Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул при старении клеток коры головного мозга крыс

На правах рукописи

УМНОВ Роман Сергеевич

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ СТАРЕНИИ КЛЕТОК КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 с;;т 2014

005553021

Санкт-Петербург - 2014

005553021

Работа выполнена в лаборатории биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Хавинсон Владимир Хацкелевич

Официальные оппоненты:

Прощаев Кирилл Иванович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации ФМБА», профессор кафедры терапии, гериатрии и антивозрастной медицины.

Виноградова Ирина Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет», заведующей кафедрой фармакологии, организации и экономики фармации, микробиологии и гигиены.

Ведущая организация:

Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская Академия имени С. М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «30» октября 2014 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197119, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН http://www.gerontology.ru.

Автореферат разослан «12» сентября 2014 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Козина Людмила Семеновна

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

У людей старше 60 лет в различных зонах центральной нервной системы достаточно часто развиваются атрофические и дегенеративные изменения. В частности, почти на 1/3 уменьшается число нервных волокон. При сочетании возрастного снижения функциональной активности головного мозга с сосудистой патологией или с наличием в анамнезе черепно-мозговых травм может возникать дисциркуляторная энцефалопатия, инсульт, деменция и эпилепсия, что является важными причинами социальной дезадаптации и смертности у лиц старших возрастных групп.

По данным Всемирной организации здравоохранения, инсульт занимает 3 место среди причин смерти взрослого населения планеты. Его средняя частота встречаемости в развитых странах составляет около 2500 случаев на 1 млн. населения в год. Особенно высок риск развития инсульта у пациентов, достигших 55 летнего возраста. С каждым последующим десятилетием вероятность развития инсульта у них возрастает почти в 2 раза [Sohrabji F. et al., 2013]. Частота деменции среди лиц в возрасте старше 65 лет составляет от 5 до 15% [Пустоханова JI.B., 2012]. В начале XXI века эти цифры увеличились почти в 1,5 раза. Кроме того, в экономически развитых странах деменция, в частности болезнь Альцгеймера, занимает 4 место среди причин смертности. Согласно данным Госкомстата (2007), в Российской Федерации ориентировочное число пациентов с деменцией превышает 1,2 млн. человек [Пустоханова Л.В., 2012].

Препараты, используемые для лечения патологии головного мозга, в том числе и у людей пожилого возраста, относятся к разным фармакологическим группам. Среди них выделяют антиоксиданты, антигипоксанты, блока-торы оксида азота и др. В настоящее время перспективными нейропротекто-рами являются пептиды, обладающие высокой физиологической активностью и низкой иммуногенностью [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. По составу их можно разделить на 2 группы: полипептидные комплексы, выделенные из мозга крупного рогатого скота или свиней (кортексин, цереброли-зин и др.), и короткие синтетические пептиды (семакс, кортаген, пептид KED и др.) [Alvarez Х.А. et al., 2000; Khavinson V.Kh., Malinin V.V., 2005; Agapova T.Y. et al., 2007].

Разработанный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии полипептидный препарат кортексин широко применяется в лечении нарушений функций головного мозга у людей разного возраста. В основе молекулярного механизма действия кортексина лежит его способность активировать экспрессию генов, регулирующих синтез собственных нейротрофи-ческих факторов, таких как мозговой нейротрофический фактор (BDNF) и фактор роста нервов (NGF) [Гранстем O.K. и соавт., 2008]. Наряду с кортек-сином был сконструирован и синтезирован трипептид KED, также обладающий выраженным нейропротекторным эффектом. Сочетанное применение пептида KED с вазопротекторным пептидом EDR показало свою эффективность у больных с черепно-мозговой травмой и церебростенией. Кроме того,

пептид КЕО обладал выраженным антиоксидантным действием и способствовал повышению гена стрессоустойчивости ШРА1А [Аги^ипуап А. е1 а1., 2012]. Представляется вероятным, что молекулярный механизм биологической активности пептида КЕО, как и для ряда других коротких пептидов, связан с эпигенетической регуляцией экспрессии ряда генов и синтеза соответствующих белков.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось сравнительное изучение влияния кортексина, пептидов КЕБ и БОЯ на экспрессию сигнальных молекул в клетках коры головного мозга при их старении.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить влияние пептидов КЕО и БОЯ и кортексина на экспрессию сигнальных молекул (виментина, серотонина, кальмодулина, Кл67, р53) в «молодой» и «старой» диссоциированных первичных культурах клеток коры головного мозга крыс.

2. Оценить влияние пептидов КЕБ и БОИ. и кортексина на экспрессию сигнальных молекул (виментина, серотонина, кальмодулина, ¥л61, р53) в ор-ганотипических культурах клеток крыс, полученных от молодых и старых животных.

3. Провести сравнительный анализ влияния пептида КЕБ и кортексина на экспрессию виментина, серотонина и Кл67 в органотипических культурах клеток молодых и старых животных в зависимости от концентрации пептидов.

4. Создать молекулярную модель предполагаемого взаимодействия пептидов КЕО и БОЯ с промоторными участками генов, продуктами которых являются изученные сигнальные молекулы;

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение влияния пептидов КЕО и БОЯ. и кортексина на экспрессию сигнальных молекул (виментина, серотонина, кальмодулина, К167, р53) в диссоциированных первичных культурах клеток коры головного мозга крыс при их старении. Установлено, что короткие пептиды КЕБ и ЕБЯ снижают уровень апоптоза в клетках коры головного мозга при их старении. Кортексин и пептид БОЯ способствуют повышению пролиферативной активности нейронов. При этом все 3 изученных пептидных препарата стимулируют синтез серотонина в «старых» культурах клеток коры головного мозга.

Впервые показано, что кортексин и пептид КЕО снижают уровень экспрессии протапоптотического протеина р53, повышают синтез пролиферо-тропного маркера Кл67, белков серотонина, кальмодулина и виментина в органотипических культурах коры головного мозга молодых и старых животных. При этом стимулирующий эффект пептида КЕО в отношении серотонина, кальмодулина и виментина оказался сильнее в сравнении с кортекси-ном.

Впервые получены данные, свидетельствующие о том, что в органоти-пических культурах клеток коры головного мозга крыс пептид КЕБ стимулирует процессы клеточного обновления в меньшей концентрации в сравнении с кортексином. В работе впервые показано, что короткие пептиды ЕБЯ и КЕБ могут связываться с промоторными зонами генов виментина, кальмо-дулина и триптофангидроксилазы (ключевого фермента, индуцирующего синтез серотонина).

Практическая значимость

Полученные результаты позволили провести сравнительный анализ молекулярных механизмов биологической активности пептидных препаратов КЕБ, ЕВ Я и кортексина. Эти данные свидетельствуют о том, что использование пептид КЕБ или сочетания пептидов КЕБ и ЕБЯ может являться эффективным методом стимулирования сниженной с возрастом функциональной активности нейронов коры головного мозга. При этом влияние пептидов КЕБ и ЕБЯ на молекулярно-клеточные механизмы восстановления экспрессии сигнальных молекул в нейронах сопоставимо с кортексином. Подобный подход сравнительного изучения биологической активности нейропротек-торных препаратов может успешно применяться и для других биологически активных веществ.

Положения, выносимые на защиту

1. Кортексин стимулирует экспрессию пролиферотропного протеина Кл67 и синтез серотонина в клетках нейронов в диссоциированных культурах при их старении. Подобным, но менее выраженным эффектом обладают пептиды КЕБ и ЕБЯ.

2. Пептид КЕБ и кортексин активируют процессы клеточного обновления, синтез серотонина, кальмодулина и виментина в органотипических культурах нейронов коры головного мозга молодых и старых животных. При этом эффект пептида КЕБ более выражен в сравнении с кортексином.

3. По данным молекулярного моделирования молекула пептида КЕБ преимущественно связывается с промоторными зонами генов кальмодулина, виментина и триптофангидроксилазы по сайту ССАвС, а пептид ЕБЯ-по сайту ССГССС.

4. Трипептиды КЕБ и ЕБЯ имеют сопоставимый, а в ряде случае и более выраженный нейропротекторный эффект в отношении культур клеток нейронов при их старении в сравнении с кортексином.

Связь с научно-исследовательской работой института Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований, 1 статья в сборнике и 15 тезисов докладов.

Апробация и реализация диссертации

Основные материалы диссертации доложены на Пушковских чтениях (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской молодежной конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты старения. Хрупкость: модели, маркеры, фенотипы. Результаты проекта «Хрусталь» (Санкт-Петербург, 2013); IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease (Санкт-Петербург, 2013); VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды»; Научно-практической конференции и школе, посвященной памяти академика В.В. Фролькиса «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии: от теории к практике» (Санкт-Петербург, 2013); Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013); Международном форуме «Старшее поколение» (Санкт-Петербург, 2013); Научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2013); 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative Medicine" (Израиль, 2013); 20th IAGG Word Congress of Gerontology and Geriatrics (Séoul, Korea, 2013).

Личный вклад автора

Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в составлении дизайна исследования, проведении опытов, статистической обработке и анализе данных сравнительного молекулярного механизма действия нейро-протекторных пептидных препаратов- кортексина, KED и EDR. В ходе выполнения исследования автором освоена методика диссоциированного и ор-ганотипического культивирования клеток и метод иммуноцитохимического исследования. Автор принимал участие во всех экспериментах, включавших в себя культивирование клеток, иммуноцитохимическое окрашивание, микроскопию, морфометрию, молекулярное моделирование взаимодействия пептидов KED и EDR с ДНК и статистический анализ данных.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 112 страницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирован 29 рисунками. Список литературы содержит 175 источников, из них на русском языке - 47, на английском - 128.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемого материала Объектом исследования была выбрана кора головного мозга молодых (3 мес., масса тела 160-180 гр.) и старых (20-24 мес., масса тела 350-500 гр.) крыс линии \Vistar. Крысы были получены в виварии Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, Россия). Для исследования влияния пептидов КЕО (С1и-АБр-А^, пинеалон, КЕБ, регулятор функций головного мозга), ЕБЯ (Ьув-Ии-АБр, везуген, ЕБЯ, регулятор функций сосудов) и полипептидного комплекса кортексина на кору головного мозга использовали органотипические и диссоциированные культуры (Табл. 1).

Таблица 1.

Схема проведения экспериментов по изучению нейропротекторных свойств пептидов в культурах клеток коры головного мозга при их старении

Тип культуры Группы Пептиды Маркеры

Органотипическая: 200 эксплантатов от молодых крыс, 200 эксплантатов от старых крыс 1 серия: 1 группа - контроль, 2 группа - пептид ЮШ 3 группа - пептид ЕОЙ. 4 группа - кортексин КЕЭ - 0,05 нг/мл ЕБИ - 0,05 нг/мл кортексин - 10 нг/мл К167, р53, виментин, кальмодулин, серотонин

2 серия: 1 группа - контроль, 2 группа - пептид ЮШ, 3 группа кортексин КЕО - 0,05, 1 и 10 нг/мл кортексин - 10, 20 и 50 нг/мл Ю67, р53, виментин, кальмодулин, серотонин

Диссоциированная: 40 культур 3 пассажа, 50 культур 14 пассажа 1 группа — контроль, 2 группа — пептид КЕЭ 3 группа — пептид ЕО!?. 4 группа - кортексин КЕЭ - 20 нг/мл ЕБИ - 20 нг/мл кортексин - 10 нг/мл Кл67, р53, виментин, кальмодулин, серотонин

Методы клеточных культур Органотипические культуры клеток. Сразу после извлечения коры головного мозга, его помещали в стерильную чашку Петри. Затем орган разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной 1 мм ). Эксплантаты помещали в чашку Петри с коллагеновым покрытием (12 эксплантатов в каждой чашке Петри) и культивировали в 3 мл питательной среды (раствор Хенкса 41 мл, среда Игла 30 мл, сыворотка крови плодов коровы 25 мл, глюкоза 40% - 1 мл, инсулин 2,5 мл (100 ЕД) и гентамицин 0,5 мл). Эксплантаты коры головного мозга культивировали в СОг-инкубаторе при температуре 36,7°С в среде с 5% содержанием СО2.

Диссоциированные культур клеток. Материалом для выделения первичной культуры клеток служила кора головного мозга, полученная от моло-

дых крыс линии Wistar. Среда для диссоциированных культур клеток коры головного мозга крыс содержала 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% DMEM, 1,5% HEPES и L-глутамин. Выделение первичной культуры проводили на чашках Петри обработанных раствором желатина (Биолот), последующее культивирование осуществляли во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (JetBiofil, 25 см2 поставщик Биолот). Клетки выращивали в 5 мл культуральной среды на флакон площадью 25 см2 и в 3 мл культуральной среды на чашку Петри диаметром 3.5 см. Через 5-7 дней первичная культура достигала монослоя, и ее пересеивали. Клетки выращивали до 3 пассажа («молодая» культура) и до 14 пассажа («старая» культура) в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007).

Иммуноцитохимический метод

Образцы культур клеток помещали на покрытые поли-Ь-лизином предметные стекла (Sigma). Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные и вторичные антитела. В качестве первичных антител применялись моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к маркерам KÍ67 (1:150, Vectorlab), р53 (1:50, Dako), серотонину (1:50, Dako), кальмодулину (1:50, Dako) и виментин (1:50, Dako).B качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины (Novocastra). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra).

Морфометрия и анализ микрофотографий Иммуноцитохимические микроизображения культур клеток сохраняли с помощью микроскопа Nikon Eclipse Е400, соединенного с цифровой камерой Nikon DXM1200. Морфометрический анализ полученных изображений проводили на персональном компьютере Intel Pentium 4 в программе «Видеотест-Морфология 5.2». На каждом препарате исследовали 10 полей зрения при увеличении х400. Площадь экспрессии (в %) рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади поля зрения. Оптическую плотность окрашивания выявленных продуктов измеряли в условных единицах.

Статистическая обработка результатов Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического и стандартного отклонения для каждой выборки и проводилась в программе Matlab R2012a. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk's W-test). Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала-Уоллиса). В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, для последующего выявления неоднородных групп (путем их попарных

сравнений) применяли процедуры множественных сравнений с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0.05.

Компьютерное моделирование взаимодействия пептидов с ДНК

Молекулярное моделирование образования комплекса ДНК с пептидами выполняли с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012. Оптимальные трехмерные структуры пептидов EDR и KED находили методом конформационного поиска с использованием процедуры LowModeMD в силовом поле MMFF94x [Halgren N.A., Nachbar R.B., 1996]. Влияние растворителя учитывали в неявном виде в генерализованном борновском приближении с введением внутренней диэлектрической константы равной 1, а внешней 80. Проводили докинг полученных конформеров с ДНК.

В качестве двухцепочечных молекул ДНК выбрали дуплексы В-формы d(CCTGCC)2 и d(CCAGC)2, содержащие предполагаемые сайты связывания для пептида EDR. Для расчета оптимальной взаимной ориентации молекулы пептидов EDR, KED и ДНК при их связывании и образовании стабильного комплекса использовали метод молекулярного докинга. В расчетах учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. В работе использовали силовое поле Amber 12ЕНТ и генетический алгоритм поиска, в качестве сайта связывания выбирали большую бороздку молекулы ДНК. Далее проводили оптимизацию геометрии комплекса ДНК-пептид в каждом найденном решении докинга. Энергию связи рассчитывали как разницу потенциальных энергий комплекса ДНК и пептида и изолированных молекул. Затем вычитали энтропийный вклад в систему, который составлял 12 ккал/моль. Выраженность взаимодействия пептида с ДНК определяли величиной энергии комплекса, которая рассчитывалась как разность энергий между комплексом ДНК-пептид и отдельно взятыми пептидом и ДНК. Взаимодействие было тем сильнее, чем более отрицательной была энергия. Промоторные последовательности генов ви-ментина (VIM1), кальмодулина (CALM1), 5-триптофангидроксилазы (ТРН1), окислительной способности скелетных мышц (PPARA, PPARG), белка теплового шока (HSPA1A), митохондриальной супероксиддисмутазы SOD2 и глутатионпероксидазы GPX1 взяли из базы данных GenBank соответственно под номерами: ВС061847.1, D90396.1, Х53501.1, NM005036.4, NM138712.3, NM005345.5, NM000636, NM000581.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пептидергическаярегуляция экспрессии пролиферотропного протеина Ю67 при старении в диссоциированной культуре клеток коры

головного мозга

При старении культуры наблюдалось снижение экспрессии пролифера-тивного белка Кл67 (рис. 1, 2). При введении пептида ПОК и кортексина в "молодые" культуры клеток наблюдалось достоверное увеличение экспрессии маркера Кл67 соответственно на 38% и 41% по сравнению с контрольной группой. В "старых" культурах клеток пептид ЕБЯ и кортексин увеличивали экспрессию маркера Кл67 соответственно на 29% и 26%.

□ "молодые" к\ш>туры

3

2.5

1.5

а 0.5

гь

гЬ

з старые культуры

контроль пептид КЕБ пеггпш ЕБЛ кортексин

Рис. 1. Действие пептидов на синтез маркера Кд67 в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга. *р <0,05 по сравнению с контролем. А Б

Рис. 2. Экспрессия маркера Ю67 в диссоциированной культуре клеток коры головного мозга, 3 пассаж, иммуноцитохимия, Х200: А — контроль, Б - кортексин.

Пептидергическая регуляция экспрессии проапоптотического протеина р53 при старении в диссоциированной культуре клеток коры

головного мозга

При старении культуры экспрессия р53 увеличивалась в 1,4 раза по сравнению с "молодыми" культурами клеток. При введении пептида ЕБЯ в "молодые" культуры клеток экспрессия маркера р53 снижалась на 10%, а при введении в "старые" культуры уменьшалась на 17% (р<0,05). Кортексин достоверно действовал только на "старые" культуры клеток и снижал экспрессию белка р53 на 11% (р<0,05). При введении пептида КЕО достоверных изменений в экспрессии белка р53 не наблюдалось (рис. 3).

□ "молодые" культуры

контроль пептид КЕБ пеппщ ЕРЯ кортексин

Рис. 3. Действие пептидов на синтез маркера р53 в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга. * - р <0,05 по сравнению с контролем.

Пептидергическая регуляция экспрессии маркере функциональной активности нейронов при их старении в диссоциированной культуре клеток коры головного мозга Экспрессия белка виментина в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга крысы представлена в таблицах 2 и 3. При старении культур клеток экспрессия виментина не изменялась. В "молодых" и "старых" культурах клеток при добавлении пептидов КЕО, ЕМ1 и кортексина достоверного изменения площади экспрессии виментина не обнаружено. При добавлении пептидов КЕБ, ЕБЯ и кортексина в "молодые" культуры клеток коры головного мозга крысы наблюдалось достоверное увеличение площади экспрессии маркера серотонина соответственно в 1,8; 2,4 и 2,2 раза (Табл. 2). При добавлении пептида ЕОК в "старые" культуры клеток площадь экспрессии серотонина увеличивалась в 1,2 раза. Однако при добавлении пептида КЕБ и кортексина в "старые" культуры клеток статистически значимых изменений площади экспрессии серотонина не наблюдалось.

Таблица 2.

Влияние пептидных препаратов на площадь экспрессии сигнальных молекул

Группа Виментин Серотонин Кальмодулин

"Молодые" культуры "Старые" культуры "Молодые" культуры "Старые" культуры "Молодые" культуры "Старые" культуры

Контроль 1,30±0,35 1,19±0,10 1,30±0,40 1,10±0,12 1,16±0,30 1,19±0,15

КЕБ 1,35±0,35 1,19±0,20 2,20±0,30* 1,15±0,15 1,15±0,40 1,20±0,25

ЕБЯ 1,35±0,40 1,30±0,10 2,90±0,50* 1,35±0,12** 1,31 ±0,20 1,25±0,15

Кортексин 1,39±0,23 1,20±0,15 2,60±0,70* 1,15±0,20 1,25±0,30 1,19±0,17

*р <0,05 по сравнению с контрольной группой в "молодых" культурах; ** - р<0,05 по сравнению с контрольной группой в "старых" культурах

Пептидергическая регуляция пролиферации, апоптоза и функциональной активности клеток коры головного мозга в органотипической культуре молодых и старых крыс

Результаты иммуноцитохимического окрашивания клеток коры головного мозга крысы на маркер пролиферации Кл67 показали эффективность действия кортексина в "молодых" культурах клеток в концентрациях 10 нг/мл и 20 нг/мл, а пептида КЕБ - в концентрации 0,05 нг/мл (Табл. 3). В "старых" культурах клеток эффективной для кортексина оказалась концентрация 10 нг/мл, а для пептида КЕБ - концентрации 0,05 нг/мл и 10 нг/мл. При этом для пептида КЕБ наиболее эффективной явилась концентрация 0,05 нг/мл.

В органотипических культурах клеток коры головного мозга молодых и старых крыс пептид КЕЭ и кортексин достоверно не влияли на синтез маркера апоптоза р53, однако в клетках молодых животных под действием пептида КЕЭ наблюдалась тенденция к повышению этого показателя (Табл. 4). В культурах клеток молодых крыс при введении пептида КЖ) и кортексина наблюдалось увеличение экспрессии Кл67 соответственно в 2 и 2,1 раза (Табл. 4).

Таблица 3.

Влияние различных концентраций пептидов на площадь экспрессии маркера

Кл67 в культурах клеток коры головного мозга

Концентрация, нг/мл "молодые" культуры | "старые" культуры

контроль 0,0035±0,0005 0,0080±0,0015

кортексин 10 0,0080±0,0020* 0,0090±0,0015

кортексин 20 0,0050±0,0005* 0,0150±0,0030**

кортексин 50 0,0030±0,0005 0,0080±0,0010

КЕБ 0,05 0,0070±0,0010* 0,0140±0,0025*

КЕО 1 0,003 5±0,0005 0,0075±0,0005

КЕБ 10 0,0040±0,0010 0,0110±0,0010**

*-р <0,05 по сравнению с контрольной группой в "молодых" культурах; ** - р<0,05 по сравнению с контрольной группой в "старых" культурах

Таблица 4

Влияние пептидов на площадь экспрессии сигнальных молекул в орга-нотипических культурах клеток коры головного мозга_

Группа Контроль КЕБ Кортексин

"Молодые" культуры "Старые" культуры "Молодые" культуры "Старые" культуры "Молодые" культуры "Старые" культуры

р53 0,0045±0, 0015 0,0015± 0,0005 0,0055± 0,0005 0,0017±0, 0005 0,0045± 0,0010 0,0012±0,0004

Кл67 0,0035±0, 0005 0,0080± 0,0015 0,0070± 0,0010* 0,0140±0, 0025** 0,0080± 0,0015* 0,0090±0,0015

Кальмоду-лин 0,0060±0, 0020 0,0040± 0,0010 0,0070± 0,0005 0,0100±0, 0020** 0,0280± 0,0040* 0,0135±0,0020**

Серотонин 0,0035±0, 0010 0,0011± 0,0002 0,0060± 0,0005* 0,0025±0, 0005** 0,0075± 0,0009* 0,0013±0,0002

Виментин 0,0010±0, 0001 0,0060± 0,0020 0,003 5± 0,0002* 0,0140±0, 0040** 0,0040± 0,0004* 0,0100±0,0030

*р <0,05 по сравнению с контрольной группой в культурах клеток молодой крысы; ** - р<0,05 по сравнению с контрольной группой в культурах клеток старой крысы. Примечание: концентраия пептида КЕБ 0,05 нг/мл, концентрация кортексина 10 нг/мл.

В органотипических культурах клеток старой крысы стимулирующий эффект пептида КЕБ сохраняется, он повышал синтез маркера К167 в 1,75 раза. Кортексин достоверно не влиял на синтез маркера Кд67 в органотипических культурах клеток головного мозга.

Под действием кортексина в культурах клеток молодых крыс наблюдалось достоверное увеличение площади экспрессии маркера кальмодулина в 4,6 раза по сравнению с контрольной группой. В культурах клеток старых крыс кортексин также оказывал стимулирующее действие на экспрессию кальмодулина, увеличивая ее площадь в 3,4 раза. Пептид КЕБ не влиял на экспрессию кальмодулина в культурах клеток молодых крыс, но увеличивал ее в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой в культурах клеток старых животных.

В опытах на органотипических культурах клеток коры головного мозга молодых крыс было показано, что при введении пептида КЕБ и кортексина наблюдалось достоверное увеличение синтеза серотонина в 1,8 и 2,2 раза по сравнению с контролем.

В культурах клеток старых крыс на синтез серотонина достоверно подействовал только пептид КЕБ, увеличивая площадь экспрессии серотонина в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой. В опытах на органотипических культурах клеток коры головного мозга крысы было показано, что при введении пептида КЕБ и кортексина наблюдалось достоверное увеличение

синтеза маркера виментина соответственно в 3,9 и 4 раза в клетках молодых крыс, и в 2,3 и 1,7 - в клетках старых крыс по сравнению с контролем.

Моделирование молекулярных взаимодействий пептидов с ДНК

Методом конформационного анализа были рассчитаны наиболее энергетически выгодные конформации пептидов КЕБ и ЕОЯ. Оказалось, что молекула КЕБ может принимать в два раза больше конформаций, чем ЕБЯ: получены 376 энергетически выгодных конформаций КЕБ и 126 конформаций ЕЭ11. Таким образом, КЕБ является менее стабильной молекулой, чем везу НЭП. Построена карта электростатического потенциала пептидов КЕБ и ЕБИ, согласно которой в молекуле КЕБ заряд равномерно распределен по всей молекуле (Рис. 4А), тогда как в молекуле ЕОЯ наблюдается разделение заряда, что придает ей выраженный дипольный момент (Рис. 4Б).

А Б

Рис. 4. Распределение электростатического потенциала в молекулах пептидов КЕО (А) и ЕТЖ (Б). Красным цветом изображены отрицательно заряженные группы молекулы, синим — положительно заряженные группы молекулы, белым - нейтрально заряженные группы молекулы.

С использованием метода молекулярного докинга были подобраны последовательности нуклеотидов с1(ССТССС)2 и с1(ССАОС)2, с которыми пептид КЕО может образовывать устойчивые комплексы. Последовательности найдены, основываясь на значениях энергии комплексов ДНК-пептид (Табл. 5).

Таблица 5.

Энергии комплексов пептидов с предполагаемыми участками ДНК

Пептид Нуклеотидные последовательности

d(CCTGCC)2, Е ккал/моль d(CCAGC)2, Е ккал/моль

KED -17,2 -19,8

EDR -23,0 -4,8

Е - энергия связи, ккал/моль

Молекула KED образует сеть из 5 водородных связей с нуклеотидами ДНК в сайте d(CCTGCC)2. Атом кислорода карбоксильной группы глутами-новой кислоты взаимодействует с азотом N4 цитозина в положении DC51 (Рис. 5А). Аминогруппа N-концевого участка пептида взаимодействует с атомом азота N7 аденина в положении DA10. Кислород основной цепи глу-таминовой кислоты взаимодействует с N6 аденина DA10. Карбоксильная группа боковой цепи аспарагиновой кислоты образует водородную связь с аминогруппой N4 цитозина DC2, боковая цепь аргинина взаимодействует с N7 гуанина DG57. Все перечисленные водородные связи показаны на рисунке 2. Помимо водородных связей особое внимание следует уделить образованию л-катионной связи, энергетический вклад которой составляет около 5 ккал/моль в водной среде. Одна я-катионная связь найдена между положительно заряженным атомом азота аминогруппы основной цепи молекулы KED и пиримидиновым кольцом цитозина DC9 (Рис. 5А). При взаимодействии EDR с сайтом d(CCTGCC)2 была обнаружена сеть из 8 водородных связей (Рис. 5Б). Несмотря на то, что л-катионных взаимодействий не обнаружено, пептид EDR образует более энергетически выгодный комплекс с d(CCTGCC)2, чем KED.

А Б

Рис. 5. Схема контактов между пептидами ЮЮ (А), ЕБЯ (Б) и нуклеотидами последовательности й(ССТОСС)г. Зеленая стрелка показывает направление отдачи протона атомом или атому боковой цепи пептида; синяя стрелка показывает направление отдачи протона атомом или атому основной цепи пептида, пунктиром изображена область контакта лиганда с растворителем.

На рисунке 6 представлена схема контактов пептидов КЕБ и БОЯ с сайтом <1(ССАОС)2. Значения энергий связи таких комплексов представлены в таблице 1. С сайтом с1(ССАОС)2 пептид КЕБ образует энергетически более выгодный комплекс по сравнению с сайтом с1(ССТССС)2. При подстановке в сайт связывания пептида ЕБЯ вместо КЕБ энергия взаимодействия с сайтом с1(ССАСС)2 составила -4,8 ккал/моль, что указывает на образования менее стабильного комплекса по сравнению с КЕБ.

Таким образом, были подобраны два предполагаемых сайта связывания для пептидов КЕБ и БОЯ: с1(ССТОСС)2 и с!(ССАОС)2. С обоими сайтами пептиды образуют стабильные комплексы. Однако с сайтом с!(ССАОС)2 пептид КЕБ взаимодействует с большей энергией, что указывает на образование энергетически более выгодного комплекса.

В промоторных участках генов ТРН1, У1М1 и САЬМ1 были обнаружены предполагаемые сайты связывания для пептида КЕБ (Табл. 6): в гене ТРН1 - один сайт связывания, в гене У1М1 - два сайта связывания, в гене САЬМ1 - один сайт связывания.

Рис. 6. Схема контактов между пептидами КЕБ (А), ЕБЫ (Б) и нуклеотидами последовательности с1(ССАСС)2.Обозначения те же, что и на рис. 2.

Таблица 6.

Промоторные участки генов у крыс Rattus norvegicus

Ген Регуляторный участок гена, range -120 to 100 bp (кДНК 5'—>3') GenBank №

ТРН1 gcttctcctataagaggcggcagctcccgtccgcaggtgaccctctgaa ctccagtggctttgaggtcctctttccagtgccggatCCTGCCcactg ggtcatcttcattcagattcaccatgattgaagacaacaaggagaacaa agaccattcctcagaaagggggagagtgactctcatcttttccttgaag aatgaagttggaggactcataaaag X53501.1

VIM1 tcttgctcctggaccccccagagaccCCAGCgctcctacggttcacagccactgcgc cctcgctctcttcttgcagatcttgcagccgcagcaagccaggccacctcgtccttcga agccatgtccaccaggtccgtgtcctcgtcctcctaccgcaggatgttcggtggctccg gcacatcgagccggcCCAGCtccaaccggagctatgtgaccacat BC061847. 1

CALM1 acaggCCAGCagccttgctcaggtcccggactcccaagtgacctctgcccgcg- taatgagcccgccgcgccgggcgcgccttgggggcggagcctt- gcggtgaggtccggttgtcgcagcgccgccctgcgcgaggcggtactgccgcggcg- gagggataccgcgcaccgtatatatatcgcggcacacaggctcgcgctacggcag- tggtgctgggagt D90396.1

Жирным цветным шрифтом выделены предполагаемые сайты связывания для пептида КЕБ.

Таблица 7.

Промоторные гены участков человека Homo sapiens__

Ген Регуляторный участок гена, range -499 to 100 bp (кДНК 5'—>3') GenBank №

PPARA accggctcatcgcacagagtagcagagccgggctcatcgaggaggcaggaggggctcgCC AGCgtggcacgggcgcccggcgggaacctccacccgccccgcggccgcgcgtccccgcct cgaattcagccccgccccggtgcgccgggctggaggggcgctgacgctcagcggtgtccca tcggtgaccttggacggtccctccacctctccggcctcagtttcccttggctgcagcggcc gcggggcgctaggtgggagccgctgagcgctcccggggccccgcccaccgcgagcagccaa tcgggcgccgccctccggggggtgtgtcccggggccgaggcccggggcccggagggcgcgc ggggcgggcggggcttccgGGTCGGgcctcgggacactggctcgcgcggaccggggcag ggggcgggccgaggggcggtgcgtgtcgcgggggcgcggctggcacggacgcgcggaggcg gcgccgggcatgggccgtggacgcggcggccccgcggcgggggcagcgggcggcgggggcg gaggcggccgctagcgcCCTGCCcggcgccgcctccttcggcgttcgccccacgg NM 005 036.4

PPARG accaagggacccgaaatatgctttaattaaattttcttttaaaatgtcactggaaagaaca tcttgggaagacggcctggccgatcgccgtgtgaagggcaagccactctggccgagaggga gccccacacctcggtctccccagaccggccctggccgggggcatccccctaaacttcggat ccctcctcggaaatgggaccctctctgggccgcctcCCAGCggtggtggcgaggagcaa acgacaccaggtagCCTGCCgcggggcagagagtggacgcgggaaagccggtggctccc gccgtgggccctactgtgcgcgggcggcggccgagcccgggccgctccctcccagtcgcgc gccgccgcccccgcccccgcccccgcccccgcccccacccccacccccacccccaccccca gccggcgcccgcgcccgcccccgcgccgggcccggctcggcccgacccggctccgccgcgg gcaggcggggcCCAGCgcactcggagcccgagcccgagccgcagccgccgcctggggcg cttgGGTCGGcctcgaggacaccggagaggggcgccacgccgccgtggccgcaggtc NM 138 712.3

HSPA1 A gtaatctttttccaaactggcccatgaggtcagagacagtatctccattgtaacgtggccg ggcggtgtcaacacaaacgcccccaccctcccctggacgcgcgtaacccgctccccgcaCC AGCccCCTGCCcacaactgcgcaggcCCAGCaagcccccacaattaaaagcCCA GCgccgacccttcctgtcaattaggcgctgaagcgcaggcggtcagcatcgccatggagac caacacccttcccaccgccactcccccttcctctcagggtccctgtcccctccagtgaatc ccagaagactctggagagttctgagcagggggcggcactctggcctctgattggtccaagg NM 005 345.5

aaggctggggggcaggacgggaggcgaaaaccctggaatattcccgacctggcagcctcat cgagctcggtgattggctcagaagggaaaaggcgggtctccgtgacgacttataaaagccc aggggcaagcggtccggataacggctagcctgaggagctgctgcgacagtccactaccttt ttcgagagtgactcccgttgtcccaaggcttcccagagcgaacctgtgcggctgcagg

SOD2 mitocho ndrial gctgggcggcgctgaCCAGCagctaggccccgtcttccctaggaacggccacgggggcc ctgggagggtatgaatgtctttttgcagtgaggcctctggaccccgcggccccccggcagc gcaaccaaaactcaggggcaggcgccgcagccgcctagtgcagccagatccccgccggcac cctcaggggcggagccggaggcagggccttcgggccgtaccaactccacgggggcaggggc cgcctcccttcggccgcgcgccactcaagtacggcagacaggcagcgaggttgccgaggcc gaggctagcctgcagcctcctttctcccgtgccctgggcgcggggtgtacggcaagcgcgg gcgggcgggacaggcacgcagggcacccccggggttgggcgcggcgggcgcggggcggggc ccgcggggggggggggcggggcggcggtgcccttgcggcgcagctggggtcgcggccctgc tccccgcgctttcttaaggcccgcgggcggcgcaggagcggcactcgtggctgtggtggct tcggcagcggcttcagcagatcggcggcatcagcggtagcaCCAGCactagca NM 000 636

GPX1 gactctgcccggttagaaaacccgcacgagggcggtgccgctttggagacagggaggaggg agaccggaagcctagatccctctggctgtcccctgcactgccggtaacatggcacaggaga ggagggctgtttgtgcacgggcagctcctgcagctgctgccgtcgcccaCCAGCctcct atgccaaaccccacatcctaactcaggaacctctgagaaaaaacggagccctcgagggccc CAGCccttggaagggtaacctggaccgctgccgcctggttgcctgggccagaccagacat gcctgctgctccttccggcttaggaggagcacgcgtcccgctcgggcgcactctCCAGC cttttcctggctgaggaggggccgagccctccgggtagggcgggggccggatgaggcggga ccctcaggcccggaaaactgcctgtgccacgtgacccgccgccggccagttaaaaggaggc gcctgctggcctccccttacagtgcttgttcggggcgctccgctggcttcttggacaattg cgccatgtgtgctgctcggctagcggcggcggcggcggcggcccagtcggtgtatg NM 000 581

Жирным цветным шрифтом выделены предполагаемые сайты связывания для пептида КЕЮ.

Анализ промоторных участков генов PPARA, PPARG, HSPA1 A, SOD2 (mitochondrial) и GPX1 также указывает на наличие сайтов связывания для пептида KED (Табл. 7). Так, для гена PPARA обнаружено 3 предполагаемых сайта связывания, для PPARG - 5 сайтов, для HSPA1А - 4 сайта, для SOD2 (mitochondrial) - 2 сайта, для GPX1 - 3 сайта связывания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее было установлено, что кортексин, пептиды KED и EDR обладают нейропротекторным и вазопротекторным действием. Кроме того, показано, что применение кортексина и пептида KED у людей пожилого возраста приводило к улучшению психоэмоционального состояния, нейрофизиологического состояния ЦНС, памяти. Однако молекулярные механизмы и сравнительная биологическая активность этих пептидов изучены лишь частично. Так, предполагается, что кортексин регулирует активность нескольких генов, кодирующмие нейропротекторные белки [Гранстем O.K. и соавт., 2008], а пептид KED связывается CG- и CNG- последовательностями в ДНК [Fedoreyeva L.I. et al., 2011] и повышает активность антиоксидантной системы [Arutjunyan A. et al., 2012].

В данном исследовании приводятся новые аспекты молекулярных механизмов действия нейропотекторного пептида KED, кортексина и вазопро-текторного пептида EDR в отношении клеток коры головного мозга при старении.

Установлено, что в дисоциированных культурах коры головного мозга при их старении in vitro короткие пептиды KED и EDR снижали уровень апоптоза, оцениваемого по экспрессии белка р53. При этом кортексин не обладал таким действием. Однако кортексин и пептид EDR симулировали экспрессию пролиферотропного протеина Ki67 в «молодых» и «старых» диссоциированных культурах нейронов, а пептид KED не обладал таким эффектом. Крайне важным является результат, свидетельствующий о повышении синтеза серотонина в культурах коры головного мозга животных под действием кортексина и пептидов KED и EDR. Известно, что из серотонина синтезируется N-ацетилсеротонин (NAS) - предшественник мелатонина, который обладает выраженным геропротекторным действием на клетки головного мозга [Khavinson V.Kh., Malinin V.V. 2005]. NAS регулирует когнитивные функции головного мозга, оказывает антидепрессантное и антигипертензив-ное действие, увеличивает продолжительность жизни и нивелирует влияние бета-амилоидных токсинов на нейроны. Возможно, именно повышение синтеза серотонина, и следовательно, стимуляция выработки NAS, является одним из механизмов нейропротекторного действия изученных пептидных биорегуляторов.

В органотипических культурах клеток коры головного мозга крыс были выявлены оптимальные конценрации пептида KED и кортексина, стимулирующие пролиферацию клеток. Установлено, что эффективная концентрация пептида KED в этом эксперименте составляет 1-10 нг/мл, а для кортексина -10-20 нг/мл.

Кроме того, в органотипических культурах клеток коры головного мозга молодых и старых животных под действием пептида KED и кортексина наблюдалось усиление процессов клеточного обновления и повышение синтеза 3 ключевых сигнальных молекул, характеризующих функциональную активность нейронов - кальмодулина, серотонина и виментина [Chi F. et al. 2012, Kanatsu Y. et al. 2012 .Yoshida N. et al. 2010,]. При этом пептид KED оказывал более сильный эффект в отношении стимуляции экспрессии белков Ki67, серотонина и виментина.

Поскольку ранее было высказано предположение, что короткие пептиды способны проникать в клетку и эпигенетически регулировать экспрессию генов [Fedoreyeva L.I. et al., 2011], нами были созданы сравнительные молекулярные модели взаимодействия пептидов KED и EDR с фрагментами про-моторных зон генов, кодирующих изученные нами белки, и тех генов, повышение экспрессии которых наблюдалось под действием пептид KED в ранее выполненных работах [Хавинсон В.Х. и др., 2012]. При изучении конформа-ционных особенностей пептидов KED и EDR было показано, что KED является более лабильной молекулой по сравнению с пептидом EDR и имеет более широкий спектр оптимальных значений энергии. В молекуле пептида KED заряд равномерно распределен по молекуле, тогда как в молекуле пептида EDR наблюдается четкое разделение заряда, что придает молекуле выраженный дипольный момент. Установлено, что пептиды KED и EDR способны связываться с большой бороздкой ДНК по последовательностям

CCTGCC и CCAGC. При этом, для пептида KED наиболее энергетически выгодный комплекс образуется с последовательностью CCAGC, а для пептида EDR - с последовательностью CCTGCC.

В промоторных участках генов ТРН1 (ген триптофангидроксилазы -фермента, участвующего в синтезе серотонина), VIM1 (ген виментина) и CALM1 (ген кальмодулина) были обнаружены предполагаемые сайты связывания для пептида KED. В генах ТРН1 и CALM 1 найден один сайт связывания, а в гене VIM1 - два сайта связывания. Анализ промоторных участков генов, кодирующих белки, регулирующие функциональную и антиоксидант-ную активность клеток (PPARA, PPARG, HSPA1A, SOD2, GPX1), также указывает на наличие сайтов связывания для пептида KED. Так, для генов PPARA и GPX1 обнаружено по 3 предполагаемых сайта связывания, для PPARG - 5 сайтов, для HSPA1А - 4 сайта связывания. Эти гены были выбраны нами в связи с тем, что ранее было установлено влияние пептида KED на их экспрессию и синтез соответствующих белков [Хавинсон В.Х. и др., 2010, 2011а].

Таким образом, одним из важнейших молекулярных аспектов нейро-протекторного действия пептида KED и кортексина является регуляция процессов клеточного обновления и синтеза серотонина в нейронах коры головного мозга. При этом пептид KED оказывает данный эффект в меньшей концентрации в сравнении с кортексином. По данным молекулярного моделирования пептиды KED и EDR могут эпигенетиически регулировать экспрессию ряда генов, продукты которых обеспечивают поддержание функциональной активности нейронного коры головного мозга при старении.

ВЫВОДЫ

1. Кортексин и пептиды KED и EDR активируют синтез серотонина, экспрессию белка Ki67 и снижают уровень проапоптотического протеина р53 в «молодых» и «старых» диссоциированных культурах клеток нейронов коры головного моза животных. Пептиды KED и EDR в большей степени снижают уровень апоптоза, а кортексин активирует пролиферацию нейронов.

2. В органтипических культурах нейронов коры головного молодых и старых животных пептид KED и кортексин активируют процессы клеточного обновления, синтез серотонина, кальмодулина и виментина. пептид KED оказывет более сильный эффект на синтез белков Ki67, серотонина и виментина в сравнении с кортексином.

3. Пептид KED и кортексин стимулируют экспрессию виментина, серотонина и Ki67 в органотипических культурах клеток молодых и старых животных в одинаковых концентрациях.

4. В промоторных зонах генов, участвующих в поддержании функциональной активности нейронов, найдена последовательность, с которой происходит комплиментарное связывание молекул пептидов KED и EDR.

5. В основе молекулярного механизма действия пептидов KED и EDR лежит его способность эпигенетически регулировать экспрессию генов и синтез соответствующих белков, что способствует восстановлению функий нейронов при их старении in vitro.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется дальнейшее изучение пептида KED в эксперимента-ных моделях патологии головного мозга, связанных с нарушеним синтеза серотонина.

Пептиды KED и EDR могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения с целью создания средств профилактики возрастных нейроде-генеративных заболеваний, поскольку установлено их стимулирующее дейсвие на процессы клеточного обновления в нервной ткани.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАКМинобрнауки РФ

1. Биологическая активность аминокислот в органотипических культурах тканей / Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая, Н.С. Линькова, В.Е. Проняева, H.A. Червякова, P.C. Умнов, В.В. Бенберин, В.Х. Хавинсон // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2013. - №2. - С. 116-120.

2. Короткие пептиды стимулируют экспрессию серотонина в клетках коры головного мозга / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, С.И. Тарновская, P.C. Умнов, Е.В. Елашкина // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2014. - Т. 157, №1.-С. 89-93.

3. Умнов, P.C. Нейропротекторные эффекты пептидных биорегуляторов у людей разного возраста: обзор литературы / P.C. Умнов, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // Успехи геронтологии. - 2013. - Т.26, №4. - С. 671-678.

4. Умнов, P.C. Пептиды стимулируют экспрессию сигнальных молекул в культурах клеток нейронов животных разного возраста / P.C. Умнов, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2014. -№2,- С. 123-126.

Статьи в сборниках

5. Умнов, P.C. Пептиды тканеспецифически стимулируют экспрессию сигнальных молекул в культурах клеток нейронов у животных разного возраста / P.C. Умнов, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон //Сб. научных трудов «Клинические и фундаментальные аспекты геронтологии». - Самара, 2014. -С. 163-169.

Тезисы докладов

6. Геропротекторный трипептид стимулирует дифференцировку клеток в подкорковых структурах головного мозга / P.C. Умнов, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, A.B. Дудков // Пушковские чтения, СПб, 2012. С. 98.

7. Короткие пептиды снижают уровень апоптоза при старении клеток головного мозга / В.Е. Проняева, P.C. Умнов, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // Сб. тез. Конгресса «Человек и лекарство». - Москва. -2013. - С. 414.

8. Модель молекулярного взаимодействия геропротекторного трипептида со специфическим сайтом в генах ТРН1, VIM1 и CALM1 / В.Х. Хавинсон, С.И. Тарновская, Н.С. Линькова, P.C. Умнов // Международный форум «Старшее поколение». - СПб., 2013. - С. 117.

9. Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций коры головного мозга при старении / Н.С. Линькова, P.C. Умнов, Е.О. Гутоп // Матер. Всероссийской молодежной конф. с международным участием «Фундаментальные аспекты старения. Хрупкость: модели, маркеры, фенотипы. Результаты проекта «Хрусталь»,- Российский семейный врач. -2013. — Т.17, №3. — С. 16-18.

10. Молекулярно-клеточные механизмы пептидной регуляции функций эндотелия сосудов при старении / P.C. Умнов, Е.В. Елашкина, Н.С. Линькова, С.И. Тарновская // Научно-практическая конференция и школа, посвященная памяти акад. В.В. Фролькиса «Актуальные проблемы геронтологии и гериат-

рии: от теории к практике». В журн. «Проблемы старения и долголетия». -2013.-С. 25.

11. Нейропротекторные пептиды регулируют синтез белка цитоскелета виментина в коре головного мозга / В.Е. Проняева, Р.С. Умнов, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease -СПб., Россия. - 2013. - С. 134.

12. Пептидергическая регуляция экспрессии маркера Ki67 в органах нейро-иммуноэндокринной системы при старении / Н.С. Линькова, Р.С. Умнов, В.Е. Проняева, Г. Йокубаускене, Н.А. Червякова // Сб. тез. Конгресса «Человек и лекарство». - Москва. -2013. - С. 374.

13. Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в клетках коры головного мозга при старении / Н.С. Линькова, В.Е. Проняева, Р.С. Умнов, А.В. Костылев, В.Х. Хавинсон // Научно-практическая конференция и школа, посвященная памяти акад. В.В. Фролькиса «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии: от теории к практике». В журн. «Проблемы старения и долголетия». - 2013. - С. 43.

14. Пептидергическая регуляция функций нервной и иммунной системы при старении / Н.С. Линькова, Р.С. Умнов, Н.А. Червякова, А.В. Костылев // Сб. тез. Научной конф. молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» - 2013. - С. 33-34.

15. Трипептиды стимулируют синтез серотонина в культуре клеток коры головного мозга / Р.С. Умнов, В.Е. Проняева, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease -СПб., Россия. - 2013. - С. 150-151.

16. Умнов, Р.С. Антидепрессантые свойства пептидов и их роль в регуляции экспрессии кальмодулина / Р.С. Умнов, Н.С. Линькова, В.Е. Проняева // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» — 2013. - С. 282.

17. Умнов, Р.С. Трипептид стимулирует дифференцировку и клеточное обновление в коре головного мозга при старении// старении / Р.С. Умнов, В.Е. Проняева, Н.С. Линькова // Сб. тез. Научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» - 2013. - С. 64.

18. Molecular aspects of tripeptide neuroprotective impact on the Ageing brain / V.Kh. Khavinson, R.S. Umnov, N.S. Linkova, S.I. Tarnovskaya, V.E. Pronyaeva, S.V. Trofimova // 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative mMedicine", Israel.-2013.-P. 78.

19. The role of peptide signal molecules in maintance of the neuro-immuno-endocrine system in ageing / V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, S.I. Tarnovskaya, V.E. Pronyaeva, R.S. Umnov, Т.Е. Nichik, N.A. Chervjakova // 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative Medicine", Israel. - 2013. - P. 17.

20. Peptides slow down aging of the brain and thymus cells / V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, V.V. Benberin, R.S. Umnov, N.A. Cherviakova, S.V.Trofimova //

The journal of nutrition, health and aging (The Materials Of 20th Iagg Word Congress Of Gerontology And Geriatrics. - Seoul, Korea). - 2013. - Vol. 17, Suppl. l.-P. S538.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

АФК активные формы кислорода

БТШ белки теплового шока

ГАМК гаммааминомаслянная кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭ дисциркуляторная энцефалопатия

КА катехоламины

МРТ магнитно-резонансная томография

МТ мелатонин

пол перекисное окисление липидов

ПСФ-тест психофизиологический тест

РНК рибонуклеиновая кислота

ЦНС центральная нервная система

ЭЭГ электроэнцефалограмма

ACRH кортикотропин-релизинг гормон

EDR трипептид СккАвр-А^

KED трипептид Ьув-СЫ-Азр

NAS М-ацетилсеротонин

УМНОВ Роман Сергеевич ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ СТАРЕНИИ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА // Автореф.

дис. канд. биол. наук: 14.01.30 - геронтология и гериатрия СПб. - 2014 - 24 с._

Подписано в печать «23» июля 2014 г. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ 154._

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 197376, С.-Петербург, ул. проф. Попова, 5.

УКАЗАТЕЛЬ ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Пустоханова Л.В. Когнитивные нарушения в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта и возможности их коррекции нейромидином // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2011. - № 4 — Вып. 2. - С. 23-27; Хавинсон В.Х., Винер И.А., Трофимова С.В. и соавт. Метод повышения резервных возможностей спортсменов высокой квалификации // International Journal on Immunorehabilitation (Международный журнал по иммунореабилитации). - 2010. - Т. 12. -№ 2. - С. 242а.; Хавинсон ВХ., Линъкова Н.С., Дудков А.В. и соавт. Пептидергическая регуляция экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные и противовоспалительные белки // Бюлл. эксп. биол. мед. 2011а. Т. 152, № 11. С. 548-551; Хавинсон В.Х., Соловьёв А.Ю., Жилинский Д.В. и соавт. Эпигенетические аспекты пептидной регуляции старения // Успехи геронтологии. 2012. Т. 25, № 1. С. 11-22; Agapova T.Y., Agniullin Y. V, Shadrina M.I. et al. Neurotrophin gene expression in rat brain under the action of Semax, an analogue of ACTH 4-10 //Neurosci Lett. - 2007. - Vol. 417 - N 2. - P. 201-205; Alvarez X.A., Lombardi V.R.M., Fernandez-Novoa L. et al. Cerebrolysin reduces microglial activation in vivo and in vitro: a potential mechanism of neuroprotection // J. Neural. Transm. Suppl. - 2000. - Vol. 59. -P. 281-292; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. // Biogerontology. - 2010. - № 11. - P. 139-149.; Arutjunyan A., Kozina L., Stvolinskiy S. et al. Pinealon prorects the rat offspring from prenatal hyperhomocysteinemia // International Journal of Clinical Experimental Medicine. - 2012. - Vol. 5 - № 2. - P. 179-185; Chi F„ Во Т., Wu C.H., Jong A., Huang S.H. Vimentin and PSF act in concert to regulate IbeA+ E. coli K1 induced activation and nuclear translocation of NF-кВ in human brain endothelial cells // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - N 4. - P. e35862; Fedoreyeva L.I., Kireev /./., Khavinson V.Kh., Vanyushin B.F. Penetration of Short Fluorescence-Labeled Peptides into the Nucleus in HeLa Cells and in vitro Specific Interaction of the Peptides with Deoxyribooligonucleotides and DNA // Biochemistry. - 2011. - Vol. 76 - № 11. - P. 1210-1219; Kanatsu Y„ Chen N.H., Mitoma J., Nakagawa T. . et al. Gangliosides stimulate bradykinin B2 receptors to promote calmodulin kinase II-mediated neuronal differentiation // J Biochem. - 2012. - Vol. 152. - N 1. -P. 63-72.; Khavinson V.Kh., Malinin V. V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. Basel (Switzerland): Karger AG, - 2005. - 104 p.; Sohrabji F„ Bake S„ Lewis D.K. Age-related changes in brain support cells: Implications for stroke severity // Neurochem Int. - 2013. - Vol. - 63 - N 4. - P. 291-301.; Yoshida N., Maejima Y., Sedbazar U. et al. Stressor-responsive central nesfatin-1 activates corticotropin-releasing hormone, noradrenaline and serotonin neurons and evokes hypothalamic-pituitary-adrenal axis // Aging (Albany NY). - 2010. - Vol. 2. -N 11. -P. 775-784.