Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Виктория Олеговна

ГЕРОПРОТЕКТОРНОЕ И РЕГУЛЯТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ НА КЛЕТКИ ТИМУСА

14.00.53 - геронтология и гериатрия

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском институте биорегуляции я геронтологии Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор биологических наук Степанов Михаил Григорьевич

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 2003 г. в а часов на заседании

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр.Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр.Динамо, 3).

Автореферат разослан

¿>4

■^А^- 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [Goya R.G., Bolognani F., 1999]. Инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой нейропептидов, цитокинов и гормонов, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов [Ярилин A.A., 1999]. Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса [Berthiaume F., Aparicio C.L., 1999]. Поиск и исследование пептидов с высокой биологической активностью, способных регулировать и восстанавливать адаптационные реакции организма является приоритетным направлением современной биологии.

Участие нейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения. На основе аминокислотного анализа природных препаратов тимуса и эпифиза в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН были сконструированы синтетические пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами [Морозов В.Г. и др.,

Сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволит более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать подходы к пептидергической регуляции иммунных и эндокринных функций железы в процессе старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие пептидов на дифференцировку тимоцитов;

2. исследовать влияние вилона и эпиталона на пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов;

3. определить эффекты действия вилона и эпиталона на экспрессию маркеров

2000].

активации и на секреторную активность эпите

библиотека

ггербург V »

ЗДО3 »w /j

4. оценить влияние пептидов на синтез внутриклеточных цитокинов;

5. изучить влияние пептидов на пролиферативный потенциал ТЭК при старении культур;

6. изучить функциональную морфологию тимуса крыс в радиационной модели ускоренного старений;

7. оценить геропротекторпые свойства изучаемых пептидов - вилона и эпиталона.

Научная новизна работы

В работе впервые получены данные о роли пептидов (вилона и эпиталона) в регуляции функций эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов при старении. Установлены внутриклеточные пептидергические механизмы, участвующие в процессах пролиферации, дифференцировки и старения клеток тимуса. Проведен анализ морфо-функциональных изменений в тимусе при ускоренном старении. Выявлено 1еропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона по отношению к клеткам тимуса.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить представления о влиянии пептидов на развитие и функционирование клеток иммунной системы, в первую очередь Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса. Установленное геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона на клетки тимуса открывают перспективы для детального изучения возможности применения пептидов в гериатрической практике для коррекции функций, нарушенных при старении организма.

Положения выносимые на защиту

1. Вилон и эпиталон обладают регуляторным действием на клетки тимуса in vitro, изменяя экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR, CD69 на их поверхности.

2. Вилон и эпиталон проявляют геропротекторные свойства при старении культур клеток тимуса человека, ослабляя апоптоз и усиливая пролиферацию ТЭК.

3. Вилон стимулирует репаративные процессы в тимусе крыс при ускоренном (радиационном) старении.

4. Вилон и эпиталон могут рассматриваться как потенциальные иммуно- и геропротекторы.

Связь с научно - исследовательской работой Института

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли пептидов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Главы 3-6 представляют собственные экспериментальные данные изучения эффектов действия пептидов на ТЭК, тимоциты, периферические Т-лимфоциты и на структурно-функциональную организацию тимуса в модели преждевременного старения in vivo. В главе 7 обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 119 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 129 источников, из которых отечественных - 82.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на Четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001); II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы коррекционной психологии, психотерапии, медицины» (Санкт-Петербург, 2001); Пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2002); второй научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); Седьмой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2002).

Результаты диссертации используются в научно-практической работе в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургском Государственном университете, Санкт-Петербургской академии последипломного образования МЗ РФ. Исследования, проводимые в рамках диссертационной работы поддержаны грантом РФФИ 02-04-49873 и 1рантом для студентов, аспирантов и молодых специалистов Администрации Санкт-Петербурга и Российской академии наук в 2002 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO

Исследования in vitro проводились в культуре клеток тимуса и мононуклеаров периферической крови человека. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса эмбрионов человека около 20-недельного срока развития, полученных из абортного материала. В качестве тимусных эпителиальных клегок (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S, ранее полученной путем трансформации ТЭК эмбрионального тимуса человека материалом, содержащим вирус SV40 и последующего клонирования трансформированных клеток в отделе клеточной иммунологии ГНЦ - Института иммунологии МЗ РФ. Автор выражает глубокую благодарность руководителю отдела профессору A.A. Ярилину за консультацию и помощь при проведении экспериментов in vitro. Мононуклеары выделяли из венозной крови доноров общепринятым методом (центрифугированием над слоем фиколла-верографина).

Клетки тимуса культивировали 1 сутки, а мононуклеары крови 3 суток как без стимуляции, так и в условиях стимуляции. Для этого тимоциты и ТЭК культивировали не только порознь (в монокультурах), но и совместно (в ко-культурах с соотношением ТЭК:тимоциты, равном 1:10). Мононуклеары стимулировали митогеном ФГА. который избирательно стимулирует Т-лимфоциты. Пептиды (вилон и эпиталон) вводили в культуры в концентрациях 2,20 и 200 нг/мл.

Пролиферацию оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина. Проточную цитофлуорометрию осуществляли на1 проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). Апоптоз оценивали Цитофлуорометрически путем определения процента гиподиплоидных клеток с предварительной окраской фиксированных клеток йодидом пропидия. Экспрессию мембранных молекул (CD69, HLA-DR и CD54), которую использовали для оценки активации клеток, определяли с использованием набора моноклональных антител фирмы Caltag.

Секрецию тимулина и цитокинов оценивали путем определения содержания в кульгуральных супернатантах исследуемых субстанций методом ELISA с использованием тест - наборов фирмы «Протеивовый контур». Все пробы ставились в триплетах.

Аргирофильныс белки областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) выявляли в клетках с помощью нитрата серебра. Учитывая различную экспрессию аргирофильных белков ОЯОР в тимоцитах и эийтелиальных клетках тимуса было подобрано оптимальное время инкубации для выявления аргирофильных белков, которое составляло для тимоцитов 15 минут, а для эпителиальных клеток -10 минут.

Интенсивность экспрессии аргирофильных белков оценивали по количеству гранул серебра, образующихся в результате реакции. Для этого проводили морфомстрические исследования с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Nikon и лицензионной программы Videotest. Подсчет гранул проводили в 100 клетках при увеличении хЮОО и рассчитывали среднее число гранул серебра на I ядро тимоцита и эпителиальной клетки, определяя среднее количество гранул в каждой исследованной группе. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistika 5.0 (Statsofl).

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

Эксперименты in vivo выполнены на 40 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 2-х месяцев, имеющих массу тела 180-200 г. Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания. Для моделирования преждевременного старения использовали гамма-облучение, на аппарате ЛУЧ-1 (источник 60Со; мощность дозы 17,166x1o"4 Гр/с). Животные получали ежедневную дозу 6 Гр в течение 5 дней. Все животные были разделены на 8 групп (табл. 1): 1 и 1а интактные крысы; 2 и 2а - облученные крысы; 3 и За - облученные животные, которым вводился вилон; 4 и 4а - крысы, которым вводился вилон (без облучения). Вилон вводили через 24 часа после первого сеанса облучения по 0,5 мкг (в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 10 дней подкожно животным 3, За, 4, 4а групп. Животным 2 и 2а групп вводилось эквивалентное количество физиологического раствора по той же схеме.

Эвтаназию животных проводили с соблюдением общепринятых правил. Забой животных и выделение тимуса проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Тимус у животных 1-4 групп брали на 14 сутки от начала эксперимента, а у 1а-4а групп - на 21 сутки от начала эксперимента. Автор выражает глубокую благодарность кандидату медицинских наук В.В. Южакову за методическую помощь при проведении облучения животных.

Распределение животных по группам и срокам взятия материала

Группы Сроки эксперимента Всего животных

14 сутки от начала эксперимента 21 сутки от начала эксперимента

1 - контроль 5 - 5

1а-контроль - 5 5

2 - облучение + физ. р-р 5 - 5

2а - облучение + физ. р-р - 5 5

3 - облучение + вилон 5 : 5

За - облучение + вилон - 5 5

4 - введение вилона 5 - 5

4а - введение вилона - 5 5

Для свето-микроскопических исследований кусочки тимуса фиксировали в течение 24 ч в кислой жидкости Буэпа. Обезвоживание материала и заливка в парафин проводились по общепринятым методикам. Парафиновые срезы (7 мкм) помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma). Общегистологическое и иммуногистохимическое изучение проводили с использованием микроскопа Jenamed-2 (Zeiss). Обзорную окраску препаратов осуществляли гематоксилином - эозином. Тучные клетки селективно окрашивали 1% раствором толуидинового синего (Fluka) в 0,5М HCl при pH 0,5.

Для электронной микроскопии кусочки тимуса фиксировали по Карновскому. Обезвоживание материала и заливку в смесь эпонов проводили по общепринятым методикам. Ультратонкие срезы (100 нм), приготовленные на ультрамикротоме LKB-7A (LKB) контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. Электронно-микроскопическое исследование осуществляли в электронном микроскопе JEM-1 OOS (Jeol).

Для изучения пролиферативной активности клеток использовали мышиные моноклональные антитела к пролиферативному клеточному ядерному антигену

(proliferative cell nuclear antigen - PCNA, клон PC10, Calbiochem, титр 1:50). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили авидин-биотин-пероксидазным методом с использованием набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (ABP-kit, Vectastain).

Морфометрические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений Imstar с применением пакета лицензионных программ Morphostar и Colquant-2, согласно основным принципам стереологии и морфометрии. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 10 визуальных полях зрения по трем срезам. Тестовая площадь включала не менее 10000 ядер тимоцитов. Тучные клетки в тимусе измеряли на площади не менее 5 мм2. Индекс пролиферативной активности (I pcna) вычисляли по формуле:

Ipcna(%)-N pcna/N ядер х 100 Для статистической обработки полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манн-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса (ТЭК)

Экспрессия маркеров активации

Проведенные исследования показали разнонаправленное действие пептидов на экспрессию СБ69 с одной стороны и НЬА- ВЯ и С054 - с другой. В отношении С054 и Ш..А-1Ж проявлялся сходный эффект вилона и эпиталона, состоящий в подавлении экспрессии этих маркеров активации (табл. 2). По отношению к обоим маркерам эффект вилона был выражен сильнее, чем эпиталона. В то же время направленность действия вилона и эпиталона на экспрессию раннего активационного антигена С069 на ТЭК противоположна: вилон усиливает, а эпиталон подавляет ее. Эффекты действия пептидов зависят от дозы, дозовые кривые реципрокны друг другу.

Влияние вилона и эпиталона на экспрессию молекул активации на поверхности тимоцитов и ТЭК1

Пептид Доза, нг/мл 'Гимоциты ТЭК

С069 СБ54 НЬД-РЯ СР69 С054 НЬД-ОЯ

Контроль 0 43,6±7,5 36,2±2,7 34,2*5,0 7,2+0,6 92,2±10,5 74,3+9,7

Вилон 2 36,5+6,2 69,3+3,9* 36,3±4,3 11,5+0,9 69,8+7,5 42,5+6,5*

20 38,9±4,9 64,4+2,9* 38,6+6,1 15,3*1,1» 70,9+9,2* 41,5+7,2*

200 38,5±5,7 52,7+5,2* 41,4+2,7 10,2±0,6 67,5+8,7* 29,9+3,6*

Эпиталон 2 43,0±3,8 52,8+4,3* 43,3+3,5 5,2+1,1 79,9*11,6 50,6+8,2*

20 37,7+6,1* 51,4±4,2* 52,5+4,5* 1,5±0,07* 84,0+17,5 51,8+7,8*

200 38,5+6,0 46,5+3,7* 44,0±5,1 1,8±0,09* 72,9+15,6* 48,9+9,1*

1 Представлены процентное содержание клеток, несущих указанные маркеры. В скобках представлены данные о влиянии пептидов на экспрессию С069 на тимоцитах в их совместной куль+уре с ТЭК.

*- различия достоверно отличаются от контроля (р< 0,05)

Секреторная функция

Обнаружено,' что вилон и эпиталон не влияют на спонтанную выработку тимулина, но полностью отменяют ее усиление, вызванное контактом ТЭК с тимоцитами.

Напротив, оба пептида существенно усиливают выработку ИЛ-1Р и ИЛ-7 в монокультуре ТЭК (рис. 1): При анализе секреции этих цитокинов в ко-культуре ТЭК и тимоцитов, было выявлено, что ингибирующее действие в этих системах проявлял лишь эпиталон.

а)

5Е *

а <в

а. х

Ь о.

X ф

а с

=г >.

I о

о. «

б)

0,4

0,3

0,2

0,1

-г-

I

Спонтанная

Индуцированная

с ь

>ч I

5 „-

г >•

I

Спонтанная

Индуцированная

□ Контроль 0 Вилон ■ Эпиталон

Рис 1 ВлияниепептидовнасекрециюИЛ-1Р(а)иИЛ-7 (б)-спонтанную (в

монокультуре ТЭК) и индуцированную (в ко-культуре ТЭК и тимоцитов). * - различия достоверно отличаются от контроля (р<0, 05)

Пролиферативная активность при старении культур

Оценивали пролиферацию ТЭК, прошедших 1, 4 и 7 пассажей (табл. 3) в присутствии пептидов и без них. Существенного влияния на включение метки в 1-суточные культуры ТЭК 1-го и 4-го пассажей не наблюдалось. При действии эпиталона на пролиферацию ТЭК 7-го пассажа тенденция к усилению пролиферации была зарегистрирована при дозах эпиталона 20 нг/мл.

Таблица 3

Влияние пептидов на пролиферацию ТЭК, подвергшихся 1,4 и 7 пассажам

Пептид Доза, нг/мл 1 пассаж 4 пассаж 7 пассаж

Контроль 0 1560193 715+54 523+32

2 1480+89 730154 705146*

Вилон 20 1585+95 680148 680±41*

200 1530191 760158 795±49*

2 1540193 695148 653±39*

Эпиталон 20 1674198 675145 614+35*

200 1525190 710152 538±34

* - различия достоверно отличаются от контроля (р<0,05)

В то же время, все три испытанные дозы вилона (2, 20, 200 нг/мл) существенно усиливали пролиферацию ТЭК, особенно в 7 пассаже, причем наиболее выраженным был эффект вилона в дозе 200 нг/мл. Полученные данные свидетельствуют, как о способности вилона усиливать пролиферацию ТЭК в старых культурах, так и о тканеспецифичности эффекта пептидов.

Экспрессия белков ядрышковых организаторов

В ТЭК контрольных препаратов при инкубации в растворе серебра в течение 10 мину! среднее число аргирофильных гранул на 1 ядро составляло 22,7±0,47. При инкубации препаратов в течение 15 мин реакция в ТЭК была более интенсивная и гранулы серебра в ядрах эпителиальных клеток сливались в отдельные глыбки.

При действии всех концентраций вилона в эпителиальных клетках наблюдалось повышение содержания гранул серебра. При этом наибольшие изменения отмечались при концентрации вилона 20 нг/мл и 200 нг/мл. При концентрации вилона 2 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 24,9±0,41, что достоверно превышало контрольные значения на 9,6% (Р<0,01). При концентрации вилона 20 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро составляло 27,8±0,91, а при

концентрации 200 нг/мл - 28,8+0,59 гранул на 1 ядро. Эта* показатели достоверно превышали контрот>ные значения соответственно на 22% (Р<0,001) и 26% (Р<0,001). '

При действии эпиталона во всех концентрациях в ТЭК наблюдалось снижение количества гранул серебра. При концентрации эпиталона 2 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 20,5±0,51, что достоверно было ниже контрольных значений на 10% (Р<0,001). При концентрации эпиталона 20 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 20,7±0,51, а при концентрации 200 нг/мл - 20,9±0,56, что было достоверно ниже контрольных значений соответственно на 9,6% и 8,6% (Р<0,01 и Р<0,02 соответственно).

Действие вилона и эпиталона на тимоциты

Экспрессия маркеров активации на тимоцитах

Действие вилона и эпиталона на тимоциты было конкордатным. Оба пептида усиливали экспрессию на тимоцитах двух молекул активации - НЬА-ЛЖ и СБ54 и ослабляли экспрессию раннего активационного антигена С069. Действие вилона на экспрессию С1Э54 выражено сильнее, а его действие на СБ69 проявляется в более широком диапазоне доз. Наоборот, более выраженным эффектом на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости класса П, НЬА-ОЯ обладает эпиталон. При действии в ко-культуре тимоцитов и ТЭК вилон в дозе 200 нг/мл усиливает экспрессию СЕ>69 на тимоцитах.

Апоптоз тимоцитов

Вилон и эпиталон ослабляли апоптоз тимоцитов, индуцированный контактом с ТЭК. Наиболее выраженное антиапоптотическое действие проявил эпиталон в дозах 20 и 200 нг/мл.

Экспрессия белков ядрышковых организаторов

В контроле тимоциты представляли однородную популяцию клеток,

характеризующихся небольшими размерами и содержащих ядра с плотной структурой хроматина. В тимоцитах при инкубации в растворе серебра в течение 15 минут отмечалось невысокое содержание гранул серебра. В среднем число гранул на 1 ядро составляло 3,15±0,08. При инкубации в течение 10 мин реакция в тимоцитах практически отсутствовала.

При введении в культуральную среду вилона в концентрации 2 нг/мл существенных изменений со стороны тимоцитов зарегистрировано не было. В тимоцитах

13

отмечалось лишь незначительное повышение числа гранул серебра по сравнению с контрольными значениями. Среднее число гранул серебра на 1 ядро в этих условиях составляло 3,3±0,13, что недостоверно превышало контрольные значения на 4% (Р<0,5).

Увеличение в культуральной среде концентрации вилона до 20 и 200 нг/мл приводило к заметному повышению числа гранул серебра в тимоцитах. При концентрации вилона 20 нг/мл количество гранул серебра составляло в среднем 3,73+0,12 на 1 ядро; при концентрации 200 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро тимоцитов составляло 3,9310,10. Эти показатели досюверно превышали контрольные значения соответственно на 18% и 24% (Р<0,001).

Эпиталон подавлял экспрессию аргирофильных белков в тимоцитах. При этом действие препарата не зависело от его концентрации. Регистрируемые различия в содержании гранул серебра в тимоцитах в зависимости от концентрации эпитапона недостоверны (Р<0,5).

Действие вилона и эпиталона на периферические Т-лимфоциты

Пролиферация и апоптоз лимфоцитов

Вилон и эпиталон не оказывали значимого влияния ни на спонтанную, ни на индуцированную пролиферацию клеток. Отклонения от средних значений при использовании различных доз препаратов носили разнонаправленный характер. Отсутствие ко-стимулирующего эффекта пептидов, возможно, связано с использованием высоких концентраций ФГА (10 мкг/мл) для стимуляции Т-клеток.

Таблица 4

Влияние пептидов на пролиферацию и апоптоз лимфоцитов крови человека

Пептид Доза, нг/мл Пролиферация, имп/мин х10"3 Апоптоз, %

спонтанная индуцированная спонтанная индуцированная

Контроль 0 7,2+2,1 149,1+56,3 12,0+1,2 20,3+3,6

Вилон 2 8,5+2,6 144,5+48,0 11,6+1,1 17,9±2,2

20 7,813,0 156,5+62,3 12,2+1,3 16,0±2,1

200 8,0+2,7 153,5+54,7 13,9+1,5 21,1+3,4

Эпиталон 2 8,6+4,0 143,0+42,3 14,1+1,6 17,5+3,3 ,

20 6,5+4.1 140,1+46,2 14,4+0,9 27,6+3,8*

200 7,7+4,0 163,9+61,0 15.6И,3 22,3+3,0

* - значение достоверно отличное от контроля (р<0,05)

Пептиды не влияют на клеточный цикл покоящихся мононуклеаров. Значимые эффекты отсутствуют и в отношении ФГА активированных клеток, однако при высоких дозах обоих пептидов намечается тенденция к повышению доли клеток, находящихся в фазах G2/M. Хотя статистически значимого влияния пептидов на апоптоз стимулированных Т-клеток не отмечено (кроме эпиталона в дозе 20 нг/мл), при использовании этого пептида проявлялась четкая тенденция к усилению апоптоза мононуклеаров, как нестимулированных, так и стимулированных ФГА.

Внутриклеточный синтез цшпокинов

Изученные пептиды оказывают влияние на экспрессию внутриклеточных цитокинов в активированных Т-клетках. Так обнаружено ослабление экспрессии ИЛ-4 при действии низких доз вилона и эпиталона. Вилон не оказывал влияния на экспрессию ИФНу в мононуклеарах и активированных Т-клетках. В то же время высокие дозы эпиталона снижали число Т-клеток, экспрессирующих ИФНу. Установлено, что повышение соотношения ИФНу+ и ИЛ-4+ клеток закономерно проявляется при использовании малых и промежуточных доз обоих пептидов.

Влияние вилона на клетки тимуса при радиационном старении in vivo

Световая микроскопия

На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином-эозином, тимус контрольных животных имеет дольчатое строение. Форма и размеры долек вариабельны. Между дольками видны тонкие прослойки соединительной ткани, содержащие мелкие кровеносные сосуды. В дольках отчетливо различаются расположенное снаружи корковое вещество и центрально расположенное мозговое вещество. - • .

Внутри коркового слоя находятся, главным образом, неделящиеся малые тимусные лимфоциты, расположенные между эпителиальными клетками коры. Эпителиальные клетки немногочисленны, имеют звездчатую форму за счет длинных и тонких цитоплазматических отростков, которые соединяясь друг С другом образуют сеть, в которой располагаются тимоциты коркового вещества. Тимоциты имеют округлое хорошо окрашенное ядро с ядрышками. В мозговом веществе количество лимфоцитов существенно меньше, чем в корковом, а клеточный состав представлен, в основном, эпителиальными клетками.

На 14-е и 21-е сутки после облучения (2, 2а групны) на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, отмечается йарушенйе структурной организации

тимуса, выражающееся, прежде всего в атрофических изменениях. Количество долек и их размеры значительно уменьшены. Деление на корковое и мозговое вещество стирается, граница между слоями фактически исчезает. В мозговом веществе незначительно увеличено содержание лимфоцитов. Соотношение между паренхимой и стромой нарушено в сторону увеличения последней. Кортикальные тимоциты представлены преимущественно большими и средними лимфоцитами. В тельцах Гассаля отмечается распад и дегенерация клеток.

При микроскопическом анализе препаратов тимуса животных, которым после первого сеанса облучения вводился вилон (3, За группы) отмечались менее выраженные инволютиввые изменения по сравнению со 2 и 2а группами.

У животных, которым вводился вилон (4 группа), гистоструктура тимуса сохраняется, но в отличие от контроля имеет некоторые особенности. Дольки значительно крупнее, чем у животных контрольной группы. Корковое вещество широкое, благодаря активной пролиферации кортикальных тимоцитов. Эпителиальные клетки значительно гиперплазированы. Тельца Гассаля многочисленны и в большинстве случаев формируются клетками с хорошо окрашенными ядрами.

Результаты злектронно-м икроскоп и ческого изучения

Электронно-микроскопическое изучение тимуса животных контрольных групп показало, что в корковом веществе долек тимоциты образуют скопления, состоящие из клеток, имеющих сходные размеры и морфологическую структуру. Эти клетки имеют крупные ядра с конденсированным по периферии хроматином, одним-двумя ядрышками крупного размера, и узкий ободок цитоплазмы, содержащий небольшое число митохондрий и полирибосом. Среди этих клеток встречаются крупные тимоциты, имеющие более широкий ободок цитоплазмы и содержащие большое число митохондрий, так называемые активированные лимфоциты.

Тучные клетки встречаются в междольковой соединительной ткани, вблизи кровеносных сосудов. Ретикуло-эпителиальные клетки, которые чаще хорошо видны в мозговом веществе долек, имеют отростчатую форму, рыхлое ядро неправильной формы и цитоплазму, богатую канальцами эндоплазматического ретикулума.

При радиационном старении у животных группы 2 среди наиболее выраженных изменений в тимусе отмечены следующие: отслоение участков наружной ядерной мембраны, нарушение тесных контактов между отдельными тимоцитами. Однако, облучение не уменьшает числа делящихся тимоцитов, находящихся на разных стадиях митоза.

Среди тучных клеток наблюдаются различия в реакции на облучение. Так, одни клетки не отличаются по своей структуре от мастощгГОв контрольных животных, тогда как в других наблюдается образование обширных вакуолей, в которых одновременно может находиться до десятка секреторных гранул различной степени электронной плотности, отражающей разные стадии лизиса секреторного материала. В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается заметное отслоение наружной мембраны, расширение мембран эндоплазматического ретикулума, появление многочисленных мелких вакуолей, набухание и лизис крист митохондрий.

На 21 день после начала эксперимента у животных при радиационном старении (группа 2а) в корковом веществе долек тимуса не наблюдается выраженных изменений по сравнению с группой 2.

У животных, которым вводился вилон, в модели радиационного старения на 14 сутки от начала облучения выраженных изменений со стороны тимоцитов не отмечено. В корковом веществе тимуса они располагаются, тесно прилегая друг к другу, имеют относительно одинаковые по размеру ядра с одним - двумя ядрышками. Ободок цитоплазмы очень тонкий, встречаются единичные митохондрии, в которых хорошо просматриваются кристы. В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается слабо выраженное отслоение кариолеммы и уменьшение вакуолизации цитоплазмы.

На 21 сутки после облучения у животных, получавших вилон (группа За) обращает на себя внимание скопление тучных клеток не только в междольковой соединительной ткани, но и в корковом веществе долек тимуса. При электронно-микроскопическом исследовании тимуса облученных животных, получавших вилон, в корковом веществе появляются гранулярные лейкоциты, а также плазматические клетки, располагающиеся небольшими группами. Ретикуло-эпителиальные клетки не обнаруживают выраженных морфологических изменений, по количество секреторных гранул в их цитоплазме снижается.

Таким образом, проведенные исследования показали, что после фракционированного облучения в диапазоне сублетальных доз, моделирующего преждевременное старение, в тимусе животных, получавших вилон, выявляются особенности структурно-функциональной организации, проявляющиеся, в основном, на ультраструктурном уровне. Инфильтрация коркового вещества зернистыми лейкоцитами и плазматическими клетками при этом, возможно, связана именно с интенсификацией репаративных процессов, так как известно, что гранулоциты чувствительны к активации различными гуморальными и клеточными факторами. Скопление тучных клеток в

корковом веществе может быть вызвано тем, что для окончательной дифференцировки мастоцитов требуется присутствие ИЛ-3, продуцируемого Т-лимфоцитами.

Компьютерный анализ микроскопических изображений

Контрольная группа (I группа). Основная популяция пролифсрирующих клеток в тимусе интактных животных (1рсна=26%) располагается в корковом веществе с тенденцией концентрироваться в периферической зоне долек, контурированных соединительно-тканными перегородками. В тимусе животных контрольной группы тучные клетки составляют относительно небольшую фракцию клеток (16±2 на 1мм2) и сосредоточены в виде характерных цепочек в тонких соединительнотканных перегородках.

Действие ионизирующей радиации - преждевременное старение (2 группа).

PCNA-пoзитивныe ядра сосредоточены преимущественно в периферической зоне редуцированных долек. Обращает внимание увеличение числа тучных клеток в соединительно-тканных перегородках (27±3). Высокий Гром, и гиперплазия тучных клеток свидетельствуют о начавшемся периоде пострадиационного восстановления тимуса.

Сочетанное действие радиации и вилона (3 группа). В тимусе регистрируется активизация восстановительных процессов по индексам пролиферации. 1рсма достигает 55%. Пролиферативная активность в экстрамедуллярных зонах кроветворения. Обращает на себя внимание увеличение числа тучных клеток в тимусе облученных животных после введения вилона (32±5).

Действие вилона (4 группа). В группе необлученных животных после введения вилона наиболее существенный эффеи регистрируется по изменению пролиферативной активности клеток в тимусе. 1роч1а достигает 37%. Все остальные изученные параметры в тимусе ос1анпся в пределах варьирования морфо-функциональных показателей у контрольных животных.

Результаты проведенного компьютерного анализа микроскопических изображений показали, что у облученных животных, получавших вилон, усиливается пролиферативный потенциал клеток. Эти данные позволяют предположить, что вилон может оказывать положительное влияние на купирование отдаленных последствий облучения и, тем самым, оказывать I ероиротекторное действие в радиационной модели преждевременного старения.

выводы

1. Вилон и эпиталон усиливают экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR на поверхности тимоцитов человека и ослабляют ее на поверхности ТЭК. Оба пептида ослабляют экспрессию раннего активационного антигена CD69 на поверхности тимоцитов. Вилон усиливает, а эпиталон ослабляет экспрессию CD69 на поверхности ТЭК.

2. Вилон и эпиталон ослабляют апоптоз тимоцитов. Эпиталон усиливает апоптоз периферических лимфоцитов, особенно активационный апоптоз 'Г-клеток. Вилон усиливает пролиферацию ТЭК человека, сниженную в результате длительных их пассажей, т.е. при старении in vitro культур ТЭК.

3. Вилон и эпиталон усиливают секрецию цитокинов ТЭК человека и ослабляют индуцированную секрецию этими клетками тимулина. При действии на активированные Т-клетки вилон и эпиталон ослабляют выработку ИЛ-4, практически не влияя на выработку ИФНу.

4. Вилон стимулирует репаративные процессы в вилочковой железе крыс при преждевременном (радиационном) старении, что связано со специфическим восстановлением микроокружения и межклеточного взаимодействия в органе.

5. Вилон обладает выраженным стимулирующим влиянием на гуморальный и клеточный иммунитет, усиливает пролиферативную активность тимоцитов ускоряя дифференцировку Т- и В- лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов. Эти эффекты особенно выражены при преждевременном (радиационном) старении тимуса.

6. Полученные данные позволяют рассматривать вилон, и эпиталон как потенциальные иммуно- и геропротекторы, усиливающие пролиферативные, репаративные и компенсаторно-адаптационные процессы в основном органе иммунной системы - тимусе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние вилона и эпиталона на секреторную активность тимусных эпителиальных клеток и дифференцировку тимоцитов/ В.Х. Хавинсон, A.A. Ярилин, Н.С. Синицкая, И.М. Кветной, В.О. Полякова, Н.И. Шарова // Новые данные о редких и распространенных заболеваниях. Сборник научных трудов под редакцией член-корреспондента РАМН, заслуженного деятеля науки РФ, профессора Н.М. Аничкова. Санкт-Петербург, 2003.- С.211-218.

2. Зезюлин H.H. Изучение пролиферативного эффектов эпиталона на эпителиальные клетки тимуса в процессе дифференцировки и старения in vitro // П.Н. Зезюлин,

B.О. Полякова // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы коррекционной психологии, психотерапии, медицины» 20 октября 2001г. -СПб.:МИРВЧ.- 2001г.- С.15.

3. Князькин И.В. Действие вилона на тимус и селезенку в радиационной модели преждевременного старения/ И.В. Князькин, В.О. Полякова // Успехи геронтол.-2002,-Вып. 9,- С. 105-109.

4. Полякова В.О. Влияние пептидного биорегулятора «вилона» на структурно-функциональную организацию вилочковой железы и других органов после общего гамма - облучения // Материалы II Российской конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Москва.- 2001.-

C.396-397.

5. Полякова В.О. Влияние пептидного биорегулятора вилона на структурно-функциональную организацию тимуса крыс при радиационном повреждении // Седьмая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов, Санкт-Петербург, 2002,- С.58.

6. Полякова В.О. Действие вилона на синтез внутриклеточных цитокинов // Материалы Пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье».- СПб, 2002.-С. 201-202.

7. Полякова В.О. Иммуноцитохимическая идентификация пептидов в эпителиальных клетках тимуса человека // Материалы второй научной конференции с международным участием, посвященная 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии»,- Новосибирск, 2002,- С. 124.

8. Полякова В.О. Функциональная морфология тимуса при действии синтетического пептидного биорегулятора "вилона // Материалы Четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - СПб.-2001.-С.214.

9. Репаративпое действие "вилона" на функциональную морфологию тимуса и других органов после общего у-облучения / В.О. Полякова, В.В. Южаков, В.В. Попучиев, С.С. Коновалов // Материалы V научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге -2001*. СПб.- 2001.-Т. 3. -As 2.-С. 334.

10. Тимус и старение/ В.О. Полякова, И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон, А.Т. Марьянович, С.С. Коновалов // Успехи геронтол,- 2001.- Вып. 8,- С. 50-57.

11. Tisssue-specific effects of peptides on differentiation and aging of thymic epithelial cells in vitro/ V. Polyakova, S. Konovalov, O. Barykina // Environment and Human Health, St.Petersburg, 2003.-P.534.

Полякова В.О. Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса // Автореф. дис....канд. биол. наук: 14.00.53. - СПб., 2003. - 20 с.

Формат 60 х84 1/8, Объем Усл. Печ. Л. 1.0. Тираж 100 экз. Зак. .Бесплатно. Подписано к печати 30.06.03.

Отпечатано с готового оригинал-макета ЧП свид. 104990 ИТД-13 от 19.07.98

ИИ391?

1Jfif

Актуальность темы

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [103]. Инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой нейропептидов, цитокинов и гормонов, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов [80]. Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса [87]. Поиск и исследование пептидов с высокой биологической активностью, способных регулировать и восстанавливать адаптационные реакции организма является приоритетным направлением современной биологии.

Участие нейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения. На основе аминокислотного анализа природных препаратов тимуса и эпифиза в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН были сконструированы синтетические пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами [46].

Сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволит более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать подходы к пептидергической регуляции иммунных и эндокринных функций железы в процессе старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие пептидов на дифференцировку тимоцитов;

2. исследовать влияние вилона и эпиталона на пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов;

3. определить эффекты действия вилона и эпиталона на экспрессию маркеров активации и на секреторную активность эпителиальных клеток тимуса (ТЭК);

4. оценить влияние пептидов на синтез внутриклеточных цитокинов;

5. изучить влияние пептидов на пролиферативный потенциал ТЭК при старении культур;

6. изучить функциональную морфологию тимуса крыс в радиационной модели ускоренного старения;

7. оценить геропротекторные свойства изучаемых пептидов - вилона и эпиталона.

Научная новизна работы

В работе впервые получены данные о роли пептидов (вилона и эпиталона) в регуляции функций эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов при старении. Установлены внутриклеточные пептидергические механизмы, участвующие в процессах пролиферации и дифференцировки и старения клеток тимуса. Проведен анализ морфо-функциональных изменений в тимусе при ускоренном старении. Выявлено геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона по отношению к клеткам тимуса.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить представления о влиянии пептидов на развитие и функционирование клеток иммунной системы, в первую очередь Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса. Установленное геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона на клетки тимуса открывают перспективы для детального изучения возможности применения пептидов в гериатрической практике для коррекции функций, нарушенных при старении организма.

Положения выносимые на защиту

1. Вилон и эпиталон обладают регуляторным действием на клетки тимуса in vitro, изменяя экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR, CD69 на их поверхности.

2. Вилон и эпиталон проявляют геропротекторные свойства при старении культур клеток тимуса человека, ослабляя апоптоз и усиливая пролиферацию ТЭК.

3. Вилон стимулирует репаративные процессы в тимусе крыс при ускоренном (радиационном) старении.

4. Вилон и эпиталон могут рассматриваться как потенциальные иммуно- и геропротекторы.

Связь с научно - исследовательской работой Института

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану ПИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли пептидов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Главы 3-6 представляют собственные экспериментальные данные изучения эффектов действия пептидов на ТЭК, тимоциты, периферические Т-лимфоциты и на структурно-функциональную организацию тимуса в модели преждевременного старения in vivo. В главе 7 обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 119 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 129 источников, из которых отечественных - 82.

выводы

Вилон и эпиталон усиливают экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR на поверхности тимоцитов человека и ослабляют ее на поверхности ТЭК. Оба пептида ослабляют экспрессию раннего активационного антигена CD69 на поверхности тимоцитов. Вилон усиливает, а эпиталон ослабляет экспрессию CD69 на поверхности ТЭК.

Вилон и эпиталон ослабляют апоптоз тимоцитов. Эпиталон усиливает апоптоз периферических лимфоцитов, особенно активационный апоптоз Т-клеток. Вилон усиливает пролиферацию ТЭК человека, сниженную в результате длительных их пассажей, т.е. при старении in vitro культур ТЭК.

Вилон и эпиталон усиливают секрецию цитокинов ТЭК человека и ослабляют индуцированную секрецию этими клетками тимулина. При действии на активированные Т-клетки вилон и эпиталон ослабляют выработку ИЛ-4, практически не влияя на выработку ИФНу.

Вилон стимулирует репаративные процессы в вил очковой железе крыс при преждевременном (радиационном) старении, что связано со специфическим восстановлением микроокружения и межклеточного взаимодействия в органе.

Вилон обладает выраженным стимулирующим влиянием на гуморальный и клеточный иммунитет, усиливает пролиферативную активность тимоцитов ускоряя дифференцировку Т- и В- лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов. Эти эффекты особенно выражены при преждевременном (радиационном) старении тимуса.

Полученные данные позволяют рассматривать вилон и эпиталон как потенциальные иммуно- и геропротекторы, усиливающие пролиферативные, репаративные и компенсаторно-адаптационные процессы в основном органе иммунной системы - тимусе.