).

Согласно электронномикроскопическому исследованию, у крыс обеих линий в популяции синапсов преобладали простые неперфорированные аксошипиковые и аксодендритные синапсы (рис. 23). Общая численная плотность синапсов была на 36% ниже у крыс OXYS, чем у крыс Вистар (табл. 6). Доля ассиметричных синапсов была на 42% меньше у крыс OXYS, а количество высокоактивных - положительно искривленных - контактов было в 2,6 раза меньше. У крыс OXYS, принимавших SkQl, плотность синапсов была на 17% больше, а функционально зрелых - ассиметричных синапсов - на 42% больше, чем у контроля (см. табл. 6).

мес. улучшил состояние ультраструктуры синапсов гиппокампа крыс OXYS. Типичный нейропиль CAI поля крысы Вистар (А, Б), OXYS (В, Г) и принимавшей SkQl крысы OXYS (Д, Е) (п—4). Ассиметричные синапсы (стрелки) крысы Вистар (Б) и принимавшей SkQl крысы OXYS (Е). Аксодендритный синапс крысы OXYS (Г); в дендрите видны очень крупные митохондрии. Масштаб -2 цт.

OXYS

OXYS +SkQ1

У принимавших SkQl крыс ОХУ8 доля ассиметричных синапсов составила 94% от общего количества синапсов, у контроля - 78%, а у крыс Вистар - 86% (см. табл. 6). Среди ассиметричных синапсов доля положительно искривленных (в фазе экзоцитоза)

синапсов у принимавших БкСН крыс ОХУЭ была на 85% больше, чем у контроля. За счет этого увеличилось число активных зон синаптического контакта, преимущественно, за счет популяции мелких контактов (200-300 нм) как механизма пластической реорганизации синапсов (Семченко и др., 2014).

Таблица 6

Влияние приема SkQl с 12 до 18 мес. на плотность синапсов CAI поля крыс OXYS

Крысы Численная плотность (на 100 мкм2) Симметричные синапсы (на 100 мкм2) Ассиметричные синапсы (на 100 мкм~)

Всего Плоские + иск - иск

Вистар 9.16*0.47 1.28±0.23 7.88±0.45 2.44*0.33 4.50*0.35 0.93*0.19

OXYS 5.82*0.44" 1,29±0.18 4.53*0.46" 1.98*0.31 1.74*0.26" 0.81*0.20

OXYS, SkQl 6.83*0.42 0.39*0.11* 6.44*0.43* 2.87*0.35 3.22*0.30* 0.35*0.11*

Примечание: + иск и — иск — положительно и отрицательно искривленные синапсы; # -межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата.

От крыс Вистар и крыс ОХУ8, принимавших 8к01, общая картина состояния ультраструктуры синаптических терминапей контрольных крыс ОХУБ отличалась снижением количества синаптических везикул и признаками их дезорганизации: скоплением всех пузырьков у пресинаптической мембраны или группированиями вблизи от нее (рис. 24). Нередко встречались терминали с выраженными деструктивными изменениями - появлением в пресинаптическом отростке лизосом и липидных включений в сочетании с гранулярным и фибриллярным материалом. У принимавших Бк01 крыс ОХУЭ результатом реорганизации синаптических устройств в гиппокампе стало увеличение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной. Синаптические пузырьки приобретали обычную для них округлую или

овальную форму (см. рис. 24).

Рис. 24. Прием 8к01 с 12 до 18 мес. улучшил состояние ультраструктуры синаптических терминапей гиппокампа крыс ОХУ5. Примеры ультраструктуры пре- и постсинаптических терминален поля СА1 крысы Вистар, крысы ОХУ5 и принимавшей 8к01 крысы ОХУв в 18 мес. (п=4). Масштаб — 1

(XIII.

Морфометрические оценки влияния 8к()1 на состояние синапсов подтвердили исследования содержания белков-маркеров пре- и постсинаптической плотности -синапсина I и Р81}-95 (вестерн-блот анализ). Уровень этих белков в гиппокампе и префронтальной коре 18-мес. крыс ОХУ8 был ниже, чем у крыс Вистар, а прием ЭкСЛ значительно повысил его в обеих структурах мозга до уровня крыс Вистар (рис. 25). Подтвердили это и результаты иммуногистохимического исследования: у

принимавших 8к01 крыс ОХУБ интенсивность сигналов

синапсина 1 и 1*80-95 была значительно выше, чем в контроле (см. рис. 25).

Таким образом, прием вкОЛ с 12 до 18 мес. существенно замедлил

структурно-функциональные изменения нейронов и синапсов крыс ОХ У 8 в период активной прогрессии у них признаков БА. Рис. 25. Прием вкСМ с 12 до 18 мес. повысил уровень пре- и постсинаптческих белков в гиппокампе и префронтальной коре крыс ОХУ5. Уровень РЭО-95 (А, Б, Д) и синапсина I (В, Г, Е) в гиппокампе и коре 18-мес. крыс Вистар и ОХУ5 и принимавших ЭкСН крыс ОХУ5 по данным вестерн-блот анализа.

Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга крыс Вистар и ОХУЭ и принимавших 8к<31 крыс ОХУ8 (И) антителами к синапсину 1 (красный) и Р80-95 (зеленый). Ядра окрашены 0АР1 (синий). Син I - синапсин I. Масштаб — 5 мкм. # - межлинейные различия, * - достоверный эффект препарата.

Влияние приема 8кС>1 на содержание Армо и АР]^ в гиппокампе и префронтальной коре крыс ОХУв и Вистар. Содержание АР|.40 и АЭ1-42 в гиппокампе и коре крыс ОХУЭ было больше, чем у крыс Вистар (табл. 7). 8ку 1 не влиял на содержание Армо в гиппокампе крыс Вистар и снизил его у крыс ОХУЭ до уровня первых. Содержание Ар,_42 в гиппокампе и коре принимавших 8кС)1 18-месячных крыс Вистар и ОХУ8 было меньше, чем у контрольных крыс соответствующей линии (см. табл. 7). Иммуногистохимческий анализ подтвердил эти результаты: интенсивность сигнала Ар|^2 в гиппокампе принимавших 8кС>1 18-мес. крыс ОХУ8 и Вистар была ниже, чем в контрольных группах.

Таким образом, прием 8к<31, начатый в возрасте 12 мес., снизил содержание Ар|. 42 в гиппокампе и префронтальной коре 18-мес. крыс ОХУЭ и Вистар.

Таблица 7

Влияние приема Йк01 с 12 до 18 мее. на содержание Лр,.42 и Армо в гиппокампе и _ префронтальной коре головного мозга крыс ОХУ8 и Вистар_

Линия крыс Воздействие Гиппокамп (п=6-8) Фронтальная кора (п=6-8)

Армо(пг/мг) АР1.42 (ПГ/МГ) АРмо (пг/мг) Ар|-42 (ПГ/МГ)

Вистар контроль 43,8±1,9 94,8±5,3 64±2,9 123,8±7,4

5к01 43,2±1,6 76,4±5,0* 69,3±2,6 101,4±5,3"

ОХУБ контроль 51,7±2,4* 147±9,3* 77±2,7* 172±13,9*

8к(}1 42,5±2,0" 111±5,4" 66,6±5,1 142,9±7,5

* - межлинейные различия, # - достоверный эффект препарата.

Заключение

Проведенное исследование показало, что ускоренное старение мозга крыс ОХУБ связано с развитием характерных для БА изменений. Их последовательность: дисфункция митохондрий, гиперфосфорилирование тау-белка, синаптическая недостаточность и деструктивные изменения нейронов на ранних стадиях и их прогрессия на фоне повышения уровня АРР, усиленного накопления Ар и образования амилоидных бляшек в мозге - соответствует современным представлениям о патогенезе спорадической формы заболевания у людей. Развитию признаков БА предшествуют и сопутствуют изменения транскриптома префронтальной коры крыс ОХУ8 - экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах нейрональной пластичности, иммунной системы и апоптоза, ассоциированы с фосфорилированием белков, гипоксией, Са2+ гомеостазом. Прогрессия признаков заболевания с возрастом у крыс ОХУв, как и у людей, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути БА - экспрессии генов, связанных с процессингом АРР, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами. Сходство механизмов ускоренного старения мозга крыс ОХУБ с патогенезом БА подтвердили результаты исследования влияния на них митохондриального антиоксиданта 5к(}1: доказана связь его нейропротекгорных эффектов со способностью предупреждать и/или задерживать развитие ключевых признаков БА. Отсутствие в геноме крыс ОХУЭ характерных для ранней формы заболевания мутаций в генах Арр, Рхеп! и Р.чеп2 ^еГапоуа е1 а1., 2015а) позволяет заключить, что линия крыс ОХУ5 - перспективная модель спорадической формы БА, исследования на которой позволят получать новые фундаментальные знания о молекулярно-генетических предпосылках развития заболевания, выявлять его предикторы и проводить поиск новых потенциальных молекулярных мишеней для терапевтических воздействий, направленных на профилактику и, возможно, лечение заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и нарушение способности к обучению и памяти у крыс ОХУ5 (к возрасту 3-4 месяцев) по времени совпадают с развитием в гиппокампе и префронтальной коре мозга умеренных деструктивных изменений нейронов и синапсов и увеличением их плотности. Повышение плотности синапсов в гиппокампе происходит за счет увеличения доли симметричных синапсов и может рассматриваться как проявление компенсаторной реакции в ответ на развитие нейродегенеративных процессов.

2. С возрастом нарушения поведения и снижение когнитивных функций у крыс ОХУ8 усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений и снижения

плотности нейронов и синапсов, снижения уровня пре- и постсинаптического белков синапсина I и PSD-95 в гиппокампе и префронтальной коре. Снижение плотности синапсов в гиппокампе крыс OXYS происходит в основном за счет снижения доли асимметричных синапсов и активных зон их контактов.

3. Структурные изменения митохондрий (деструкция крист, лизис матрикса, снижение удельной площади) в нейронах гиппокампа крыс OXYS выявляются в возрасте 4 месяцев и усиливаются с возрастом. Активность фермента цитохром с оксидазы комплекса IV дыхательной цепи, характеризующая функциональную активность митохондрий, в гиппокампе крыс OXYS снижена, по сравнению с таковой у крыс Вистар, уже с возраста 20 дней, в префронтальной коре — с возраста 4 месяцев, что сопряжено с умеренными деструктивными изменениями нейронов и синапсов, и как следствие, нарушениями поведения и снижением когнитивных функций.

4. Ускоренное старение мозга крыс OXYS связано с развитием ключевых признаков болезни Альцгеймера - гиперфосфорилированием тау-белка, повышением уровня АРР - белка-предшественника Ар, усиленным накоплением Ар пептида в гиппокампе и префронтальной коре и формированием амилоидных бляшек в мозге. Повышение уровня тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS выявляются с возраста 3 месяцев и нарастает с возрастом на фоне повышения уровня АРР и APi^2-

5. Усиленному накоплению Ар пептида в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS к возрасту 12 месяцев предшествуют деструктивные изменения нейронов и синапсов, структурно-функциональные изменения митохондрий, повышение уровня тау-белка и его фосфорилированной формы.

6. Сравнительный анализ транскриптома префронтальной коры крыс OXYS и Вистар методом RNA-seq выявил межлинейные различия в уровне экспрессии генов: в возрасте 5 мес. на ранней стадии развития признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS изменены уровни мРНК более 900 генов, в период их активной профессии в возрасте 18 мес. — более 2000 генов. Большинство из них связано с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом.

7. Свозрастом в префронтальной коре крыс OXYS изменяется экспрессия более 5500 генов, у крыс Вистар с возрастом изменяется экспрессия 499 генов, из которых 333 - общие для них и крыс OXYS. Прогрессия с возрастом признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, как и у людей с этим заболеванием, происходит на фоне изменения в коре мозга метаболического пути болезни Альцгеймера — экспрессии 85 генов, связанных с процессингом АРР, агрегацией и деградацией Ар, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами.

8. Прием антиоксиданта SkQl (с возраста 1,5 до 23 мес.) замедлил развитие фенотипических проявлений ускоренного старения мозга у крыс OXYS (рост тревожности, снижение моторно-исследовательсхой активности, способности к обучению и памяти), подавляя развитие ключевых признаков болезни Альцгеймера: деструктивных изменений нейронов, повышение уровня АРР и Apljt2. тау-белка и его фосфорилированной формы в гиппокампе и префронтальной коре, что в совокупности может свидетельствовать об улучшении нейрональной пластичности Мозга и улучшении когнитивных функций. Как у крыс OXYS, так и у крыс Вистар прием SkQl замедлил снижение с возрастом системных маркеров старения — уровня в крови соматотропного гормона и IGF-1.

9. Прием SkQl (с возраста 12 до' 18 мес.) замедлил как у крыс OXYS, так и у крыс Вистар снижение с возрастом способности к обучению и памяти, снизил уровень APi_42 в гиппокампе и префронтальной коре, но не повлиял на уровень тревожности и моторно-исследовательскую активность. У крыс OXYS, принимавших SkQl, в отличие от контрольных крыс повышение уровня пре- и постсинаптического белков синапсина I и PSD-95 в гиппокампе и префронтальной коре, снижение деструктивно измененных нейронов наряду с ультраструктурным состоянием нейронов, синапсов и митохондрий в гиппокампе отражают улучшение внутринейрональных процессов и аксонального транспорта.

Список основных публикаций по теме диссертации :

1. Effects of Cistanche desertlcola on behavior and signs of cataract and retinopathy in senescence-accelerated OXYS rats / N.A. Stefanova, A.Zh. Fursova, K.N. Sarsenbaev, N.G. Kolosova И J Ethnopharmacol. - 2011. - V. 138, N.2. - P.624-632.

2. Brain proteoglycans in postnatal development and during behavior decline in senescence-accelerated OXYS rats / V.I. Rykova, E.Y. Leberfarb, N.A. Stefanova, O.B. Shevelev, G.M. Dymshits, N.G. Kolosova//Adv Gerontol. - 2011. - V.24, N2 -P 234243.

3. Quantitative trait loci on chromosome 1 for cataract and AMD-like retinopathy in senescence-accelerated OXYS rats / E.E. Korbolina, O.S. Kozhevnikova, N.A. Stefanova, N.G. Kolosova // Aging (Albany NY). - 2012. - V.4, N.l. - P. 49-59.

4. Prevention of Age-Related Macular Degeneration-Like Retinopathy by Rapamycin in Rats / N.G. Kolosova, N.A. Muraleva, A.A. Zhdankina, N.A. Stefanova, A.Z. Fursova, M.V. Blagosklonny U Am J Pathol. -2012. - V.181, N.2. - P. 472-477

5. The mitochondria-targeted antioxidant SkQl but not N-acetylcysteine reverses aging-related biomarkers in rats / N.G. Kolosova, N.A. Stefanova, N.A. Muraleva, V.P. Skulachev II Aging (AlbanyNY). - 2012. - V.4, N. 10. - P. 686-694.

6. Rapamycin suppresses brain aging in senescence-accelerated OXYS rats / N.G. Kolosova, A.O. Vitovtov, N.A. Muraleva, A.E. Akulov, N.A. Stefanova, M.V. Blagosklonny // Aging(Albany NY). — 2013. - V.5, N.6. - P. 474-484.

7. Association of AMD-like retinopathy development with an Alzheimer's disease metabolic pathway in OXYS rats / O.S. Kozhevnikova, E.E. Korbolina, N.A. Stefanova, N.A. Muraleva, Y.L. Orlov, N.G. Kolosova // Biogerontology. - 2013. - V 14 N 6 - P 753-762;

8. Alzheimer's Disease-Like Pathology in Senescence-Accelerated OXYS Rats can be Partially Retarded with Mitochondria-Targeted Antioxidant SkQl / N.A. Stefanova, N.A. Muraleva, V-P- Skulachev, N.G. Kolosova // J Alzheimers Dis. . - 2014. - V.38 N 3 - P 681-694.

9. Максимова К.Ю. Морфологические изменения нейронов в гиппокампе крыс при преждевременном старении / К.Ю. Максимова, Н.А. Стефанова, С.В. Логвинов Н Бюллетень сибирской медицины.-2014.-Т.13, №1. - С.56-61.

10- !. .Senescence-accelerated OXYS rats: a model of age-related cognitive decline with relevance to abnormalities in Alzheimer disease / N.A. Stefanova, O.S. Kozhevnikova, A.O. yitovtov, K.Y. Maksimova, S.V. Logvinov, E.A. Rudnitskaya, E.E. Korbolina, N.A. Muraleva, N.G. Kolosova // Cell Cycle. - 2014. - V. 13, N.6. - P. 898-909. 11. Колосова КГ. Крысы OXYS — генетическая модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний / Н.Г. Колосова, Н.А. Стефанова, Е.Е.

Корболина, А. Ж. О.С. Фурсова, Кожевникова // Успехи геронтологии. - 2014. - Т. 27, № 2. С. 336-340.

12. Максимова К.Ю. Ультраструктура синапсов в гиппокампе крыс в процессе старения / К.Ю. Максимова, Н.А. Стсфанова, С.В. Логвинов II Бюллетень сибирской медицины. - 2014. - Т. 13, № 5. С. 49-54.

13. Beneficial effects of melatonin in a rat model of sporadic Alzheimer's disease / E.A. Rudnitskaya, K.Y. Maksimova, N.A. Muraleva, S.V. Logvinov, L.V. Yanshole, N.G. Kolosova, N.A. Stefanova // Biogerontology. - 2015.-V.16, N.3.-P. 303-316.

14. Amyloid accumulation is a late event in sporadic Alzheimer's disease-like pathology in nontransgenic rats / N.A. Stefanova, N.A. Muraleva, E.E. Korbolina, E. Kiseleva, K.Y. Maksimova, N.G. Kolosova // Oncotarget. - 2015. - V.6, N.3. - P. 1396-1413.

15. Лощенова П.С. Накопление делеций в ДНК митохондрий гиппокампа преждевременно стареющих крыс OXYS и влияние на него ангиоксиданта SkQl / П.С. Лощенова, О.И. Синицына, Л.А. Федосеева, Н.А. Стефанова, Н.Г. Колосова // Биохимия. - 2015. - Т.80, № 5. - С.707 - 715.

16. Melatonin attenuates memory impairment, amyloid-P accumulation, and neurodegeneration in a rat model of sporadic Alzheimer's disease / E.A. Rudnitskaya, N.A. Muraleva, K.Yi. Maksimova, E. Kiseleva, N.G. Kolosova, N.A'. Stefanova II J Alzheimers Dis. - 2015. - V.47, P. 103-116.

17. Melatonin attenuates impairments of structural hippocampal neuroplasticity in OXYS rats during active progression of Alzheimer's disease-like pathology / N.A. Stefanova, K.Yi. Maksimova, E. Kiseleva, E.A. Rudnitskaya, N.A. Muraleva, N.G. Kolosova IIJ Pineal Res. -2015. - V.59, N.2. - P. 163-177.

18. Максимова К.Ю. Морфологическая характеристика гиппокампа крыс линии OXYS и Вистар в процессе старения / К.Ю. Максимова, С.В. Логвинов, Н.А. Стефанова // Морфология. - 2015. - Т. 147,№3.-С. 11—16.

19. Стефанова Н.А. Изменения транскриптома префронтальной коры мозга при развитии признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS. Н.А. Стефанова, Е.Е. Корболина, Н.И. Ершов, Е.И. Рогаев, Н.Г. Колосова // Вавшовский журнал генетики и селекции. - 2015. - Т. 19, № 4. - С. 74—82.

Список сокращений:

БА — болезнь Альцгеймера, ДЭГ - дифференциально экспрессирующийся ген, ИФА — иммуноферментный анализ, Aß - бета-амилоид, АРР - предшественник белка Aß, RNA-seq - секвенирование транскриптома

Соискатель H.A. Стефанова

Подписано к печати 21.09.2015 Формат бумаги 60 х 90 1/36 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 100 экз. заказ № 204

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10