Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Влияние аналога тетрапептида холецистокинина на поведенческие и нейрохимические эффекты морфина у крыс

На правах рукописи

□ОЗОБЗОВ5

ШОХОНОВА ВЕРА АЛЕКСЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ АНАЛОГА ТЕТРАПЕПТИДА ХОЛЕЦИСТОКИНИНА НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МОРФИНА

У КРЫС

14 00 45- наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва-2007

003063065

Работа выполнена в лаборатории радиорецепторных исследований ФГУ «Национальный научный центр наркологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (директор - д м н , член корреспондент РАМН, профессор Н Н Иванец)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Проскурякова Татьяна Васильевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,

профессор Судаков Сергей Константинович

Доктор биологических наук Башкатова Валентина Германовна

Ведущая организация — ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им В П Сербского Росздрава»

Защита диссертации состоится « » мая 2007 г в часов на заседании диссертационного совета Д 208 051 01 при ФГУ ННЦ наркологии Росздрава по адресу 119002, Москва, Малый Могильцевский пер , д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ННЦ наркологии Росздрава (119002, Москва, Малый Могильцевский пер , д 3)

Автореферат разослан «_»

а ¿¿/¿г ¿Л.

«_» х 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Галева Наталья Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В России наиболее часто употребляемыми наркотическими средствами являются опий кустарного производства, героин и его самодельные аналоги (Иванец H H и др , 2005, Кошкина Е А и др , 2005, Кошкина Е А и др , 2006), поэтому лечение и профилактика опийной наркомании является чрезвычайно актуальной проблемой

Согласно современным представлениям, в формировании зависимости от опиатов существенную роль играет изменение опиоидной рецепции, прежде всего, на уровне таких регуляторных процессов, как десенситизация и интернализация рецепторов (Williams JT et al, 2001) В связи с этим в научной литературе обсуждается возможность поиска эффективных средств лечения опийной наркомании среди соединений, модулирующих опиоидную рецепцию (Blake AD et al, 1997), a в клинической наркологии в настоящее время широко используются препараты, являющиеся антагонистами опиоидных рецепторов (Сиволап Ю П Савченков В А , 2005)

Физиологические эффекты опиоидных пептидов реализуются посредством их взаимодействия со специфическими рецепторами ¡1-, 5- и к-типа, широко представленными в ЦНС и на периферии (Mansour A et al, 1995), и регулируются большим числом нейромодуляторов, в том числе и биологически активными фрагментами холецистокинина (cholecystokinin, ССК) - окта- и тетрапептидами ССК, ССК-8 и ССК-4 (Wiesenfeld-Hallin Z et al, 1999) Если ССК-8 взаимодействует в ЦНС с двумя типами ССК-рецепторов (ССК1 и ССК2), то ССК-4 обладает выраженной селективностью к ССК2-рецепторам (Rehfeld J F et al, 1985, Wank S A, 1995) Авторадиографические исследования показали, что биологически активные фрагменты ССК и опиоидные пептиды обнаруживаются в одних и тех же морфологических структурах мозга, а их специфические рецепторы локализованы на мембране одних и тех же нейронов (Noble F, et al, 1993,4 Zhang X et al, 2000)

В большинстве работ, посвященных изучению взаимодействия между ССК- и опиоидной системами, исследуется влияние лигандов ССК-рецепторов на анальгетический эффект эндогенных опиоидов и морфина (Itoh S et al, 1982, Ding XL et al, 1986, Friedrich AE, Gebhart GF, 2000, Falicio J F et al, 2001) И лишь незначительное число исследований пытается ответить на вопрос, каким образом лиганды ССК-рецепторов модифицируют подкрепляющий и анксиолитический эффекты опиоидов, а также поведенческие и вегетативные реакции, индуцируемые отменой морфина у животных опийной зависимостью (Valverde О et al, 1996, Hernando F et al, 1996, Kayser V et al, 1998)

В настоящее время доминирует мнение, что стимуляция ССК2-рецепторов снижает анальгетическое действие морфина и эндогенных опиоидных пептидов (Backus R С et al, 1997), тогда как антагонисты ССК2-рецепторов усиливают индуцируемые опиоидами анальгезию (Smadja С et al, 1995) и антидепрессантно-подобный эффект (Backus R С et al, 1997) В то же время, сообщается и о способности агонистов ССК-рецепторов (ССК-8S и церулеина) предотвращать развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина при его длительном употреблении и снижать выраженность синдрома отмены наркотика (Zarnndast MR et al, 1995, ZarnndastMR et al, 1997) При этом практически открытым остается вопрос о влиянии лигандов ССК-рецепторов на связывающую и функциональную активность опиодных рецепторов

Представленные данные послужили основанием для проведения настоящего исследования, в котором в качестве лиганда ССК-рецепторов планировалось использовать пептидное соединение, созданное путем модификации эндогенного тетрапептида ССК (аналог ССК-4) с выраженной избирательностью к ССК 1-рецепторам (Анохина ИП и соавт, 1999, Проскурякова Т В , 2000)

Цель работы состояла в изучении влияния аналога ССК-4 на опиоидергические механизмы формирования толерантности и зависимости от морфина у животных

Задачи исследования:

1 Исследовать влияние аналога ССК-4 на выраженность эффектов однократного и хронического введения морфина анальгетического действия морфина, толерантности и зависимости от наркотика

2 Изучить характер влияния аналога ССК-4 на связывающую активность агонистов опиоидных рецепторов в экспериментах ш vitro

3 Изучить влияние аналога ССК-4 на связывающую и функциональную активность опиоидных и холецистокининовых рецепторов в различных структурах мозга крыс при однократном и хроническом введении морфина

4 Оценить влияние аналога ССК-4 на потребление морфина в условиях свободного выбора у животных с опийной зависимостью

Научная новизна. Структура аналога ССК-4, созданного путем модификации эндогенного тетрапептида холецистокинина является приоритетной Впервые установлено, что аналог ССК-4 подавляет развитие основных симптомов опийной зависимости, а именно, предотвращает развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина, снижает тяжесть физической зависимости от наркотика, а также снижает потребление морфина у животных с опийной зависимостью Механизм действия аналога ССК-4 при однократном и хроническом введении морфина связан с его модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов в структурах мозга

Практическое значение. Проведенные исследования выявили у аналога ССК-4 фармакологическую активность, которая позволяет рассматривать это соединение в качестве потенциального средства для лечения опийной наркомании Это пополнит имеющийся на настоящий момент арсенал фармакологических препаратов для лечения опийной

наркомании принципиально новым средством, механизм действия которого связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов

Способность аналога ССК-4 потенцировать анальгетический эффект морфина позволяет снижать дозу наркотика, что имеет практическое значение при использовании морфина в качестве обезболивающего средства Положения, выносимые на защиту

Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем играет существенную роль в реализации эффектов острого и хронического введения морфина

В качестве эффективных средств лечения опийной зависимости могут быть использованы препараты, модулирующие связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании межлабораторной конференции ННЦ наркологии Росздрава (Москва, июнь 2003), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003), на научной конференции «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты», март 2005), на УШ-ой региональной конференции Европейского колледжа по нейропсихофармакологии (Москва, апрель 2005), на П-ом Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, май 2005), на заседании Проблемной комиссии ННЦ наркологии (Москва, апрель 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных

работ

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов Работа изложена на 130 страницах, содержит 16 таблиц и 8 рисунков Список цитированной литературы включает 169 источников, из которых - 15 работ отечественных авторов

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальные модели и методы исследования. Работа выполнена на 500 лабораторных крысах (самцах) породы Вистар с начальной массой 100-120 г Модель острой интоксикации морфином создавали путем однократного внутрибрюшинного (в/б) введения раствора морфина гидрохлорида в дозе 5 мг/кг веса животного Другой группе животных за 15 минут до введения морфина в/б вводили аналог ССК-41 в дозе 2 мкг/кг

Для создания модели физической зависимости от морфина животным в течение 14 дней дважды в сутки с интервалом в 8 часов в/б вводили раствор морфина гидрохлорида в возрастающих концентрациях от 10 до 50 мг/кг веса Во второй группе животным за 15 минут до введения морфина в/б вводили аналог ССК-4 в дозе 2 мкг/кг Синдром отмены морфина провоцировали введением налоксона в дозе 2 мг/кг вместо последней инъекции морфина Регистрацию специфических для синдрома отмены морфина поведенческих и вегетативных реакций проводили в тесте «открытое поле» в течение 45 минут Потребление морфина у животных с опийной зависимостью оценивали в условиях свободного выбора между растворами морфина и хинина Вначале животные с опийной зависимостью на протяжении двух недель получали в качестве единственного источника жидкости 0,5% раствор морфина Далее животных в течение 10 дней тестировали в условиях свободного выбора между 0,5% раствором морфина и 0,05% раствором хинина, регистрируя суточное потребление жидкостей По результатам тестирования животные были разделены на две группы с высокой (более 10 мг/кг веса) и низкой (менее 10 мг/кг веса) суточной дозой потребления морфина, т е условно на «многопьюших» и «малопьющих»

Затем животным в течение двух недель вводили аналог ССК-4 двумя способами внутрибрюшинно (в дозе 2,0 мкг/кг) и интраназально (в дозах 5,

1 Синтез аналога ССК-4 был выполнен сотрудниками лаборатории синтеза пептидов (рук лаб — канд хим наук Беспалова Ж Д ) Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава (директор - академик РАН и РАМН, профессор Чазов Е И)

50 и 200 мкг/кг) при одновременном тестировании в условиях свободного выбора между растворами морфина и хинина После отмены препарата животных вновь тестировали в тех же условиях в течение 10 дней

Влияние аналога ССК-4 на анальгетический эффект морфина оценивалось в тесте отдергивания хвоста (тест "tail-flick") по изменению латентного периода реакции животного (ЛПР ОХ) на болевой раздражитель Регистрация ЛПР ОХ осуществлялась в течение 90 минут с интервалом в 15 минут В первой серии экспериментов одной группе животных внутрибрюшинно (в/б) вводили аналог ССК-4 в дозе 2,0 мкг/кг, а другой -эквивалентный объем 0,9% раствор NaCl Во второй серии экспериментов животным 1-ой группы в/б вводили морфин в дозе 5,0 мг/кг, животным Н-ой группы морфин (5,0 мг/кг) вводили одновременно с аналогом ССК-4 (2,0 мкг/кг), животным Ш-ей группы вначале вводили аналог ССК-4 (2,0 мкг/кг), а через 15 минут - морфин (5 мг/кг)

В третьей серии экспериментов одной группе животных в течение 14 дней вводился морфин в возрастающей концентрации (от 5 до 50 мг/кг) Другая группа животных получала морфин по этой же схеме вместе с аналогом ССК-4, причем последний вводился в дозе 2,0 мкг/кг за 15 минут до морфина Через день после последней инъекции морфина у животных обеих групп оценивали выраженность анальгетического эффекта при остром введении морфина в дозе 15,0 мг/кг

Радиорецеиторные исследования. Связывающую активность опиоидных (ОР) и холецистокининовых (ССК) рецепторов в структурах мозга определяли в мембранных препаратах отделов мозга с помощью радиорецепторного анализа В качестве лигандов ОР были использованы 3Н-[D-Ala2, Б-Ьеи5]-энкефалин (3Н-ДАДЛ) и 3H-[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-энкефалин (3Н-ДАГО), а в качестве лиганда ССК-рецепторов был использован 125I-CCK-8S (Проскурякова ТВ и соавт, 2005) Для оценки связывающей активности рецепторов использовали Kd (константу

диссоциации) - величину, обратную сродству рецепторов к лиганду, и Втах, или число мест связывания лиганда

Определение базального и форсколинстимулированного уровня цАМФ в структурах мозга проводили с помощью наборов [3H]-cyclic AMP assay system (Проскурякова T В и соавт , 2006)

Математическую обработку результатов радиорецепторного анализа проводили с помощью программы Ligand Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statgraf Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате выполненного исследования было установлено, что аналог ССК-4 не обладает анальгетическим действием, но при одновременном введении с морфином потенцирует анальгетический эффект последнего, и это действие аналога ССК-4 наиболее выражено, когда введение пептида предшествует введению морфина (рис 1) Эти данные предполагают изменение под действием аналога ССК-4 опиоидной рецепции, а, возможно, и наличие у аналога ССК-4 сродства к ц — и 5- ОР, так как в реализацию анальгетического действия морфина вовлечены оба типа ОР (Rady J J et al, 2001)

В экспериментах in vitro было показано, что аналог ССК-4 вызывает дозозависимое ингибирование специфического связывания селективного агониста (J.-OP (3Н-ДАГО) (рис 2, кривая 1) и увеличение специфического связывания селективного агониста 5-ОР (3Н-ДАДЛ) (рис 2, кривая 2) Учитывая, что (i-OP и ССК-рецепторы локализованы на одних и тех же нейронах (Gall С et al, 1987, Noble F, et al, 1993, Zhang X et al, 2000), полученные результаты, на наш взгляд, не могут рассматриваться в качестве доказательства наличия у аналога ССК-4 сродства к (i-OP Что касается специфического связывания 3Н-ДАДЛ, то нам удалось доказать, что

%

500 400 300 200 1001 О

* * л *

* *

/\ * *

15 30 45 60

— Аналог ССК-4 —А— Морфин+аналог ССК-4

75 90

—П— Морфин Р Аналог CCK-4+морфнн

Рис. 1. Влияние аналога ССК-4 на анальгетический эффект морфина * - достоверность различий по сравнению с животными, получавшими один морфин (п=10)

Специфическое связывание, 1

200

160

-7 -6 -5 -4 Ig ([аналог], М)

Рис. 2. Специфическое связывание агонистов (I- и S-OP - 3Н-ДАГО (1) и Н-ДАДЛ (2) in vitro в присутствии аналога ССК-4 * - достоверность различий по сравнению с контролем (п=5)

наблюдаемое увеличение происходит за счет возрастания количества мест его связывания

Достоверное увеличение числа мест связывания 3Н-ДАДЛ при уменьшении их сродства к лиганду во фронтальной коре и стриатуме было обнаружено и в экспериментах in vivo при однократном внутрибрюшинном введении разных доз аналога ССК-4, тогда как параметры связывания 3Н-ДАГО в этих структурах мозга достоверно не изменялись (табл 1)

Таблица 1. Связывающая активность агонистов ц- и 5-ОР при однократном введении аналога ССК-4

Группы животных Стриатум Фронтальная кора

Kd (нМ) Втах(фмоль/ мг белка) Kd (нМ) Втах(фмоль/ мг белка)

'Н-ДАГО

контроль 4,1+1,2 448±70 2,4±0,5 279±150

2 мкг/кг 2,4±0,2 323±7б 3,5±1,8 197+33

20 мкг/кг 5,4+0,8 484±52 2,5+0,6 455+172

200 мкг/кг 4,0±0,7 248±91 4,2±1,0 274+161

3Н-ДАДЛ

контроль 4,5±1,2 292±57 2,7±0,8 61+16

2 мкг/кг 20,1±4,5* 244±60 7,9±2,4* 465+118*

20 мкг/кг 21,9±2,4* 484±20* 12,9±2,7* 878±296*

200 мкг/кг 20,1±2,5* 1210+140* 8,0±1,7* 1151+302*

Примечание * - р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных, каждая группа состояла из 4-5 животных

Обнаружив способность аналога ССК-4 изменять связывание агонистов [Х- и 5-ОР - 3Н-ДАГО и Н-ДАДЛ в экспериментах in vitro и in vivo, было проведено исследование его влияния на опиоидную рецепцию при

и

однократном введении морфина Для этого и дальнейших экспериментов ш vivo нами была выбрана минимальная доза аналога ССК-4 - 2 мкг/кг веса животного, потому что при этой дозе падение сродства 3Н-ДАДЛ к местам специфического связывания было таким же, как и при 10- и 100-кратном увеличении дозы аналога ССК-4

С помощью анализа насыщения ОР 3Н-ДАГО и Н-ДАДЛ было установлено, что морфин приводил к падению сродства 3Н-ДАГО к специфическим местам связывания во фронтальной коре и стриатуме (табл 2)

Таблица 2. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность агонистов (I- и 8-ОР при однократном введении морфина

Группы животных Стриатум Фронтальная кора

Kd (нМ) ВШах(фмОЛЬ/ мг белка) Kd (нМ) Вшах(фМ0ЛЬ/ мг белка)

'Н-ДАГО

контроль 4,1±1,2 448+704 2,7±0,5 279±18

морфин 15,7±ЗД* 393±96 5,8±1,2* 176+61

аналог ССК-4 + морфин 10,2±2,0* 365±73 18,8±2,9*'** 255±51

3Н-ДАДЛ

контроль 4,51,2 292+57 2,7±0,8 61+16

морфин 7,7±1,3* 285±58 4,7+0,9 163+37*

аналог ССК-4 + морфин 9,7±2,4* 189±38 4,1 ±0,8 50±10**

Примечание * - р < 0,05 — достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных, ** - р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с группой животных, получавших морфин, каждая группа состояла из 4-5 животных

Инъекция аналога ССК-4 за 15 минут до введения морфина приводила к усилению наблюдаемого при однократном введении одного морфина падения сродства 3Н-ДАГО к местам специфического связывания во фронтальной коре

При использовании в качестве лиганда 3Н-ДАДЛ наблюдаемое на фоне однократного введения морфина увеличение числа мест связывания лиганда во фронтальной коре купировалось предварительной инъекцией аналога ССК-4 В стриатуме сродство 3Н-ДАДЛ к местам специфического связывания оставалось сниженным как при введении морфина, так и при сочетанном введении аналога и морфина

Таким образом, аналог ССК-4 не предотвращал изменения сродства агонистов ц- и 5-ОР к специфическим местам связывания при однократном введении морфина, но нормализовал количество мест связывания 3Н-ДАДЛ во фронтальной коре Эту способность аналога ССК-4 трудно привлечь для объяснения увеличения анальгетического эффекта морфина при его сочетанном введении с аналогом ССК-4, так как в тесте «tail-flick» реакция животного на болевой раздражитель реализуется на спинальном уровне По-видимому, потенцирование анальгетического эффекта морфина при его сочетанном введении с аналогом ССК-4 может быть обусловлено изменениями внутриклеточных процессов, возможно, на уровне вторичных посредников

Используемая в работе схема хронического введения морфина приводила к развитию толерантности к анальгетическому действию морфина (рис 3) и формированию зависимости от морфина (рис 4)

Введение аналога ССК-4 на фоне длительной морфинизации частично предотвращало развитие толерантности к анальгетическому действию морфина (рис 3)

Основным критерием физической зависимости от морфина, как известно, является синдром отмены, который в эксперименте на животных

%

-о- КОНТРОЛЬ -а- МОРФИН -А- АНАЛОГ ССК-4 + МОРФИН

Рис. 3. Влияние аналога ССК-4 на развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина при длительном введении наркотика

обычно провоцируется введением налоксона У длительно морфинизированных животных реакции, специфические для синдрома отмены морфина наблюдались в первые 5 минут после введения налоксона, а суммарный показатель их выраженности составил в среднем 20 баллов (рис 4) У животных, которым на фоне морфинизации вводили аналог ССК-4, специфические для синдрома отмены реакции начинали проявляться через 30-45 минут после введения налоксона, а суммарный показатель их выраженности составил в среднем 7,0 баллов

Принято считать, что суммарный показатель выраженности реакций, специфических для синдрома отмены морфина, отражает тяжесть физической зависимости от морфина, в связи с чем полученные данные позволяют констатировать, что аналог ССК-4 при введении на фоне морфинизации более чем в два раза снижает ее тяжесть

скрежет зубами

диспноэ скрежет зубами

диспноэ

встряхивание головой

встряхивание

н—I птоз

головой

1-1-1—1 птоз

кция нарушение позы

__________..илоэрекция

нарушение позы

отсутствие активности

корчи 5

диарея

отряхивание мокрой собаки

ринорея

отсутствие активности

корчи

5 т

отряхивание мокрой собаки

диарея

ринорея

! I -МОРФИН

П -АНАЛОГ ССК-4+МОРФИН

Рис. 4. Влияние аналога ССК-4 на проявление синдрома отмены морфина.

Определение параметров опиоидной рецепции у хронически морфинизированных животных показало, что во фронтальной коре и стриатуме наблюдалось снижение мест специфического связывания 3Н-ДАГО при отсутствии изменений сродства использованного лиганда к ц-ОР (табл 3)

Таблица 3. Влияние аналога СС-4 на связывающую активность агонистов ОР рецепторов при длительном введении морфина

Группы животных Стриатум Фронтальная кора

К„ (нМ) ВШах (фмоль/мг белка) Кй (нМ) Вшах (фмоль/мг белка)

'Н-ДАГО

контроль 4,1±1,2 448+70 2,4±0,6 279±18

Хроническое введение морфина

- аналог ССК-4 6,1±0,8 183+67* 2,6+1,1 57±23*

+ аналог ССК-4 7,3±1,2 368±70 2,3±1,3 51±21*

Отмена морфина

- аналог ССК4 6,6±1,5 140±56* 7,3+2,1* 75±28*

+ аналог ССК-4 5,0±1,9 227±97 12,0+2,0* 215+95

'Н-ДАДЛ

контроль 4,5±0,9 292+57 2,7±0,8 61±16

Хроническое введение морфина

- аналог ССК-4 9,9±1,3* 365+89 3,5+1,3 181±39*

+ аналог ССК-4 9,5+2,1* 544±93* 5,6±1,4 250±60*

Отмена морфина

- аналог ССК-4 5,7±1,7 256±77 4,8+1,1 98±45

+ аналог ССК-4 6,5±1 9 258+91 2,6±0,2 155±61

Примечание * - р < 0,05 достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных, каждая группа состояла из 4-5 животных

Введение аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации восстанавливало до контрольных значений только число мест связывания 3Н-ДАГО в стриатуме

Увеличение мест связывания 3Н-ДАДЛ во фронтальной коре, наблюдаемое на фоне хронической морфинизации, не изменялось после предварительной инъекции аналога СССК-4, в стриатуме отмечалось увеличение мест связывания 3Н-ДАДЛ, причем его сродство в этом отделе мозга оставалось пониженным, как и при введении одного морфина

Итак, при хроническом и однократном введении морфина обнаруживаются различия не только в изменении параметров связывания используемых в работе агонистов (Д.- и 8-ОР, но и в характере влияния аналога ССК-4 на связывающую активность используемых лигандов

При отмене морфина у животных сохранялось наблюдаемое при хроническом введении морфина снижение мест связывания 3Н-ДАГО во фронтальной коре и стриатуме (табл 3 ) Когда животным морфин вводили с аналогом ССК-4, то при отмене морфина во фронтальной коре отмечалась нормализация мест связывания 3Н-ДАГО, но сродство лиганда к местам специфического связывания оставалось пониженным При использовании 3Н-ДАДЛ отмена морфина сопровождалась нормализацией его связывающей активности как у животных, получавших один морфин, так и у крыс, которым морфин вводили в сочетании с аналогом ССК-4

Таким образом, развитие опийной зависимости при длительном введении морфина приводит к снижению числа ц-ОР во фронтальной коре и стриатуме, а также к увеличению числа 8-ОР во фронтальной коре и падению сродства 8-ОР к лиганду в стриатуме Аналог ССК-4, вводимый на фоне хронической морфинизации, снижает тяжесть опийной зависимости, о чем свидетельствует менее выраженный синдром отмены морфина Полученные результаты позволяют связывать снижение тяжести опийной зависимости с увеличением 8-ОР и нормализацией числа ц-ОР в стриатуме, а менее

выраженный синдром отмены - с нормализацией числа (1-ОР во фронтальной коре

Определение параметров холецистокининовой рецепции с использованием в качестве лиганда 1251-ССК88 показало, что у хронически морфинизированных животных во фронтальной коре и гипоталамусе наблюдалось снижение мест связывания 1251-ССК88 при увеличении сродства 1251-ССК88 к ССК-рецепторам в гипоталамусе (табл 4) Аналогичные результаты были получены и у животных, которым на фоне хронической морфинизации вводился аналог ССК-4

Таблица 4. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность ССК-рецепторов на фоне длительного введения морфина и в период его отмены

Группы животных Гипоталамус Фронтальная кора

КДнМ) Втах (ПМОЛЬ/МГ белка) Ка(нМ) Вщах (ПМОЛЬ/МГ белка)

12:>1-ССК88

контроль 9,9±1,0 0,33±0,01 4,1 ±0,3 31,7 ±4,1

Хроническое введение морфина

- аналог ССК-4 3,3±0,4* 0,11 ±0,02* 4,0+0,4 19,9±3,9*

+ аналог ССК-4 3,5±0,5* 0,15±0,04* 7,9±0,7 15,3±2,7*

Отмена морфина

- аналог ССК-4 25,6±2,3* 1,80±0,09* 8,0±0,2* 33,9±4,3

+ аналог ССК-4 13,6±1,9 0,63±0,08* 5,9+1,7 25,0±2,6

Примечание * - р < 0,05 достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных, каждая группа состояла из 6-8 животных

При отмене морфина у животных наблюдалось падение сродства 1251-ССК8Б к ССК-рецепторам во фронтальной коре и гипоталамусе Во фронтальной коре падение сродства 1251-ССК88 к ССК-рецепторам

происходило на фоне нормализации мест связывания 125I-CCK8S, а в гипоталамусе - на фоне увеличения мест связывания 125I-CCK8S При отмене морфина после длительного сочетанного введения аналога ССК-4 и морфина во фронтальной коре и гипоталамусе наблюдалось восстановление сродства 125I-CCK8S к ССК-рецепторам При этом во фронтальной коре происходила нормализация мест связывания 125I-CCK8S, а в гипоталамусе - снижение мест связывания 125I-CCK8S, правда, не до контрольных значений

Согласно данным литературы, ССК- и опиоидные рецепторы локализованы на одном и том же нейроне, а в качестве одного из вторичных внутриклеточных посредников выступает цАМФ Если активация ОР инициирует снижение образования цАМФ, то при активации ССК1-рецепторов образование цАМФ увеличивается (De la Fuente М et al, 1998) Учитывая, что аналог ССК-4 обладает выраженным сродством к ССК1-рецепторам (Проскурякова Т В , 2000), важно было выяснить, каким образом изменяется уровень цАМФ при сочетанном введении аналога ССК-4 и морфина Важность этого исследования обусловлена тем, что образование цАМФ является показателем функциональной активности рецепторов

При определении базального и форсколинстимулированного уровня цАМФ было обнаружено, что при однократном введении морфина снижение форсколинстимулированного уровня цАМФ наблюдается только в гипоталамусе, а при хроническом введении морфина - только в стриатуме (рис 5) Особого внимания заслуживает выявленное в работе повышение форсколинстимулированного уровня цАМФ в стриатуме и фронтальной коре на фоне хронического сочетанного введения аналога ССК-4 и морфина и при последующей отмене морфина

Учитывая тот факт, что введение аналога ССК-4 предшествовало введению морфина, эти результаты дают основание предполагать, что аналог ССК-4, связываясь с CCKl-рецепторами, вызывает конформационные

I

II

III

цАМФ, пмоль/мг белка

т

(б)

фронгальная сгриатум гипоталамус кора

гипоталамус

I 1- контроль

I- морфин

I- аналог + морфин

Рис. 5. Базальный (а) и фор сколи нети му ли рованный (б) уровень цАМФ в отделах мозга у животных на фоне однократного (I) и хронического (II) введения аналога ССК-4 и морфина, и через 48 ч после отмены морфина и аналога ССК-4 (III); *- р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с соответствующей группой контрольных животных.

изменения ОР и, тем самым, изменяет внутриклеточные процессы, развивающиеся при последующей активации ОР морфином Эти изменения можно рассматривать как один из механизмов предотвращения развития толерантности к анальгетическому эффекту морфина и снижения тяжести физической зависимости от морфина при хроническом сочетанном введении аналога ССК-4 и морфина

Оценка влияния аналога ССК-4 на потребление морфина у животных с опийной зависимостью осуществлялась в условиях свободного выбора между растворами морфина и хинина У животных с низкой дозой потребления морфина (3,3±0,4 мл) при в/б введении аналога ССК-4 в дозе 2 мкг/кг потребление морфина снижалось до 1,5±0,2 мл (р < 0,05), а после прекращения введения пептида — до 0,7±0,3 мл (р < 0,05) У животных с высокой суточной дозой потребления морфина (15,8±2,1мл) при в/б введении аналога ССК-4 потребление морфина снижалось до 10,3±3,6 мл, а после прекращения введения пептида - до 8,3±0,9 (р < 0,05)

При интраназальном введении аналог ССК-4 вводили в дозах 5, 50 и 200 мкг/кг веса Нам не удалось выявить изменений в потреблении морфина у животных с высокой суточной дозой потребления наркотика ни при одной из используемых доз аналога ССК-4, а также после прекращения введения пептида У животных с низкой суточной дозой потребления морфина при интраназальном введении аналога ССК-4 отмечалась тенденция к снижению потребления морфина, а после прекращения введения аналога ССК-4 -достоверное снижение потребления морфина При этом у животных, получавших аналог ССК-4 в дозе 5 мкг/кг, потребление морфина снижалось более чем в 4 раза, у животных, получавших аналог ССК-4 в дозе 50 мкг/кг, -более чем в 8 раз, а у животных, получавших аналог ССК-4 в дозе 200 мкг/кг - более чем в 6 раз Эти результаты дают основание заключить, что аналог ССК-4 при интраназальном введении снижает потребление морфина только у животных с низкой суточной дозой потребления наркотика Этот эффект

аналога ССК-4 наиболее выражен после прекращения введения пептида у животных, получавших аналог ССК-4 в дозе в 50 мкг/кг

Обращает внимание, что при внутрибрюшинном способе введения ингибирующее действие аналога ССК-4 на потребление морфина не зависит от индивидуальной чувствительности животных к наркотику, тогда как при интраназальном введении аналог ССК-4 снижает потребление морфина только у животных с высокой чувствительностью к наркотику

Таким образом, анализ полученных результатов в сопоставлении с известными данными литературы свидетельствует, что взаимодействие ССК-и опиоидной систем в условиях действия морфина играет важную роль в развитии основных симптомов опийной зависимости, а в качестве эффективных средств лечения опийной зависимости могут использоваться препараты, механизм действия которых связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов

ВЫВОДЫ

1 В экспериментах т vitro аналог ССК-4 ингибирует специфическое связывание селективного агониста ц-рецепторов и увеличивает специфическое связывание селективного агониста 5-рецепторов, что свидетельствует о его модуляторном действии на опиоидную рецепцию

2 Аналог ССК-4 предотвращает наблюдаемое при однократном введении морфина увеличение числа 5-рецепторов и усиливает падение сродства ц-рецепторов во фронтальной коре

3 При формировании зависимости от морфина и толерантности к его анальгетическому эффекту наблюдается снижение числа ц-рецепторов во фронтальной коре и стриатуме, увеличение числа 8-рецепторов во фронтальной коре и падение сродства 8-рецепторов в стриатуме

4 Аналог ССК-4, вводимый на фоне хронической морфинизации, частично предотвращает развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина и снижает тяжесть опийной зависимости, что

сопровождается нормализацией числа ¡^-рецепторов и увеличением числа 8-рецепторов в стриатуме

5 Аналог ССК-4 снижает у животных с опийной зависимостью потребление морфина в условиях свободного выбора, при этом уменьшается как суточная доза морфина, так и индекс предпочтения

6 При хроническом введении морфина изменяются параметры связывания ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе Действие аналога ССК-4, вводимого на фоне хронической морфинизации, проявляется только при отмене морфина и выражается в нормализации сродства ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе и снижении числа ССК-рецепторов в гипоталамусе

7 Увеличение форсколинстимулированного уровня цАМФ в стриатуме и фронтальной коре при введении аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации может свидетельствовать об изменении под действием пептида внутриклеточных процессов, развивающихся при активации опиоидных рецепторов, вследствие чего изменяется их функциональная активность

8 Полученные результаты позволяют рассматривать аналог ССК-4 как принципиально новое средство для лечения опийной зависимости, так как механизм его действия связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Проскурякова Т В , Панкратова Н В , Петриченко О Б , Шохонова В А , Анохина И П Влияние аналога тетрапептида холецистокинина на анальгетический эффект морфина // Нейрохимия - 2003 - Т 20 - №1 - С 28-34

2 Проскурякова Т В , Панкратова Н В , Петриченко О Б , Шохонова В А , Анохина И П Влияние аналога холецистокинина на поведенческие и нейрохимические эффекты морфина // Тезисы докладов 2-ого съезда Российского Научного Общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» - Москва - 2003 - ч II - С 99

3 Проскурякова Т В , Панкратова Н В, Петриченко О Б , Шохонова В А , Анохина И П Оценка эффективности использования аналога тетрапептида холецистокинина у животных для подавления влечения к морфину и снижения тяжести физической зависимости от него // Росс псих Журнал - 2003 - № 6 - С 55-58

4 Анохина И П , Проскурякова Т В , Беспалова Ж Д , Палькеева М Е , Петриченко О Б, Шохонова В А Фармакологическая активность аналога тетрапептида холецистокинина // Российский Симпозиум по химии и биологии пептидов Тезисы докладов и стендовых сообщений Москва - 2003 - С 87

5 Проскурякова Т В , Панкратова Н В , Петриченко О Б, Шохонова В А , Палькеева М Е , Беспалова Ж Д , Анохина И П Биологическая активность холецистокинин-(ЗО-ЗЗ)-тетрапептида //Биоорганическая химия -2005 -Т 31 -№2 - С 130-139

6 Anokhma IР , Proskuryakova Т V , Petrichenko О В , Shokhonova V A Mechanism of ССК-4 analogue activity m morphine-dependent rats // Eur Neuropsychopharmacology - 2005 -V 15 -S 2 - P S264

7 Проскурякова T В , Петриченко О Б , Шохонова В А Аналог ССК-4 модулирует связывающую активность опиоидных рецепторов у животных со сформированной толерантностью к морфину // Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты Тезисы докладов и стендовых сообщений - Москва -2005 - С 119

8 Анохина И П , Проскурякова Т В , Беспалова Ж Д, Палькеева М Е , Петриченко О Б , Шохонова В А Влияние аналога тетрапептида холецистокинина на опиоидную рецепцию в условиях острого и хронического введения морфина // П Российский Симпозиум по химии и биологии пептидов Тезисы докладов и стендовых сообщений -С-Петербург -2005 - С 11

9 Проскурякова Т В , Петриченко О Б , Шохонова В А Холецистокининовые и опиоидные рецепторы мозга при длительном введении морфина и в условиях его отмены //Нейрохимия -2005 -Т 22 -№2 - С 123-127

10 Проскурякова Т В, Панкратова Н В , Петриченко О Б , Шохонова В А , Гарстукова JIГ, Анохина И П Использование аналога тетрапептида холецистокинина для подавления основных признаков зависимости от морфина у животных // Сб научных трудов «Современные проблемы наркологии» - Москва - 2005 - С 52-62

11 Анохина И П , Проскурякова Т В , Беспалова Ж Д, Палькеева М Е , Петриченко О Б, Шохонова В А Влияние аналога тетрапептида холецистокинина на опиоидную рецепцию в условиях острого и хронического введения морфина // Биоорганическая химия -2006 -Т 32-№3 - С 285-292

12 Шохонова В А, Петриченко О Б, Проскурякова Т В Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем в условиях действия морфина // Наркология -2007 - № 2 - С 49-55

Подписано в печать 23 04 2007 Формат 60x90/16 Уел печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ №64-04

Отпечатано в ООО "Центр полиграфических услуг "Радуга" 115280, г Москва, ул Автозаводская, 25 Тел 739-56-80, www raduga-pnnt ru

Актуальность исследования. В России наиболее часто употребляемыми наркотическими средствами являются опий кустарного производства, героин и его самодельные аналоги (Иванец Н.Н. и др., 2005; Кошкина Е.А. и др., 2005; Кошкина Е.А. и др., 2006), поэтому лечение и профилактика опийной наркомании являются чрезвычайно актуальной проблемой.

Согласно современным представлениям, в формировании зависимости от опиатов существенную роль играет изменение опиоидной рецепции, прежде всего, на уровне таких регуляторных процессов, как десенситизация и интернализация рецепторов (Williams J.T. et al., 2001). В связи с этим в научной литературе обсуждается возможность поиска эффективных средств лечения опийной наркомании среди соединений, модулирующих опиоидную рецепцию (Blake A.D. et al., 1997), а в клинической наркологии в настоящее время широко используются препараты, являющиеся антагонистами опиоидных рецепторов (Сиволап Ю.П., Савченков В.А., 2005).

Физиологические эффекты опиоидных пептидов реализуются посредством их взаимодействия со специфическими рецепторами ц-, б- и к-типа, широко представленными в ЦНС и на периферии (Mansour A. et al., 1995), и регулируются большим числом нейромодуляторов, в том числе и биологически активными фрагментами холецистокинина (cholecystokinin, ССК) - окта- и тетрапептидами ССК, ССК-8 и ССК-4 (Wiesenfeld-Hallin Z. et al., 1999). Если ССК-8 взаимодействует в ЦНС с двумя типами ССК-рецепторов (ССК1 и ССК2), то ССК-4 обладает выраженной селективностью к ССК2-рецепторам (Rehfeld J.F. et al., 1985; Wank S.A., 1995). Авторадиографические исследования показали, что биологически активные фрагменты ССК и опиоидные пептиды обнаруживаются в одних и тех же морфологических структурах мозга, а их специфические рецепторы локализованы на мембране одних и тех же нейронов (Noble F. et al., 1993;' Zhang X. et al., 2000).

В большинстве работ, посвященных изучению взаимодействия между ССК- и опиоидной системами, исследуется влияние лигандов ССК-рецепторов на аналитический эффект эндогенных опиоидов и морфина (Itoh S. et al., 1982; Ding X.L. et al., 1986; Friedrich A.E., Gebhart G.F., 2000; Falicio J.F. et al., 2001). И лишь незначительное число исследований пытается ответить на вопрос, каким образом лиганды ССК-рецепторов модифицируют подкрепляющий и анксиолитический эффекты опиоидов, а также поведенческие и вегетативные реакции, индуцируемые отменой морфина у животных с опийной зависимостью (Valverde О. et al., 1996; Hernando F. et al., 1996; KayserV. et al., 1998).

В настоящее время доминирует мнение, что стимуляция ССК2-рецепторов снижает анальгетическое действие морфина и эндогенных опиоидных пептидов (Backus R.C. et al., 1997), тогда как антагонисты ССК2-рецепторов усиливают индуцируемые опиоидами анальгезию (Smadja С. et al., 1995) и антидепрессантно-подобный эффект (Backus R.C. et al., 1997). В то же время, сообщается и о способности агонистов ССК-рецепторов (ССК-8S и церулеина) предотвращать развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина при его длительном употреблении и снижать выраженность синдрома отмены наркотика (Zarrindast M.R. et al., 1995; Zarrindast M.R. et al., 1997). При этом практически открытым остается вопрос о влиянии лигандов ССК-рецепторов на связывающую и функциональную активность опиодных рецепторов.

Представленные данные послужили основанием для проведения настоящего исследования, в котором в качестве лиганда ССК-рецепторов планировалось использовать пептидное соединение, созданное путем модификации эндогенного тетрапептида ССК (аналог ССК-4) с выраженной избирательностью к ССК 1-рецепторам (Анохина И.П. и соавт., 1999; Проскурякова Т.В., 2000).

Цель работы состояла в изучении влияния аналога ССК-4 на опиоидергические механизмы формирования толерантности и зависимости от морфина у животных.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние аналога ССК-4 на выраженность эффектов однократного и хронического введения морфина: анальгетического действия морфина, толерантности и зависимости от наркотика.

2. Изучить характер влияния аналога ССК-4 на связывающую активность агонистов опиоидных рецепторов в экспериментах in vitro.

3. Изучить влияние аналога ССК-4 на связывающую и функциональную активность опиоидных и холецистокининовых рецепторов в различных структурах мозга крыс при однократном и хроническом введении морфина.

4. Оценить влияние аналога ССК-4 на потребление морфина в условиях свободного выбора у животных с опийной зависимостью.

Научная новизна. Структура аналога ССК-4, созданного путем модификации эндогенного тетрапептида холецистокинина является приоритетной. Впервые установлено, что аналог ССК-4 подавляет развитие основных симптомов опийной зависимости, а именно, предотвращает развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина, снижает тяжесть физической зависимости от наркотика, а также снижает потребление морфина у животных с опийной зависимостью. Механизм действия аналога ССК-4 при однократном и хроническом введении морфина связан с его модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов в структурах мозга.

Практическое значение. Проведенные исследования выявили у аналога ССК-4 фармакологическую активность, которая позволяет рассматривать это соединение в качестве потенциального средства для лечения опийной наркомании. Это пополнит имеющийся на настоящий момент арсенал фармакологических препаратов для лечения опийной наркомании принципиально новым средством, механизм действия которого связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов.

Способность аналога ССК-4 потенцировать анальгетический эффект морфина позволяет снижать дозу наркотика, что имеет практическое значение при использовании морфина в качестве обезболивающего средства.

Положения, выносимые на защиту.

Взаимодействие холецистокининовой и опиоидной систем играет существенную роль в реализации эффектов острого и хронического введения морфина.

В качестве эффективных средств лечения опийной зависимости могут быть использованы препараты, модулирующие связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании межлабораторной конференции ННЦ наркологии Росздрава (Москва, июнь 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003); на научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», март 2005); на VIII-ой региональной конференции Европейского колледжа по нейропсихофармакологии (Москва, апрель 2005); на Н-ом Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, май 2005); на заседании Проблемной комиссии ННЦ наркологии (Москва, апрель 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 130 страницах, содержит 16 таблиц и 8 рисунков. Список цитированной литературы включает 169 источников, из которых -15 работ отечественных авторов.

выводы

1. В экспериментах in vitro аналог ССК-4 ингибирует специфическое связывание селективного агониста ц-рецепторов и увеличивает специфическое связывание селективного агониста 5-рецепторов, что свидетельствует о его модуляторном действии на опиоидную рецепцию.

2. Аналог ССК-4 предотвращает наблюдаемое при однократном введении морфина увеличение числа б-рецепторов и усиливает падение сродства ц-рецепторов во фронтальной коре.

3. При формировании зависимости от морфина и толерантности к его анальгетическому эффекту наблюдается снижение числа ц-рецепторов во фронтальной коре и стриатуме, увеличение числа б-рецепторов во фронтальной коре и падение сродства 5-рецепторов в стриатуме.

4. Аналог ССК-4, вводимый на фоне хронической морфинизации, частично предотвращает развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина и снижает тяжесть опийной зависимости, что сопровождается нормализацией числа (i-рецепторов и увеличением числа 5-рецепторов в стриатуме.

5. Аналог ССК-4 снижает у животных с опийной зависимостью потребление морфина в условиях свободного выбора, при этом уменьшается как суточная доза морфина, так и индекс предпочтения.

6. При хроническом введении морфина изменяются параметры связывания ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе. Действие аналога ССК-4, вводимого на фоне хронической морфинизации, проявляется только при отмене морфина и выражается в нормализации сродства ССК-рецепторов во фронтальной коре и гипоталамусе и снижении числа ССК-рецепторов в гипоталамусе.

7. Увеличение форсколинстимулированного уровня цАМФ в стриатуме и фронтальной коре при введении аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации может свидетельствовать об изменении под действием пептида внутриклеточных процессов, развивающихся при активации опиоидных рецепторов, вследствие чего изменяется их функциональная активность.

8. Полученные результаты позволяют рассматривать аналог ССК-4 как принципиально новое средство для лечения опийной зависимости, так как механизм его действия связан с модулирующим влиянием на связывающую и функциональную активность опиоидных рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поведенческие и нейрохимические эффекты острого и, особенно, хронического введения морфина являются предметом изучения на протяжении очень длительного периода времени. Благодаря этим исследованиям были обнаружены нарушения обмена практически всех нейромедиаторов и нейромодуляторов, в том числе и на уровне внутриклеточных процессов (Williams J.T. et al., 2001). Эти нарушения, вероятно, лежат в основе изменения мотивации поступков и реакции на стресс при хроническом употреблении морфина и обусловливают, в конечном счете, формирование основных симптомов опийной зависимости: патологического влечения к опиатам, развитие толерантности к их физиологическим эффектам и синдрома отмены.

На настоящий момент наиболее обсуждаемой является теория, связывающая механизм формирования зависимости от психоактивных веществ, в том числе и морфина с нарушением обмена дофамина в структурах мезолимбической системы мозга (Анохина И.П., 1995). Доказано, что ПАВ активируют проводящие пути ДА-нейронов, локализованных в вентральной области покрышки среднего мозга, в прилежащее ядро и префронтальную кору (Nutt D.J., 1996). Но при этом никто не отрицает важной роли опиодных систем в развитии толерантности и зависимости от морфина, так как начальным этапом фармакологического действия морфина является его связывание со специфическими рецепторами ц-, 5- и к-типа, широко представленными в ЦНС и на периферии (Mansour A. et al., 1995).

Физиологические эффекты морфина регулируются большим числом нейромодуляторов. ССК, как нейромодуляторный пептид, попал в поле зрения исследователей после того, как в 1982 г. S.Itoh et al., обнаружили ингибирующее действие CCK-8S на анальгетический эффект (3-эндорфина. В дальнейшем появилось множество исследований, посвященных изучению влияния лигандов ССК-рецепторов не только на анальгетический эффект морфина (Faris P.L. et al., 1983; Zarrindast M.R. et al., 1997; Williams C.L. et al.,

1997; Friedrich A.E., Gebhart G.F., 2000; Falicio J.F. et al., 2001 и др.), но и на подкрепляющий (Smadja С. et al., 1995; Valverde О. et al., 1996 и др.) и антидепрессантноподобный эффекты морфина (Hernando F. et al., 1994), а также поведенческие и вегетативные реакции, индуцируемые отменой морфина у животных опийной зависимостью (Maldonado R. et al., 1995; Zarrindast M.R. et al., 1995; Kayser V. et al., 1998).

Эти исследования преследовали две цели. Во-первых, получить доказательства, что ССК-система играет важную роль в реализации эффектов морфина при остром и хроническом введении наркотика. И, во-вторых, оценить возможность использования лигандов ССК-рецепторов различной химической природы для купирования основных симптомов опийной зависимости.

Представленные данные литературы и послужили основанием для проведения настоящего исследования с использование в качестве лиганда ССК-рецепторов пептидного соединения, созданного путем модификации эндогенного ССК-4 (аналог ССК-4) и являющегося лигандом ССК1-рецепторов (Анохина И.П. и соавт., 1999; Проскурякова Т.В. и соавт., 2000)

В результате выполненной работы удалось обнаружить увеличение анальгетического эффекта морфина при его совместном введении с аналогом ССК-4, и это увеличение было наиболее выраженным, когда введение пептида предшествовало введению морфина. Используя этот режим введения аналога ССК-4 и морфина в условиях хронического введения наркотика, наблюдалось частичное предотвращение развития толерантности к анальгетическому эффекту морфина и значительное снижение тяжести физической зависимости от морфина. И, наконец, у животных с физической опийной зависимостью было выявлено снижение под действием аналога ССК-4 потребления морфина в условиях свободного выбора между растворами морфина и хинина. Ингибирующий эффект аналога ССК-4 на потребление морфина наблюдался при двух способах введения аналога ССК-4 (внутрибрюшинном и интраназальном) и наиболее значимо проявлялся после прекращения введения пептида. При внутрибрюшинном способе введения аналога ССК-4 снижение потребления морфина отмечалось у животных с высокой и низкой суточной дозой потребления морфина, т.е. не зависело от чувствительности животных к морфину. При интраназальном способе введения аналога ССК-4 снижение потребления морфина отмечалось только у животных с низкой суточной дозой потребления морфина. Следует отметить, что у животных интраназальное введение сопровождается развитием стресса, вызванного кратковременной иммобилизацией животного в руках экспериментатора. Этот факт, вероятно, трудно привлечь для объяснения отсутствия ингибирующего действие аналога ССК-4 на потребление морфина у животных с высокой суточной дозой потребления наркотика при интраназальном способе введения пептида. Скорее всего, в условиях стресса потребление морфина должно было бы возрастать, но этого не наблюдалось. Вместе с тем, при хроническом введении морфина реакция на стресс изменяется.

На наш взгляд, представляют интерес данные, согласно которым у животных с опийной зависимостью, получавших аналог ССК-4, в период отмены морфина снижался уровень тревожности. Известно, что существует положительная корреляционная связь между редукцией тревожности и снижением влечения к ПАВ, в том числе и морфину.

В настоящей работе было уделено внимание изучению влияния аналога ССК-4 на связывающую активность опиоидных рецепторов ц- и 5- типа в экспериментах in vitro и in vivo. Но при этом наиболее значимым было решение двух вопросов. Первый вопрос предполагал выяснить, каким образом изменяется связывающая активность ц- и 8- опиоидных и ССК-рецепторов при сочетанном введении аналога ССК-4 и морфина в условиях однократного, и особенного, хронического введения наркотика. Второй вопрос касался изменений в тех же условиях образования цАМФ, одного из вторичных внутриклеточных посредников, так как образование цАМФ является показателем функциональной активности ц- и 8- опиоидных и ССК-рецепторов.

В результате выполненных исследований было показано, что если в экспериментах in vitro аналог ССК-4 при добавлении в реакционную среду вызывал дозозависимое ингибирование специфического связывания селективного лиганда ц-ОР (3Н-ДАГО) и увеличивал специфическое связывание селективного агониста 8-ОР (3Н-ДАДЛ) за счет возрастания числа 8-ОР, то в экспериментах in vivo при однократном введении аналога ССК-4 связывающая активность ц-ОР во фронтальной коре и стриатуме не изменялась, но при этом в обеих структурах мозга отмечалось достоверное увеличение числа мест 8-ОР на фоне падения сродства лиганда к 8-ОР.

Стоит отметить, что обнаруженное в экспериментах in vitro ингибирование аналогом ССК-4 специфического 3Н-ДАГО не является доказательством наличия у пептида сродства к Ц.-ОР, потому что ССК- и ц-опиоидные рецепторы локализованы на одних и тех же нейронах.

Обращают внимание и различия в действии самого аналога ССК-4 на связывающую активность ц- и 8- ОР при однократном и хроническом введении пептида. При однократном введении аналога ССК-4 изменялась только связывающая активность 8-ОР. Эти изменения выражались в увеличении мест связывания 3Н-ДАДЛ падении его сродства к 8-ОР во фронтальной коре и стриатуме по сравнению с контрольными животными, которым вместо аналога ССК-4 вводили эквивалентный объем 0,9% раствора NaCl. При длительном введении аналога ССК-4 наблюдалось увеличение мест связывания 3Н-ДАГО во фронтальной коре и увеличение мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре и стриатуме при падении сродства этих лигандов к (д.- и 8-ОР в обеих структурах мозга.

Различия в изменении параметров связывания используемых в работе агонистов {д.- и 8-ОР наблюдались при однократном и хроническом введении морфина, а также в том случае, когда на фоне однократного и хронического введения морфина животным вводился аналог ССК-4.

Если при однократном введении морфина отмечалось лишь падение сродства Н-ДАГО к ц-ОР во фронтальной коре и стриатуме, то при хроническом введении морфина наблюдалось снижение мест специфического связывания 3Н-ДАГО в исследуемых структурах мозга. Инъекция аналога ССК-4, предшествующая однократному введению морфина, усиливала падение сродства 3Н-ДАГО к ji-ОР во фронтальной коре, тогда как введение аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации приводило к нормализации мест связывания 3Н-ДАГО в стриатуме.

Продолжительность введения морфина не оказывала влияния на связывающую активность 5-ОР: и при однократном, и при хроническом л введении морфина наблюдалось увеличение мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре и падение сродства 3Н-ДАДЛ к 8-ОР в стриатуме. Различия обнаруживались в том случае, когда введению морфина предшествовало введение аналога ССК-4. Если при однократном введении л аналога ССК-4 и морфина наблюдалась нормализация мест связывания Н-ДАДЛ во фронтальной коре, то при введении аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации отмечалось увеличение мест связывания 3Н-ДАДЛ в стриатуме.

Необходимо отметить, что при однократном введении аналога ССК-4 и морфина регистрировалось увеличение анальгетического эффекта морфина. Известно, что в основе анальгетического эффекта морфина, во-первых, лежит способность наркотика тормозить болевой импульс на путях его иррадиации по ЦНС, а именно на интернейронах спинного мозга, ретикулярной формации ствола, таламуса и коры больших полушарий, которые содержат главные болевые центры. И, во-вторых, способность морфина изменять восприятие боли и, следовательно, изменять реакции на болевой импульс, что позволяет связывать анальгетический эффект морфина с его влиянием на нейроны коры головного мозга. Эти данные позволяют связывать потенцирующее действие аналога ССК-4 на анальгетический эффект морфина с изменением связывающей активности, прежде всего, 5-ОР во фронтальной коре, несмотря на то, что для определения анальгетического действия морфина использовался тест отдергивания хвоста.

Если сконцентрировать внимание на данных, полученных при определении связывающей активности |х- и 5-опиоидных рецепторов у животных, длительное время получавших морфин в сочетании с аналогом ССК-4, то можно придти к заключению, что наблюдаемое при этом предотвращение развития толерантности к анальгетическому эффекту морфина и снижение тяжести опийной зависимости сопровождается нормализацией числа ц-рецепторов и увеличением числа 8-рецепторов в стриатуме.

Механизм формирования толерантности и зависимости от морфина до сих пор окончательно неясен, несмотря на длительность исследования этих феноменов. Результаты, полученные при изучении механизма развития толерантности и зависимости от морфина на уровне ц-опиоидной рецепции, оказались противоричивыми. Наряду с данными об отсутствии изменений связывающей активности ц-рецепторов при длительном введении морфина (Wong C.S. et al., 1996) имеются сообщения о снижении их плотности и/или аффинности в структурах головного мозга экспериментальных животных (Jordan В., Devi L.A., 1998). При этом наиболее устойчиво феномен down-регуляции fi-OP проявляется при хроническом воздействии опиатами в опытах in vitro (Self D.W. et al., 1995). В ряде работ сообщается о ир-регуляции, т.е. повышении числа jj.-OP при хроническом введении опиатов (Ueda Н. et al., 1997; Georges F. et al., 1999).

Необходимо подчеркнуть трудность сопоставления результатов разных авторов, так как регуляция экспрессии ц-ОР в условиях действия морфина очень нестабильна. К тому же связывающая активность ц-ОР зависит от нескольких факторов, таких как локализация ц-ОР рецепторов в ЦНС, схема морфинизации (доза и длительность введения морфина), используемая авторами для формирования толерантности и зависимости от морфина, и метод определения параметров связывания ц-ОР. Так, использование авторадиографического или гистохимического методов позволяет определять только плотность рецепторов. Применение радиорецепторного анализа позволяет определять не только число рецепторов, но и константу диссоциации. Но при сопоставлении результатов, полученных разными авторами с помощью радиорецепторного анализа, важным моментом является использование различных меченых лигандов, обладающих, как правило, различной избирательностью к рецепторам. Если же используются одни и те же меченые лиганды, то опять возникает проблема, связанная с фирмой-проиводителем этих лигандов, так как одни и те же меченые лиганды, изготовляемые разными фирмами, не всегда имеют одни и те же параметры связывания.

В задачи настоящей работы не входило изучение влияния аналога ССК-4 на синдром отмены морфина. Однако, учитывая тот факт, что о снижении тяжести физической зависимости от морфина у животных, которым на фоне хронической морфинизации вводился аналог ССК-4, мы судили по менее выраженному синдрому отмены морфина, нами было выполнено исследование связывающей активности ц- и 8-опиоидных рецепторов мозга в период отмены морфина. Согласно полученным результатам, в период отмены морфина у животных, получавших один морфин, наблюдалось снижение числа ц-ОР в стриатуме и во фронтальной коре. У животных, получавших морфин в сочетании с аналогом ССК-4, в период отмены морфина число р,-ОР в этих структурах мозга не отличалось от контрольных значений, и при этом суммарный показатель выраженности синдрома отмены был ниже, чем у животных, получавших один морфин. Эти данные позволили нам связать менее выраженный синдром отмены у животных, которым на фоне хронической морфинизации вводился аналог ССК-4, с нормализацией числа (i-опиоидных рецепторов во фронтальной коре.

Изучение механизма, лежащего в основе изменения эффектов морфина под действием ССК, на протяжении последних 15-ти лет проводилось как на уровне опиоидной рецепции, так и на уровне внутриклеточных процессов, развивающихся при активации OP. L.Zhang et al. (1993) показал, что CCK-8S л в широком диапазоне концентраций ингибирует связывание Н-налоксона с ОР в мозге крыс, что выражается в уменьшении числа ОР на фоне увеличения константы диссоциации. Нам удалось получить аналогичные данные только в отношении числа ц-ОР в экспериментах in vitro и при хроническом введении морфина и аналога ССК-4 при использовании 3Нл

ДАГО в качестве лиганда ц-ОР. Уменьшал сродство Н-эторфина к ОР и один из вторичных внутриклеточных посредников, гуанозин-5 - 0 - 3(3-тиотрифосфат), и этот эффект в значительной степени снижался в присутствии CCK-8S. На основании полученных данных авторы выдвинули предположение, что CCK-8S ингибирует связывание лигандов ОР как на рецепторном, так и на пост-рецепторном уровнях. В первом случае действие CCK-8S проявляется в снижении числа и аффинности ОР, а механизм действия пептида, скорее всего, связан с изменением конформации рецепторного белка ОР после связывания CCK-8S со специфическими рецепторами. С этим можно согласиться, но при этом необходимо помнить, что при связывании CCK-8S со специфическими рецепторами также происходит изменение конформации рецепторного белка ССК 1-рецептора. Во втором случае действие CCK-8S проявляется, по-видимому, в подавлении процесса спаривания рецепторного белка ОР с G-белками.

Эти данные имеют чрезвычайно важное значение, т.к. действие аналога ССК-4 на фоне однократного и хронического введения морфина происходит в условиях конкуренции с эндогенным CCK-8S за места специфического связывания. Правда, ранее при сравнении селективности аналога ССК-4 с селективностью эндогенного CCK-8S было обнаружено, что при одновременной модифицикации N- и С- терминальных участков в структуре эндогенного ССК-4 посредством замены Met31 на Nle и введения в С-концевой амид пространственного заместителя [СН(СНз)2] у аналога ССК-4 более чем на порядок увеличивается селективность к ССК 1-рецепторам по сравнению с CCK-8(S) (Проскурякова Т.В. и соавт., 2000).

Объяснить способность аналога ССК-4 предотвращать развитие толерантности к анальгетическому эффекту морфина и снижать тяжесть зависимости от морфина невозможно без привлечения полученных в работе данных об уровне цАМФ.

До сих пор изменения аденилатциклазной активности обсуждаются в качестве одной из гипотез развития толерантности и зависимости от опиатов. Согласно этой гипотезе, связываясь со специфическими рецепторами, морфин вызывает ингибирование аденилатциклазы. Если действие морфина носит хронический характер, то включаются компенсаторные клеточные механизмы, благодаря которым происходит увеличение числа молекул аденилатциклазы и повышение концентрации цАМФ до нормального уровня. Эту гипотезу нам удалось подтвердить в отношении как базального, так и форсколинстимулированного уровня цАМФ практически во всех изучаемых отделах мозга при хроническом введении морфина. При этом форсколинстимулированный уровень цАМФ в стриатуме при хроническом введении морфина был сниженным.

В литературе снижение форсколинстимулированного уровня цАМФ рассматривается в качестве показателя отсутствия десенситизации ОР при длительном введении морфина (Blake A.D. et al., 1997). На наш взгляд, объяснить полученные результаты возможно, если обратить внимание на тот факт, что именно в стриатуме обнаружена наибольшая плотность не только (х-, но и б-ОР. Морфин же, как известно, чаще рассматривается в качестве селективного агониста ц-ОР и хроническое введение морфина приводит к десенситизации именно этого подтипа ОР. В связи с этим, можно предположить, что в стриатуме, несмотря на длительное введение морфина, часть ОР, скорее всего, 8-типа сохранили чувствительность к наркотику.

Особого внимания заслуживают выявленное в работе повышение форсколин-стимулированного уровня цАМФ в стриатуме и фронтальной коре животных, которым на фоне хронического введения морфина осуществлялась инъекция аналога ССК-4, и сохранение повышенного форсколин-стимулированного уровня цАМФ у этих животных после отмены морфина. При этом введение аналога ССК-4, как отмечалось выше, предшествовало введению морфина.

Опираясь на известные данные литературы о том, что ССК 1-рецепторы, выраженной избирательностью к которым обладает аналог ССК-4, спарены с Gs-белком, самое простое объяснение повышения форсколин-стимулированного уровня цАМФ можно было бы свести к активации под действием аналога ССК-4 ССК 1-рецепторов, при которой наблюдается увеличение образования ц-АМФ. Вместе с тем последующее введение морфина приводит к активации (i- и 5-опиоидных рецепторов, которые спарены с Gi -белками и поэтому активация этих рецепторов инициирует снижение образования цАМФ. В связи с этим возникает вопрос, почему не изменяется форсколин-стимулированный уровень, ответить на который на основании полученных в работе данных, не так просто.

Можно предположить, что аналог ССК-4, связываясь со специфическими рецепторами, вызывает конформационные изменения не только ССК 1-рецепторов, но и локализованных в непосредственной близости ОР. В результате этого, по-видимому, нарушается процесс спаривания ОР с G-белком, а, возможно, и процесс фосфорилирования G-белка и, как следствие этого, не происходит диссоциации G-белка на составляющие его субъединицы. Главным моментом при этом является то, что если а-субъединица не диссоциирует из G-белка, то не произойдет и её воздействия на аденилатциклазу и, следовательно, снижения уровня цАМФ.

Полученные нами результаты позволяют констатировать, что увеличение форсколинстимулированного уровня цАМФ в стриатуме и фронтальной коре при введении аналога ССК-4 на фоне хронической морфинизации может свидетельствовать об изменении под действием пептида внутриклеточных процессов, развивающихся при активации опиоидных рецепторов, вследствие чего изменяется их функциональная активность.

Таким образом, выявленная в настоящей работе фармакологическая активность аналога ССК-4 свидетельствует, что взаимодействие ССК- и опиоидной систем в условиях действия морфина играет важную роль в развитии основных симптомов опийной зависимости. Некоторые вопросы и, прежде всего, механизм этого взаимодействия остаются, в известной степени, открытыми. Но уже на данном этапе исследований можно обсуждать возможность разработки на основе аналога ССК-4 принципиально нового лекарственного средства для лечения опийной наркомании, механизм действия которого связан с молулирующим действием на связывающую и функциональную активность ц- и 5-опиоидных рецепторов мозга. Однако окончательный ответ об эффективности его применения в практической наркологии могут дать только клинические испытания, потому что в развитии опийной зависимости существенную роль играют не только физиологическая, но и психологическая составляющая, особенно, при формировании патологического влечения к опиатам. В условиях эксперимента на животных наиболее объективно оценивается физиологическая составляющая опийной зависимости, хотя разработаны подходы и к оценке психологической составляющей (уровня тревожности, депрессивно-подобного состояния, мотивации к употреблению психоактивных веществ), но интерпретация результатов, полученных с использованием этих подходов, требует определенной корректности.

110