Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние адаптации к теплу на апоптоз в тимусе

На правах рукописи

КРУГЛОВ СЕРГЕИ ВАСИЛЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ АДАПТАЦИИ К ТЕПЛУ НА АПОПТОЗ В ТИМУСЕ

14 00.16 - патологическая физиология 03 00 04 - биохимия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории стресса и адаптации Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И Ю Малышев доктор медицинских наук, профессор Н П Ларионов

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН,

доктор биологических наук, профессор Л Д Лукьянова доктор биологических наук, профессор Ю.В Архипенко

Ведущее учреждение: Российский Университет Дружбы Народов Автореферат разослан "20" сентября 2005 года

Защита диссертации состоится "20" октября 2005 года в 14 00 ч. на заседании Диссертационного совета Д 001 003 01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофи оологии РАМН (125315, Москва, Балтийская улица, дом 8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л Н Скуратовская

Im

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Исследования последних лет показали, что ключевая роль в реализации ряда физиологических процессов принадлежит апоптозу. Нарушение механизмов, участвующих в реализации или контроле апоптоза может стать причиной многих заболеваний. При изучении апоптоза было выявлено, что истощение и ускоренная инволюция вилочковой железы при действии сильных или длительных стрессорных факторов происходит вследствие усиления апоптоза, вызванного этими факторами (Cohen J J , 1992). В различных экспериментах показано, что к индукции апоптоза в тимусе приводят различные стрессоры, в том числе иммобилизационный стресс (Hatanaka К . et al 2001.). сепсис ( Ayala А , et al 1996) и гипертермия ( Khan V.R 2002).

Среди стрессорных факторов особое место занимает гипертермия Повышение температуры может быть вызвано как внешними факторами, например, при длительном нахождении организма в условиях повышенной температуры, так и внутренними факторами, например, при иммунной реакции. При этом, с одной стороны, значительное повышение температуры, как и любой другой достаточно сильный стрессор, вызывает стресс-реакцию, увеличивает концентрацию кортикостероидов и катехоламинов в крови (Brenner M, 1998) и, как следствие, создает возможность усиления апоптоза в органах иммунной системы. С другой стороны, гипертермия приводит к внутриклеточным повреждениям и в этом случае также способствует индукции апоптоза.

Для профилактики и коррекции стрессорных повреждений и заболеваний, имеющих в своей основе стрессорный компонент, используют адаптацию к факторам окружающей среды. Так адаптацию к периодической гипобарической гипоксии используют для профилактики и лечения состояний, в патогенезе которых присутствует стрессорный компонент' нарушений функции иммунной системы, неврозов, гипертонической болезни, параноидальной формы шизофрении и др (Меерсон Ф 3. 1993; Пшенникова М.Г 2001).

Исследования последних лет показали, что защитные эффекты адаптации связаны с синтезом защитных стресс-белков группы белков теплового шока (HSPs) (Jäättelä M., 1992; Malyshev I. et al., 1995, 1996). Главные внутриклеточные механизмы защитного действия HSPs состоят в дезагрегации аномальных белковых комплексов, утилизации и репарации поврежденных белков, регуляции синтеза белка de novo (Mizzen F., 1988;). Также важную роль в формировании адаптационной защиты играет оксид азота (NO) (Малышев И Ю., Манухина Е Б., 1998). Механизмы действия NO включают антиоксидантное (Siow С et al, 1999), противовоспалительное действие (Lamas S et al., 1998) и эффекты, опосредованные продукцией цГМФ (Du Toit et al, 1998). Кромр тот NO гппсппрн активировать синтез защитных стресс-белков группы H , 1996), которые

способны регулировать апоптоз, обладая антиапоптотическим действием (Lang et al., 2002). NO также может выступать в качестве фактора, регулирующего апоптоз' в малых и физиологических концентрациях NO проявляет антиапоптотическое действие (Kim et al., 1999), в больших же дозах NO приводит к индукции апоптоза (Murphy М , 1999 , Dimmeier S , 1997).

В экспериментах in vivo было показано, что адаптация к теплу ограничивала апоптотическую iибель клеток (Монастырская F А и др 2003) Таким обраюм. имеющиеся данные наводят на мысль о возможности антиапоптотического действия адаптации на уровне целою организма и участии в этом процессе HSPs и NO Вместе с тем не изучалось влияние адаптации на ключевой механизм апоптоза - каскадную акгивацию каспаз Соответственно, возможность потенциально эффективного использования адаптации для предупреждения и коррекции стресс-индупированных нарушений иммунологических функций тимуса не оценивалась

В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности адаптационной защиты клеток тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза и исследовании молекулярных механизмов, вовлеченных в развитие такой защиты.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1 Изучить пути активации апоптоза при тепловом шоке

2 Изучить влияние адаптации к теплу на индуцированный тепловым шоком апоптоз в тимусе.

3. Изучить роль белков теплового шока в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез HSP70 и влияния ингибитора синтеза HSPs на развитие защитных эффектов адаптации

4. Изучить роль NO в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез N0 и влияния ингибитора NO-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации

5 Оценить возможность перекрестного антиапоптотического эффекта адаптации к теплу при сепсис- и стресс-индуцированном апоптозе в тимусе.

6. Выявить генетическую детерминированность эффекта адаптации к теплу.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами

1 Тепловой шок приводит к активации эффекторных каспаз 3 и 6 и инициаторных каспаз 8 и 9 в клетках тимуса При этом активность каспазы 9, вызванная тепловым шоком, выше чем активность каспазы 8 Это свидетельствует о том. чго апоптоз, индуцированный тепловым шоком,

развивается в большей степени по митохондриальному пути, чем по рецепторзависимому пути

2. Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу защищает клетки тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза. Защитный эффект проявляется в снижении уровня активности инициаторных и эффекторных каспаз.

3. Впервые показано, что накопление Н8Р70 в процессе адаптации в клетках тим\са сопровождается снижением активности каспаз 3. 8 и 9, индицированной тепловым шоком Введение ингибитора синтеза белков теплового шока приводит к устранению адаптационного накопления ИБР70 и потенцированию активности эффекторной каспазы 3 и инициаторной каспазы 9, но не каспазы 8, индуцированной тепловым шоком

4. Впервые доказано, что N0 вносит вклад в формирование защитного антиапоптотического эффекта адаптации к теплу При этом ограничение активности эффекторных каспаз происходит как за счет действия самого N0, так и за счет активации механизмов, связанных с Н5Р70. Это подтверждается тем, что ингибитор МО-синтазы, ограничивая гиперпродукцию N0, уменьшает активность каспазы 3 при тепловом шоке. Вместе с тем ингибитор ЫО-синтазы отменяет эффект адаптивного ограничения индукции Н5Р70 и адаптационное ограничение индуцированной тепловым шоком активности каспазы 3

5 Впервые показано, что адаптация к теплу ограничивает индуцированную эмоциональным стрессом и ЛПС-индуцированную активность каспазы 3.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней впервые продемонстрирована возможность формирования адаптационной защиты клеток тимуса от повреждающих воздействий стрессоров Продемонстрирована избирательность пути активации апоптоза при действии на организм гипертермии. Раскрыта роль N0 и Н8Р70 в защитных эффектах адаптации клеток тимуса от апоптоза индуцированного тепловым шоком. Доказано, что адаптация к теплу обладает перекрестным антиапоптотическим эффектом.

Практическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность предупреждения гибели клеток иммунной системы с помощью адаптации к теплу Это позволяет обосновать возможность применения адаптации к теплу при заболеваниях, связанных с вторичными иммунодифицитами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Индукция апоптоза в тимусе при тепловом шоке развивается преимущественно по митохондрий-зависимому пути.

2. Адаптация организма к теплу эффективно защищает тимус от апоптоза, индуцированного тепловым шоком.

3. Молекулярные механизмы адаптации, опосредованные действием НБР и N0, вовлечены в антиапоптотический эффект адаптации к теплу.

4 Адаптация к теплу обладает перекрестным эффектом, защищая от апоптоза вызванного разными стрессорными факторами.

Апробация работы Основные результаты проведенных исследований были доложены на межлабораторном семинаре Отдела адаптационной медицины НИИ ОПП (Москва, 2004), II международной научно-практической конференции «Дисфункции эндотелия» (Витебск, 2001), на XXI международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва 2003). 7-ом международном кошрессе Международною общее 1ва адашанионной медицины (Сан Диет. США, 2003)

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы содержит 162 источника Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 20 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена на 532 крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 грамм и 40 крысах-самцах линии Август массой 200-220 грамм Содержание животных и проведение экспериментов проводилось в соответствие с международными правилами "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"

Адаптацию животных к теплу проводили в термостате (ТС-80. Россия) в течение 6 дней путем ежедневного помещения крыс в термостат на 20 мин при температуре воздуха 41±1°С и ректальной температуре 38±0,5°С Эффективность адаптации оценивали через 24 ч после последнего сеанса адаптации по изменению устойчивости к тепловому шоку, артериального давления и массы тимуса.

Тепловой шок воспроизводили путем прогревания бодрствующих животных в термостате(ТС-80, Россия) в течение 20 мин при температуре воздуха 51 ±1°С. Ректальная температура составляла 41,5 ± 0,5°С. Средняя температура тела перед проведением теплового шока составляла 37,8+0,6°С. Выживаемость животных после теплового шока оценивали в течение 24 ч.

Измерение артериального давления АД проводили до и через один час после теплового шока непрямым бескровным способом по методу Короткова на хвостовой артерии Для регистрации использовали пневматический датчик Pneumatic pulse transduser DY-4 и Physiograph DMP-4F (Narco Bio-System, США)

Эмоцианальный стресс «Свободное плавание в клетке» (СПК) Экспериментальная установка представляет собой стандартную пластиковую жилую клетку (50 х 30 х 20 см), заполненную водой (температура +22°С), покрытую сеткой. Расстояние от сетки до поверхности воды - 5 см В клетку помещали по 5 крыс Животные имели возможность стоять, ухватившись за сетку, висеть на ней, а также плавать,

не мешая друг другу Время пребывания животных в условиях СПК - 30 мин и 60 мин.

Иммобилизационный стресс производили путем фиксации бодрствующих животных в положении на спине. Иммобилизация длилась 60 мин.

В качестве блокатора синтеза HSP70 использовали ингибитор транскрипции гена hsp кверцетин, который вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг в 1-й, 3-й и 5-й дни адаптации за 60 мин до каждого сеанса теплового воздейс1Бия в ходе адаптации (Malyshev et al, 1995)

В качестве ингибитора NO-синтазы использовали №-нитро-Ь-аргинин (L-NNA, Sigma, США). L-NNA вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг, 30 мг/кг и 100 мг/кг однократно за один час до теплового шока и в дозе 10 мг/кг ежедневно перед каждым адаптирующим воздействием в ходе курса адаптации (Зенина и др , 1998).

Модификация метода измерения суммарной концентрации нитратов и нитритов в биологических жидкостях

Данные о содержании нитритов и нитратов в биологических жидкостях являются косвенным показателем продукции NO в организме (Moshage et al., 1995) Для измерения суммарной концентрации нитратов и нитритов нами был разработан "Редуктор нитратов", представляющий собой пересекающиеся по взаимно перпендикулярным плоскостям две кадмиевые пластины с отверстиями, установленные на держателе и имеющие в нижней части магнитный элемент

Измерение суммарной концентрации нитритов и нитратов в плазме с использованием Редуктора нитратов (патент № 2161303 от 28.02.2000)

Во время декапитации производили забор крови с использованием гепарина Плазму получали центрифугированием цельной крови при 3000 об/мин в течение 15 мин и депротеинизировали путем добавления 1/20 объема ZnS04 в концентрации 300 г/л. После центрифугирования при комнатной температуре (15 мин при 3000 об./мин.) в супернатанте проводили восстановление нитратов до нитритов с помощью Редуктора Нитратов в присутствии 0,5М NH4OH, рН 9,0 в качестве буфера (отношение объема плазмы к объему буфера 91) После восстановления аликвоту плазмы смешивали с равным объемом реактива Грисса, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре для развития окраски и измеряли интенсивность поглощения спектрофотометрически при 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой (5-50 мкМ NaN02).

Определение активности каспаз в тимусе

Для определения активности каспаз тимус гомогенизировали на льду с помощью стеклянного гомогенизатора в лизис-буфере, содержащем 10 мМ HEPES, рН 7 2, 5 мМ EGTA, 0.1% CHAPS, 5 мМ DTT, 1.5 мМ MgCl2 и коктейль ингибиторов протеаз Гомогенат центрифугировали. В супернатанте определяли концентрацию общего белка по Лоури.

Супернатант, содержащий 650 мкг белка, переносили в кювету, добавляли 10 мкл субстрата, 40 мкл буфера (250 мМ HEPES, pH 7 4, 50 мМ FDT А, 2 5% CHAPS. 125 мМ DTT) (BioRad) Инкубировали при 25°С в течение 3 часов В этот период через каждые 30 минут определяли флюоресценцию высвобождающегося при расщеплении субстрата 7-амино-4-трифторметилкумарина (АФК). Флюоресцентные единицы переводились в пмоль АФК. высвобождаемого за минуту, используя калибровочную кривую, nocí роенную по свободному АФК

Определение HSP70 проводили методом Вестерн-блот апализа После 30-минутного лизирования в лизис-буфере [по 1 orsterman & Gath (1996) с добавлением 0,1% Triton X100J при (емпературе 4°С гомогенат ткани фильтровали и центрифугировали в охлажденной до 4°С ценфифуге 20 мин при 12000 об/мин Полученный супернатант использовали для электрофоре sä Концентрацию белка в образце определяли по методу Фолина-Лоури (Досон и др , 1991) Для проведения вестерн-блот анализа использовали реактивы и оборудование фирмы "Bio-Rad", USA. Супернатант соединяли с двухкратным sample-буфером по Laemmli и инкубировали 7 мин при 95°С на водяной бане Электрофорез проводили в 12% SDS полиакриламидном геле (ПААГ) по Laemmli (Laemmli, 1970) в течение 50 мин в камере Mini-PROTEAN 2 Cell. По окончании SDS-электрофореза белки из ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроэлюцией по Towbin (1979), используя прибор Trans-Blot Cell при напряжении 100 в в течение одног часа После этого блоты инкубировали с моноклональными антителами против индуцибельной формы HSP70 (SPA-810 фирмы Stress Gen Biotechnologies Corp.) в разведении 1:1000 в rex же условиях. Затем мембрану инкубировали 1 ч со специфичными к первым вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (NA-931 "Amersham". LIFE Sei. NIF825, Batch 175937), в разведении 1 5000 Для визуализации антигенной мишени использовали набор ECL RPN 2108 Batch 76 (Amersham) Экспонирование осуществляли на пленку Hyperfilm ECL ("Amersham Pharmacia Bioteh", Великобритания) Пленку проявляли и фиксировали используя фотографические реактивы О содержании HSP70 судили по плотности окрашивания полосы связывания антител

Количественная обработка полученных иммуноблотов проводилась путем сканирования и обработки с помощью компьютерной программы Photoshop Результаты представляли в виде репрезентативных диаграмм.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента Различия считались достоверными при р<0,05 Результаты представлены в виде М+т

Для оценки достоверности различий по смертности животных использовали точный метод Фишера

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Защитные эффекты адаптации к теплу при тепловом шоке

При разработке модели адаптации крыс к теплу в качестве критерия эффективности адаптационной защиты использовали устойчивость крыс к повреждающему действию теплового шока. В табл. 1 представлены данные, показывающие влияние предварительной адаптации к теплу на смертность крыс после теплового шока.

Таблица 1. Влияние адаптации к теплу на выживаемость крыс после теплового шока (%).___

Общее кол-во Кол-во крыс Кол-во крыс

Группы крыс погибших крыс, погибших во погибших в

% время ТШ, % течение 24 часов после ТШ, %

Адаптация 1 день+ 52% 52 -

тепловой шок,п=22

Адаптация 3 дня+ 73% 73% -

тепловой шок, п=22

Адаптация 6 дней+ 26%* 21%* 5%*

тепловой шок, п=40

Тепловой шок, п=40 68% 42% 26%

*- р < 0,05 по сравнению с тепловым шоком п - здесь и далее число крыс в группе

Видно, что после 1-го сеанса адаптации эти показатели достоверно не отличались от неадаптированного контроля После трех дней адаптации наблюдалось транзиторное снижение устойчивости животных Адаптация крыс в течение 6 дней приводила к выраженному повышению устойчивости к острому перегреву. При этом адаптация снижала смертность, как во время теплового шока, так и в последующие 24 часа.

Тепловой шок вызывал острую гипотензию (табл. 2). В контроле артериальное давление (АД) составляло 113±3 мм рт.ст, в течение 1 часа после теплового шока оно падало до 88+1 мм рт ст (Р<0,05 по сравнению с контролем).

Таблица 2.

Артериальное давление у крыс_

Группы артериальное давление, мм рт.ст

Контроль (интактные животные), п=10 113+3

Тепловой шок, п=15 88+ 1*

Адаптация, пН5 115 + 2

Адаптация + Тепловой шок, п=15 112 + 3**

*- р < 0,05 по сравнению с контролем, **- р < 0,05 по сравнению тепловым шоком

Адаптация сама по себе не вызывала достоверных изменений АД После 6-ти дневной адаптации наблюдался достоверный защитный эффект, (р " 0.05 по сравнению с ТШ)

Данные рис. 1 показывают защитный эффект адаптации на вызванное тепловым шоком снижение массы тимуса Тепловой шок приводил к достоверному снижению массы тимуса У адаптированных животных, подвергшихся штем действию тепловою шока, снижение массы тимчса было досюверно меньше

3,5 3

га

§ 2,5 н

5 2

га

о

>• 1,5 х

Е 1

0,5

0

I " 1 I

контроль адаптация

* .х.

**

ТШ

Ад + ТШ

Рис I Влияние адаптации к теплу на отношение масса тимуса/масса тела.

ТШ- тепловой шок. Ад - адаптация 6 дней *- р ^ 0,05 по сравнению с контролем **- р <" 0.05 по сравнению тепловым шоком т - масса

Таким образом, использованная нами модель адаптации к теплу эффективно защищала животных от повреждающего действия теплового шока Эти данные позволили предположить, что адаптация к теплу может ограничивать индуцированный тепловым шоком апоптоз в тимусе.

Влияние адаптации к теплу на активность инициаторных и эффекторных каспаз в тимусе

Для выявления защитного эффекта адаптации к теплу от индуцированного тепловым шоком апоптоза в тимусе, адаптированных в течение 6-ти дней крыс подвергали действию тепловою шока Степень апоптоза в тимусе оценивали по активности инициаторных каспаз 8 и 9 и эффекторных каспаз 3 и 6

/ Влияние адаптации к теплу на активность инициаторных каспаз 8 и 9 в тимусе

На рис 2 видно, что тепловой шок вызвал усиление активности каспаз 8 и 9 на 26,4% (р ^ о,05) и 85,3,3% (р < 0.05 ) соответственно. Предварительная адаптация к теплу полностью предупреждала индуцированную тепловым шоком активность каспазы 8, и снижала активность каспазы 9 на 73% (р <■ 0.05)

Рис 2. Влияние адаптации к теплу на активность инициаторных каспаз 8 и 9 в тимусе (контроль принят за 100%)

Ад - адаптация к теплу, ТШ - тепловой шок, Ад + ТШ - адаптация к теплу с последующим тепловым шоком

* - р < 0,05 по сравнению с контролем # - р < 0,05 по сравнению тепловым шоком

2 Вчияние адаптации к тешу на активность эффекторных каспаз 3 и 6 в тимусе

Результаты исследования влияния адаптации к теплу на активность инициаторных каспаз 3 и 6 представлены на рис. 3 Тепловой шок вызывал значительное увеличение уровня активности эффекторных каспаз: каспазы 6 в 2,3 раза, а каспазы-3 в 4,2 раза. Адаптация к теплу достоверно снижала активность каспазы 3 Предварительная адаптация в значительной мере снизила индуцированную тепловым шоком активность эффекторных каспаз. для каспазы 3 до 130,8 ± 8,88%, а для каспазы 6 до 146,6 + 7,81%.

Индуцирующее действие теплового шока на апоптоз в тим\се, как и любое другое стрессорное воздействие приводит к снижению проаукции зрелых Т-лимфоцитов и ускорению инволюции этого органа (Cohen J J 1992 и Khan V.R., Brown I.R 2002).

500 450 400 350 300 ^ 250 200 150 100 50 0

Рис. 3. Влияние адаптации к теплу на активность эффекторных каспаз 3 и 6

Лд - адаптация к теплу Till - тепловой шок. Ад + IШ - адаптация к теплу с последующим тепловым шоком

*- р 0.05 по сравнению с контролем ** - р ^ 0.001 по сравнению с контролем ß -р 0.001 по сравнению теп ювым шоком

Возможность предупреждения апоптоза с помощью предварительного однократного теплового шока была показана во многих исследованиях. Применительно к тимусу было показано, что предварительный тепловой шок тимоцитов защищал их от апоптоза, индуцируемого дексаметазоном или кальциевым ионофором, однако сам по себе тепловой шок при этом приводил к заметной фрагментации ДНК клеток (Migliorati G , et al 1992) В ходе наших экспериментов мы показали, что защита тимуса от индуцированного апоптоза может достигаться за счет предварительных периодических достаточно мягких тепловых воздействий Предварительная адаптация к геплу снижает индуцированную тепловым шоком активацию как эффекторных так и инициаторных каспаз.

Влияние ингибитора синтеза белков теплового шока квериетина на антиапоптотический эффект адаптации.

Для проверки претположения об участии HSP70 в антиапоптотическом эффект адаптации крысы в процессе адаптации получали инъекции ингибитора синтеза белков [силового шока -кверцетина

Как видно на рис 4, тепловой шок и адаптация приводили к накоплению в тимусе белков теплового шока Введение кверцетина приводило к достоверному снижению содержание Н8Р70 у животных всех групп.

300 250 200 150 100 50 0

□ без кверцетина В кверцетин

контроль

ТШ

адаптация Ад + ТШ

Рис 4 Влияние введения кверцетина на синтез Н8Р70 в тимусе

а)- Репрезентативная электрофореграмма накопления Н5Р70 в тимусе

крыс,

1 - контроль; 2 - адаптация. 3 - курсовое введение кверцетина: 4 -адаптация на фоне курсового введения кверцетина; 5 - тепловой шок, 6 - адаптация + тепловой шок; 7 - курсовое введение кверцетина + тепловой шок, 8 -адаптация на фоне курсового введения кверцетина + тепловой шок

б) - Диаграмма, показывающая уровень НЯР70 в тимусе крыс

ТШ - тепловой шок. Ад + ТШ - адаптация + тепловой шок

*- р < 0,05

При исследовании влияния ингибитора синтеза белков теплового шока на активность каспаз 3, 8, и 9 было показано, что сам по себе кверцетин в контроле снизил уровень активности каспазы 8 на 17,1 % (р ^ 0,05) (рис 5). В группе животных, подвергнутых тепловому шоку, инъекции кверцетина снизили активность каспазы 8 до 108,4 ± 7,39% (р < 0,05).

Шбез кверцетина ■ кверцетин

140 *

Рис. 5 Влияние кверцетина на активность каспазы 8

*- р 0.05 по сравнению с животными, не пол>чавшими кверцетин

В группе животных, адаптированных к теплу и подвергнутых действию теплового шока, инъекции кверцетина достоверно повысили уровень активности каспазы 8 с 97,8 ± 6,22% до 116,7 ± 10,31%, тем самым частично отменив защитный эффект адаптации по ограничению индуцированной тепловым шоком активности каспаз

250 200 150 100 50 0

и

Шбез кверцетина ■ кверцетин

ТШ

1

(■ (

д

1

Ад + ТШ

Рис 6 Влияние кверцетина на активность каспазы 9

*- р 0.05 по сравнению с животными, не поучавшими кверцетин На рис 6 показано, что у адаптированных животных кверцетин вызывал достоверное снижение активности каспазы 9 до 86,3 % В группе

животных подвергнутых тепловому шоку инъекции кверцетина снизили активность каспазы 9 на 18 % (р < 0,05). В группе животных адаптированных к теплу и подвергнутых действию теплового шока инъекции кверцетина повысили уровень активности каспазы 9 до 216,1 % по сравнению с контролем, т.е. кверцетин не только отменил адаптационную защиту, но даже потенцировал активацию каспазы 9, вызванную тепловым шоком

700 600 500 400 300 200 100 0

□ без кверцетина 0кверцетин

ТШ

Ад

Ад + ТШ

Рис. 7. Влияние кверцетина на активность каспазы 3 *- р < 0,05, **- р < 0.001 по сравнению с животными, не получавшими кверцетин

Данные о влиянии кверцетина на активность каспазы 3 представлены на рис. 7 Сам по себе в контроле кверцетин снижает активность каспазы 3 на 34,2 % (р ^ 0,05) В группе животных подвергнутых тепловому шоку инъекции кверцетина усилили активность каспазы 3 до 579,3 % В группе животных, адаптированных к теплу и подвергнутых действию теплового шока, инъекции данного ингибитора синтеза белков теплового шока также потенцировали активность каспазы 3, • повысив ее до 575,9 % (р <0.001)

Таким образом антиапоптотический эффект адаптации очевидно связан с синтезом ЩР70. Снижение уровня апоптоза (маркером которого является снижение уровня активности эффекторной каспазы 3) происходит на фоне накопления в процессе адаптации в тимусе НБР70 Вероятно, снижение уровня апоптоза происходит вследствие того, что Н8Р70 способны прерывать механизм активации эффекторных каспаз Это достигается за счет ют, чю Н8Р70 могут выступать в качестве мишени

для эффекторных каспаз (1д С.У, е1 а! 2000), а также за счет ингибирования активации инициаторных каспаз, особенно каспазы 9 (8а1еЬ А , й а!, 2000), о чем свидетельствуют полученные данные При введении ингибитора синтеза Н8Р70 после теплового шока значительно возрастает уровень активности каспазы 9, а активность каспазы 8 практически не изменяется. Таким образом, антиапоптотический эффект адаптации к теплу опосредован экспрессией белков НБР 70, антиапоптотическое действие которых в наибольшей степени проявляется на митохондрия-зависимом пути активации апоптоза

Тканеспецифичность синтеза Н8Р 70

Ранее, при исследованиях роли НБР70 в адаптационной защите, проводилась оценка динамики Н8Р70 в различных органах сердце, печени, мозге, аорте и др (Малышев И Ю) В ходе исследования влияния ингибитора синтеза белков теплового шока на накопление Н5Р70 в процессе адаптации выявилось отличие накопления Н8Р70 в тимусе от накопления в других органах.

Тимус

Сердце

12 3 4

Печень

Рис. 8а. Различия в синтезе Н8Р70 в разных тканях Репрезентативная электрофореграмма накопления Н5Р70 1 контроль. 2 -адаптация, 3 - курсовое введение кверцетина: 4 - адаптация на фоне курсового введения кверцетина

Из данных представленных на рис. 8а и 86 видно, что в процессе адаптации содержание Н8Р70 в тимусе увеличилось менее чем в два раза, в то время как в сердце содержание НБР70 увеличилось более чем в 4 раз, а в печени - более чем в 5 раз Введение ингибитора синтеза Н5Р70 приводит к снижению уровня Н5Р70 у адаптированных животных в тимусе менее чем в 2 раза, в сердце в 3 раза и в печени примерно в четыре раза Таким образом, в тимусе выявилась тканеспецифичность синтеза НБР70 при различных воздействиях. Вероятно, такая особенность синтеза Н8Р70 в тимусе связана с тем, что этот белок участвует в регуляции апоптоза.

10,00i 8,006,00' 4,00Ц 2,00 0,00

тимус

сердце

Рис 86. Различия в синтезе Н8Р70 в разных тканях Диаграмма, показывающая уровень Н?Р70 (данные представлены в виде относительных денситометрических единиц)

1 кошро 1Ь 2 - курсовое вветение кверцешна 3 адаптация. 4 - адаптация на фоне курсового введения кверцетина,

Роль оксида азота (N0) в антиапоптотическом эффекте адаптации к теплу.

N0, как и НБР 70 играет важную роль в формировании защитного эффекта адаптации (Манухина Е.Б , МалышевИ Ю., 2000).

800 700 600 500 400 300 200 100 0

ТШ

L 10

L10 + ТШ

п

L 30

L30+ L100 L100 + ТШ ТШ

Рис 9 Влияние различных доз 1-NNA на активность каспазы 3 К - контроль. Till 1 еп ювой шок. 1 К) инъекция 1 -NNА в дозе 10 мг кг. 1 40 инъекция L-NNA в юзе 30 мг/кг L100 - инъекция L-NNA в дозе 100 mi 'кг I 10+ МП инъекция L-NNA в дозе 10 мг/кг за 1 час до тетового шока I 30 Т1П-иньекния L-NNA в дозе 30 мг/кг за 1 час ло тепповот шока. I 100+ГШ- инъекция L-NNA в дозе 100 мг/кг за 1 час до теплового шока *- р < 0.05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению тепловым шоком

На рис. 9 представлены данные о влиянии однократного введения различных доз ЫчГЫА на индуцированную тепловым шоком активность каспазы 3 Сами по себе дозы 10, 30 и 100 мг/кг вызывали

недостоверное усиление активности каспазы 3 При введении Ь-ЫТЧА за 1 час до теплового шока доза И^ПМА 10 мг/кг оказала защитное действие, снизив индуцированную тепловым шоком активность каспазы 3 до 220-!. 15,01 % (р 0,001); инъекция ингибитора N0 синтазы в дозах 30 и 100 мг'кг потенцировала индуцированную тепловым шоком активность каспазы 3 на 247 % и 160 % соответственно ( р < 0,001)

Таким образом, однократные инъекции различных доз Ь-1ЧЫА показывают, что сам по себе N0 может проявлять как анти- так и проапоптотические свойства. Из полученных данных можно сделать вывод, что небольшие дозы N0 защищают организм от индуцированного тепловым шоком апоптоза. а гиперпродукция также как и полное ингибирование синтеза N0, вызывает значительное усиление апоптоза в тимусе

Влияние курсового введения ингибитора N0 - синтазы на активность каспазы 3 в тимусе

Адаптация к теплу стимулирует синтез N0 в организме, что проявляется в постепенном увеличении концентрации нитритов и нитратов в плазме крови и моче крыс. Одновременно в стенке кровеносных сосудов происходит формирование и нарастание в объеме депо N0 (Манухина Е.Б. 2000). На рисунке 10 показано, что в процессе адаптации к теплу происходит достоверное накопление продуктов метаболизма N0 нитратов/нитритов с 54,3±3 25 мкМ у контрольных животных до 73,75±6.54 мкМ у адаптированных.

Рис 10. Влияние на содержание нитратов/нитритов в

плазме К - контроль Ад - адаптация. Ь - курсовое введение кверцетина. Лд И. адаптация на фоне курсового введения кверцетина *- р < 0.05 по сравнению с контролем #- р < 0,05 по сравнению с адаптацией

Введение ингибитора синтеза оксида азота снизило содержание продукции нитратов нитритов у контрольных крыс до 39,4±5.31 мкМ, а у адаптированных крыс до 47,9+4.11 мкМ (р ^ 0,05)

Вместе с тем, известно, что N0 вовлечен в синтез Н8Р 70 (Малышев И Ю 1998) В процессе адаптации происходило накопление белков теплового шока Инъекции L-NNA снизили содержание НБР 70 как у контрольных, так и у адаптированных животных( рис 11)

Из данных приведенных на рисунке 12 видно, что курсовое введение иш ибитора сишеза N0 животным привотило к достоверном) (р 0,05) снижению уровня активности каспазы 3 до 87,4+5,40 % у животных получивших Ь-№М. Введение ингибитора сишеза N0 в процессе адаптации также снизило активность каспазы 3 до 77,5 % (адаптация + Ь-ЫЫА). В группе животных подвергнутых тепловому шоку инъекции Ь-^А снизили активность каспазы 3 с 405 1 % но 308,4 % В группе животных адаптированных к теплу и подвергну 1ых действию тепловою шока инъекции ингибитора синтеза N0 повысили уровень активности каспазы 3 с 101,4 % до 176,3 % а)

12 3 4 5 6 7 8

Рис 11 Влияние Ь-ЫЫА на синтез 11ЧР70 в шмчсс

а)- Репрезентативная э тектрофореграмча накоп 1ения Ь^Р70 втимчее

крыс.

1 - контроль 2 курсовое введение Ь-ЫЫА 3 - адаптация. 4 адаптация на фоне курсового вве тения 1,-№4А. 5 - гепповой шок 6 - курсовое вве шние I -

NNA + теп ювой шок, 7 - адаптация + тепловой шок. 8 -адаптация на фоне курсового введения L-NNA + тепловой шок

б) - Диаграмма, показывающая уровень HSP70 в тимусе крыс ТШ - тепловой шок. Ад + Till - адаптация + тепловой шок *- р < 0,05 по сравнению с животными, не получавшими L-NNA

700 600 500 400 300 200 100 0

%

□ без L NNA 01 NNA

К

ТШ

Ад

Ад + ТШ

Рис 12 Влияние Ь-ЫКА на активность каспазы 3 в тимусе

Обозначения как на рис 11

*-р ^ 0,05 по сравнению с животными, не получавшими Ь-1ЧЫА

Таким образом, ингибитор синтеза N0 Ь-КЫА приводит к снижению синтеза Н8Р 70 в процессе адаптации, в результате частично снижается антиапоптотический эффект адаптации к теплу. Более низкий уровень апоптоза после теплового шока у крыс, получавших в ходе

адаптации, по сравнению с контрольными крысами, объясняется тем, что Ь-№М ограничивает гиперпродукцию N0. Это свидетельствует о том, что N0 участвует в антиапоптотическом эффекте адаптации к теплу не только косвенно (посредством регуляции синтеза НБР 70), но и напрямую

Влияние адаптации к теплу на апоптоз в тимусе, индуцированный ЛПС и эмоциональным стрессом. (Перекрестный эффект адаптации)

140 120 100 80 60 40 20 0

ЛПС

#

S-

Ад Ад + ЛПС

Рис 13 Влияние аыптации к тет\ на ЛПС-индуцированную активность каспазы 3

К - контроль. Ад - адаптация ЛГ1С - инъекция липополисахарида. Ад+ЛПС -инъекция липополисахарида после 6-1И дневною курса адаптации к теплу За 100% - показатели в контроле

*- р <" 0.05 по сравнению с контролем #- р < 0.05 по сравнению с Л ПС

Известно, что адаптация к одному фактору способна защитить орган иди целый организм от повреждающего действия другого фактора Для выявления возможности защиты адаптации к теплу от апоптоза, индуцированного различными факторами среды нами было изучено влияние адаптации к теплу на апоптоз, индуцированный Л ПС (рис 13) и различными видами эмоционального стресса (рис 14)

Из данных представленных на рис 13 видно, что введение животным ЛПС вызывало индукцию активности каспазы 3 в тимусе по сравнению с контролем на 29,3 % Предварительная адаптация к теплу снижала индуцированную ЛПС активацию каспазы 3 до контрольных значений.

160 140 120 100 80 60 40 20 0

а) %

Ст

В)

* гЭг!

30> 250 200 150 100 50 0

#

г-Ь

б)

140 120 100 80 60 40 20 0

Ад Ад+ст

60 мин СПК

30 мин СПК

#

Ст

Ад Ад+ст

Ст

Ад

Ад+ст

Рис 14 Втияние адаптации к теплу на индуцированную эмоциональным стрессом активность каспазы 3

а) иммобилизационный стресс 60 мин б) водно-иммерсионный стресс 30 мин в) водно-иммерсионный стресс 60 мин

К - контроль. Ад - адаптация к теплу. Ст - стресс, Ад+ ст - стресс после адаптации

*- р ^ 0.05 по сравнению с контролем. # - р < 0,05 по сравнению со

стрессом

На рис 14 показано, что рашичные виды стрессорных воздействий вызывают активацию каспазы 3 на 26,2 %, 23,9 % и 103 % (р ' 0.05) соответственно

Предварительная адаптация к теплу не защищает тимус от индуцированной всеми тремя видами стресса активации каспазы 3. а напротив вызывает потенцирование активности каспазы 3 Для иммобилизационною 1 часового стресс до 140,8 % (р < 0 05), свободное плавание в клетке 30 минут до 131.7 % (р ^ 0 05), свободное плавание в клетке 60 минут до 254,8 % (р < 0.05)

Таким образом, адаптация к теплу обладает перекрестным эффектом Она может защитить организм от апоптоза, вызванного бактериальной инфекцией Но не защищает от апоптоза, индуцированного эмоциональным стрессом и даже может привести к его потенцированию

Генетическая детерминированность защитных эффектов адаптации к теплу

Ранее было показано, что животные разных генетических линий по-разному реагируют на адаптацию и последующие стрессорные воздействия (Devries A.C., et al., 1997;)

На рисунке 15 представлены данные о влиянии адаптации к теплу на индуцированную эмоциональным стрессом активность каспазы 3 у крыс линии Вистар и Август Видно, что у крыс Август стресс активировал каспазу 3 более активно - на 117.3 %, в то время как у крыс Вистар - на 23,9 % Причиной этого явления может служить то обстоятельство, что у крыс линии Август, по сравнению с крысами линии Вистар, наблюдается более высокий уровень продукции оксида азота, как в покое, так и в ответ на стрессорное воздействие

Рис 15 Влияние адаптации к теплу на индуцированный эмоциональным стрессом апотоз в тимусе у крыс разных линий

К - контро ib A i - а шпация к ien i\ Ст - сгресс Ад+ и - стресс после алал гации

*- р ^ 0.05 по сравнению с контролем # - р ^ 0.05 по сравнению со стрессом

Показано также, что у крыс линии Август содержание метаболитов оксида азота нитратов и нитритов после эмоционального стресса было в два раза больше, чем у крыс линии Вистар (Пшенникова М.Г., 2000)

Предварительная адаптация к теплу у крыс Вистар потенцировала активность каспазы 3 при стрессе, а у крыс Август предварительная адаптация снизижала активность каспазы 3 до контрольного уровня (98,1 %) Можно предположить, что данный эффект связан с ограничением у адаптированных крыс Август продукции оксида азота при стрессе Действительно, имеются данные, показывающие, что в ходе адаптации у крыс линии Август формируется мощная система защиты организма от избытка оксида азота за счет его депонирования (Пшенникова М Г и др., 2002).

ВЫВОДЫ

1 Предварительная адаптация к теплу снижает гибель животных, как во время, так и в последующие 24 ч после теплового шока, защищает от падения артериального давления и ограничивает вызванное тепловым шоком снижение массы тимуса.

2 При тепловом шоке у крыс Вистар в тимусе происходит индукция как инициаторных каспаз 8 и 9. гак и эффекторных каспаз 3 и 6 При этом, тепловой шок в большей степени активирует каспазу 9, опосредующую митохондрия-зависимый путь активации апоптоза, а среди эффекторных - каспазу 3.

3 Предварительная адаптация крыс Вистар к теплу в равной степени ограничивает индуцированную тепловым шоком активность инициаюрных (8 и 9) и эффекторных (3 и 6) каспаз

4 Ингибитор синтеза белков теплового шока НБР70 кверцетин увеличивает индуцированную тепловым шоком активность эффекторной каспазы 3 в тимусе адаптированных крыс Вистар Это указывает на важную роль, которую играют Н8Р70 в антиапоптотических механизмах адаптации к теплу.

5 Ингибитор синтеза N0 ограничивает синтез НБР70 и увеличивает индуцированную тепловым шоком активность каспазы 3 у адаптированных к теплу животных Следовательно, N0 вовлечен в механизмы антиапоптотического действия адаптации к теплу. При этом один из механизмов антиапоптотического действия N0 связан с активацией синтеза Н8Р70

6 Предварительная адаптация крыс Вистар к теплу снижает в тимусе активность каспазы 3, индуцированную липополисахаридом, но не влияет на увеличение активности каспазы 3 после эмоционального стресса. Таким образом, адаптация крыс Вистар к теплу обладает избирательным перекрестным антиапоптотическим эффектом.

7. При сопоставлении крыс линии Вистар с крысами линии Август показано, что адаптация крыс линии Август к теплу, в отличие от крыс линии Вистар, снижет активность каспазы 3, индуцированную эмоциональным стрессом. Таким образом, защитные эффекты адаптации к теплу при стресс-индуцированном апоптозе являются генетически детерминированными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Круглов C.B., Амелин В Г., Ларионов H П Редуктор нитратов // Официальный бюллетень Изобретения Полезные приспособления -№36 2000г. - [laieнт № 2161303 от 27 12.2000

2 Малышев И.Ю , Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф., Байда Л А , Бондаренко О.H , Монастырская Е.А , Круглов C.B., Манухина Е Б. Роль оксида азота в активации синтеза белков [еплового шока '/ Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека 2001 С 88-89.

3 Круглов C.B., Байда Л.А., Пшенникова M Г , Ларионов Н.П , Манухина Е.Б , Малышев И Ю Адаптация к теплу ограничивает стресс-индуцированную активность каспаз в тимусе <7 Бюл. эксперим биол и мед -2002 - U34-№10 -С 374-378

4 Kruglov S.B Adaptation of hypoxia prevents stress-induced caspase activation in the thymus of August but not Wistar rats // 7-th International ISAM Conference San Diego, California

5 Круглов C.B. Манухина E Б , Малышев И Ю. Адаптация крыс к теплу ограничивает апоптоз тимоцитов, индуцированный тепловым шоком // Материалы XI международного симпозиума Эколого-физиологические проблемы адаптации' - M - 2003. - С 288-289.

6 Круглов C.B., Ларионов Н.П , Малышев И Ю Участие стресс белков HSP 70 в адаптационной защите тимуса от апоптоза, индуцированного тепловым шоком. // Рос. Физиол. журн. им И.М. Сеченова. 2004. - Т. 90. №8 - С. 200-201.

7 Малышев И.Ю , Круглов C.B., Бахтина Л Ю., Малышева Е В., Зубин М., Норкин M Стресс-ответ и апоптоз в про - и антивоспалительном фенотипе макрофагов.//Бюл. эксперим. биол и мед.-2004 -T.I38.-№8.-С. 162-165.

8 Круглов C.B., Ларионов H П., Малышев И Ю. Роль белков теплового шока HSP 70 в защите тимуса от индуцированного апоптоза // Третий Российский конгресс по патофизиологии -М - 2004. - С. 154.

68 35

РНБ Русский фонд

2QQ6-4 12761

Актуальность проблемы

Исследования последних лет показали, что апоптозу принадлежит ключевая роль в реализации ряда физиологических процессов, особенно связанных с поддержанием клеточного гомеостаза и с развитием организма. Нарушение механизмов, участвующих в реализации или контроле апоптоза может стать причиной многих заболеваний. Эти заболевания могут быть обусловлены как ослаблением, так и усилением апоптоза. В случае нарушений, приводящих к ослаблению апоптоза, могут развиваться аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка. Ослабление апоптоза способствует также развитию злокачественных опухолей. С усилением апоптоза коррелируют такие заболевания как токсичные гепатиты, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, СПИД и др.

При изучении апоптоза было выявлено, что истощение и ускоренная инволюция лимфоидных органов при действии сильных или длительных стрессорных факторов происходит вследствие усиления апоптоза, вызванного этими факторами. В первую очередь это касается главного органа лимфотворения вилочковой железы. (Cohen J.J., 1992). В экспериментах показано, что к индукции апоптоза в тимусе приводят различные стрессоры, такие как иммобилизационный стресс (Hatanaka К., et al 2001.), сепсис ( Ayala A., et al 1996) и гипертермия ( Khan V.R. 2002).

Среди различных стрессорных факторов особое место занимает гипертермия. Повышение температуры может быть вызвано как внешними, например, при длительном нахождении организма в условиях повышенной температуры, так и внутренними факторами, например, при иммунной реакции, когда гипертермия опосредована деятельностью лимфоцитов. При этом с одной стороны, значительное повышение температуры, как и любой другой достаточно сильный стрессор, вызывает стресс-реакцию, увеличивает концентрацию кортикостероидов и катехоламинов в крови (Brenner I., 1998) и, как следствие, создает возможность развития апоптоза в органах иммунной системы. С другой стороны, гипертермия приводит к внутриклеточным повреждениям и в этом случае также способствует индукции апоптоза.

Для профилактики и коррекции стрессорных повреждений и заболеваний, имеющих в своей основе стрессорный компонент, используют адаптацию к различным факторам окружающей среды. Например, адаптацию к периодической гипобарической гипоксии используют для профилактики и лечения патологических состояний, в патогенезе которых присутствует стрессорный компонент. К таким заболеваниям относятся нарушения функции иммунной системы, неврозы, гипертоническая болезнь, параноидальные формы шизофрении и др. (Меерсон Ф.З. и др. 1989; Меерсон Ф.З. 1993; Пшенникова М.Г., 2001). В ряде экспериментальных работ применяли тепловое прекондиционирование (Bolli , 2000) и адаптацию организма к стрессу (Meerson F., et al., 1989).

Исследования последних лет показали, что защитные эффекты адаптации связаны с синтезом защитных стресс-белков группы HSPs (Beckmann R.P., et al., 1990; Malyshev I. et al., 1996). Первоначально считали, что накопление HSPs приводит к повышению теплоустойчивости организма. Однако позднее были получены доказательства того, что HSPs повышают устойчивость организма к различным стрессам: гипоксии, действию тяжелых металлов, оксидативному стрессу, компоненты бактериальных клеток и вирусов и т.д. (Jäättelä M., 1992 Lepore et al., 2001). Главные молекулярные механизмы защитного действия HSPs состоят в дезагрегации аномальных белковых комплексов, утилизации и репарации поврежденных белков, регуляции синтеза белка de novo (Welch D., 1988; Hightower et al., 1994). Важную роль в формировании адаптационной защиты играет оксид азота (NO) (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998). Механизмы действия NO включают антиоксидантное (Siow N. et al., 1999), противовоспалительное действие (Lamas S. et al., 1998) и эффекты, опосредованные продукцией цГМФ (Du Toit et al., 1998). Кроме того, NO способен активировать синтез защитных стрессбелков группы I ISPs (Häuser G.J., et al., 1996; Kim Y.-M., et al., 1999b; Malyshev I. et al., 2000).

И звестно что, I ISP 70 способны регулировать апоптоз, обладая антиапоптотическим действием (Lang et al., 2002; Klein F., Brune, 2002). NO также может выступать в качестве фактора, регулирующего апоптоз. NO в малых и физиологических концентрациях проявляет антиапоптотическое действие (Kim Y. et al., 1999), в больших же дозах оксид азота приводит к индукции апоптоза (Murphy М., 1999.; Dimmeier S., 1997).

Таким образом, имеющиеся данные наводят на мысль о возможности антиапоптотического действия адаптации и участии в этом процессе I ISPs и

NO, так как оба эти вещества синтезируются в процессе адаптации к разным « факторам (Меерсон Ф.З. и др., 1994; Манухина Е.Б. и др., 1996; Kuroshima, 1995; Meerson F., Malyshev I., 1993) и в тоже время способны регулировать апоптоз. Вместе с тем влияние адаптации на ключевой механизм апоптоза -каскадную активацию каспаз — не изучалось. Соответственно, возможность потенциально эффективного использования адаптации для предупреждения и коррекции стресс-индуцированных нарушений иммунологических функций тимуса не оценивалось.

В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности адаптационной защиты клеток тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза и исследовании молекулярных механизмов, вовлеченных в развитие такой защиты.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Изучить пути активации апоптоза при тепловом шоке.

2. Изучить влияние адаптации к теплу на индуцированный тепловым шоком апоптоз в тимусе.

3. Изучить роль белков теплового шока в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки f влияния адаптации на синтез Hsp70 и влияния ингибитора синтеза I ISPs на развитие защитных эффектов адаптации

4. Изучить роль N0 в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез N0 и влияния ингибитора N0-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации

5. Оценить возможность перекрестного антиапоптотического эффекта адаптации к теплу при сепсис и стресс - индуцированном апоптозе в тимусе.

6. Выявить генетическую детерминированность эффекта адаптации к теплу.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Тепловой шок приводит к активации эффекторных каспаз 3 и 6 и инициаторных каспаз 8 и 9 в клетках тимуса. При этом активность каспазы 9, вызванная тепловым шоком, выше, чем активность каспазы 8. Это свидетельствует о том, что апоптоз, индуцированный тепловым шоком, развивается в большей степени по митохондриальному пути, чем по рецептор зависимому пути.

Впервые показано, что дозированная адаптация крыс к теплу защищает клетки тимуса от индуцированного тепловым шоком апоптоза. Защитный эффект проявляется в снижении уровня активности инициаторных и эффекторных каспаз.

Впервые показано, что накопление Нзр70 в клетках тимуса в процессе адаптации сопровождается снижением активности каспаз 3, 8 ^9,

V ( индуцированной тепловым шоком. Введение ингибитора синтеза белков теплового шока приводит к устранению адаптационного накопления 11зр70 и потенцированию активности эффекторной каспазы 3 и инициаторной каспазы 9, но не каспаз 8 индуцированной тепловым шоком.

Впервые доказано, что N0 вносит вклад в формирование защитного эффекта адаптации к теплу. При этом ограничение активности эффекторных каспаз происходит как за счет действия самого N0, так и за счет активации механизмов, связанных с накоплением ШР 70. Это подтверждается тем, что ингибитор 1ЧО-синтазы, ограничивая гиперпродукцию N0, уменьшает активность каспазы 3 при тепловом шоке. Вместе с тем ингибитор N0-синтазы отменяет эффект адаптивного ограничения индукции Н5Р70 и адаптационное ограничение индуцированной тепловым шоком активности каспазы 3. Впервые показано, что адаптация к теплу ограничивает индуцированную эмоциональным стрессом и липополисахаридом (ЛПС) активность каспазы 3.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ней впервые продемонстрирована возможность формирования адаптационной защиты клеток тимуса от повреждающих воздействий стрессоров. Продемонстрирована избирательность пути активации апоптоза при действии на организм гипертермии. Раскрыта роль N0 и ШР 70 в защитных эффектах адаптации клеток тимуса от апоптоза индуцированного тепловым шоком. Доказано, что адаптация к теплу обладает перекрестным антиапоптотическим эффектом.

Практическое значение работы состоит в том, что в ней продемонстрирована возможность предупреждения гибели клеток иммунной системы с помощью адаптации к теплу. Это позволяет обосновать возможность применения адаптации к теплу при заболеваниях, связанных с вторичными иммунодефицитами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Индукция апоптоза в тимусе при тепловом шоке развивается преимущественно по митохондрий-зависимому пути.

2. Адаптация организма к теплу эффективно защищает тимус от апоптоза, индуцированного тепловым шоком.

3. Молекулярные механизмы адаптации, опосредованные действием НБР и N0, вовлечены в антиапоптотический эффект адаптации к теплу.

4. Адаптация к теплу обладает перекрестным эффектом, защищая от апоптоза вызванного другими стрессорными факторами.

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований были доложены на межлабораторном семинаре Отдела адаптационной медицины НИИ ОПП (Москва, 2004), II международной научно-практической конференции «Дисфункции эндотелия» (Витебск, 2001), на XXI международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва,2003), 7-м международном конгрессе Международного общества адаптационной медицины (Сан Диего, США, 2003).

выводы

1. Предварительная адаптация к теплу снижает гибель животных, как во время, так и в последующие 24 ч после теплового шока, защищает от падения артериального давления и ограничивает вызванное тепловым шоком снижение массы тимуса.

2. При тепловом шоке у крыс Вистар в тимусе происходит индукция как инициаторных каспаз 8 и 9, так и эффекторных каспаз 3 и 6. При этом, тепловой шок в большей степени активирует каспазу 9, опосредующую митохондрия-зависимый путь активации апоптоза, а среди эффекторных — каспазу 3.

3. Предварительная адаптация крыс Вистар к теплу в равной степени ограничивает индуцированную тепловым шоком активность инициаторных (8 и 9) и эффекторных (3 и 6) каспаз.

4. Ингибитор синтеза белков теплового шока Н$Р70 кверцетин увеличивает индуцированную тепловым шоком активность эффекторной каспазы 3 в тимусе адаптированных крыс Вистар. Это указывает на важную роль, которую играют Н$Р70 в антиапоптотических механизмах адаптации к теплу.

5. Ингибитор синтеза N0 Ь-ЫЫА ограничивает синтез Н5Р70 и увеличивает индуцированную тепловым шоком активность каспазы 3 у адаптированных к теплу животных. Следовательно, N0 вовлечен в механизмы антиапоптотического действия адаптации к теплу. При этом один из механизмов антиапоптотического действия N0 связан с активацией синтеза П5Р70.

6. Предварительная адаптация крыс Вистар к теплу снижает в тимусе активность каспазы 3, индуцированную липополисахаридом, но не влияет на увеличение активности каспазы 3 после эмоционального стресса. Таким образом, адаптация крыс Вистар к теплу обладает избирательным перекрестным антиапоптотическим эффектом.

7. При сопоставлении крыс линии Вистар с крысами линии Август показано, что адаптация крыс линии Август к теплу, в отличие от крыс линии Вистар, снижет активность каспазы 3, индуцированную эмоциональным стрессом. Таким образом, защитные эффекты адаптации к теплу при стресс-индуцированном апоптозе являются генетически детерминированными.

Заключение

Таким образом, в настоящее время, широко продемонстрировано повреждающее действие гипертермии на иммунную систему, особенно на главный орган лимфопоэза - тимус, посредством активации апоптоза. Для повышения устойчивости организма к острому тепловому воздействию применяют предварительную адаптацию к неповреждающим тепловым воздействиям. Однако возможность адаптационной защиты тимуса при индукции тепловым шоком апоптоза в его клетках до настоящего момента не изучалась, также как не изучалось влияние адаптации на ключевой механизм апоптоза - каскадную активацию каспаз. Соответственно, возможность потенциально эффективного использования адаптации для предупреждения и коррекции иммунологических стресс-индуцированных нарушений не оценивалась. Для изучения такой возможности, необходима разработка адекватной модели адаптации к теплу с последующим анализом влияния такой адаптации на способность организма противостоять апоптотической гибели тимоцитов.

Известно, что в процессе реализации апоптотической программы важную роль играют N0 и IISPs. Вместе с тем NO и I ISPs являются основными медиаторами развития адаптационной защиты в условиях организма, в частности при адаптации к теплу (Malyshev et al., 2000), это косвенно подтверждает возможность антиапоптотического действия адаптации. Однако для докозательства этого предположения необходимо изучить влияния адаптации к теплу на синтез N0 и IISPs и участие этих агентов в развитии защитного эффекта адаптации.

В связи со всем этим были определены следующие задачи работы:

1. Изучить пути активации апоптоза при тепловом шоке.

2. Изучить влияние адаптации к теплу на индуцированный тепловым шоком апоптоз в тимусе.

3. Изучить роль белков теплового шока в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез Hsp70 и влияния ингибитора синтеза I ISPs на развитие защитных эффектов адаптации

4. Изучить роль N0 в молекулярных механизмах антиапоптотического эффекта адаптации к теплу путем оценки влияния адаптации на синтез N0 и влияния ингибитора N0-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации

5. Оценить возможность перекрестного антиапоптотического эффекта адаптации к теплу при сепсис и стресс индуцированном апоптозе в тимусе.

6. Выявить генетическую детерминированность эффекта адаптации к теплу.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ