Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Особенности нейрохимических систем мозга у крыс с различным отношением к морфину

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НАРКОЛОГИИ

На правах рукописи

¿№ 6</£.№.. Ч. О/?: у

РУСАКОВА ИРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ СИСТЕМ МОЗГА У КРЫС С РАЗЛИЧНЫМ ОТНОШЕНИЕМ К МОРФИНУ.

14.00.45. - Наркология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Государственном Научном Центре наркологии Минздрава России

Научный руководитель - доктор медицинских наук С.К.Судаков

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, Б.М. Коган,

кандидат биологических наук Л.Ф.Мещеряков.

Ведущее учреждение - Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится ¿ССЛС^-З 1997 года в ......

часов на заседании диссертационного совета Д 074.50.01 при НИИ наркологии Минздрава России (121921, Москва, Малый Могильцевский пер., 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ наркологии Минздрава России

■¿у. ¿и

Автореферат разослан "¿А." с^иь-ЩЛ 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

О.Ф.Львова

Актуальность исследования.

Известно, что люди и животные обладают не одинаковой чувствительностью к действию фармакологических препаратов, в частности морфина и других опиатов ( Kolb L., Himinelsbacli C.K.1938; Майский А.И., Ведерникова H.H. 1982; O'Brien C.P., Ehrman R.N. 1986; Segal D.S., Kuczensky R. 1987; Piazza P.V., Deminiere J.-M. 1989; George et al.,1991; Cadoret R.J.1992). В связи с этим возникают две проблемы, касающиеся индивидуальной восприимчивости к эффектам опиатов. Первая касается медицинского применения морфина для обезболивания. Поскольку как исходная болевая чувствительность, так и выраженность анальгетического действия морфппа имеют значительные индивидуальные колебания (Chapman C.R. et al., 1990; Dampier C.D. et al.,1995), то существует проблема «морфин-толерантных» пациентов, у которых наличие сильного болевого синдрома, некупируемого даже большими дозами наркотика приводит к длительному мучительному состоянию (Lossignol D.А.,1993; Sosnovvski M.,1993; de -Leon Casasola O.A., Lema M.J.,1994). Другая проблема касается формирования зависимости от опиатов. С одной стороны имеется индивидуальная чувствительность к положительно-подкрепляющему действию наркотика, что обусловливает большие различия в частоте и количестве потребления наркотика (Petrie В.F.,1996). С другой стороны, известно, что у некоторых индивидуумов зависимость формируется уже после нескольких инъекций, а у других не наблюдается синдрома отмены даже после длительного употребления опиатов (Wang J.J.,Но S.T.,1994).

В основе индивидуальных особенностей чувствительности к действию опиатов лежат генетические и индивидуально-приобретенные факторы из которых первые являются, как правило довольно значительными (Nunes de Souza R.L. et al., 1993; Mogil J.S.,1997). Как известно, генегичсские особенности проявляются в особенностях биохимических, физиологических, морфологических и поведенческих (Purrman J. et al.,1989; Corvo! P. Et a!.,1989; Feller D.J., Crabbe J.C.,1991; Poletaeva I.I., Salimov R.M.,1992; Mogil J.S. et a!., 1995). Таким образом, изучение проявлений генетических особенностей у индивидуумов с различной чувствительностью к действию опиатов является весьма актуальной задачей.

Для изучения индивидуальных особенное гей действия наркотических веществ довольно широко проводятся эксперименты на животных инбредных линиях грызунов (Suzuki T. et al., 1988; 1992; George F.R., Goldberg,S.R.,1988). Благодаря длительному близкородственному скрещиванию эти животные приобрели практически одинаковый генотип, что позволяет считать особенности, характерные для конкрегной линии чисто генетическими (Кайданов, Лучникова 1981). Известно, что некоторые линии мышей ( Erikson, Kiianmaa, 1971; Castellano 1974; Kiiribara, Tadokoro 1989; Survit et al 1989; Belknap etal 1989; Berrettini W.U. et al., 1994; Noble F., CoxB.M.,1996) и крыс (Nichols and Hsiao 1967; Satinder 1977; Belknap J.K. et al.. 1990; Kanarek R.B. et al.,

1991; Suzuki et al., 1992) проявляют разную чувствительность к действию морфина.

Исходные характеристики состояния тон или иной нейромедиаторной системы мозга могут определять чувствительность индивидуума к действию морфина. Существует немного работ, где авторы пытаются найти взаимосвязь между нейрохимическими процессами п чувствительностью к действию наркотических веществ ( Hooks M.S.et al., 1992). Несомненно, что действие экзогенных опиатов реализуется прежде всего через эндогенную опиоидпую систему мозга, находящуюся в тесном взаимодействии с другими нейрохимическими системами, в частности системами моноаминов (Carr K.D., Papadouka V.,1994; Codd Е.Е. et al., 1995; Rabadan J.V., et al., 1997). Большое количество данных указывает на участие катехоламиновой и индоламнновой систем мозга в реализации острого и хронического действия морфина (Анохина И.П. и соавт.,1979; Sutton L.C. et al., 1997; Maldonado R. et al.,1997). Таким образом, можно предположить, что генетические особенности эндогенной опиоидной системы мозга, а также сопряженных моноаминовых систем могут определять индивидуальную чувствительность к действию морфина. Действительно, ряд данных указывает на то, что плотность опнатных рецепторов в некоторых отделах мозга коррелирует с выраженностью анальгегпческого и положительно-подкрепляющего действия морфина (Moskowitz et al., 1985; Mogil J.S. et ill.,1994; Elmer G.I. et al., 1995; Sora I. et al., 1997). Роль индивидуальных особенностей моноаминергических систем мозга в индивидуальном чувствительности к действию опиатов практически неясна.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение роли генетических особенностей некоторых нейрохимических систем мозга в формировании чувствительности к действию морфина. В соответствии с этим в ходе исследования решались следующие задачи:

1. Изучить выраженность эффектов однократного и хроническою введения морфина у двух генетически чистых линий крыс - WAG/G и Fisclier-344. При этом планировалось изучение анальгегпческого, депрессивного, каталептическою и положительно-подкрепляющего действия морфина, а также формирования толерантности и синдрома отмены у морфин-зависимых животных.

2. Исследовать характеристики рецепторного связывания опиатной, адренергической и серогонинергической систем мозга крыс линий Fisher-344 и WAG/G .

3. Изучить влияние внутрижелудочкового введения агонистов и антагонистов а2- и S2- рецепторов на чувствительность к острому (анальгезия) м хроническому ( синдром отмены) действию морфина у инбредных линии крыс.

Научная новизна.

Впервые обнаружены генетически детерминированные различия в чувствительности к действию морфина у линейных крыс: крысы линии WAG/G менее чувствительны, чем F-344 к эффектам острого введения морфина (двигательная активность, каталепсия, анальгезия, положительное подкрепление).

Показано, что исследуемые линии различаются но

характеристикам рецеигорного связывания в мембранах головного мозга : концентрация ц-опнатных и а2-адренорецепторов крыс линии WAG/G достоверно выше, чем у линии F-344. Чувствительность же S2-серотониновых рецепторов достоверно ниже у липни WAG/G, чем у F-344.

Полученные результаты даюг основание полагать, что большая чувствительность к анальгетичсскому действию морфина у крыс линий F-344 может быть обусловлена большей активностью у них серотониновой системы мозга.

Выявлена различная структура абстинентного синдрома: у крыс линии F-344 чаще встречаются такие признаки как отряхивания «мокрой собаки» и скрежет зубами, а у животных линии WAG/G - пилоэрекция. Показано, что преобладание в структуре абстинентного синдрома отряхивании «мокром собаки» и встряхиваний передними лапами возникает у индивидуумов со сниженной активностью а2-адренергической системы.

Научно-практическая значимость исследований.

Данные о линейных различиях в чувствительности к действию морфина могут служить основой для дальнейшего углубленного изучения конкретных нейрохимических механизмов, лежащих в основе генетической предрасположенности или устойчивости к эффектам морфина и могут быть использованы для коррекции неблагоприятных генетически детерминированных реакций на введение морфина.

Обнаружено , что воздействие на серотонинергическую систему мозга, увеличивающее ее активность, может способствовать решению проблемы обезболивания в клинике у так называемых «морфин-толерантных» больных.

Проведенные эксперименты указывают на важность индивидуального подхода в лечении опийной абстиненции. По-видимому, преобладание в структуре абстинентного синдрома тех или иных признаков отражают генетически предрасположенную «слабость» определенных нейрохимических систем, что требует различного фармакологического воздействия. При купировании абстинентного синдрома возможно избирательное воздействие на отдельные признаки синдрома отмены, в зависимости от того, какие из них преобладают в структуре абстинентного синдрома. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Конференции Российской ассоциации по изучению боли г.Новгород, 12-15 сентября

1995г., заседании Проблемной комиссии по вопросам наркологии Государственного Научного Центра наркологин 10 июля 1997 г., семинаре Института биофизики клетки РАН и Филиала Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина г.Пущино, 21 июля 1997 года.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на ^^.страницах машинописного текста и состоит из введения , обзора литературы , посвященного роли генетических факторов в индивидуальной чувствительности к действию наркотиков и нейрохимическим механизмам действия морфина, материалов и методов исследования, двух глав результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и библиографии, включающей -/^ггназваний. Диссертация содержит Sty рисунков и ИЙ.таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Животные.

Эксперименты выполнены на 532 крысах-самцах линий Fisher 344 (F-344/N) и Wistar albino Glaxo (WAG/GSto), весом в начале эксперимента 180-200 г. Животные из питомника АМН РФ "Столбовая". На протяжении экспериментов крыс содержали в условиях постоянного доступа к стандартному комбинированному корму и воде в клетках по 810 животных.

Соединения, используемые в экспериментах .

Ююнидин, серотонпн производства фирмы "Serva" , йохимбин производства фирмы "Sigma" , кетансерин тартраг -"Research Biochemicals Inc."; промышленного производства; морфин гидрохлорид (Чимкентский завод). 0,9% изотонический раствор хлорида натрия. Методы исследования.

Двигательную активность крыс исследовали на 10 группах по 10 животных в каждой группе. Двум группам, по группе из каждой линии, вводили раствор морфина в дозе 0,5 мг/кг; двум группам - раствор морфина в дозе 1,0 мг/кг; двум группам - раствор морфина в дозе 3,0 мг/кг; двум группам - раствор морфина в дозе 5,0 мг/кг; и двум контрольным группам - физиологический раствор. Двигательную активность определяли в аппарате "Animex" (LKB, Sweden) и регистрировали по показаниям счетчика в условных единицах в течение 15 минут спустя 30 минут после внутрибрюшинных (в/б) инъекций морфина или физиологического раствора.

В экспериментах по изучению каталептического эффекта морфин вводили в/б в дозе 20 мг/кг. Состояние каталепсии оценивали по способности животного сохранять неудобную позу. После появления заторможенного состояния передние конечности крыс помещали на опору высотой 15 см. Регистрировали время возникновения заторможенного состояния и продолжительность каталепсии.

Болевую чувствительность и аиальгетическое действие морфина изучали на 6 группах крыс. Двум группам, по группе из каждой линии, вводили в/б физиологический раствор; двум группам - 5мг/кг морфина гидрохлорида; двум группам - 10 мг/кг морфина гидрохлорида. Перед тестированием животных помещали в индивидуальные пластиковые камеры на 15 минут, свисающий из которых вертикально вниз хвост погружался на 4-5 см в горячую воду (56 е С). Регистрировали длительность латентного периода реакции отдергивания хвоста (ЛП РОХ). Болеутоляющее действие оценивали по изменению времени латентного периода реакции.

Положительно-подкрепляющие свойства морфина изучали по методике добровольного пероральиого потребления раствора морфина в двухбутылочном тесте, а так же внутривенного самовведения (Sudakov et al, 1993).

Для формирования физической зависимости крысам вводили морфин гидрохлорид в дозах, возраставших от 10 до 60 мг/кг. Инъекции осуществляли в/б два раза в сутки в течение 12 дне)"). Через 36 часов после последней инъекции морфина животных помещали в автоматизированное "открытое ноле", где в течение 3 минут регистрировали горизонтальную и вертикальную двигательную активность и наличие и частоту специфических абстинентных реакций. Оценку тяжести синдрома отмены морфина у крыс производили индивидуально у каждого животного, подсчитывая сумму наблюдаемых у него в тесте "открытое поле" тех или иных признаков, умноженных на соответствующий индекс, определяющий специфичность данного признака ( Судаков с соавт.,1994).

Толерантность к анальгетнческому эффекту морфина у крыс формировали посредством ежедневных инъекций морфина гидрохлорида в дозе 5 мг/кг в течение 11 дней. Спустя 30 минут после каждого введения морфина, измеряли длительность ЛП РОХ у каждого животного. Рассчитывали Д% - процент изменения величины ЛП РОХ за каждый день по отношению к первому дню.

Исследование основных характеристик рецеиторного связывания jn-опиатных, al, a2- адренергичсских и 82-серотонинергичсских рецепторов коры головного мозга крыс проводили методом радиолигандного связывания в модификации Русакова (1992). Концентрацию белка в пробе определяли по методу Lowry et al., (1951). Расчеты концентрации рецепторов и константы диссоциации проводили в координатах Скетчарда, с последующей статистической обработкой данных с использованием t-кри герия Стъюдента.

Для изучения влияния состояния а2-адренергнческой и S2-серотоминергической систем мозга крыс на чувствительность к анальгетнческому действию морфина вводили агонисты и антагонисты а2-рецепгоров (клонидин и йохимбин) и 32-реценторов (серотонин и кетансерин) внутрь желудочков мозга крыс, после чего животным

внутрибрюшмнпо вводили морфин и измеряли анальгетический эффект в тесте «отдергивания хвоста».

Для изучения влияния состояния а2-адреперп!ческой и $2-серотонинергической систем мозга крыс па синдром отмены морфина у морфин-зависимых крыс клониднн, йохимбин, серотонпн н кегансерин вводили внутрнбрюшиино за 30 минут до тестирования в «открытом поле».

Обработка результатов проводилась при помощи пакета статистических программ «Мюго81аЬ> с использованием (-критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

/. Различия в чувствительности к действию морфина г крыс линий И^С/С и Г-344.

1.1.Влияние морфина на двигательную активность крыс .

Двигательная активность в контрольных группах животных обеих лиши'! статистически не различалась. Морфин в дозе Змг/кг достоверно уменьшал двигательную активность только у крыс линии Р-344, в то время как у крыс линии \VAGIG еще не возникало достоверного уменьшения. Морфии в дозе 5мг/кг достоверно уменьшает двигательную активность у крыс обеих линии.

ТАБЛИЦА I. Двигательная активность крыс линий Р-344 и \VAGZG

после однократного введения морфина

Р-344 \VAGZG

Вещества Показания счетчика % Показания счетчика %

Физ. р-р 1099+156 100 889+141 100

Морфин 0.5 мг/кг 1258+108 114 739+89 89

Морфин 1 мг/кг 1030+94 94 579+98 67

Морфин 3 мг/кг 502+90 46* 671+75 75

Морфин 5 мг/кг 328+78 30* 379+64 43*

*- р< 0.05 но сравнению с контролем (физ. р-р)

Таким образом крысы линии \VAGZG проявили меньшую чувствительность к действию морфина на спонтанную двигательную активность.

1.2. Продолжительность каталепсии после однократного введения морфина.

Мы обнаружили, что первые признаки катадбнОДймышц туловища и конечностей у животных линии Р-344 наступали быстрее, чем у крыс линии \VAGZG (в среднем спустя 5,25±1,3 и 19,0±7,5 мин соответственно, р = 0,012). Продолжительность каталепсии у крыс линии Р-344 была больше в 2,2 раза (96,0±24,2 и 47,7± 13,3 мин соответственно, р = 0,009).

Индивидуальные особенности реакции крыс линии WAG/G выражались в более позднем наступлении каталептического эффекта и в меньшей его длительности.

1.3. Влияние морфина на длительность латентного периода реакции отдергивания хвоста у крыс.

После введения физиологического раствора в контрольной группе крыс линии F-344 ЛП РОХ был достоверно больше, чем у крыс линии WAG/G (6,25 ± 1,7 и 4,45 ± 1,0 соответственно, р<(),05). Введение морфина в дозе 5 мг/кг приводило к достоверному увеличению ЛП РОХ у животных обеих линий по сравнению с контрольными значениями (12,7 ± 3,86 и 5,9 ± 1,11 соответственно р<0,05). При этом анальгетнческий эффект морфина был достоверно выше у крыс линии F-344. Введение морфина в дозе 10 мг/кг приводило к значительному увеличению длительности ЛП РОХ по сравнению с контролем: у крыс линии F-344 33,0 ± 11,24 сек и у крыс линии WAG/G 17,8 ± 4,66 сек.. Различия между линиями статистически не достоверны из за больших индивидуальных различий в ЛП РОХ .

Таким образом, при исследовании индивидульной болевой чувствительности была обнаружена разница между крысами линий WAG/G и F-344, которая сохранялась при воздействии морфином. Исходная болевая чувствительность у крыс линии WAG/G выше и анальгетнческий эффект морфина у этих животных выражен слабее, чем у крыс линии F-344.

1.4. Оценка первично-подкрепляющих свойств морфина.

1.4.1. Добровольное пероральное потребление раствора морфина.

В течении 10 дней животным предоставляли раствор морфина в качестве единственного источника жидкости, при этом среднесуточное потребление морфина у крыс обеих линии не имело различий и составляло 6,28 ± 0,48 мг у крыс линии F-344 и 5,55 ± 0,42 мг у крыс линии WAG/G. С 11-го дня эксперимента животным предоставили выбор между раствором морфина и раствором хинина. 11ачиная со 2-го дня предоставления животным выбора жидкостей, крысы линии F-344 преимущественно продолжали потреблять растпор морфина ( 4,497 ± 0,413 мг), в то время как крысы линии WAG/G снизили потребление до 2,166 ± 0,353 мг морфина. Начиная с 4-го дня различия между линиями в потреблении р-ра морфина статистически достоверны. (Рис.1). Среднесуточное потребление хинина, начиная со 2-го дня предоставления выбора жидкостей не имело достоверных различии между линиями и составляло у крыс линии F-344 0,278 ± 0,0029 мг, у крыс линии WAG/G -0,45 ± 0,0032 мг и в течение всего эксперимента оставалось практически неизменным. На 6-й день выбора потребление хинина у крыс линии F-344 составило 0,212 ± 0,0024 мг, у крыс линии WAG/G 0,72 ± 0,0038 мг.

мл 9

В 7 6 5 4 3 2 1 О

8

10 11 12 13 дни эксперимента

14

Рпс.1. Ежедиепнос плюральное по i pcGjiciinc распюра морфппа крысами липни F-344 п WAG/G. По оси opjuuini - количеств пышною p-pa морфина Ii мл. Пупкшром отмечено начало предосктлсмпя иыГшра между рас шорами морфина н хинина * - I' < 0,05

F-344

1.4.2.Внутрпвеинос самоиведепис морфина.

В начале эксперимента животные обучались нажимать на педаль для получения гранул корма в среднем за 10 дней. После закрепления навыка сытые животные в lex же камерах, обучались нажимать пятикратно на педаль для получения 10 мкл раствора морфина внутривенно. Ежедневное самовведение морфина у крыс линии F-344 было в 4-10 раз больше, чем у крыс линии WAG/G , эти различия сохранялись при увеличении концентрации раствора морфина. Количество иажатнп на педаль, для получения инъекции у крыс линии F-344 составляло в среднем 28,281 ± 6,523 ; у крыс линии WAG/G - 13,333 ± 5,244. При изменении концентрации раствора морфина крысы линии F-344 поддерживали тот же уровень числа нажатии 27,593 ± 6,405, в то время как у крыс линии WAG/G он снизился 2,857 ± 1,044. При смене раствора морфина на изотонический раствор NaCl у крыс линии F-344 наблюдалось подавление поведения самовведепия (17,1 ± 5,321), у крыс линии WAG/G, напротив, имелась тенденция к увеличению числа нажатии (14,182 ± 6.788).

Результаты проведенных экспериментов указываю! на то, что нмеегся общин генетически детерминированный механизм двух типов поведения, направленного па получение наркотического вещества: внутривенного самовведения и питья раствора морфина. Крысы линии F-344, по сравнению с WAG/G, которые демонстрируют большую частоту самовведепия, пыот большие количества морфина. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что положительно-подкрепляющее действие морфина у крыс линии F-344 выражено сильнее, чем у крыс линии WAG/G.

Таким образом, имеются линейные различия в чувствительности к действию морфина у крыс: крысы линии WAG/G менее чувствительны,

чем F-344 к эффектам острого введения морфина (двигательная активность, каталепсия, анальгезия, положительное подкрепление). 1.5.Влиянне хронического действия морфина.

1.5.1. Формирование физической зависимости и синдрома отмены. Было обнаружено, что через 36 часов после последней инъекции

морфина у крыс линий WAG/G и F-344 в тесте " открытое поле" наблюдались признаки синдрома отмены наркотического вещества различной степени выраженности. Суммарный показатель абстиненции у крыс линии F-344 был равен 5,625 ± 0,962 , а у крыс линии WAG/G -4,750 ± 0,860 , данные различия статистически не достоверны. Однако при сравнении отдельных поведенческих признаков обнаруживается различная структура абстинентного синдрома: у крыс линии F-344 значительно больше "отряхиваний мокрой собаки" и встряхиваний передними лапами, но у них не наблюдается пилоэрекция, имеющая место у крыс линии WAG/G.

1.5.2.Формированис толерантности к аналы етпческому эффекту морфина.

Ежедневное введений морфина в течение 11 диен достоверно уменьшало болеутоляющее действие морфина у животных обеих линий . Начиная с 4-го дня наблюдалась стойкая тенденция к уменьшению анальгетического эффекта у обеих линий крыс: па 7-й день у крыс линии F-344 на 26,9%, а у крыс линии WAG/G на 35,7% (Р<0,05 по сравнению с первым днем). К 11-му дню болеутоляющее действие морфина снижается на 34,3% у F-344 и на 32,9% у WAG/G.

Таким образом, процесс формирования толерантности к анальгегическому эффекту морфина у обеих линии проходит без статистически значимой разницы.

2. а2 и S2 рецепторпые системы мозга в механизмах чувствительности крыс к действию морфина.

2.1.Особенности характеристик рецепторпого связывания сипаптических мембран коры головного мозга крыс линий WAG/G и F-344.

Наличие специфических для морфипа мест связывания на мембранах нейронов коры мозга, а также многочисленные сведения об опосредовании действия наркотиков через нейромедпаторные процессы ( Анохина и соавт. 1979; Erdo et al., 1990; Vonliof and Siren, 1991), предполагают, что генетические различия, связанные с особенностями формирования наркотической зависимости, могут, в первую очередь, проявляться в количественных, а возможно, и в качественных отличиях экспрессии мембранных рсцепторных белков в мозге.

Для выяснения этого вопроса были проведены эксперименты по выявлению у крыс линий WAG/G и F-344 особенностей в характеристиках связывания с рецепторами мембран головного мозга ряда лигандов, некоторых рецепториых систем, которые имеют непосредственное отношение к действию морфина.

В таблице 2 показана сравнительная характеристика al-, a2-адренергических, 82-серотонинергических и ц-оппатных рецепторов

синантическпх мембран коры головного мозга крыс линии WAG/G и F-

344.

ТАБЛИЦА 2.

Рецепторы Вшах (fmol/mg) Kd (tiM)

WAG / G F-344 WAG/G F-344

jn 151+15 132±12 ** 0,49±0,07 0,64±0,23

al 284±10 264±28 0,31 ±0,06 0,36±0,07

a2 110±17 83±I3 ** 0,43+0,16 0,64±0,I3 *

5-НТ2 346±29 315±40 1,63±0,45 0,9 [±0,37 **

* - р<0,05 ** - р<0,01

Можно отмстить, что концентрация р-опиатных и а2-

адренорецепторов крыс линии WAG/G досговсрно выше, чем у линии F-344. Чувствительность же S2-ceporoinnioBbix рецепторов, величина обратная константе диссоциации, достоверно ниже у крыс линии WAG/G. Характеристики рецепгорного связывания al-адрснорецеп горой достоверных отличии не имели

.2.2. Влияние впутрнжелудочкового введения агоиистов и антагонистов а2- и S-2 рецепторов на чувствительность к острому и хроническому действию морфина

По литературным данным плотность ц-опиатных рецепторов в головном мозге экспериментальных животных можег иметь существен нос значение в проявлении анальгегического действия морфина: чем выше плотность jn-рецепторов в коре головного мозга мышей, тем выше апалыетичсское действие морфина (Moskowitz et al., 1985). В наших экспериментах большую чувствительность к анальгетнческому эффекту морфина проявили крысы, имеющие меньшую плотность jli-опиатных рецепторов (F-344). Поэтому, можно было предположить, что различия в чувствительности к анальгетнческому эффекту морфина могут быть связаны с различиями в акт ивности других нейрохимических систем, адрспергнчсской и/или серотопипергической. В связи с этим следующей задачей было изучит), влияние введения агоиистов и антагонистов а2- и S2- рецепторов на чувствительность к острому (анальгезия) действию морфина у инбредных линий крыс.

По литературным данным большее анальгетическое действие морфина коррелирует с большаей гшотпостис^-опнатных рецепторов в головном мозге (Moskowitz et al.,1985).

Исходя из результатов радпорсцепторных исследований следующей задачей было изучить влияние введения агоиистов и антагонистов а.2- и S2- рецепторов на чувствительность к острому (анальгезия) и хроническому ( синдром отмены) действию морфина у ннбредных линий крыс.

2.2.1.Влияние па аиальгетическое действие морфина.

Известно, что причиной снижения болевой чувствительности при различных анальгетических воздействиях является изменение функциональной активности супраспинальпых структур, что вызывает активацию нисходящих тормозных влиянии па спинной мозг. Ослабление анальгезирующего действия морфина, получено при внутримозговом введении порадреналина (1мкг) или L-ДОФЛ (0,25 мкг) (Yano ct al., 1983). Подоболочечпое введение а2-адрепсргического агониста клонидпна или порадреналина приводит к четкому удлиппению болевой реакции в тесте отведения хвоста (Rcddy et al.,1980; Rcddy and Yaksli ,1980; Milne et al.,1985). Супрасегмепгарный уровень анальгезии включает в себя различные подсистемы: нисходящую адрепсргнческую, нисходящую серотонипергичсскую и нисходящую оппоидную (Proudfit 11.К.,1988).По-видимому, и индивидуальные особенности нейрохимических систем мозга могут определять чувствительность к анальгетнческому действию морфина. Для того, чтобы изучить влияние воздействия на адрсиергичсскую и серотоппнсргичсскую системы мозга на проявление анальгетнческого действия морфина , необходимо было предварительно исследовать влияние самих агоннстов и антагонистов на длительность ЛГ1 РОХ.

2.2.1.1.Измененне латентного периода отдергивания хвоста после

однократного введения_клонидпна,___йохпмбпна, серотонпна и

кетанссрина.

Рис.2. ЛГ1 РОХ у крмс jmiinii F-344 п WAG/G после пмутрижслудочконого ппедсния изотопического р-ра хлорида ширин (I), клонидпна (2), ПохпмГшпа (3), ссроюшша (4), кстапсерпна (5). * - Р < 0.05 между лшшямм + - Р < 0.05 при сраппсшш с кошролем

При введении физиологического раствора в боковые желудочки мозга была отмечена разница в Л Г1 РОХ между крысами линий F-344 и WAG/G. Введение клонидпна приводило к увеличению этого показателя только у крыс линии WAG/G. Применение йохнмбина не вызывало заметных изменений в ЛП РОХ ни у одной линии животных. Введение серотопипа п кегансерипа вызывало статистически значимое увеличение

ЛП POX только у крыс линии F-344 (Рис.2). Эти данные подтверждают результаты радиорецепторных исследований: чувствительность а2-адренорецепторов достоверно выше у крыс липни WAG/G ,а S2-серотониновых рецепторов у линии F344. Поскольку мы наблюдали различия в характеристиках рецепторного связывания у исследуемых линий крыс, которые различаются в чувствительности к действию морфина возникает вопрос, можем ли мы считать различия в характеристиках рецепторного связывания теми факторами, которые предрасполагают к различной чувствительности животных к действию морфина?

Для выяснения этого вопроса была проведена следующая серия экспериментов.

2.2.1.2.Влияние агоннстов и антагонистов а2- и S2- рецепторов на анальгетическин эффект морфина.

Было изучено влияние состояния а2-адренергической и S2-серотонинергической систем мозга крыс на чувствительность к анальгетическому действию морфина. Для этого, после инъекций в желудочки мозга крыс агонистов и антагонистов а2-рецепторов (клонидина и йохимбина) и Б2-реценторов (серотонина и кетапсерина), животным внутрибрюшинно вводили морфин в дозе 5 мг/кг и исследовали анальгстический эффект морфина по вышеописанной методике.

сек.

30 .

10

I F-344 pWAG/G

+

+

Рнс.З. ЛП РОХ у крыс JuuiHii F-344 и WAG/G после и/б «ведения р-ра морфнна и виутрижелудочкопого введения изотопического р-ра хлорида unrpmi (I), клопндппа (2), Гюхнмбпна (3), ссроюшша (4), кетанссрина (5). * - Р < 0.05 между линиями + - Р < 0.05 при cpaimcmiit с конфолем

Крысы линии F-344 увеличивали ЛП РОХ при введении клонидина перед морфином. Введение серотонина вызывло увеличение анальгетического действия морфина не только у крыс линии F-344, но и у крыс линии WAG/G. Т.е. усиление активности серотониновой системы

увеличивло чувтвнтельность к анальгетическому действию морфина (Рис.3).

2.2.2.Влияние на синдром отмены морфина.

Введение антагонистов ц-опнатных рецепторов способно провоцировать и усугублять синдром отмены у морфин-зависимых животных. Очевидно, что именно оплатой системе принадлежит ведущая роль в развитии данного процесса. Однако, взаимодействие нейрохимических систем не позволяет изменить состояние одной нейрохимической системы, не отразившись на состоянии других. В связи с этим, задачей настоящего эксперимента было изучение влияния внутрибрюшшшого введения клонидина, йохпмбпиа, серотоиина и кегаисерипа на синдром отмены морфина у морфин-зависимых крыс двух линий, WAG/G и F-344.

В контрольной группе крыс, как упоминалось выше, обнаруживалась различная структура абстинентного синдрома: у крыс линии F-344 значительно больше "отряхиваний мокрой собаки " и встряхиваний передними лапами, но у них не наблюдалась пилоэрекция, имеющая место у крыс линии WAG/G. Введение серотоиина уменьшало скрежет зубами у крыс линии F-344. У крыс липни WAG/G серотонип полностью устранял "отряхивания мокрой собаки". Кетанссрип достоверно уменьшал "отряхивания мокрой собаки" у крыс линии F-344 и полностью устранял этот показатель у крыс линии WAG/. Введение клонидина и йохимбина приводило к уменьшению отряхиваний «мокрой собаки» и встряхиваний передними лапами у животных линии F-344. Именно эти симптомы преобладали в структуре абстинент ного синдрома у этих животных. На преобладающую у крыс липни WAG/G пплоэрекцию влиял лишь йохпыбии, вызывая уменьшение частоты проявления этого признака.

Таким образом , можно думать, что преобладание в структуре абстинентного синдрома отряхиваний «мокрой собаки» и встряхиваний передними лапами возникает у индивидуумов со сниженной активностью а2-адрепсргнческоп системы, в данном эксперименте это крысы линии F-344.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬ'ГАТОВ.

В результате проведенных экспериментов мы обнаружили, что крысы линии WAG/G менее чувствительны, чем крысы линии F-344 к влиянию морфина на двигательную активность, на каталептический эффект, к анальгетическому и положительно-подкрепляющему действию морфина. Полученные данные указывают' на то, что, по-видимому, некоторые генетические факторы могут определять чувствительность животных к различным эффектам опиатов. Изучая эту взаимосвязь Ambrosio Е. и соавт.(1995) использовали крыс 4-х нпбредпых линий, с генетически детерминированными различиями в спонтанной локомоторной активности и обнаружили положительную взаимосвязь этого признака с частотой потребления морфпна при самовведении. Авторы полагают, что эти два признака находятся под влиянием общего

или близкосцеплениых генов. В наших экспериментах лишь частично подтверждается эта точка зрения, т.к. линия крыс поддерживающая самовведепие морфина (F-344) отличалась большим количеством стоек в «открытом поле» (Sudakov et al., 1993). Некоторые авторы описывают положительную корреляцию между развитием зависимости и стимулирующим действием морфина, и отрицательную корреляцию с его анальгетическим эффектом (Oliverio and Castellano, 1974). В других работах такой корреляции найдено не было (Elmer el al., 1991). В литературе имеются данные, например в работе Cunningham and Kelley (1992), которые демонстрируют разделение эффектов опиатов на двигательную активность и подкрепляющие свойства. Мы обнаружили выраженную обратную зависимость между положительно-подкрепляющим действием морфина и его анальгетическим и кататоническим действием. Крысы линии F-344, обладающие более высокой чувствительностью к эффектам однократного введения морфина и более чувствительны к его подкрепляющему действию, снижали, а не увеличивали двигательную активность после инъекции морфина. Эти факты указывают па то, что подкрепляющее действие морфина у данных линий животных более связано с анальгетическими и депрессивными эффектами.

Основные нейрохимические механизмы, обеспечивающие эффекты морфина - это сопряженное взаимодействие опиондной и нейромедиаторных систем мозга, где роль каждой системы коррелирует с определенными проявлениями свойств морфина. Состояние той или иной нейромеднаторной системы н изменения, которые вызывает введение морфина в этих системах могуг являться основанием для устойчивости и предрасположенности к действию морфина.

На основании обнаруженных нами достоверных различий в характеристиках р-опиодных, а2-адренергических и S2-серотонинергнческих рецепторов коры головного мозга можно предположить, что имеется связь этих различий с различиями в чувствительности к действию морфина у крыс исследуемых линий .

Известно, что причиной снижения болевой чувствительности при различных анальгегических воздействиях является изменение функциональной активности супраспинальных структур, что вызываег активацию нисходящих тормозных влияний на спинной мозг. Мнкроинъекции морфина в различные области бледного шара: дорзальную, медиальную и вентральную показали, что эти области в разной степени вовлечены в морфиновую анальгезию, опосредованную опиатнымн рецепторами (Y.Anagnostakis et al, 1992). Вполне обоснованной представляется гипотеза о том, что угнетение ноцицентивных реакций под влиянием опиатов и оииоидов обусловлено усилением процессов нисходящего торможения струтур спинного мозга, которое реализуется через норадренергические системы ( Hammond D.,1984; Duggan А., 1985). Обнаружено, что как введение морфина, так и электрическая стимуляция указанных структур приводя к анальгезии,

вызывает увеличение содержания серотонина во всех областях антиноцицептивнои системы (Bourgouin S. et al., 1980; Puig S. et al.,1991), т.е. активация сертонинергическнх и подавление норадрепергических нейронов в головном мозге вызывает замедление спинального болевого рефлекса.

Как было сказано ранее, плотность ц-опиатных рецепторов в головном мозге экспериментальных животных может иметь существенное значение в реализации приспособительных болевых реакций (Moskowitz et al.,1985). По представлениям Lipp J.(1991) морфин взаимодействует с jii-рецепторамн локализованными на вставочных ГАМК-нейронах и инактивирует их при гиперполяризации. В наших экспериментах большую чувствительность к анальгетическому эффекту морфина проявили крысы линии F-344, имеющие меньшую плотность ш-опиондных рецепторов. В реализации анальгетнчсского эффекта морфина па супрасегментарном уровне участвуют как минимум, три нейрохимические системы: опиоидная, адренергическая и серотонпнергнчсская, которые функционируют в тесном взаимодействии друг с другом. Имеющиеся в литературе сведения по этому вопросу достаточно противоречивы, кроме того комплексных исследований по изучению роли этих систем с использованием генетических моделей, характеристик рецегпориого связывания и фармакологического воздействия проведено не было. Наши эксперименты показали, что крысы линии F-344, имеющие более выраженный анальгегичсский эффект морфина и меньшую чувствительность а2-адренергической системы, еще больше увеличивают ЛП РОХ при введении клонидина перед морфином , т.е. мы не можем считать нзиачапыю низкую активность а2-спстемы фактором, обусловливающим большую чувствительность к анальгетическому действию морфина. На основании наших данных, можно говорить о том, что состояние или активность а2-адренергической системы не связано с чувствительностью к анальгетическому эффекту морфина. Введение серотонина вызывает увеличение анальгстического действия морфина не только у крыс, имеющих большую чувствительность к этому агенту (крысы линии F-344), но и у животных с изначально низким сродством рецепторов мозга к серотонину и имеющих низкую чувствительность к анальгетическому действию морфина (WAG/G). Т.е. усиление активности серотониновой системы увеличивает чувствительность к анальгетическому действию морфина. Если учитывать, что повышенная концентрацияjm-рецепторов, определяющая по литературным данным выраженное анальгетическое действие морфина отсутствует у крыс линии F-344, то, по-видимому, выраженное анальгетическое действие морфина у крыс линии F-344 может определяться генетически детерминированной повышенной активностью нндоламиновой системы мозга.

В пользу существующего мнения, о важной роли серотоиснергического звена в регуляции болевой чувствительности, указывают опыты, в которых установлено развитие обезболивания при

введении серотонина или его предшественников в мозг животных (Yano et al., 1983). Другим доказательством справедливости этого предположения является тот факт, что аналысзия после инъекций морфина сопровождается значительным усилением обмена серотонина, о чем свидетельствует увеличение 5-окспиндолуксусной кислоты в тканях головного мозга (Isliikawa et al.,1983). Угнетение синтеза серотонина уменьшает анальгетический эффект морфина, о чем свидетельствовало снижение порогов прыжковых реакций (Bodnar et al., 1979) и снижение длительности латентных периодов реакции отведения хвоста (Berge el al., 1983). Предполагают также, что аналыетнческое действие морфина обусловлено его влиянием на серотонинергнческую систему головного мозга, связанную со срединным ядром шва головного мозга (Samanin and Miranda , 1976). В работах Berge О. (1986) обобщены основные данные об изменениях морфиновой аналгезии, определяемой в различных экспериментальных тестах, при изменении серотонинергической медиации.

Что касается анальгетического эффекта морфина на снинальном и супраспинальном уровнях и роли серотонина в реализации этого эффекта, то представляется уместным вспомнить работу Advokat С. (1993), где на основании полученных данных утверждается, что серотонин усиливает антиноцицепцию у интактных крыс.

Таким образом, воздействие на серотонинергнческую систему мозга, увеличивающее ее активность, может способствовать решению проблемы обезболивания в клинике у гак называемых «морфин-толерантных» больных.

Мы полагаем, что обнаруженные нами различия в восприятии подкрепляющего действия морфина у крыс линии F-344 и WAG/G являются генетически детерминированными. К подобному выводу пришел Suzuki с соавт. (1992), работая с крысами линий Lewis (LEW) и Fischer (F-344) и продемонстрировав различия в подкрепляющем эффекте опиоидов, которые показывают, что генотип в значительной мере определяет чувствительность к подкрепляющему действию морфина. Belknap J.К.. (1990) исследовал предпочтение раствора морфина в 2-х бутылочном тесте у двух , а затем и у 15 инбредных линий мышей (1993) и показал, что предпочтение морфина строго генетически детерминировано и высокая степень физической зависимости ( по проявлению признаков синдрома отмены) может быть проявлением свойств линии, предпочитающей морфин. В нашей работе мы не получили подобной закономерности. По-видимому , у исследуемых нами линий животных процессы предпочтения морфина и проявление синдрома его отмены не имеют прямопропорциональной связи. Возможно, что это связяно с особенностями нейрохимических систем головного мозга этих линий животных, имеющих различия в их активности. Так при изучении перорального потребления раствора морфина инбредными линиями мышей C57BL/6J и DBA/2J Berrettini W.H. с соавторами (1994) было обнаружено, что различия в

предпочтении морфина у этих линий представляют основанный на подкреплении механизм, который опосредуется через опиатные рецепторы. В работе Hui S.С. и соав.(1993) введение антагонистов 5-НТЗ рецепторов уменьшает потребление морфина, из чего следует, что и серотонинергическая система участвует в механизме подкрепляющего действия морфина. Исследования в этой области будут проведены нами в дальнейшем.

Использование пнбредиых линий животных с заранее известными генетически детерминированными различиями позволило Suzuki Т.с соавг. (1992), выявить корреляции между отдельными признаками абстиненции и особенностями в характеристиках рецепторного связывания в коре головного мозга например : у мышей линии СХВК с дефицитом m-рецспторов отсутствуют такие признаки отмены морфина как отряхивания и прыжки при налоксон-преципнтированной абстиненции. В наших экспериментах, анализируя различия в структуре абстинентного синдрома мы приходим к выводу, что именно они могут объяснить отсутствие достоверных различий по суммарному показателю абстиненции, т.е. нивелируют общую картину проявления абстиненции. Проявление отдельных признаком абстиненции по-видимому связаны с состоянием п активностью отдельных нейрохимических систем. Наши эксперименты показали, что преобладание в структуре абстинентного синдрома у крыс линии F-344 отряхиваний «мокрой собаки» и встряхиваний передними лапами возникает у индивидуумов со сниженной активностью а2-адренергическоп системы. По данным I.M. Coupar (1992) а2-адренорецепторы вовлечены в подавление синдрома отмены морфина. Полученные им результаты позволяют предположить, что существуют субпопуляции сх2-адренорецепторов, которые модулируют проявление симптомов синдрома отмены. Важную роль адренергических систем отметили Gold M. и Pottash A.L.С.(1981) , развив концепцию о связи опиатного абстинентного синдрома с "растормаживаннем" системы восходящих адренергических проекций из области голубоватого пятна. Известно также, что острое введение клонидппа, а гон иста а2-адрепорецепторов, уменьшает проявление синдрома абстиненции ( Tseng et.al. 1975). Важность а2- адренергической активации в развитии опиоидной физической зависимости отмечена Iglesias V. и соавторами (1992) при проявлении симптомов синдрома отмены морфина при абстиненции, преципнтированпой налоксоном. Многие исследования демонстрируют взаимосвязь между опиатными и адренергнческпми рецепторами при моделировании физической зависимости и синдрома отмены у животных (Colado M.I. and Martin М.1., 1992; Gonzalves et al., 1994). Разрушая центральные норадренергнческие нейроны и используя агонисты серотониновых рецепторов ( El-Kadi A.D. and Sharif S.I.,1995) пришли к заключению, что серотопиновые рецепторы вовлечены в проявление синдрома отмены и функциональная активность этих рецепторов зависит от состояния норадренергической системы.

По-видимому, преобладание в структуре абстинентного синдрома тех или иных признаков отражают генетически предрасположенную «слабость» определенных нейрохимических систем, что требует различного фармакологического воздействия. Таким образом, при купировании абстинентного синдрома возможно избирательное воздействие на отдельные признаки синдрома отмены, в зависимости от того, какие из них преобладают в структуре абстинентного синдрома. Проведенные эксперименты указывают на важность индивидуального подхода в лечении опийной абстиненции.

ВЫВОДЫ

1.Обнаружены различия в чувствительности к действию морфина у крыс 2-х инбредных линий. Крысы линии WAG/G менее чувствительны, чем F-344 к эффектам острого введения морфина: депрессивному, каталептическому, анальгегичсскому и положительно-подкрепляющему.

2.Показано, что исследуемые линии различаются по характеристикам реценторного связывания в мембранах головного мозга: концентрация ц-опиатиых и а2-адренорецспторов крыс линии WAG/G достоверно выше, чем у линии F-344. Чувствительность же S2-ceporoiinnoBbix рецепторов достоверно ниже у линии WAG/G, чем у F-344.

3.Получены данные о взаимосвязи чувствительности к анальгетнческому действию морфина у крыс линии F-344 и активностью их серотонинергической системы мозга.

4.Показано, что преобладание в структуре абстинентного синдрома отряхиваний «мокрой собаки» и встряхиваний передними лапами возникает у индивидуумов со сниженной активностью а2-адренергической системы.

5.Полученные данные дают основание полагать, что генетические различия в характеристиках реценторного связывания являются одной из причин различной индивидуальной чувствительности к действию морфина у животных.

СПИСОК РАБОТ. РУСАКОВОЙ И.В. (ТЮРИ НОЙ П.В.) ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Sudakov S.K.. Goldberg S.R.IO, Borisova E.V,. Surkova L.A., Turina I.V., Rusakov D.Yu., Elmer G.//Differences in morphine reinforcement property in two inbred rat strains: associations with cortical receptors, behavioral activiti, analgesia and cataleptic effects of morphine. Psychopharmacology.- 1993,-V.112 .-P. 183-188.

2. Тюрина И.В.//Влияние генетических особенностей серотоиин - и адренергических систем мозга крыс на эффекты острого и хронического введения морфина. Мат. международной конференции МЗ Республики Беларусь,- Гродно,- 1993.-C.340-34I.

3. Тюрина И.В., Русаков Д.Ю., Судаков С.К. //Генетические особенности а2- адренергической и 52-серотонинергической систем головного мозга в реализации болевого рефлекса отдергивания хвоста и подавлении его

морфином у крыс. Экспериментальная и клиническая фармакология.-1995,- т.58.-Ы2.- С.22-24.

4. Тюрина И.В., Русаков Д.Ю. //Роль серотонинергической и адренергической систем мозга крыс в механизме анальгетического действия морфина. Тез.докладов 2-й Конференции Российской ассоциации по изучению боли.- Новгород,- 1995,- с.90-91.

5. Тюрина И.В., Русаков Д.10., Судаков С.К. //Участие серотонинергической системы мозга в механизмах чувствительности к действию морфина. Сб.материалов съезда психиаторов наркологов,- М., 1995.-С.839-840.

6. Судаков С.К. .Тюрина И.В. //Роль опноидных п серотопинергических рецепторов мозга в механизмах амфетаминовой стереотипии и гипертермии. Бюлл. экслерим. биол. и медицины,- 1995,- N9.- С.242-243.

7. Судаков С.К. Русаков Д.Ю. Борисова Е.В., Тюрина И.В. //Механизмы генетической устойчивости к действию опиатов у крыс. Вопросы наркологии,- 1995,- N2,- С.44-51.