Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование биологической активности ампассе, кальциевой соли n-(5-гидроксиникотиноил)-l-глутаминовой кислоты

КИСЕЛЕВ АЛЕКСЕЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АМПАССЕ, КАЛЬЦИЕВОЙ СОЛИ N-(5-ГИДРОКСИНИКОТИНОИЛ)-Ь-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 6 пДР ¿014

МОСКВА 2014

005545750

Работа выполнена в Институте Химической Физики РАН им. H.H. Семенова

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор физико-математических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторий психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической фармакокинетики Научного центра неврологии РАМН Ведущая организация: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова

Защита состоится «^р» апреля 2014 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН.

Автореферат разослан^?»)) февраля 2014 г.

Сергиенко Валерий Иванович

Стовбун Сергей Витальевич

Воронина Татьяна Александровна

Сариев Абрек Куангалиевич

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Николаева Ирина Сергеевна

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Каждый год от болезней, сопровождающихся нейродегенерацией, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, цереброваскулярные расстройства, инсульты, травмы и др., погибают или становятся нетрудоспособными миллионы людей в мире. В частности, в ряде стран болезнь Альцгеймера занимает одно из первых мест среди других болезней в качестве причины смерти (Brookmeyer R., Johnson Е. et al., 2007). Инсульт занимает третье место среди болезней, вызывающих смерть пациентов, а травмы мозга являются наиболее частыми заболеваниями, приводящими к нетрудоспособности лиц в молодом возрасте (СкворцоваВ.И., 2013).

Препараты с ноотропным действием, применяемые в настоящее время для лечения когнитивных расстройств, недостаточно эффективны. Выделяют истинные ноотропы, ведущее свойство которых - улучшение когнитивных функций, и ноотропоподобные средства - препараты поливалентного комплексного нейропротективного действия (Воронина Т.А.и Середенин С.Б., 1993). Препараты с нейропротективным действием часто направлены только на локализацию драматических последствий. Однако у ряда имеющихся лекарственных препаратов нейропротективные свойства выражены довольно слабо; также они обладают побочными действиями, ограничивающими возможности их длительного и широкого применения. А терапевтический эффект ноотропов наступает только через продолжительный срок применения и требует достаточно высоких доз.

Эффекты нейропротективных средств могут реализоваться за счет церебральной вазодилатации (ницерголин), антагонизма кальциевых каналов (нимодипин), антиоксидантного действия (мексидол), влияния на ГАМК-систему (пантогам), активации метаболизма (ацетил-Ь-карнитин), ингибиро-вания микроглии (НПВС), активации нейрогенеза (ростовые факторы) и др. Эффект ряда ноотропных средств опосредуется через нейромедиаторные си-

стемы мозга среди которых наибольшее значение имеют моноаминергиче-ская, холинергическая, глутаматергическая (Ковалев Г.И., 1993, Zhao, 2001, Marchi, 1992, Петров В.И., 2003, Бачурин С.О., 2008, Григорьев В.В., 2008). Эффективны подходы поиска нейропротекторов и когнитивных стимуляторов, основанных на представлениях о важнейшей роли NMDA и АМРА типов глутаматных рецепторов в механизмах памяти и выживании нейрона. В настоящее время активно разрабатываются препараты для лечения когнитивных расстройств и нейродегенеративных процессов с глутаматергическим механизмом действия.

Очевидно, что фармакологическая коррекция нейродегенеративных расстройств, сопровождающихся развитием неврологического и когнитивного дефицитов, относится к одной из наиболее важных проблем фармакологии и неврологии.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение нейропсихотропных свойств кальциевой соли Ы-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ампассе) в качестве потенциального лекарственного средства.

Задачи исследования:

1. Изучение нейропротективных эффектов ампассе на модели массивной кортикальной ишемии на крысах.

2. Изучение нейропротективных эффектов ампассе на модели посттравматической интрацеребральной гематомы (геморрагический инсульт) на крысах.

3. Изучение эффектов ампассе у крыс на модели естественного старения.

4. Изучение эффектов ампассе на модели болезни Альцгей-мера у крыс.

5. Изучение антиалкогольных свойств ампассе в условиях острого алкогольного отравления на крысах.

6. Изучение антиамнестического действия ампассе на моделях амнезии условного рефлекса пассивного избегания, вызванной скополамином и максимальным электрошоком.

7. Изучение влияния ампассе на процессы памяти на модели условнорефлекторного обучения крыс питьевому рефлексу в Т-образном лабиринте.

8. Изучение процессов толерантности при хроническом применении ампассе и синдрома отмены при отмене его длительного введения.

Научная новизна работы

В работе впервые выявлены нейропротективные, антиамнестические и антиалкогольные свойства нового оригинального соединения кальциевой соли К-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты. Показано, что ампассе при однократном и длительном введении способно корректировать когнитивные и неврологические нарушения, возникающие при различных моделях патологии (инсульты, ишемия мозга, экспериментальная болезнь Аль-цгеймера, изменения сопряженные с процессами естественного старения). Антиамнестические эффекты препарата исследования сопоставимы или превышают таковые у препарата сравнения пирацетама. При длительном применении ампассе не развиваются толерантность и синдром отмены после прекращения применения.

Научно-практическая значимость

Экспериментальные результаты, полученные в настоящем исследовании, позволяют рассматривать кальциевую соль Ы-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты в качестве перспективного соединения для создания безопасного эффективного лекарственного средства, обладающего нейропротекторными и ноотропными свойствами. Ампассе может быть использовано для лечения ряда заболеваний и состояний (инсульты, абстинент-

ный синдром, дисциркуляторная энцефалопатия, болезнь Альцгеймера и другие). Материалы диссертационной работы вошли в регистрационное досье препарата ампассе для подачи в Минздрав РФ.

Положения выносимы на защиту

1. Ампассе обладает выраженным нейропротективным эффектом на модели массивной кортикальной ишемии и модели геморрагического инсульта.

2. Ампассе на модели естественного старения и модели болезни Альцгеймера устраняет когнитивные и неврологические нарушения.

3. Ампассе проявляет отчетливые антиамнестические свойства в условиях острого алкогольного отравления и амнезий вызванных скополамином и максимальным электрошоком.

4. Ампассе при длительном введении проявляет выраженные ноо-тропные свойства.

5. Ампассе при хроническом введении в терапевтических дозах не приводит к появлению, неврологических побочных эффектов.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре Института Химической Физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук, 11-ом Региональном съезде ECNP (Санкт-Петербург, 2011); 14-ом биеннале EBPS (Amsterdam, 2011); XXIII симпозиуме «Современная Химическая Физика» (Туапсе, 2011); Международном конгрессе «28th World CINP Congress of Neuropsychopharmacology» (Stockholm, 2012).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 7 печатных работах: 4 статьи - в журналах рекомендованных ВАК; 3 публикации - в трудах конференций и съездов.

Личный вклад

Автор является непосредственным исполнителем всех этапов проведенного исследования: поиска и анализа литературы по теме диссертации, проведения радиолигандного анализа, поведенческих экспериментов, обработки и анализа полученных результатов, формулирования положений и выводов работы. При активном участии автора подготовлены основные публикации по материалам диссертации.

Структура и объём работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 3 рисунка. Библиографический указатель включает 145 отечественных и иностранных источников.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования

В исследовании были использованы самцы белых беспородных крыс (массой 180-220 г) и мышей (массой 18-22 г), крыс инбредной линии \Vistar, самцы и самки (массой 200-230 г), мышей инбредной линии С57В1/6; линии Ва1Ь/с (самцы и самки, вес 18-20 г), мыши-гибриды (СВАх С57В16). Экспериментальных животных содержали с предоставлением свободного доступа к корму (полный рацион экструдированного брикетированного корма, ГОСТ Р 50258-92) и питьевой воде. Во всех экспериментах использовали группы от 10 до 20 животных. Содержание животных в виварии соответствовало правилам лабораторной практики (вЬР) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики». При работе с животными соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

Препарат исследования - ампассе (кальциевая соль N-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты) - оригинальный препарат разработан и запатентован группой российских ученых (Патент № 2314293 авторы Якимук П.В. Стовбун C.B. Литвин A.A. от 10.01.2008г). Вещество вводили внутривенно (в/в) или внутрибрюшинно (в/б) в водном растворе или 0,9% физиологическом растворе. В качестве препаратов сравнения были использованы пирацетам (Шрея Лайф Саенсиз Пвт. Лтд., Индия), мексидол (Фарма Софт), которые вводили аналогично препарату исследования. Животные контрольных групп получали дистиллированную воду или физиологический раствор.

Фармакологические свойства веществ изучены согласно «Методическим рекомендациям по доклиническому изучению фармакологической активности новых веществ», 2005.

Для моделирования локального кровоизлияния (модель геморрагического инсульта) в головном мозге крысам, наркотизированным хлоралгидратом (350 мг/кг, в/б), осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы, с последующим (через 2-3 минуты) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02- 0,03 мл) (Макаренко А.Н., 2009).

При моделировании массивной кортикальной ишемии (ишемический инсульт) животным проводили перевязку левой сонной артерии, а затем при использовании микроскопа (увеличение 14.0x3.3) выполняли окклюзию средней мозговой артерии (ОСМА), проксимальнее места её бифуркации на фронтальную и париетальную ветви. Через 72 часа после ОСМА животных декапитировали, затем исследовали серию фронтальных срезов полушария головного мозга и определяли объём зоны поражения (Chen et al., 1986).

Для моделирования болезни Альцгеймера у белых беспородных крыс формировали холинергический дефицит при в/б введении в течение 20 дней М-холиноблокатора скополамина (1 мг/кг/день). Исследуемые вещества вводили с

21-го по 30-й день (Буров Ю.В. и соавт., 1991; Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

Для моделирования естественного старения использовали белых беспородных крыс самцов линии Вистар в возрасте 24 месяцев (массой 450-600 г). Исследуемые вещества вводили старым крысам в/б в течение 2-х месяцев, а затем оценивали влияние вещества на нарушенные старением обучение и память и неврологический дефицит в сравнении с группой животных аналогичного возраста, получавших курс инъекций физиологического раствора (контрольные животные), а также с половозрелыми крысами в возрасте 3 месяца (массой 250-300 г) (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

Острую гипобарическую гипоксию моделировали в проточно-вытяжной барокамере. Гипоксию с гиперкапнией в гермообъеме создавали путем помещения животного в герметично закупоренную стеклянную емкость объемом 200 мл. Регистрировали продолжительность жизни животных в условиях гипоксии (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

Модель ареколинового тремора основана на способности холиномиме-тика ареколина в высокой дозе, активировать холинергические нейроны, что приводит к появлению у мышей тремора, имеющего холинергическую природу. Ареколин вводили подкожно в дозе 25 мг/кг. Исследуемые препараты вводили в/б за 40 минут до ареколина. Оценивали время наступления и продолжительность тремора.

Обучение и память крыс исследовали на модели условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), на модели условного рефлекса с использованием Т-образного лабиринта с питьевым вознаграждением, на модели условной реакции активного избегания (УРАИ) в «Шаттл - боксе» (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

Для оценки антиамнестических свойств соединений использовали методику амнезии УРПИ у крыс, вызванной максимальным электрошоком (МЭШ). МЭШ применяли непосредственно после обучения через корниаль-

ные электроды. Для получения экспериментальной амнезии, вызванной ско-

9

поламином, крысам за 15 минут до обучения УРПИ вводили внутрибрюшин-но блокатор М-холинергических рецепторов в дозе 2,0 мг/кг (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

Для оценки уровня тревожности был использован приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Pellow et al., 1985).

Неврологический статус крыс определяли с использованием шкалы Stroke-index McGrow (Ганнушкина И.В., 1977).

Для анализа нарушения координации движений был использован тест вращающегося стержня. Для определения миорелаксантных свойств соединений также был использован тест подтягивания на горизонтальной перекладине. Для определения болевой чувствительности и агрессивности у крыс использовался метод регистрации порогов болевой чувствительности и агрессивности, вызванной электроболевым раздражением пары крыс (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005).

Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности животных проводилась с использованием методики открытого поля (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005).

Для оценки возможных проявлений синдрома отмены ампассе в дозе 50 мг/кг вводили крысам в/б в течение 28 дней, а затем ампассе отменяли и через 24 и 48 ч оценивали уровень тревожности, агрессивности, судорожной готовности, ориентировочно-исследовательское поведение и пороги болевой чувствительности.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы "Biostatistics III" с использованием параметрических и непараметрических методов Стьюдента, Вилкоксона, Манна - Уитни, Крускала-Уолиса, ANOVA.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование эффекта ампассе на площадь ишемического поражения

коры на модели массивной кортикальной ишемии показало, что у контроль-

10

ных животных, получавших физиологический раствор после ишемии, общий объем поражения составлял 20,17±3,12%, а максимальное ишемическое повреждение имеет место на уровне 2-го и 3-го срезов. Ампассе (20 мг/кг) после 4-х кратного введения у ишемизированных животных вызывал достоверное уменьшение объема повреждения на уровне трех первых срезов. При этом, общая площадь поражения после использования ампассе (10,54±1.84%) снизилась в сравнении с контрольными животными на 47,3% (р< 0.05). Мексидол оказывал эффект в более высокой дозе 100 мг/кг и вызывал менее выраженные изменения.

Воспроизведение УРПИ у крыс через 3-е суток после обучения показало, что в контрольной группе животных (без ишемии) сохранялся памятный след у 80% крыс; в группе с массивной кортикальной ишемией об ударе током помнили только 20% животных (Рис.1). Ампассе в используемой дозе 20 мг/кг статистически достоверно увеличивал количество обучившихся животных (р <0,05), что составило 68,3% крыс. Мексидол, также способствовал увеличению обучившихся УРПИ крыс, достоверно увеличивая процент помнящих об ударе током животных (Рис.1).

Исследование влияния ампассе на гибель и неврологический дефицит крыс с геморрагическим инсультом (ГИ) показало, что в группе ложно оперированных крыс к 14-му дню погибло лишь 7% животных, а в группе с ГИ этот показатель составил 64%, при этом в первые трое суток погибло более 56% животных. Ампассе в дозе 10 мг/кг почти полностью предупреждал гибель животных на протяжении всего времени наблюдения, и к 14-у дню число погибших составило всего 10% животных. Мексидол в дозе 100мг/кг в два раза (р <0,05) снижал гибель животных, и к 14 суткам погибло 30% крыс.

Исследование неврологического статуса выживших животных с использованием шкалы Stroke-index McGrow показало, что в контрольной группе животных с ГИ в первый день наблюдения тяжелая симптоматика (парезы, параличи) отмечалась у 20%, и нарастала в течение всего времени наблюдения. В результате, к 14-му дню этот показатель составил 50% животных.

11

Ампассе существенно уменьшал количество крыс с тяжелой симптоматикой, и предотвратил их развитие в критические дни инсульта (3-й, 7-е и 14-е), тем самым ослабляя неврологический дефицит. Таким образом, к 14-у дню этот показатель составил 5%. Мексидол уменьшил долю животных с тяжелыми симптомами (парезы) до 20%.

Рис. 1. Влияние веществ на воспроизведение УРПИ у крыс с окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) через 3 суток после обучения. 1 -контрольная группа, 2 - крысы с ОСМА, 3 - Ампассе 10 мг/кг у крыс с ОСМА, 4 - Мексидол 80 мг/кг у крыс с ОСМА. *- отличие от контрольной группы при р<0,05; # - отличие от группы крыс с ОСМА при р< 0,05 (точный критерий Фишера).

Установлено, что при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения животные в группе интактных и ложнооперированных крыс помнили об ударе током и не заходили в темную "опасную" камеру, а через 14 суток -65 % крыс осуществляли рефлекс. Крысы с ГИ при воспроизведении рефлекса через 14 суток после обучения забывали ситуацию и заходили в темную камеру, при этом обучилось УРПИ только 8% животных. Эти данные свидетельствуют о нарушении консолидации навыка у крыс с ГИ. В группе крыс с ГИ, получивших ампассе в дозе 20 мг/кг, наблюдалось увеличение латентного времени рефлекса при воспроизведении УРПИ на 14 сутки после обучения, а количество животных, не зашедших в темную камеру, увеличился до 52% (р<0,01). Сходным эффектом обладал мексидол в дозе 100 мг/кг, на фоне

которого наблюдалось увеличение количества обучившихся крыс до 40%(р<0,05) (Таблица! ).

Таблица 1. Влияние веществ на обучение крыс условному рефлексу пассивного избегания после инсульта

Группы животных Воспроизведение УРПИ ч/з: 24 часа Воспроизведение УРПИ ч/з: 14 суток

Латентное время захода в темную камеру, (с) Количество животных не вошедших в темную камеру, % Латентное время захода в темную камеру, (с) Количество животных не вошедших в темную камеру, %

Интактные 174,2 ± 24,5 80 124,3 ± 26,5 65

Ложно оперированные 140,3 ± 18,4 70 105,1 ±21,7 57

ГИ 126,7 ± 17,5 60 29,6 ±7,6** 8-

ГИ + ампассе в дозе 20 мг/кг 128,1 ± 17,6 63 98,9 ± 21,3 # 52$$

ГИ +мексидол, в дозе 100 мг/кг 130,4 ±20,1 60 62,9 ± 16,1 # 40$

Достоверность отличий между группой ложно оперированных животных и крыс с ГИ: ** - при р<0,01 (U - критерий Манна-Уитни), • - при р<0,01 (yl ); достоверность отличий между группой крыс с ГИ и животными с ГИ + ампассе, при: $ -р<0,05; $$ - при р<0,01 (х2)

На модели естественного старения показано, что молодые половозрелые крысы (3-х месячного возраста) при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения в 80% случаев не заходили в темную камеру или заходили с большим латентным временем рефлекса. В группе старых 24-х месячных крыс условный рефлекс воспроизводили только 30% животных, остальные крысы заходили в темную опасную камеру с коротким латентным временем рефлекса, что свидетельствует о нарушении у крыс обучения и памяти. Старые крысы, получавшие ампассе в дозе 20 мг/кг/бОдней, при воспроизведении осуществляли рефлекс в 64% случаев. Отчетливым эффектом обладал и мексидол в дозе 150 мг/кг/бОдней, улучшая у 50% крыс процесс воспроизведения памятного следа. Ампассе и мексидол также увеличивали ла-

тентное время захода в темную опасную камеру. Таким образом, ампассе обладает выраженным геропротекторным действием в опытах на старых 24-х месячных крыс, улучшая процессы обучения и памяти при выработке УРПИ и ослабляя неврологический дефицит. Сходным, но менее выраженным эффектом обладает мексидол.

Показано, что 100% молодых животных успешно обучались удерживаться на вращающемся (2 об/мин) стержне с первых пяти попыток; 25% старых крыс обучались этому навыку начиная с 11-й по 15-ю попытки. Старые крысы, получавшие в течение 2-х месяцев ампассе, к 10 попытке обучились навыку в 60% случаев, а у животных, получавших мексидол, навык восстанавливался к 10-ой попытке в 40% случаев.

На модели болезни Альцгеймера, где дефицит холинергической системы достигался длительным введением скополамина, установлено, что в контрольной группе крыс, получавших в течение всего эксперимента только физиологический раствор, уровень обученности УРАИ к 5-му дню составлял 77 %. Обучение УРАИ животных группы активного контроля (получавших ско-поламин) проходило значительно медленнее, чем в группе пассивного контроля. На пятый день обучения средний уровень реакций избегания у животных с холинергическим дефицитом составил 27,2%. При этом у животных, длительно получавших скополамин, на протяжении всего обучения было высоким количество отказов от выполнения как условных, так и безусловных реакций: на 4- и 5-й дни в 6,3 и 9,1 раз больше, чем у крыс, не получавших скополамин (р<0,05).

Использование ампассе в дозе 40 мг/кг/10дней предотвратило ухудшение обучения УРАИ, характерное для животных активного контроля (получавших скополамин).

120

100

" I

I с 5 попытки

I с 10попытки

I с 15 попытки

Т

1)"

ЛГ

(V

г"

Рис. 2. Влияние веществ на координацию движений старых крыс (в возрасте 24 месяцев) в тесте вращающегося стержня. Вещества вводились в течение 10 дней. * - достоверность отличий между группами молодых и старых животных при р<0,05; # - достоверность отличий между группами контрольных старых крыс старых животных, получавших вещества при р<0,05 (х2). Контроль , Зм - крысы в возрасте 3 месяцев, дистиллированная вода; контроль, 24м - крысы в возрасте 24 месяцев, диет, вода; старые крысы в опытных группах получали ампассе 20 мг/кг и мексидол 150 мг/кг.

1 2 3 4 5

Дни обучения

Физ. р-р. _ — ♦— Скопопамин

Рис. 3. Динамика формирования УРАИ у крыс на фоне длительного введения ско-поламина. *, ** - р<0,05 и р<0,01 относительно контроля.

_ 1 ______2____3 _ ____ 4 ___5

I__ ■ Контроль___—» -Скополамин !

Рис. 4. Количество отказов животных от выполнения адекватных реакций в процессе формирования УРАИ на фоне холинергического дефицита. *- р<0,05 относительно контроля.

Под действием соединения скорость формирования навыка была выше во все дни обучения. Наиболее выраженный эффект наблюдался во второй день обучения, когда число реакций избегания в опытной группе было в 7,5 раз больше, чем у животных с холинергическим дефицитом (р<0,01). При этом на фоне ампассе статистически значимых различий по числу реакций избегания относительно животных пассивного (интактного) контроля не отмечалось, что дополнительно свидетельствует о полном восстановлении способности к обучению у крыс с холинергическим дефицитом (Таблица 2). Пира-цетам в дозе 300 мг/кг вызывал лишь тенденцию к увеличению доли успешно обучившихся животных.

При исследовании влияния веществ на обучение УРПИ крыс с холинергическим дефицитом, установлено, что в контрольной группе крыс, получавших в течение всего эксперимента дистиллированную воду (пассивный контроль), при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения 80% животных помнили об ударе током и не заходили в темную «опасную» камеру в течение всего времени наблюдения. В группе крыс, получивших до обучения скополамин (активный контроль), при воспроизведении рефлекса через 24 часа обучилось только 30 % животных. У крыс, получавших после отмены скополамина ампассе, доля животных, не зашедших в темную камеру,

увеличивалась по сравнению с группой крыс, подвергшихся действию ско-поламина до 66%. Пирацетам в данных условиях оказывал менее выраженный эффект, чем ампассе (44%).

Таблица 2. Влияние веществ на способность крыс обучаться УРАИ на фоне хо-линергического дефицита.__

Группы животных (доза) Доля крыс с критерием обученности (%)

Пассивный контроль (физ. р-р.) 77

Активный контроль - скополамин (2мг/кг + ф-з. р-р.) 20*

Скополамин + ампассе (2мг/кг + 40 мг/кг) 70 #

Скополамин + пирацетам (2мг/кг + 300 мг/кг) 46

*- отличие от пассивного контроля, при р<0,05 (по точному критерию Фишера); # - отличие от активного контроля, при р<0,05 (по точному критерию Фишера).

Во время исследования влияние ампассе на ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное статус крыс с холинергиче-ским дефицитом, было установлено, что при тестировании животных в условиях методики «открытого поля» у крыс с холинергическим дефицитом (группа активного контроля) отмечалось изменение исследовательского поведения в виде уменьшения (в 2,2 раза, р< 0,05) числа обследований отверстий. Ампассе обладал способностью предупреждать развитие этих нарушений, увеличивая число обследований отверстий до уровня показателей у группы пассивного контроля. Пирацетам в этих условиях не оказывал влияния на поведение крыс с холинергическим дефицитом.

Изучение у крыс с холинергическим дефицитом уровня тревожности проводили в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). Показано, что у животных активного контроля (со скополамином) в сравнении с пассивным контролем (физ. р-р) наблюдалось уменьшение в 10 раз (р<0,05) основного показателя поведения - времени, проведенного крысами в открытых рукавах; уменьшение двигательной активности, регистрируемое по числу переходов

(р<0,05). Кроме того, в группе крыс активного контроля отмечалось уменьшение времени, проведенного крысами на центральной площадке и уменьшение количества вертикальных стоек. Ампассе оптимизировал поведение крыс с холинергическим дефицитом в условиях приподнятого крестообразного лабиринта, увеличивая основной показатель - время в открытых рукавах (в 5 раз, р<0,05), а также время на центральной площадке (в 2 раза, р<0,05). Пирацетам не оказывал влияние на эмоциональные нарушения крыс с холинергическим дефицитом.

У крыс контрольной группы, длительно получавших скополамин, при оценке поведения по шкале МС Grow отмечались отклонения, свидетельствующие о неврологическом дефиците: у 50% крыс регистрировались слабость и вялость движений, односторонний полуптоз, односторонний птоз. В группе животных получавших ампассе подобные нарушения наблюдались у 22% животных.

При изучении влияния ампассе на тремор, вызванный холиномимети-ком ареколином, показано, что в контроле ареколин в дозе 25 мг/кг вызывает тремор уже через 20 секунд, длительность которого составляет 14-21 минут. Ампассе во всех изученных дозах (0,1; 10; 30 мг/кг) не обладал способностью ослаблять или потенцировать продолжительность и время наступления тремора, вызванного ареколином.

При исследовании когнитивных нарушений, вызванных острой алкогольной интоксикацией, было установлено, что этанол в дозе 2 г/кг достоверно уменьшал (в 5,6 раза) время удерживания крыс на вращающемся стержне, что характеризуется как нарушение координации движений и свидетельствует о выраженном неврологическом дефиците. Ампассе в дозе 10 и 20 мг/кг и мексидол в дозе 100 мг/кг при однократном в/б введении не вызывали нарушения координации движения у крыс в тесте вращающегося стержня. Ампассе в дозах 10 и 20 мг/кг существенно ослаблял проявления неврологического дефицита, вызванного этанолом, уменьшая количество падений животных с вращающегося стержня. Под влиянием ампассе в дозе 10 мг/кг время

18

удерживания на вращающемся стержне достоверно увеличивалось в 4,2 раза, а с увеличением дозы до 20 мг/кг увеличилось в 3,0 раза по сравнению с контрольными животными, получившими этанол. Мексидол в дозе 100 мг/кг у крыс, получивших этанол, достоверно увеличивал (в 3,8 раза) время удерживания животных на вращающемся стержне по сравнению с контролем при введении одного этанола.

Установлено, что этанол в дозе 2 г/кг вызывал достоверное снижение вертикальных перемещений и числа обследованных отверстий, что характеризует нарушения ориентировочно-исследовательского поведения у животных, а увеличение числа выходов в центр открытого поля отражает анксио-литическое действие этанола. Ампассе в дозе 10 и 20 мг/кг, как и мексидол в дозе 100 мг/кг, при однократном в/б введении достоверно не изменяли число горизонтальных и вертикальных перемещений и обследованных отверстий в тесте открытого поля по сравнению с интактным контролем. Под влиянием ампассе в дозе 10 и 20 мг/кг и мексидола в дозе 100 мг/кг наблюдалось достоверное увеличение числа выходов в центр открытого поля, что свидетельствует об анксиолитическом действии препаратов. Ампассе в дозе 10 мг/кг на фоне этанола достоверно увеличивал горизонтальную и вертикальную двигательную активность и число обследованных отверстий по сравнению с показателями группы крыс при введении одного этанола, что свидетельствует о способности ампассе ослаблять нарушение двигательного и ориентировочно-исследовательского поведения, вызванное этанолом. При увеличении дозы ампассе до 20 мг/кг препарат не проявлял антиалкогольного эффекта ни по одному из показателей. Мексидол в дозе 50 мг/кг оказывал отчетливое антиалкогольное действие в тесте открытого поля, которое проявлялось в повышении вертикальных перемещений и числа обследованных отверстий по сравнению с показателями при введении одного этанола. Мексидол в дозе 100 мг/кг не оказывал антиалкогольного эффекта ни по одному из показателей.

Показано, что при воспроизведении УРПИ через 24 часа у животных этанол в дозе 2 г/кг вызывал отчетливую амнезию рефлекса, что выражалось в достоверном уменьшении латентного времени захода в темную камеру и в уменьшении процента животных, не зашедших в темную камеру по сравнению с показателями интактного контроля. Ампассе в дозах 10 и 20 мг/кг и Мексидол в дозе 100 мг/кг не изменяли выполнение УРПИ при его воспроизведении через 24 часа. Ампассе в дозе 20 мг/кг уменьшал амнезию, вызванную этанолом, достоверно увеличивая латентное временя захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса через 24 часа по сравнению с показателями при введении одного этанола. В дозе 10 мг/кг ампассе не оказывал антиамнестического эффекта. Мексидол в дозе 100 мг/кг также оказывал ан-тиамнестическое действие, увеличивая латентное время захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса по сравнению с показателями крыс, получивших только этанол.

В условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме средняя продолжительность жизни контрольных животных составила 14,3 минуты. Ампассе статистически достоверно увеличивал продолжительность жизни мышей линейно в дозо-зависимой манере (30, 60 и 120 мг/кг) до 18,1 минут на модели гипоксии в гермообъеме. Мексидол проявлял свои антигипоксические свойства в дозе 150 мг/кг, увеличивая продолжительность жизни мышей до 17,8 минут. В условиях гипобарической гипоксии средняя продолжительность жизни контрольных животных составляет от 3,6-4,2 минуты. Ампассе в исследуемых дозах более чем в 2 раза (Р<0,05) увеличил продолжительность жизни мышей. Эффект мексидола был сравним с группой животных, получивших ампассе.

Изучение влияния ампассе на обучение в Т-образном лабиринте показало, что вещество практически не влияло на формирование памятного следа у животных с 1 по 10 сеанс обучения. Однако, в дальнейшем, с 11 по 20 сеанс, крысы под влиянием ампассе выполняли рефлекс значительно быстрее (в среднем в 2 раза), чем контрольные животные. Пирацетам также способ-

20

ствовал обучению питьевому рефлексу крыс, но начиная с 16 сеанса обучения.

Для изучения антиамнестического эффекта ампассе использовались модель амнезии УРПИ, вызванная скополамином; а также модель амнезии УРПИ, вызванная максимальным электрошоком (МЭШ).

В группе контрольных животных, получавших физиологический раствор, латентное время воспроизведения УРПИ составило 112,6±23,0 с, а доля не зашедших в темную камеру крыс - 90%. Скополамин вызывал нарушение воспроизведения полученного навыка, что проявлялось уменьшением латентного периода рефлекса (26,6±6,3 с) и количеством не зашедших в темную камеру установки животных (10%). Ампассе в дозах от 10 до 50 мг/кг линейно усиливал антиамнестические свойства у животных при воспроизведении УРПИ через сутки после обучения, достоверно увеличивая латентное время рефлекса и количество животных, помнящих об «опасной» камере. Пирацетам при воспроизведении УРПИ у крыс статистически достоверно увеличивал латентное время рефлекса и количество обучившихся животных лишь в дозе 600 мг/кг.

В контрольной группе крыс с МЭШ при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения 13 % животных помнили об ударе током и не заходили в темный отсек камеры, тогда как в группе интактных (без МЭШ) животных этот показатель составлял 88 %. Ампассе в исследуемых дозах дозозависимо увеличивал оба показателя поведения крыс (Р<0,05): латентное время рефлекса (до 118с) и число животных, не зашедших в темную камеру при воспроизведении рефлекса (до 83%). Исследование пирацетама показало, что препарат в дозе 300 и 500 мг/кг статистически достоверно увеличивал как латентное время рефлекса, так и количество животных, не зашедших в темную «опасную» камеру установки (Таблица 3).

Установлено, что ампассе в дозе 50 мг/кг при однократном введении

крысам оказывает выраженное антиамнестическое действие на модели

скополаминовой амнезии, увеличивая в 3,5 раза количество

21

воспроизводящих рефлекс животных. Хроническое введение ампассе 50мг/кг в течение 28 дней практически полностью реверсирует амнезию, вызванную однократным введением скополамина, увеличивая количество обучившихся животных до 90 %.

Таблица 3. Антиамнестическое действие ампассе на модели амнезии УРПИ, вызванной максимальным электрошоком (МЭШ) при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения.___

Вещество Доза, мг/кг Латентное время рефлекса, (с) Время, проведенное на освещенной площадке, (с) Доля крыс, не зашедших в темную камеру, (%)

Контроль — 104,4 ±14,5 105,4 ±14,6 88

Контроль + МЭШ — 35,3 ±5,3# 35,3 ±5,3# 13&

Ампассе + МЭШ 5 94,6 ±16,8* 94,6 ±16,8* 64$

Ампассе + МЭШ 25 110,4 ± 19,5 * 126,3 ±18,1 * 80S

Ампассе + МЭШ 50 118± 16,4* 118± 16,4 * 83$

Пирацетам + МЭШ 300 94,5 ± 15,1 * 94,5 ±15,1 * 60$

Пирацетам + МЭШ 500 101,0 ±17,9* 101,0±17,9* 70$

# - достоверность отличий от контроля без МЭШ, при р<0,05 (и-критерий Манна-Уитни), & - достоверность отличий от контроля без МЭШ, при р<0,05 (Критерий х2), * - достоверность отличий от контроля с МЭШ при р<0,05 (и-критерий Манна-Уитни); & - достоверность отличий от контроля с МЭШ при р<0,05 (Критерий х2).

После длительного (28 дней) введения антиамнестический эффект ампассе усиливается на уровне статистической тенденции по сравнению с животными, получивших ампассе однократно. Изучение поведения группы крыс с длительным введением ампассе в открытом поле показало, что в сравнении с животными групп контрольной и однократным введением не наблюдалось изменений ориентировочно-исследовательской и двигательной активностей в отрытом поле. Не изменялось и количество стереотипных движений - эпизодов умывания (груминга), а также количества болюсов, что свидетельствует о стабильности эмоционального статуса крыс.

Исследование влияния ампассе на поведение включало регистрацию

22

болевой чувствительности, агрессии, а также судорожной готовности, вызванной коразолом. У контрольной группы животных порог болевой чувствительности регистрировался при силе тока 0,3 мА, а порог групповой агрессии — при 0,7 мА. При исследовании болевой чувствительности и агрессивности у крыс, получивших ампассе однократно и в течение 28 дней не регистрировались изменения порогов болевой чувствительности и агрессии по сравнению с контрольными животными. При регистрации порогов судорожных реакций показано, что в контрольной группе крыс введение коразола в дозе 35 мг/кг вызывало появление клонических судорог соответствующих 1,9 баллам по шкале их выраженности. Ампассе при однократном и при длительном введении не изменял степень выраженности судорог у крыс в условиях коразоловой модели.

После отмены длительного введения ампассе 50 мг/кг/28дней изучали ориентировочно - исследовательское поведение в условиях методики «открытого поля». Как видно из таблицы 4, отмена длительного введения ампассе не приводила к изменению показателей горизонтальной и вертикальной двигательной активности, обследования отверстий. Дефекация и эпизоды умывания после отмены вещества также не изменились. Дальнейшие исследования уровня тревожности, порогов болевой чувствительности, агрессивных реакций, судорожных реакций после отмены длительного введения ампассе, выявили, что данные показатели не изменялись по сравнению с контрольной группой крыс.

Установлено, что ампассе является малотоксичным препаратом. LDso при однократном внутрибрюшинном введении мышам линии BALB/c и крысам Вистар составляют соответственно 1220 мг/кг и 1490 мг/кг. Ампассе не обладает аллергизирующими свойствами при оценке влияния препарата на клеточность подколенных лимфоузлов у мышей. Не обнаружено гиперемии, признаков отека или воспаления в реакции гиперчувствительности III типа на морских свинках. Не вызывает проявления анафилактического шока (Киселев A.B., Стовбун C.B., 2012).

Фармакокинетика ампассе характеризуется быстрым проникновением в периферические ткани, в том числе к месту действия (ткани головного мозга), где концентрация препарата зависит от дозы. По результатам межвидовой экстраполяции фармакокинетических данных период полувыведения ампассе у человека может составлять около 4 ч (Фирсов A.A., Киселев A.B., 2010).

Таблица 4. Поведение крыс в открытом поле через 24 и 48 часов после отмены длительного (28 дней) введения ампассе (50 мг/кг/30 дней) __

Условия опыта Горизонтальные перемещения Вертикальные перемещения Обследование отверстий Эпизоды умываний Дефекация Суммарный показатель перемещений

Контроль 12,3±0,9 8,3±1,0 12,2±3,1 1,5±0,4 0,8±0,3 32,8±1,9

Отмена ампассе 24 часа 16,5±4,1 9,8±1,9 11,0±1,7 2,1±0,7 1,8±0,8 37,3±4,0

Отмена ампассе 48 часов 18,1±2,8 10,4±1,7 9,8±1,2 0,9±0,2 0,9±0,3 38,3±6,9

В настоящем исследовании у ампассе при разных путях и режимах введения не выявлены какие-либо побочные эффекты, зачастую присущие аго-нистам или антагонистам АМРА-, NMDA- рецепторов, что может объясняться мягким модулирующим влиянием на глутаматергическую систему. По спектру фармакологической активности и отсутствию нежелательных побочных проявлений ампассе отличается от других препаратов с глутаматергиче-ским механизмом действия и в большей части исследований превосходит препараты сравнения пирацетам и мексидол.

Выводы

1. Установлено, что ампассе в дозе 20 мг/кг при 4-х кратном введении обладает выраженным нейропротективным эффектом на модели массивной кортикальной ишемии, вызванной перевязкой левой сонной артерии, а затем окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) крыс, уменьшая площадь ишемического поражения головного мозга в 2 раза и устраняя дефицит обучения и памяти. Ампассе по своей активности превосходит препарат сравнения мексидол.

2. На модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагический инсульт) однократное введение ампассе в дозе 20 мг/кг предупреждает на 90 % гибель крыс и значительно ослабляет неврологические и когнитивные нарушения.

3. На модели естественного старения ампассе (20 мг/кг 2 месяца крысам возраста 24месяца) устраняет когнитивные и неврологические нарушения, облегчая формирование условных рефлексов пассивного и активного избегания (УРПИ, УРАИ), ускоряя приобретение моторных навыков.

4. На модели болезни Альцгеймера (модель ускоренного старения вызванного длительным введением скополамина (1 мг/кг, 20 дней)) ампассе (40 мг/кг/ 10 дней) устраняет когнитивные и неврологические нарушения, развившиеся вследствие холинергического дефицита, облегчая формирование УРПИ и УРАИ, ускоряя приобретение моторных навыков.

5. В условиях острого алкогольного отравления ампассе в дозе 10 мг/кг восстанавливает нарушенное этанолом (2 мг/кг) ориентировочно-исследовательское поведение животных, устраняет моторный дефицит и когнитивные расстройства в задачах на обучении УРПИ. С увеличением дозы до 20 мг/кг антиамнестический эффект усиливается.

6. Ампассе в дозе 50 мг/кг при однократном введении проявляет отчетливые антиамнестические свойства на моделях амнезии УРПИ, вызванных скополамином или максимальным электрошоком (МЭШ), и по эффективности превосходит пирацетам.

25

7. Ампассе (20 мг/кг) при длительном введении проявляет выраженные ноотропные свойства, регистрируемые по ускорению выработки питьевого рефлекса в Т-образном лабиринте (в 2 раза), тогда как пирацетам в дозе 400 мг/кг влияет на процесс обучения преимущественно на заключительных этапах формирования памятного следа.

8. Хроническое (50 мг/кг, 28дней) введение ампассе не приводит к появлению, каких - либо нежелательных побочных эффектов, регистрируемых по изменению поведения и эмоционального состояния крыс, а также к повышению судорожной готовности. Отмена хронического введения ампассе не вызывает развитие синдрома отмены, регистрируемого через 24 и 48 часов после его последнего введения.

Список публикаций по теме диссертации

1. Фирсов А.А. Фармакокинетические свойства кальциевой соли N-(5-оксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты при внутривенном введении крысам и кроликам: межвидовая экстраполяция. [Текст] / А.А. Фирсов, Ю.А. Портной, С.А. Довженко, М.Б. Кобрин, А.В. Киселев, С.В. Стов-бун // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010 - №12. -С.31-35.

2. Stovbun, S.V. Effects of a novel neuroprotective calcium salt of N-(5-hydroxy-nicotinoyl)-L-glutamate in a model of Alzheimer's disease and in aging rodents. [Текст] / S.V. Stovbun, A.V. Kiselev, V.I. Sergienko // Сборник тезисов The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology, материалы 11-го регионального съезда ECNP. - 2011. - vol.21; supp.2. -P.156.

3. Киселев А.В. Изучение ноотропных эффектов D- и L-изомеров N-(5-гидроксиникотиноил)-глутаминовой кислоты. [Текст] / А.В. Киселев, С.В. Стовбун, В.И. Сергиенко // Журнал Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2011. - №2. - С.47-49.

4. Стовбун, С.В. Экспериментальное изучение ноотропных и нейропротек-тивных свойств кальциевой соли Ы-(5-гидроксиникотиноил)-глутаминовой кислоты. [Текст] / С.В. Стовбун, А.В.Киселев, В.И.Сергиенко // Журнал Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». — 2011. -№2. - С.83-93.

5. Киселев А.В. Behavioral effects of calcium salt of N-(5-hydroxy-nicotinoyl)-L-glutamate in amnesic and post-traumatic intracerebral hematoma models in male wistar rats. [Текст] / А.В. Киселев, С.В. Стовбун, Т.С. Калинина // Сборник тезисов. Материалы 14-ой биеннале EBPS Behavioural Pharmacology. - 2011. - vol.22. - Р.46.

6. Стовбун С.В. Хиральная кальциевая соль 5-оксиникотиноил-Ь-глутаминовой кислоты (ампассе) новый препарат в терапии Паркинсо-

низма. [Текст] / C.B. Стовбун, A.B. Киселев, А.И. Михайлов, A.A. Берлин, В.И. Сергиенко // Сборник тезисов. Материалы XXIII симпозиума «Современная Химическая Физика». - 2011. - С.119.

7. Киселев A.B. Изучение аллергенности и иммунотоксичности кальциевой соли М-(5-гидроксиникотиноил)- L-глутаминовой кислоты. [Текст] / A.B. Киселев, C.B. Стовбун Т.Б. Танирбергенов, Е.В. Арзамасцев, К.И. Малиновская // Токсикологический вестник. - 2012. - №2. - С.5-8.

Список сокращений и условных обозначений

АМРА — а-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота

БА — болезнь Альцгеймера

ГАМК — Гамма-аминомасляная кислота

ГИ - геморрагический инсульт

МЭШ - максимальный электрошок

НПВС — нестероидное противовоспалительное средство

ОСМА — окклюзия средней мозговой артерии

ПКЛ — приподнятый крестообразный лабиринт

УРАИ — условная реакция активного избегания

УРПИ — условная реакция пассивного избегания

ЫМОА — М-метил-О-аспарагиновая кислота

Заказ № 27-Р/02/2014 Подписано в печать 12.02.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,4

Н 0°° "ЧиФРовичок"' тел' (495) 797-75-76 www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru