Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Влияние 5-бромо-2-дезоксиуридина на канцерогенез и старение (экспериментальное исследование)

'г 6 0дроссииская академия медицинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ

4 п *ПР ШПЧ_им. проф. Н. Н. ПЕТРОВА_

■ ...........

На правах рукописи

ОСИПОВА Галина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ 5-БРОМ0-2-ДЕ30КСИУРИДИНА НА КАНЦЕРОГЕНЕЗ И СТАРЕНИЕ

(экспериментальное исследование) Специальность 14.00.14 — онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

* . У.-" ^

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н. Н. Петрова РАМН в лаборатории экспериментальных опухолей.

Научный руководитель: доктор медицинских наук В. Н. Анисимов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н. Н. Петришев доктор биологических наук М. Н. Остроумова

Ведущее учреждение: Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Минздрава России.

Защита диссертации состоится « ^ . » . . . 1993 г.

в 14.00 час. на заседании специализированного Ученого совета К 074.38.01 научно-исследовательского института онкологии им. проф. Н. Н. Петрова РАМН, Санкт-Петербург, 198646, Песоч-ный-2, Ленинградская ул., 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « X . » ¿гу'/С-^-^ . . 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук

Е. В. Демин

Актуальность работы.

Одной из ведущих меди-со-биологических проблен является изучение механизма пзаимосвязи процессов старения организна и возникновения рака, Предполагается, что в основе обоих процессов могут лежать сходные ■ изменения, в частности. молекулярио--генетические 1С. К. Kl rich. К. 1,. .'¡hnelder. 1985: U.H.Ames. 1989: П. И. Анисинов, 198J. 1987, 1992; Т. В. I.. KlrKWOOd. 1989; J. Vile. 19401. в пользу этого предположения свидетельствует то. что многие канцерогены, как и агенты, вызывавшие ускоренное старение, повреждают ДНК. Однако они взаинодейстуют также и с другини макромолекулами, что может приводить к эпигеномным нарушениям и затрудняет понимание как роли избирательных изменений И ПС п канцерогенезе и старении организма, так и взаимосвязи этих процессов in. Stneer. п. Огппъегвег. 1983; н. П.Напалков и coatrr.. 1989; I». II. Анисинов. 1987. 1990, 199?). Поэтому, изучение влияния на процессы старения и канцерогенеза веществ. облалаюиих избирательным действием на ДНК. может иметь первостепенное значение.

5-бромо-?.' - дезсксиурндин (ВДУ) представляет собой синтетический аналог естественного основания ДНК ткмидина. в котором нетильная группа последнего элмешена броннд-ионон. Вследствие рапных ван-дер-наальсовых радиусов атома брома и метальной группы ир происходит 'узнавания" и удаления 5ЯУ из ДНК Ферментами р»'паралии. Не включившийся в ДНК ВЛУ подвергается быстрому катаболизму в печени до урацила и бромид-иона 1ЛКг1з и соавт.. HfijM. При включении ПДУ в ДНК и при ее последующих репликациях, из-за его склонности к присоединению не только аденина, по н пишпина, ВДУ вызывает транзипии пар оснований, а также ряд других Физико-химических изменений ДНК IS. Н. Morris, 1991).

п рамках многостадийной модели канцерогенеза признается возможность инициации опухолевого роста в результате одной или нескольких последовательных мутаций ДНК tJ. И. Kaldor. Н. Е. Day. |ч«7; п. и. Напалков и соапт.. 1989: С. С. Harris. 1991). Среди теорий старения, основанных на избирательности повреждения ДНК, центральное место занимает теории соматических мутаций, согласно которой к старению ведет постепенное накопление множественных ■•тохлетичегкик мггапий в геноме соматических клеток и рчзпимчгямяся вследствие зтого нестабильность генома

p..

IB. L. strerncr. 1966; R.G.Cutler. i.Semsei. 1989; Т. B. L. KlrKvood. 1969; J. VIib. 19901. Тают образом, накопление нутаций, инлунируеных БДУ. может. с одной стороны, вызывать активацию протоонкогеноп. а с другой - приводить к нестабильности генома и. я результате этого, к преждевременной/ старению. Немногочисленные эксперименты, и которых предпринимались попытки выявить канцерогенные свойства БДУ Ш. Trainln. 1964; DlPaolo. 1964; V.CraddocK, 1961; л. я. Лихачев. 1964; Е. С. Мангклова и соавт.. 1965J пе припели к однозначным пмводак. в работе Н.П.Напалкова и ссавт. [19091. где БДУ вподился крысан а первые дни после рождения, удалось убедительно показать его канцерогенные свойства. Вместе с тем, практически неизученным остаиался соирос о взаимосвязи между вызнваенини ПДУ изменениями п ДНК. чувствительностью отдельных тканей и оргамизна в полон к дополнительным канцерогенным поздсйствням, и процессом старения организма.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования является изучение роли индуцируемого ЕДУ изолированного повреждения днх в процессах канцерогенеза и старения.

Для этого предстояло решить следующие основные задачи:

1. Изучить канцерогенез и некоторые показатели старения у крыс, подвергшихся воздействие БДУ в ранней постнатальпом периоде, и их потомков;

г. Изучить динамику распределения н персистенпии БДУ о ДНК клеток различных тканей у крыс;

3. Изучить влияние раннего постнатального введения БДУ на частоту хромосомных аберраций в линФоцитах периферической крови у взрослых крыс;

4. Изучить у крыс и мышей комбинированное канцерогенное действие БДУ и других канцерогенных факторов: н-нитрозо-метилмочевикы (ИНН), уретана. эстгадиола беизоата ОБ), общего рентгеновского облучения (оро>;

5. Изучить влияние раннего постна.'ального введения БДУ. а также его комбинации с НИИ на мутации в протоонкогене Ki-газ в незенккмальных опухолях почек у крыс.

Научная новизна подученных результатов.

в настоящей работе впервые выявлен канцерогенный эффект ИДУ у мышей и иодтпержден у крыс при его раннем постнатальнон введении.

Установлено, что раннее постнатальное введение ЕДУ повышает чувствительность тканей и всего организма в пелон к последтпену воздействию канцерогенных агентоз различной природы (химической, Физической, гормональной), при этой. усиление канцерогенеза происходит преимущественно в тканях-имиенях для второго канцерогенного агента. Выявлено, что инициирующее канцерогенез лепстрие БДУ сохраняется длительное время (более 1 гола) после его последнего введения.

Введение ЕДУ крмсаи родительского поколегия приводит к уменьшению рождаемости, пеонатальной гибели, появлению разнообразных уродств, уменьшению средней продолжительности жизни у потомства, а также к значительному увеличению у него частоты как всех, так и злокачественных новообразований, и уменьшению латентного периода их обнаружения по сравнению с контрольными животными и крысами родительского поколени". При этой происходит увеличение частоты как "спонтанных", так и "редких" для используемой разводки опухолей,

Впервые кимуногистохимическни методом была изучена динаника включения, распределения и выведения БДУ в тканях и органах в течение года при его введении в раннем постяатальном периоде и установлена их зависимость от нитотической активности тканей.

Впервые в хронических опытах ln vivo были исследованы некоторые молекулярно-генетические эффекта присутствия БДУ в ДНК. Обнаружено двухкратное увеличение частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у 3-месячных крыс через ТО суток после последней ниьекпии БДУ. Не было выявлено единого типа мутаций при изучении последовательности оснований в 12 кодове протоонкогена Eiras в меэенхималышх опухолях почек, индуцируемых БДУ у крыс.

Ппервме установлено, что равнее постнатальное введение БДУ иызывзет у крыс и их потомков уменьшение средней продолжительности жизни, увеличение скорости старения популяции, а также изменения Функции репродуктивной системы, свойственные ускоренному старению. обнаружено, что педутаую роль в их развитии играют

нарушения в игнтралышх регуляторных органах эндокринной системы.

Совокупность полученных данных свидетельс- aret о том. что изолированное повреждение ДНК, вызываемое воздействием БЛУ в раннем постнатальном периоде, может приводить как к усилению канцерогенеза в поколениях животных, так и способствовать реализации канцерогенного и пронотируилего действия других агентов, а также вызывать развитие преждевременного старения.

Научно-практическое значение.

Работа носит теоретический характер. Полученные данные о роли изолированного повреждения ДНК в спонтанном канцерогенезе, чувствительности организма к последуют» воздействиям различных канцерогеннкых и промотируюших Факторов, а также в развитии ускоренного старения, могут лечь в основу новых представлений о механизмах инициации опухолевого процесса и старения ln vivo.

Структура и обьен диссертации.

Работа изложена на страницах печатного текста, включает введение, обзор литературы, материалы ч методы исследования, результаты собственных исследований. заключение. выводы, указатель литературы; иллюстрирована 23 рисунхами и 21 таблипой. Библиографический указатель содержит /<£€ источников: отечественных и зарубежных авторов.

Апробапия работы.

Основные положения диссертаии обсуждались 15 января 1992 г. на совместном заседании отдела канцерогенеза и лаборатории эндокринологии НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова. были представлены на республиканской научной конференции 'Механизмы канперо- и лейкозогенеза" (Киев. 1990). Всесоюзной конференции "Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, пути увеличения" (Киев. 1991). научной конференции "Ускоренное старение, связь с возрастной патологией" (Киев. 1992).

по материалам диссертации опубликовано 10 работ (включая тезисы докладор на конференциях).

НАТЕРИА/М И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

п опытах использовано '213 белых крыс лио обоего пола разводки НИИ онкологии нн. проф. Н. Н. Петрова и ЧЧЗ ныин НАЬВ/с обоего пола, полученные чз питомника "Рапполово* РАНН.

Соответственно задачам исследования крысы были разделены па Ч серии экспериментов, а ныши - на 2 серии. Обшая сиена хронических экспериментов на животных представлена на рис. 1.

Изучение каиперогенности БДУ и его влияние на пропесс старения проводилось в Г серии опытои на крысах. Для этого сампы и слмкн крыс были ссажены и:2) для получения потомства, части которого на 1-е. 3-й, 7-е и 21-е сутки жизни подкожно вводили растворенный в о. 1 мл дистиллированной воды БДУ в разовой дозе 3.г мг на животное. часть потомков оставалась интактной и служила контролен. одновременно были ссажены 3-несячные крысы, подвергавшиеся такому же воздействию БДУ. Полученное от них потонство не подвергалось никаким дополнительным воздействиям. Наблюдение за контрольными животными, крысами, получавшими БДУ. н потонкани 1-го поколения проводилось на протяжении всей их жизни. У хипотных изучали поэрастную динамику массы тела, смертность, появление новообразований. Расчитывали показатели старения популяций: среднюю и максимальную продолжительности жизни, показатели уравнения Гомпертпа-Накейма 1К = А ♦ 1Ц), где У обпан смертность животных; А - не зависящая от возраста смертность животных; кш - зависяпая от возраста смертность, определяемая как йо-е'' . где Ко - смертность в момент времени I о; л - константа) [Л. А. Гаврилов. и. с. Гавоилова. 1991). исследовали возрастную динамику репродуктивкой функции у самок крыс на протяжении всей их жизни. Для этого у контрольных, подвергшихся воздействию БДУ, и потомков 1-го поколения саиок крыс определяли сроки открытия влагалища и. начюпя с 3-. В-. 9-, 1йч 15-, 18 и 21-го месячного позраста. в течение 30 суток ежедневно проводили цитологическое исследование Фаз эстральпого пнкла. Для изучения механизмов нарушения эстральной функции у крис. подвергавшихся воздействию БДУ, были проведены дополнительные опыты с определением величины компенсаторной гипертрофии яичника (КГЯ) у з- и 9-месячных самок крыс и тест с »ведением экзогенного хорионического гонадотрошта человека (ХГ) у инфантильных зо-суточных санок крыс. Величину КГЯ определяли

о» О» О о-

я s ■я s

\> "о 'о

ю g ю g

1 а ; i 1 • и

и

_ Cr1 Л. J- V

■o<3 -oí

■et -o

Cl (U

о

Ч1

о*

R

s

III

"8

-«Si

S >

J

о* *o o-

ЧЭ

Jo- Л Л 'Jo-

о- 5 «Р* о* о* о-

» _ е- S Ъ ю «г . Е R V о «г

'J и 1- £ (U & «г о Й s

o»

\> Й

« 4>

w ^ «г Л

'о 4>

и M -и; u и- шг ir

О* О-

« В

I4*

г и Ü

О»

8

ч> g

g

го" о J.Jo- "о

к Я

11

о-V

<к*0

I I

Ï л

о- 'о о-"о 'о**о о**о о»

Ö

как отношение веса оставшегося после гекикастрашш яичника ic весу удаленного, в х, на loo г масси тела. ХГ вводили подкожно в дозе О. 5 ед. ежедневно в течение 3- дней и определяли отношение веса натки к нассэ тела у подопытных и контрольных животных.

По п ни сериях опытов па крысах изучали комбинированное канперогенное действие ранпего постнатальпого воздействия БДУ и последуюшего однократного в/в введения нни в дозах 10 или 50 нг/кг иассы тела в возрасте 3 (П серия) и 13 месяцев (Ш серия).

На крысах IV серии исследовали комбинированное канцерогенное действие раннего постнатального введения ПДУ и последуюшего однократного воздействия в 3-месячном возрасте ОРО в дозе 1.5 Гр.

Наблюдение за крысани всех серий проводили до их естественной гибели.

В опытах на мылах изучали комбинированно» канцерогенпос действие НДУ и тканеспедиФичных канцерогешшх агентов: уретана и ЭК.

в i серии опытов кь-шам. который на 1-. 3- и 7-е сутки жизни подкожно вводили НДУ п дозе 1 нг. начиная с 3-несячпого возраста пятикратно пнутрибрюшинно вводили по О, 1 нл 5 У. раствора уретана. Дожившие до 9-месяч]юго возраста живопше были умерщвлены парами эфира. Подсчитывали количество и размеры опухолей на поверхности легких. Наиболее крупные из ник изучали гистологически.

Во П сенш опытов санкам милей, получавший неонатально НЛУ как животные I серии, с 3-иесячного возраста еженедельно э течение 15 педель подкожно вводили по 5 нкг эстрадиола-бензоата. Опыт был завершен, когда возраст иыпей достиг 00 педель.

Павших и умерщвленных крыс и нышей вскрывали, выявлешше новообразования распенивали как Фатальные или случайные IJ. J. Gart и созвт.. 1у0в1. кусочки опухолей и тканей, d которых hosko было заподозрить появление опухолевого роста, исследовали гистологически. Опухоли классифицировали согласно рекснепдациян нлир IV. s. Turusov. 1979; V. s. Turusov, U.Mohr, 19901.

пннуиогистохимическое исследование Фарнакодинаникп и Фармакокинетикн БДУ проводили у самцов и самок крыс, подвергшихся раннему постнатальнону его воздействию, как животные 2-й группы 1 серии. С помощью ноноклопальиых антител CEecton-DlcKlnson, Mountain viev, США) изучали включение, распределение и персистев-иию 1>ДУ через 1 и ЕЧ часа, 7 и 30 суток после его последней иньекиии и в возрасте 1 года - в головной мозгу, печени, селе-

в.

зенке. почке, яичке «у санпов) иди катке и яичнике (у санок). Препараты были приготовлены по методу С. Н. Veehorst и соавт. (19911. Подсчитывали обчее количество клеток с включенный в ядра v>nv на юоо клеток той или иной ткани.

Изучение индукпии БДУ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической кропи проводилось у 3-месячных самох крыс по иетоду а. С. Монахова (1963). Полученные препараты окрашивали простым методом Гимэа. Аля анализа хромосомных аберраций использовали только нетафазы с хорошим разбросом и с не менее чем 40 центромерами. Анализ хромосомных аберраций проводили в соответствии с рекомендациями комитета по стандартизации кариотипа Rattus KorvcRlcus 119741.

Изучение последовательностей пар оснований в протоонкогене Kl-газ производили с помощью реакции цепной полимеризации в мезенхимальных опухолях почек, развивающихся у крыс, подвергшихся воздействии ВДУ и/или НИМ в дозе so иг/кг в 3-месячном возрасте.

При статистическом анализе полученных данных использовали критерий t Стьвдента. X • метод наименьших квадратов и точный метод Фишера, оценка достоверности частоты возникновения опухолей у животных различных групп производили в соответствии с рекомендациями КАИР (J. J. Gart и cor эт.. 1986) методом комбинирования таблиц контингентное!и для Фатальных и случайных опухолей с поношью программы "Cartest" на ПЭВН IBH/PC AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Биологические эффекты раннего постнатального введения БДУ.

Раннее постнатальное введение БДУ крысам родительского поколения приводило при их спаривании к значительному уменьшению числа крысят в помете (7.7»о. ч по сравнению с 10.7tl.O в контроле, р < 0.05) и к увеличению числа мертворожденных <12.7 х против з.в х в контроле, р < о, 05).

Для крыс, родителям которых вводили БДУ. было характерно появление стигм - нарушений развития отдельных частей тела и органов. Так. отсутствие пальцев нз передних лапах наблюдалось у сампов в 35.7 х, а у санок - в 31.1 х случаев. У животных родительского поколения, подвергшихся воздействию КДУ. и их потомков, соответственно, в ?.г ' и 15 х случаев у самцов и 47 х и

13 * - 7 санок наблюдались макро- и никрокистозные изменения d почках. У интактных саииов и санок такие изменения в почках обнаруживались п 5, а * и 4,7 '/ случаев.

V крыс. подвергшихся воздействию иду, и в меньшей степени у их потомков наблюдалось значительное отставание в росте, увеличение смертности как в период до 1,5 ■• 2-несячного яозраста. так а и дальнейшем, на протяжешм всей жизни. V крыс-потомков достоверное; увеличение ранней смертности наблюдалось только в первые трое суток жизни но сравнелюо с родительеют поколением (р < О,05), что вероятно, обьисняется развитием у крыс-потонкоб несовместимых с яизньо изменений, индуцированных введением родитегян иду. в дальнейшей, их смертность превышала контрольную (р < 0.001). ио была значительно неньше, чем в родительской поколении. Это увеличение смертности не определялось преждевременной гибелью животных от опухолей, так как не было найдено корреляции неаду продолжительностью жизни крыс и развитием Фатальных опухолей. Уменьшение продолжительности дизни популяпий подопытных понулйпий происходило за счет равпонерпого смешения влооо кривых выживаемости (рис. 2). При анализе зависимости логариФна ичтенсинности снертностг от возраста, было установлено, что копстанта <£ , хнршетеризгазап в уравнешш Гонпертпа-Нейкена скорость старения популяции, как у сампов. так и у самок крыс, подвергшихся раннему постнатальному воздействию БДУ. и их потомков была достоверно большей, чем у контрольных животных. Эти данные позиолиют предположить, что раннее постнатальное введение ЕДУ пызывает изменения. сходные с синдромом "ускоренного" старения У крыс, а также их потомков.

Для изучения влияния раннего постнатального введения ВДУ па показатели биологического возраста в качестве таковых были выбраны некоторые параметры функции репродуктивной систены у самок крыс на протяжении всей их хизни. Было выявлено сугаествен-ное замедление становления Функции репродуктивной системы у самок, подвергшихся воздействию БДУ. по сравнению с контрольными, при регулярной изучении цитологического содержимого влагалишных иазкоп установлено, что у подопытютя крыс происходило более раннее выключение астральной функции, чем у тггактннх самок. С 3 го по Ю-й месяпы хизни у подопытных животных наблюдалось более позднее, чем в контроле, уменьшение средпей продолжительности астрального цикла.» а в более позднем возрасте - бопее раннее ее

увеличение, в тесте с кгя было установлено. что Равнее постна-тальное введение вду угнетает вызванную гекикаст^анией в 3-несячг ной возрасте гипертрофию оставшегося яичника, что свидетельствует 05 угнетении гонадотропной функции гипофиза. V 9-несячных крыс величины кгл в подопытной и контрольной группах не различались. V инфантильных санок крыс, получавших БДУ. не было обнаружено нарушений чувствительности рецепторов яичников к действию экзогенного ХГ. ' : '.-•

Таким образон. у санок крыс, подвергшихся раннему постна-тальному воздействию БДУ, наблюдалось замедление полового созревания и более ранне выключение астральной функшо»- чек в контроле. V крыс-потомков эти нарушения были иенее выражены. Указанный процесс носил не однононеитный. а постепенный характер, что может свидетельствовать о сходстве указанных изменений с наблюдаемынн при естественном ускоренном старении. Результаты опытов с кгя и ХГ позволяют предполагать ведущую роль нарушений центрального звена регуляции гонадотропной функции в развита» преждевременного старения репродуктивной функции у подопытных крыс. •''."•''.•'.'..''•'■ .'..-."

Раннее постнатальное введение БДУ сопровождалось достоверный увеличением частоты как всех, так н только злокачественных опухолей и более ранним их развитием, чек в контроле. У ".крыс-потомков наблюдалось увеличение числа злокачественных опухолей по сравнению с родительским поколением, и как всех, так и злокачественных опухолей по сравнению с контрольными аагаотныки (табл. 1. рис. Э).

Часто встречающиеся (>1 X от всех опухолей) в ванной разводке крыс опухоли были обнаружены примерно у одинакового числа самцов и санок крыс всех трех групп I серии, однако.' у крыс, получавших БДУ. и их потомков эти опухоли выявляли значительно раньше, чен у контрольных. В структуре всех новообразований они составили 21.г х у саипов и т7,о х у самок, получавших БДУ. 30. г х - у самцов и 67.1-8 г самок ю>ыс-потонков и 65.0 * у самцов и ОТ. 1 х у санок контрольных крыс..', Не было выявлено достоверных различий в частоте, развития часто: встречающихся опухолей отдельных локализация нежду самцами 1-й и 2-й групп. V самцов крыс-потонков наблюдалось увеличение частота опухолей питовидной железы, кроветворной системы по сравнению с контрольный« самцами и крысаии. получавгаии БДУ. У самок, получавших БДУ. наблюдалось увеличение новообразований гипофиза и щитовидной

80ЭРМТ, СУТКИ

i

300 500 -700, 900 1100 возраот! сутки '

Рис. 2. Шяивзеность кклс. шгшотгчЕся воздействий ЕЛУ и ин потомков после 3-несячного возраста. 1 - шяпроль: 2 - ЕДУ; 3 - погожи. I

А - сангы; Б - санки. )

Рис. 3. Окртаость ки*: с оптголяни. индштованшнн I рангам постаатапьньн воздействием ЕДУ. и • из потомков. 1 - контроль: 2 - еш', 3 - потоке! Л - егхял Б - сгтс'и

железы по сравнению с контрольными. V санок-потомков также наблюдалось увеличение опухолей гипофиза (по сравнению с контрольными и получавшими БДУ крысами) к опухолей щитовидной железы (по сравнению с контрольными крысами),

У крыс, подвергшихся воздействию БДУ. и их потомков было обнаружено развитие значительного числа уникальных опухолей, не встречавшихся у контрольных животных. Так. у 9 самцов. получавших БДУ, выявлено 10 лейдигон яичка, а у б санцов-потомков - в лей-дигон. У санок, получавших БДУ. и их потонков были выявлены злокачественные опухоли натки (аденосаркона. аденокарцхноиа). не наблюдавшиеся в контроле. У 3 сампов и 3 санск. получавших ЕДУ, развились незенхинальные опухоли почки, не встречавшиеся в контроле и у крыс-потонков. В единичных случаях у крыс, который вводили БДУ. и их потомков были выявлены нейроглиомы головного и спиного козга, гемангиосаркома печени, злокачественные гистио-питоны печени и поджелудочной железы.

Таким образом, введение БДУ в раннем постнатальпом периоде вызывает как усиление "спонтанного" канцерогенеза, так и развитие "редких" для использованной разводки крыс опухолей. Усиление частоты развития опухолей у крыс-потомхов по отношению как и контрольный животным, так и крысам родительского поколения, позволяют предполагать, что повреждения ДНК, вызываемые БДУ г крыс родительского поколения, закрепляются в геноме половых клеток и передается по наследству. '

кммуногистохиническое изучение персистенпии БДУ показало, что он включался во все исследованные органы и ткани, а уровень его содержания в тех иди иных тканях обратно коррелировал с иитотической активностью клеток этих тканей. С увеличением срока после введепия БДУ его содержание во всех тканях уменьшалось и только в некоторых их них (преимущественно в клетках строки различных органов) обнаруживалось его присутствие через 49 недель после его последней иньекдии (т.е. в возрасте 1 года) (рис. 4). Не было обнаружено корреляции между высоким уровнем включения БДУ или его длительной персистенпией в тех или иных тканях с органо-тропностью его канцерогенного действия.

При питогенетическон исследовании лимфоцитов периферической крови З-нйсячных крыс, подвергшихся раннему постнатальному воздействию БДУ, выявлено 2-кратное увеличение числа хромосомных аберраций по сравнение с контрольными животными, поскольку к

этому сроку присутствие кду в линФоидпоя ткани иммуногистохини-ческими метода»™ не обнаруживалось, мохло предположить, что ХА обусловлены вызванными вду и длэтельно персистируюшими мутациями • в днк.

г. Канцерогенез. индуцированный . ракнин постпатальнын воздействием ВДУ и последушим введением канцерогенных агентов Различной природы (химической. Физической и горнональной).

Введение крысам НИИ в 3-месячной возрасте в дозе ю нг/кг приводило к небольшому, но достоверному увеличению по сравнению с контролен частоты развития опухолей, типичных для крыс используемой разводки, тогда как предварительное введенир ЕДУ усиливало канцерогенный эффект налой дозы НИН у саипов (табл. 1). V --рыс обего пола, который вводили НИИ в дозе 50 нг/кг в 3-несячнон возрасте.' паблюдалось существенное увеличение частоты развития всех или только злокачественных опухолей по сравнению с контрольными животными, а также по сравнению с крысаии. получавшини НИН в дозе ю нг/кг. У крыс развивались опухоли почек, кишечника, органов кроветворной и репродуктивной систен, причен у самдоп поражались прекмупестпеипо потки и кишечник, а г самок - молочная железа, яичники и почки. У санаоп и санок, подвергшихся комбинированному воздействию ВДУ и 50 мг/кг ИМИ в 3-кесячнон гозрасте. наблюдалось достоверное усиление канцерогенеза по сравнению с контрольными хивотшжя и крысами, получавшими БДУ или 10 нг/кг НИН. При этой развивались опухоли в основной тех же локализаций, что и у крыс, получавших только ЧИН.

Введение 10 мг/кг 1ГМК в 15-месячяон возрасте сопровождалссь как увепичением числа крыс со всени. так и со злокачестве-тшни опухолями по сравнению с контрольными животными, прожившими более 1в месяцев. При комбинированном воздействии ВДУ и ю нг/кг ним число крыс со всеми или только злокачественными опухолями было большим по сравнению с контрольными животными и крысам:;, получаигкни только НИИ.

У крыс, которым НИН в позе 50 кг/кг вводгяи в возраст» 15 месяцев наблюдалось увеличение частоты крыс как со всени, то -с и только злокачественнки опухолями по сравпеккю с одпооозрастшти контролен и животныня, получавшими нин в дозе 10 нг/кг. Пг.т комбинированной воздействии ВДУ и 50 мг/кг НИМ паблюдалось гэзкое

крис от 1 часа до 49 недель после его „

последней нньеюни.

1 - через 1 час; г - через 1 несящ

3 - через 49 педелк !

А - кора голоюого нэзга; Б - строналыие

клетки печени; В - гепатаьпи; !

г- Фолликулы «тез; д - кора почки.

По оси орвинагг - индекс нетки

(на 1000 клеток). /

йк. 5. Частота и тиестЕенносп. опухолей лета у ииеП. подшргаеся »»яействио КПУ и уретаьа.

1 - контроль: г - летай: 3 - БЯУ; ч - ЕДУ и уретап. Разнила с контролен достоверна: » - р < 0,05:

разшси с I, г и 3 группами достоверна: «I - Р < 0,05.

Чэпый сектор соответствует частоте обпарухешэт адакжарпином легких.

усиление канцерогенеза как в отношении всех опухолей, так н только злокачественных по сравнению с животными всех остальных групп.

V старых санпов, получавши ННН в дозе ю нг/кг наблюдалось увеличение частота опухолей сзгговидной железы, у самок - всех и ■Только злокачественных опухолей молочной железы. опухолей кроветворной системы и мягких тканей, по сравнению с одновоз-растпыи контролен. Хонбкпнрованное введение еду и 10 нг/кг НИМ приводило к есте бодьиеиу усилению канцерогенеза у санпов и санок в отношении опухолей питозшшой железы и кроветворной систекы, а у санок - всех или только злокачественных опухолей натки, по сравнению с контрольными я получавшими только НИН животными.

V сгчпов и санок крыс, подвергшихся в 15-несячнон возрасте воздействию 50 нг/кг НИН. наблюдалось значительное увеличение частоты и укорочение сроков появления опухолей кроветворной систены, у санок - злокачествешшх опухолей молочной железы и натки, по: сравнению с контрольными п получавшими ю нг/кг ннн гмкгпшкк. Предварительное введение Бду приводило к увеличению частоты незецхиналышх опухолей почек, кроветворной систены, г санпов - опухолей легкого, нягкнх тканей, у самок - щитовидной железы, злокачественных опухолей молочной железы и натки по сравнению со всени остальными группами.

Такте« обрззон. при конбштрованнон раянен постиатальнон воздейств!п1 ПДУ а последующей введении разных доз НИН в 15-несячион возрасте, гашииирушее канцерогенез действие БДУ сохранялось. .'. по крайней нере. в течение 14 несяпев после его после/шеп пньешши. а усиление канцерогенеза происходило в тканях, пвлпхяихся кишеияни для НИН.

В целок, введение гахтактнын шш получавшим БДУ крысан ННН в 3-несячкон возрасте, по сравнению с животными, подгчавшнни его в 15-несячнон возрасте, приводило к возникновению большего числа как всех, так и злокачествепшх опухолей, что вероятно объясняется тем. что крысы старших возрастных групп пе доживают до развития всея возможных опухолей. В то же время, у крыс стаултп возрастных групп наблюдалось болея раннее возникновение опухопеч от нонента ввгдепил ННН. чсн у нодолых животных.

Следует откетить, что введение 1ШН в 15-несячнон возр;:сте изменяло спектр новообразовании по сравпению с ее введепнен п з-нееячнон возрасте, что вероятно связано с изкенепнен возрастной

чувствительности тканей к канцерогенный воздействиям (В. Н. Лнхсимов. 1997. 1990). Так, при введении НИН в 15-месячном гозрасте у крыс обоего пола было выявлено зависимое от дозы увеличение частота опухолей кроветворной систены. уменьшение частота незенхимальных опухолей ночек, у самцов - уменьшение частоты опухолей толстой кишки. У самок - возникновение опухолей матки (не встречавшихся при воздействии ним в 3-несячном возрасте) и уменьшение частоты опухолей молочных желез по сравнению с животныни. подвергшимися воздействию соответствующих доз НИН в 3-месячной возрасте. При предварительном введении БДУ эффект ННН у старик крыс проявлялся аналогичным образон: у животных обоего пола происходило зависимое от дозы увеличение частоты развития опухолей кропетворной системы, у самцов - злокачественных опухолей легкого н мягких тканей и угнетение развития опухолей почек, .у самок - возрастала частота опухолей натки и уменьшалась частота злокачественных опухолей молочной железы по сравнению с хивотныни. подверппимися комбинированному воздействию БДУ и ННН в соответствующих дозах в 3-иесячнон возрасте.

Таким образон. было установлено, что с возрастом происходит в целом ослабление канцерогенеза, индуцируемого ННН. Однако, было отмечено как увеличение, так и уменьшение чувствительности отдельных органов и тканей старых крыс к действию этого канцерогена. а также появление опухолей, не встречающихся при. введении ним молодын животным. Предварительное введение . БДУ усиливало канцерогенное действие КИИ при его введении как в 3-. так и 15-месячной возрасте, ори этой, усиление канцерогенеза цроисходило в тканях, являвшихся мишенями для НИМ.

в иезенхималышк опухолях почек, индуцированных воздействием только БДУ или ННН. а также комбинированным их применением, не было обнаружено единого механизма активации протоонкогена К1-газ. более того, были обнаружены трансверзии пар оснований, не характерные для непосредственного воздействия БДУ на ДНЕ. Эти данные могут свидетельствовать о тон. что активация протоонкогена к1-газ обусловлена не прямын включением БДУ в ключевой кодон и вызванных непосредственно им нутаций, а является вторичным событием, следствием развивавшейся нестабильности генома.

Введение мышам другого химического канцерогена - 7ретапа. приводило к возникновению ааеиом легких в 66,7 7. у самцов и 5»,3 * у самок. При комбинированном воздействии бду и уретана

наблюдалось значительное усиление канцерогенеза а легком: аденомы были выявлены ч 99. ! к у сампоп и тз. 5 у. у самок. При этом увеличивалась и их множественность (рис. 3). v санпов этой группы также наблюдалось увеличение частоти появления аденокаршлюм легкого по сравнению со всеми осталышни группами.

Такин образом, при комбинированном действии БДУ и химических кагшерогенних попестн (НМН в разных дозах и возрастах у крнс. уретлна у ныпей) наблюдалось усиление канцерогенеза как по сравнению с контролен и животными, получавшими только БДУ. или подвергнутыми воздействию только НИМ или уретана. Инициирующий эффект пду сохранялся длительное время (при воздействии гол! через 14 иесяпсв после его последней ипьекпни).

У с, I мпо в к самок крыс, подвергшихся воздействию оро, наблюдалось достоверно»? увеличение как всех, так и только злокачественных опухолей по отношению к контрольный. При кон5иннрованнон розпейстяии БДУ. и оро наблюдалось резкое увеличение частоты злокачественных опухолей по сравнению со всеми остальными группами, а также любых опухолей, по сравнению с ' контрольными и голучавпини ЕДУ животными (табл. 1). оро приводило к увеличению частоты опухолей, типичных для крыс используемой Разводки. прежде всего новообразований желез • внутренней секреции, органов репродуктивной и генатопозтической системы, почек, кнпечлиха. комбинированное применение ВТ7 и оро вызывало усиление клипер«1 генного эффекта по сравнению с действием одного оро. У с.чмпоз достоверное увеличение частоты и/или уменьшение сроков появления опухолей имело несто в пынбаловой железе, почках и гематопоэтической системе, у санок - в матке, молочной железе и почках. Таким образом, при комбинированном применении БДУ и оро усиление канцерогенеза наблюдалось в тез же органах и тканях, как при воздействии одного оро.

у санок милей, подвергшихся неонатальноиу воздействию БДУ. к во- недельному возрасту наблюдалось достоверное увеличение, по сравнению с интактным контролем, частоты всег. только злокачественных и перпттпэ-ннохестврнных опухолей. Введение кьсяан СЧ сопровождалось увеличением по сравнению с контролен частоты псС1 или только ?лсг:,пестчеп1шк новообразований. Конбшшровс.нно:",' иеииат.1льнор ппог.ение кчтяам БДУ и последующие нньекшш ЭБ привели к о-гчетлипоиу потрнпировапиг их эффектов: частота развитая г|деиок.и-11иноч молочной железы у мшей этой группы составила

80,6 У. по сравнению с 15, в 7. у нылей, подвергшихся воздействию бду. v нылей контрольной группы развития аденокаршгаом нолочной х°лезы не наблюдалось. • Таким образом, неонатальпое воздействие вду у санок нишей balb/c усиливало капцерогешшй эффект эб в нолочной хелезе.

Таким образом, при комбинированном воздействии БДУ и канцерогенных агентов различной природы (химической, физической и гормональной) наблюдалось усиление капцерогенеза. наиболее выраженное в органах. являвшихся нишенянн для второго агента. Вместе с тем, у самцов и самок крыс во всех группах, подвергшихся воздействию ЕДУ, наблюдалось появление редких, не свойственных контрольным животным опухолей.

Таблица 1.

Сведения о продолжительности жизни и частоте возникновения новообразования у крыс, подвергшихся воздействию БДУ и/или WIM и ОРО, а также крыс-потомков

Воздействие Эффективное число КРЫС Средняя ПРОДОЛ- Число КРЫС С ОПУХОЛЯМИ Число КРЫС с Количество опухолей

ность яизнн (СУТКИ) Все Злокачественные множественными ОПУХОЛЯМИ Все Злокачественные

1 2 3 4 5 6 7 0

С А Н П Ы

Контроль 71 779116. 1 15/21. 1 4/5.6 5/7.0 20 4/20.0

БДУ 77 а«»» 633tl8.6 а» 25/32, 5 я««« 12/15.6 an 11/14.3 43 а» 12/34.3

Fl ' 42 а» 700t22. 3 a><i5>< 23/54.0 а««»б»« 11/26.2 а>а«б>> 11/26.2 43 11/25.6

19.

Продолжение таблицы 1.

1 г 3 4 .j 6 7 8

ИНН • 3-10 35 а* 713*22.4 аз« 12/34, 3 а«««з< 6/17, 1 5/14, 3 18 аз« 7/ЗВ.9

БДУ*ННН 3-10 37 а«««в« 639*19. 3 абви«« 23/62. 2 а»»бви« 10/27.0 а» »«бв» 10/27.0 35 а« 12/34. 3

ННН 3-50 27 SB»»« 384*17. 4 авк««« 18/66, 7 авк»« 14/51.9 ав»»» 9/33. 3 26 аьк«»« •7/65.4

БДУ*ННН 3-50 43 аб«»«г« 443*16,7 абг«»« дл»« « 37/86. 1 абг««" дл««« 35/81.4 абд«««г« 19/44.2 74 w6«««r* дл««« 54/73.0

КОНТРОЛЬ 18 нес 67 772*11, » 30/44.в 5/7.5 16/23.9 56 5/8.9

БДУ 18 нес 64 е»»« 713*7.9 е»«» 40/62.5 е» 10/15.6 16/25,0 66 10/15.2

ИНН 15-10 32 еаа» 734*12.9 15/46,9 е«« 7/21.9 8/25, 0 38 е» 8/21.1

БДУ'ННН 15-10 43 ез»«« 685*10,0 ез««« 26/60. 5 ея»»«з« 12/27.9 ез«»ж» 15/34.9 52 е««« 14/26.9

ННН 15-50 31 ез««« 690*12,5 ез*»«. 18/58.1 е««« 9/29.0 ез««* 17/54.8 53 е» 11/20.8

ПДУЧШН 15-50 35 ежик««» 627*11. 1 ежик««« 26/74.3 ежик««« 18/51. 4 ежи»««к* 16/45.7 53 ежик»«» 23/43.4

ОРО 35 719*22. 8 а«»• 19/54.3 а«»« 8/22, 9 а«>* 8/22, 3 34 9/26. 5

продолжение таблицы 1.

1 2 3 • 4 5 6 7 8

Г.ЛУ<ОРО 40 ам««> ьзг*гг. ь абн«»» 32/80. 0 ■1бИ»»» 18/45.0 аб«»»м>» 16/40.0 55 ам»»»б» 21/38.2

САМКИ

Контроль 79 72?.« 15.0 35/44.3 5/6. 3 1в/аг.в 63 5/7.9

ПДУ 107 а«»• 599* 1 5. 0 а«» 58/56. 3 а»«» 15/14.6 19/18.4 89 а» -15/16.9

Г' 45 а» 670*18.6 аб'*> 38/84.4 аб»» 11/24.4 аб»»» 18/40.0 70 а» 12/17.1

ним 3-10 35 676*21. в а»>з»»» 20/57.1 аз» 5/14.3 аз»»» 17/40.6 64 5/7.0

иду«ним 3-10 46 а» • ■он 592«21.6 ам»»«б» 29/63. 0 аб» В/17.4 а»•»6»» 16/34.0 58 а* 11/19.0

ими 3-50 35 ав»«» 406*23. 1 авк»»» 25/71.4 авк»«» 17/48. 6 авк»»» 21/60.0 07 ав»»« 25/28.7

ЕДУ«НИИ 3-50 33 абг»«» 402*24. 1 абгл»»» л». 27/81.8 абгд»«» л«» 22/66.7 абгл»»« 22/66. 7 82 абг»»д* 33/40. 2

Контроль 1в мес 63 В19*14.3 12/19.0 4/6. 3 4/6.3 16 4/25.0

ИДУ ш мес 45 е<>* 728*13. 6 е**> 21/46. 7 е»»» 10/22.2 е» 6/13. 3 29 е» 10/34,5

ним 15-10 42 е* ■ • 740*12.2 12/28.6 е» 6/14. 3 4/9.5 16 е» 6/37.5

Et.

Продолжение таблицы 1.

1 г 3 4 5 6 7 8

ПДУ «ИНН 15-10 44 РЭ***Ж** 666*11.7 ез*«» 24/54. 5 е«**ж*> 11/25.0 ежз*** 15/34. 1 49 14/28.6

НИИ 15-50 4t ез**« 680*10.6 е«*« 15/36.6 е***з* 9/22. 0 е* 5/12.2 21 е* * ■ 9/42. 9

ВДУМ1ИН 15-50 41 ежик«»« 604*5.9 ежик*«* 30/73.2 ежик*»« 20/40. 8 ежк*** 13/31.7 50 ежк*«« 23/46.0

ОРО 35 а»«« 622*19. 1 а*** 27/77.1 а*» 6/17. 1 а»** 16/45.7 03 Ö/9. 5

ВДУ«ОРО 35 а««» 629*18. 9 аб*•«н* 30/85.9 аб**«м* 10/28. 6 аби*** 23/65. 7 77 13/16.9

Примечания:

Разница между группами достоверна: а - по ovioncirn» к контрольный животным; б - по отношению к крысам, получатаим БДУ- в - по " отношению к крысам, получавзкм НИН в 3-месячнон возрасте в дозе ю мг/кг: г - по отношению к крысам, подвегшимся комбинированному воздействию БДУ и НИИ з 3-месячнон возрасте в дозе 10 кг/кг: а - по отновению к крысам, получавшим НИИ в 3-месячнон возрасте в дозе 50 мг/кг; с - по отиоаению к контрольным животны". прожившим более 18 месяцев: ж - по отновению к крысам, получавшим ЕДУ. и прожившим более 1в месяцев; э - по отношению к крысам, получавшем lftffl в 15-месячном возрасте в дозе 10 мг/кг: и - по отновеьию к крысам, подвегпимся комбинированному воздействию ЕДУ н НИИ в 15-месячном возрасте в дозе 10 мг/кг: к - по отношению к крысам, получавшим НИН в 15-месячном возрасте о дозе 50 мг/кг; л - по отноиению к крысам, подвергшимся комбинированному воздействию RCV н НИМ в 15-месячном возрасте в дозе 50 иг/кг: и - по отношению а крысам, полпегштмся воздействию 0P0; ■ - р < 0.05; •• - р < 0.01; •«• - р < 0.001.

п числителе - абсолютное число крыс или опухолей, в знапенателе -относительное, в х.

гг.

выводы

I синтетический аналог тимндина БДУ является слабым канцерогеном у крыс и нытпей при раннем постнатальиом введении и вызывает т крыс-потомков уродства и возникновение новообразования с большей частотой, чем в родительской поколении.

г. Анализ кинетики смертности крыс, подвергшихся раннену постна-тальному введению БДУ. и их потомков выявил независимую от возраста компоненту, обусловленную токсическим действием агента, и экспоненциально изненямпуюся в зависимости от возраста составляющую. свидетельствующую об ускорении старения подопытных популяций, которое сопровождалось постепенным развитием преждевременных возрастных нарушений репродуктивной Функции.

3. Постнатально введенный крысам БДУ включается в различные ткани организма пропорционально их нитотической активности, в течение нескольких ьией выводится из гонад и длительно персистирует в тканях с низкой нитотической активностью (почки, головной ноэг. стрональные клетки печени и селезенки).

4. Введение БДУ в раннем постнатальиом периоде приводит к увеличению частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови крыс по сравнению с интактным контролен.

5. Ранпсе постнатальное введение БДУ повышает чувствительность тканей-мишеней и организма в целом к последующим канцерогенным воздействиям н-нитрозонётилиочевины. уретана. облего рентгеновского облучения, эстрадиола-бензоата. Инициирующий эффект БДУ сохраняется. по крайней мере, в течение 1-го гола после его введения,

6. в мезенхиналмшх опухолях почек крыс, индуцированных БДУ и/или пин не обнаружено единого типа мутаций в 12 колоне протоонкогена Kl-ras.

7. совокупность полученных ванных свидетельствует в пользу гипотезы о достаточности индуцируемого БДУ изолированного повреждения ДНК. приводящего к развитию нестабильности генома, для инициации опухолевого гропесса и ускоренного старения.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации.

1. Осипова Р. в., Анисимоя В. И. Канцерогенез. индуцированный неонатальнын введением 5-бромо-2'-дезоксиуридина (ВДУ) и последующим воздействием нитрозоиетилмочепины (КНМ) г крыс // В кн.: Республиканская научная коиФсреипия "Механизмы кандеро- и леякозогенеза*. Тезисы докл. •• Киев. - 1990.- с. 12-13.

2. осипова Г. о.. Аписииоп в. Н. Влияние 5-броио-2'-дезоксиуридина на процесс старения у крыс // в кн. : "Продолжительность жизни: механизмы, прогнозы, п/ти увеличения". Тезисы докд. всесоюзной конференции. - Киев. - 1991.'- й. 101.

3. Ward J. И., ttenneman J. К.. Osipova G. Tu.. Anlslmov П. Persistence of S-bromo-ci'-deoxruridlne in tissues of rats after exposure in earlr life // Toxics 1 oar. - 1991.- Vol. TO. - P. 345-352.

4. Анисимоо В. H.. Осипова P. Ю. сокрапепие продолжительности жизни крыс под влняпиек 5-броно-2'-лезокскуридина // Проблемы старения П долголетия. - 1992. - Т. 1. - Н 2. - С. 147-154.

5. осипова Г. D.. Анпскмов В. К. Капцерогенез. пндупированпый неонатальнын введением з-бромо-г'-дезоксиуридина и последушнм воздействием п-китрозометнлмочевины у крыс // Вопр. опкол. - 1992. -Т. 38. - Н 2. - С. 195-204.

в. Осчповз Г. Ю.. Анисииов а И. Канцерогенез, индуцированный неонатальнын введенной 5-бромо-2'-дезоксиурндипа и последукаим воздействием эстрадиола бензоата у санок ныаей BALB/c // i3onp. ОПКОЛ. - 1992. - Т. 38. - П 3. - С. 320-327.

7. Анисимоо В. И.. OcnnoDa Г. Р. Ускоренное старение п капцерогенез у крыс двух поколепия. пызывашше введепиен 5-броно-2'-дезокси-уридина (ВЛУ) в раннем возрасте // В кп. : "Ускоренное старение, связь с возрастной патологией". Тезисы докл. пауч. копФ. - Клев. -1992.-С. т.

в. Осипова Г. С., Лннсимов в. Н. Канцерогенез, индуцированный иеоиатадьным введением Ъ-Ьроно-2'-дезоксиуридина и последующим воздействием уретана у мышей BALB/c // Вопр. онкол. - 1992. - Т. 90. -* 7. - С. 704-Т11.

9. Anislnov V.H., Oslpova G. Vu. Effect of neonatal exposure to 5-bromo-2*-deoxrurldlne on life span, estrus function and tuoor development in rats - an areuroent in favor of the natation theory of аяШНТ // Mutât. Bee. - 1992,- vol. 275. - P. 97-110.

10. Aniaimov v. H., oslpova G. Vu. Two-step carcinogenesis induced by neonatal exposure to S-brooo-2'-deoxruridine and subseqent administration of urethan in BALB/c mice ft Cancer Letter. • 1992.-V. 64. - P. 75-62.

"b/7 Ô tit t. w 2ч/,; fi