Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства

Ларькина, Мария Сергеевна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Ларькина, Мария Сергеевна Самара 2011 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства

На правах рукописи

, [-сорьихм?^

Ларькина Мария Сергеевна

4845173

ВАСИЛЕК ШЕРОХОВАТЫЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ИСТОЧНИК ГЕПАТОПРОТЕКТИВНОГО СРЕДСТВА

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 МАЙ 2011

Самара-2011

4845173

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

кандидат фармацевтических наук, доцент

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ермилова Елена Васильевна

Халиуллин Феркат Адельзянович Воронин Александр Васильевич

Защита состоится «3» июня 2011 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

2011 г.

И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Препараты из лекарственных растений, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, действуют на различные системы организма, в том числе и на систему антиоксидантной защиты. Это обеспечивает возможность их использования для профилактики и комплексной терапии свободно-радикальных патологий. Ухудшение экологической обстановки, повышенное содержание нежелательных примесей в пище, растущее потребление медикаментов, алкогольная интоксикация - эти и другие факторы привели к увеличению частоты токсических поражений печени, которая является основным органом синтеза и депонирования антиоксидантов и центром детоксикации прооксидантных веществ. Таким образом, подавление процессов активации свободно-радикального окисления, играющих ключевую роль в повреждении липидов мембран гепатоцитов в патогенезе заболеваний органов гепатобилиарной системы, является важным свойством гепатозащитных препаратов.

Среди веществ с гепатозащитными свойствами выделяют сравнительно небольшую группу гепатопротекторов, обладающих терапевтическим влиянием на печень (легапон, карсил, силимар, силибор, катерген, эссенциале и другие) (Оковитый С.В., 2006).

По популярности среди лекарственных средств растительного происхождения, применяемых per os, можно выделить группу препаратов расторопши (карсил, легапон, силибор и силимар), большинство из которых являются импортными. Важно отметить, что получение данных препаратов производится по трудоемкой технологии с использованием токсических и дорогих растворителей (хлороформ, тетрахлорметан и др.), что ведет к удорожанию продукции.

Поэтому актуальна проблема разработки новых отечественных гепато-протективных фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным действием, на основе растений Сибири и Дальнего Востока. Перспективным в этом плане является василек шероховатый (Centaurea scabiosa (L.) Maxim., сем. Asteraceae), применяемый в народной медицине при болезнях печени.

Цель работы - на основании фармакогностического изучения обосновать возможность применения василька шероховатого в качестве источника гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантным действием.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучить компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений.

2. На основании изучения антиоксидантной активности сухих экстрактов из надземной части василька шероховатого обосновать выбор экстракта для исследования гепатопротективной активности.

3. Выделить из фармакологически активного сухого экстракта индивидуальные компоненты и идентифицировать соединения с помощью химических, хроматографических и спектральных методов.

4. Разработать проект нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья - василька шероховатого траву (Centaurea scabiosa herba).

5. На основе проведенных исследований предложить способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определить основные показатели его качества.

Научная новизна. Впервые проведен общий фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучен компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений (фенольных соединений и полисахаридов). Хроматографией на бумаге в надземной части С. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, я-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

Впервые из василька шероховатого выделены флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, p-ситостерол, ранее описанные для данного растения.

Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения в надземной части василька шероховатого флавоноидов и гидро-ксикоричных кислот.

Впервые экспериментально обоснована возможность использования василька шероховатого в качестве источника гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, и целесообразность его стандартизации по флавоноидам и гидроксикоричным кислотам. Изучена динамика накопления указанных групп биологически активных веществ.

Впервые проведено анатомическое исследование надземной части василька шероховатого и выявлены диагностические микроскопические признаки вида.

На основе проведенных исследований предложен способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определены основные показатели его качества.

Практическая значимость. На основании проведенных фармакогности-ческих исследований для медицинской практики предложен новый вид лекарственного растительного сырья в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием.

Результаты микроскопических и фитохимических исследований использованы для разработки методик диагностики и определения качества надземной части василька шероховатого и заложены в проект Фармакопейной статьи (ФС) «Василька шероховатого трава».

Для углубленных фармакологических исследований в качестве гепато-протективного средства предложен сухой экстракт василька шероховатого, полученный на 70% этаноле.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2009100195/15(000290) «Гепатопротективное средство, обладающее антиоксидантной активностью, и способ его получения» (18 января 2011 г).

Внедрение. Для студентов и аспирантов кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института ГОУ ВПО «Томский государственный университет» разработаны методические рекомендации на тему «Методика последовательного количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье», в которых использованы материалы диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического изучения надземной части василька шероховатого.

2. Данные изучения антиоксидантной активности экстрактов и фракций василька шероховатого.

3. Результаты исследований гепатопротективной активности сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.

4. Результаты исследований по выделению, идентификации и установлению структуры соединений из василька шероховатого.

5. Методики стандартизации надземной части и сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 63-й и 65-ой Международной студенческой научной конференции им Н.И. Пирогова (Томск, 2004, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ государственной регистрации 01200602076 от 14. 02. 2006 г.).

Публикации. По результатам работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармацевтической химии СибГМУ (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами следующих научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ) СибГМУ (отделение биохимии), НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск), НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), Томский политехнический университет (кафедра аналитической химии, г. Томск).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений на 37 страницах. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 31 рисунками. Библиографический указатель включает 267 источников литературы, из которых 85 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть василька шероховатого (ВШ) (Centaurea scabiosa L.), собранная в 2006-2007 гг. в Томской и Кемеровской областях.

Обнаружение основных групп биологически активных веществ и изучение компонентного состава фенольных соединений и полисахаридов надземной части ВШ проводили с помощью общепринятых методов и приемов фотохимического анализа. Для разделения сложных смесей веществ и выделения индивидуальных соединений применяли избирательную жидкостную экстракцию, колоночную хроматографию. Строение выделенных веществ устанавливали с привлечением УФ-, ИК- спектроскопии, ВЭЖХ, масс- и хромато-масс-спектрометрии, 'Н-ЯМР-спектроскопиии.

Антиоксидантпую активность (АОА) изучали вольтамперометрическим методом, антирадикальную активность (АРА) - спектрофотометрическим методом.

Изучение гепатопротекторной активности исследуемого экстракта проводили на 56 беспородных крысах-самцах массой 180-220 г с острым токсическим поражением печени тетрахлорметаном. Гепатит вызывали введением 50% раствора тетрахлорметана на растительном масле в дозе 1 мл/кг массы крысы в течение 4 дней. В последующие шесть дней вводили животным экстракт ВШ, полученный на 70% этаноле, в дозах 100, 200 и 400 мг/кг и препарат сравнения (карсил) в дозе 100 мг/кг массы крысы внутрижелудочно в виде суспензии на 1% крахмальной слизи, а также эквиобъемное количество растворителей.

Острую токсичность экстракта ВШ определяли по методике Е. Buchby на крысах массой 200-250 г при внутрижелудочном способе введения.

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества J1C. Основные положения».

Микроскопические признаки устанавливали на основании анатомического исследования частей растения. Просмотр и фотографирование препаратов выполняли с помощью микроскопа Cari Zeiss (увеличения 7x1,5x4,5; 7x1,5x8; 7x1,5x20; 7x1,5x40), цифрового фотоаппарата «Olympus Camedia» digital compact camera C-4000 zoom и оптико-механического согласователя. Снимки обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop 5,5».

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакет программ StatSoft Statistica v 6.0 с определением средней арифметической (М) и ее ошибки (т). Достоверность различий оценивалась с использованием параметрического (t-критерий Стьюдента) и непараметрического (критерия Вилкоксона) методов. Различия считались достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Фотохимическое исследование надземной части василька шероховатого

В результате проведенных исследований было выявлено, что в надземной части ВШ присутствуют флавоноиды (ФЛ), гидроксикоричные кислоты (ГКК), дубильные вещества, кумарины, полисахариды (ПС), сесквитерпеновые лакто-ны, аскорбиновая кислота, каротиноиды и аминокислоты и отсутствуют алкалоиды, иридоиды и экдистероиды (табл. 2).

Нами проведено более подробное исследование фенольных соединений и полисахаридов василька шероховатого.

Изучение фенолъного комплекса василька шероховатого

Анализ хроматографических данных водного экстракта и экстрактов, полученных на 40% и 70% этаноле, показал, что в состав экстрактов входят 20 -25 фенольных соединений, из них 10 - 13 являются ФЛ, 10 - 12 - кумаринами, фенолокислотами и ГКК. Для количественного определения ФЛ использовали метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на их способности образовывать с алюминия хлоридом комплексы, устойчивые в кислой среде (содержание флавоноидов - 2,85±0,19% в пересчете на рутин) (табл. 2).

Количественное определение ГКК проводили с использованием двух методов: 1) по собственному поглощению ГКК в УФ-области и 2) экстракционно-спектрофотометрическим. Найдено, что содержание ГКК в надземной части ВШ в пересчете на кофейную кислоту составило первым методом 3,65±0,07% и вторым методом 1,60±0,13%. Полученные данные позволяют сделать вывод о рациональности количественного определения суммы ГКК в надземной части ВШ вторым методом.

Исследование полисахаридного комплекса василька шероховатого

Фракционное разделение полисахаридного комплекса на фракции (табл. 2) показало наличие значительных количеств фракций ПС (в сумме около

35%), что свидетельствует о перспективности использования надземной части ВШ в качестве источника ПС.

Для определения количественного содержания ВРПС использовали два метода: гравиметрический (ГФ XI) и антроновый метод, подобрав рациональные условия для исследуемого растения. Определение количественного содержания ПВ гравиметрическим методом было проведено из шрота, оставшегося после определения ВРСП.

При исследовании влияния различных факторов на полноту извлечения ВРПС и ПВ установлено, что максимальное их извлечение достигается при 3-х кратной экстракции на кипящей водяной бане сырья с размером частиц 2 мм (соотношении сырье - экстрагент 1:20, 1:20, 1:10 соответственно) в течение 30 мин. Содержание ВРПС в надземной части ВШ составило 6,07±0,12% и ПВ -10,10±0,15%.

По модифицированной нами методике определения ВРПС антроновым методом найдено, что содержание ВРПС в надземной части в пересчете на глюкозу составило 5,03±0,12%.

Результаты исследования содержания ВРПС и ПВ по органам растения показали наибольшее содержание их в листьях (табл. 1).

Таблица 1

Результаты количественного содержания ВРПС и ПВ в васильке шероховатом, определенные гравиметрическим методом

Исходное Содержание ВРПС Содержание ПВ

сырьё в пересчете на воздушно-сухое сырье, %

Надземная часть 6,70±0,12 10,10±0,15

Листья 8,35±0,11 14,77±0,09

Цветочные корзинки 4,29±0,08 6,24±0,10

Стебли менее 0,5 6,50±0,10

Таблица 2

Химический состав василька шероховатого

Название группы БАВ Со-держа-ние Представители Количественное содержание в пересчете на воздушно-сухое сырье

Флавоноиды +++ Рутин, байкалеин, лютеолин, апи-генин, апиин*, скутелляреин и его глюкуронид*, хризин*, изо-кверцитрин 2,85±0,19% в пересчете на рутин

Фенолокисло-ты и ГКК +++ Кофейная, хлорогеновая*, феру-ловая, салициловая, коричная, галловая, л-кумаровая кислоты Сумма ГКК -1,60±0,3% в пересчете на кофейную кислоту

Кумарины + Скополетин*, умбеллиферон* -

Дубильные вещества +++ Гидролизуемые и конденсированные 3,36±0,40% гидролизуемые; 3,77±0,40% конденсированные

Сесквитерпе-новые лактоны +++ Гроссгемин*, цинаропикрин*, скабиолид* -

Полисахариды +++ Водорастворимые полисахариды (ВРПС) (в гидролизате - галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза) 6,70±0,71%

Пектиновые вещества (ПВ)" 9,98±0,37% Гемицеллюлоза А (ГЦ А) 18,77±0,30% Гемицеллюлоза Б (ГЦ Б)" 6,07±0,31% " (в гидролизате - галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты)

Каротиноиды +++ В-каротин 116,5±28,0 мг%

Аскорбиновая кислота +-н- - 53,5±2,6мг%

Аминокислоты +++ - -

Хлорофилл ++ - 31,4±0,4мг%

Алкалоиды - - -

Иридоиды - - -

Экдистероиды - - -

Примечание: * - отмечены литературные данные.

Изучение антиоксидантной и гепатопротективной активностей ВШ

Учитывая, что в надземной части ВШ содержится значительное количество фенольных соединений, аскорбиновой кислоты и каротиноидов, была изучена антиоксидантная активность экстрактов (АОА) двумя методами.

В спектрофотометрическом методе на основе реакции с дифенилпикрил-гидразилом (ДФПГ) антирадикальные свойства исследуемых экстрактов оценивали по радикалсвязывающей активности, выраженной в процентах, которая показывает уровень снижения оптической плотности ДФПГ относительно исходной. Полученные кинетические кривые, отражающие зависимость радикалсвязывающей активности экстрактов от времени (рис. 1), свидетельствуют о наиболее выраженных антирадикальных свойствах у экстракта, полученного на 70% этаноле, интенсивность радикалсвязывающей активности которого приближается к препарату сравнения - дигидрокверцетину.

I ё

О 5 10 15 20 25 30 35 <0 45 50 55 60

Время, мин

Рис. 1. Кинетические кривые реакции ДФПГ с исследуемыми образцами и препаратом сравнения (1 - сухой экстракт (экстрагент - вода); 2 - сухой экстракт, полученный на 40% этаноле; 3- сухой экстракт, полученный на 95% этаноле; 4 - сухой экстракт, полученный на 70% этаноле; 5-дигидрокверцетнн)

Методом катодной вольтамперометрии АОА сухих экстрактов ВШ и фракций экстракта, полученного на 70% этаноле, оценивали по кинетическому критерию (К, мкмоль/л'мин), который отражает количество прореагировавших с экстрактами кислородных форм. Полученные данные (табл. 3) показали, что наиболее высокой АОА обладает сухой экстракт, полученный на 70% этаноле, кинетический критерий которого превосходит критерии дигидрокверцетина и аскорбиновой кислоты. Разделение активного экстракта на фракции нецелесообразно, так как не приводит к увеличению АОА.

Таблица 3

АОА экстрактов и фракций ВШ

Исследуемые экстракты и фракции С=0,001 г/мл

Кср S2 S АХ

Экстракт на 40% этаноле 1,29 0,0042 0,065 0,16

Экстракт на 96% этаноле 0,94 0,0021 0,046 0,11

Экстракт на 70% этаноле 1,43 0,0038 0,062 0,15

Бутанолъная фракция 1,06 0,0027 0,052 0,13

Хлороформная фракция 1,12 0,0020 0,045 0,11

Этипацетатная фракция 1,18 0,0016 0,040 0,10

Аскорбиновая кислота 1,15

Дигидрокверцетин 0,78

Данные о содержании ФЛ, ГКК и аскорбиновой кислоты в сухих экстрактах ВШ, свидетельствуют о том, что степень выраженности антиоксидантных

свойств, вероятно, связана с присутствием в них ГКК.

Таблица 4

Количественное содержание групп БАВ в сухих экстрактах ВШ

Название группы БАВ (Название метода) Количественное содержание, % в пересчете на сухой экстракт

Водный экстракт 40% экстракт 70% экстракт 95% экстракт

ФЛ (Спектрофотометрическнй метод (в пересчете па рутин)) 5,13±0,12 7,85±0,20 7,80±0,14 8,21±0,11

ГКК (Экстракционно-спектрофотометрический метод (в пересчете на кофейную кислоту)) 3,40±0,13 5,65±0,12 8,76±0,32 6,01 ±0,24

Аскорбиновая кислота (Титриметрический) 0,55±0,14 0,51±0,15 0,35± 0,13 0,10t 0,12

Учитывая высокую АОА in vitro сухого экстракта, полученного на 70% этаноле, а также применение ВШ в народной медицине при лечении болезней печени, мы предположили наличие гепатопротективных и антиоксидантных свойств у экстракта и изучили их на модели острого токсического поражения печени крыс тетрахлорметаном. Гепатопротективную активность оценивали по морфологическим, биохимическим показателям, антиоксидантную - по влиянию экстракта на процесс ПОЛ в печени и сыворотке крови.

Морфологические показатели свидетельствуют, что применение экстракта ВШ в исследуемых дозах привело к снижению содержания некротизирован-ных клеток, гепатоцитов с дистрофией, плотности клеточного инфильтрата. В то же время, количество двуъядерных гепатоцитов возросло по сравнению с животными с гепатитом, что свидетельствует о благоприятном воздействии экстракта, направленном на стимуляцию регенераторной способности и проли-феративных возможностей гепатоцитов.

Применение экстракта сопровождалось регрессом биохимических показателей - статистически достоверно уменьшались активность в сыворотке АЛаТ (2,0 раза), АСаТ (1,5раза), а также содержание общего и конъюгирован-ного билирубина, щелочной фосфатазы (ЩФ) и уровень тимоловой пробы.

Также экстракт ВШ в дозах 100 и 200 мг/кг оказывает положительный эффект на процессы ПОЛ, уменьшая уровень токсических перекисных соединений - ДК и ТБК-активных продуктов в печени и сыворотке крови. Полученные результаты, вероятно, обусловлены активацией антиоксидантной системы на фоне действия экстракта ВШ, о чем свидетельствует повышение активности каталазы и радикапсвязывающей активности липидорастворимых компонентов клеточных мембран по сравнению с крысами с гепатитом.

Таким образом, установлено, что сухой экстракт, полученный на 70% этаноле, обладает выраженными гепатопротективными и антиоксидантными свойствами и по активности не уступает препарату сравнения - карсилу.

Испытания на острую токсичность показало, что исследуемый экстракт в дозе 10 г/кг массы животного обладает малой острой токсичностью, что соответствует IV классу «Вещества малоопасные».

Исследование химического состава экстракта, полученного на 70% этаноле

Для разделения сложных смесей веществ полученного экстракта применяли методы избирательной экстракции, используя в качестве экстрагентов хлороформ, этилацетат и н-бутанол.

Хроматографическое изучение фракций в сравнении со стандартными образцами веществ-свидетелей (СОВС) показало присутствие в хлороформной фракции преимущественно фенолокислот и ГКК (феруловой, кофейной, п-кумаровой и салициловой); в этилацетатной и бутанольной фракциях - флаво-ноидов, фенолокислот и ГКК (лютеолина, байкалеина, апигенина, рутина, изо-кверцитрина, феруловой, кофейной, л-кумаровой и салициловой кислот); в вод-

ной - следовые количества вышеперечисленных веществ-свидетелей, дубильные вещества, моносахара, полисахариды и аминокислоты.

Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле. (Ь 40/100). Элюирование проводили хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, постепенно повышая градиент последнего, затем этилацетатом, смесью этил-ацетат-этанол, этанолом. В результате из этилацетатной фракции были выделены шесть образцов (1 - 6). На основании качественных реакций и хроматогра-фических исследований было установлено, что образец 1 представляет собой смесь сложных эфиров карбоновых кислот, образец 2 - индивидуальное фе-нольное соединение (кофейная кислота), образцы 3, 4 и 5 содержали по два вещества флавоноидной природы, образец 6 - соединение стероидного ряда.

Идентификация выделенных образцов Образец 1. Для дальнейшего разделения и установления структуры образец 1 анализировали на приборе хромато-масс-спектрометр Finnigan Trace DSQ (США). Хроматограмма образца 1 свидетельствует о наличии в нем 3 основных соединений: 1/1 (время удерживание-26,21 мин), 1/2 (время удерживание - 29,27 мин) и 1/3 (время удерживание - 29,72 мин) (рис. 2).

Рис. 2. ГЖ хроматограмма образца 1

Соединение 1/1. Согласно данным масс-спектра (рис. 3) молекулярная масса соединения равна 310 а.е.м. ((М)+ 310 (С2оНз802)). В масс-спектре присутствуют пики осколочных ионов, характерные для неразветвленной углеводородной цепи (m/z (/, %) 43 (37), 55 (23), 57 (15), 88 (100), 143 (3), 157 (12), 239 (7)) и эфиров одноосновных карбоновых кислот с алифатическими заместителями (m/z (/, %) 73 (15) и 101 (55)). Таким образом, соединение 1/1 по структуре относится к алифатическим сложным эфирам неразветвленного строения. Данные масс-спектра вещества по базе данных Databaze/wiley7n.L совпадают со

степенью вероятности около 95% со спектром этилового эфира гексадекановой (пальмитиновой) кислоты.

lOO во" АО-; 4020 -сЛ

'?7 239 284 loo 200 ЗОО

m/z

Рис. 3. Масс-спектр соединения 1/1

Соединение 1/2. Согласно данным масс-спектра (рис. 4) молекулярная масса соединения равна 310 а.е.м. ((М)+ 310 (С2оН3802)). Масс-спектр соединения 1/2 имеет пики осколочных ионов, присутствующие в масс-спектре соединения 1/1, что характерно для алифатического сложного эфира неразветв-ленного строения, кроме того ионы с m/z (/, %) 83 (43) и 110 (13) соответствуют ионам алкеновой серии. Данные масс-спектра вещества по базе данных Da-tabaze/ wiley7n.L совпадают со степенью вероятности около 96% со спектром этилового эфиоа октадецен-9-овой кислоты.

100 ~55 vWW\WvV

80 1 j 1

60 40

101

С Iji

oilili

10 157 222

IjLa^AI^^I,-.

264

265

310

...L...........

100 200 300 AOO

m/z

Рис. 4. Масс-спектр соединения Vi

500

¿oo

Соединение 1/3. Данные масс-спектра вещества (рис. 5) по базе данных Оа1аЬагеЛ«1еу7п.Ь совпадают с невысокой степенью вероятности (около 20%) 1-(гидроксиметил)-1,2-этандиоловым эфиром гексадекановой кислоты - пальмитином (молекулярная масса - 568 а.е.м.).

ill <?! .4«I. 550 625 i.i:—. ¡ % i_________............... i.....

mhr

Рис. 5. Масс-спектр соединения 1/3

Для детального изучения состава и химического строения образцы 3, 4 и 5 анализировали методом ВЭЖХ с УФ- и масс-детекторами и 'Н-ЯМР спектроскопии.

По данным ВЭЖХ образцы 3 (рис. 6) и 4 содержат по два вещества: флавоноид 1 (время удерживания - 39,908 мин и X шах, нм: 268 и 336), присутствующий в обоих образцах, флавоноид 2 (40,362 мин и X шах, нм: 212,234, 272, 336) и флавоноид 3 (40,389 мин и X max, нм: 214, 270, 336) соответственно.

Рис. 6. ВЭЖ хроматограмма образца 3

ESI-масс-спектры флавоноида 1, полученные электроспрей-методом, характеризуются основными ионами типа [М+Н]+с m/z 271 и [М-Н]" с m/z 269. Таким образом, молекулярная масса флавоноида 1 равна 270 а.е.м., что соответствует флавоноиду, содержащему три гидроксильные группы. ESI-масс-спектры флавоноидов 2 и 3 имеют основные пики ионов типа [М+Н]+ с m/z 301 и [М-Н]" cm/z 299, следовательно, молекулярные массы флавоноидов 2 и

3 одинаковы и равны 300 а. е. м., что соответствует флавоноидам, содержащим три гидроксильные и одну метокси- группы.

îtl'I-SU'l-

m'i-

[114-

561 î !1П 615

3G9J-OBL'9 -TTfi'S-0V6'9-

m-L-* 6VS'L —

It t-4

LJts^

¡s

I »

I6V9 6154

8064 Ш4

60V0

. tSO'O

cw:

Рис. 7. 'Н-ЯМР-спектр образца 3

Примечание: сигналы с химическими сдвигами 3,36 и 2,5 м.д. принадлежат растворителю.

Для установления структуры флавоноидов 1 и 2 был получен 'Н-ЯМР-спектр образца 3 (300 МГц, ДМСО, б, м.д.), в котором мы выделили три группы сигналов протонов флавоноидов, поскольку образец 3 является смесью двух флавоноидов и, следовательно,' некоторые сигналы образованы при наложении

сигналов протонов одного типа флавоноидов 1 и 2, либо сигналы могут принадлежать протонам только флавоноида 1 или 2 (рис. 7).

Первая группа сигналов с низкой интенсивностью - два плохо разрешенных дублета с величинами химических сдвигов 6,51 и 6,20 м.д. относится к протонам Н-6 и Н-8 кольца А флавоноида 1 соответственно, который в образце 3 по сравнению с флавоноидом 2 присутствует в меньшем количестве.

Вторая группа сигналов - это синглет с величиной химического сдвига 6,60 м.д., который относится к Н-8 кольца А флавоноида 2, и синглет с химическим сдвигом 3,74 м.д., относящийся к метокси-группе в положении 6 кольца А флавоноида 2.

Третья группа сигналов - это сигналы протонов колец В и С флавоно-дов 1 и 2, которые резонируют при одинаковых значениях химических сдвигов, увеличивая интенсивность сигналов пропорционально числу протонов каждого типа и массовой доли каждого флавоноида в образце 3. Исходя из этого, установлено, что в спектре 'Н-ЯМР сигналы протонов с химическими сдвигами -6,78 м.д. (1Н, с, Н-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3'и Н-5', ./=8,7 Гц) и 7,92 м.д. (2Н,д, Н-2 и Н-6 ,7=8,7 Гц) принадлежат протонам колец В и С как флавоноида 1 так и флавоноида 2.

Следовательно, флавоноид 1 является 5,7,4-тригидроксифлавоном (апи-генин), содержание которого по данным 'Н-ЯМР составляет около 30% в смеси с флавоноидом 2 (рис. 8).

В !Н-ЯМР-спектре образца 4, помимо сигналов протонов флавоноида 1 (апигенина), который является доминирующем флавоноидом этого образца, четко виден синглет с химическим сдвигом 3,85 м.д., который принадлежит протонам метокси-группы в положении 3' (ЗН, с) кольца В флавоноида 3. Также в спектре присутствует синглет низкой интенсивности с химическим сдвигом 7,85 м.д., который можно отнести к протону Н-2 (1Н, с) кольца С флавоноида 3. Таким образом, метокси-группа флавоноида 3 находиться в положении 3 кольца С.

Анализируя 'Н-ЯМР-спектр, следует отметить, что сигналы остальных протонов флавоноида 3 имеют те же значения величин химических сдвигов, что и сигналы протонов флавоноида 1 (апигенина), незначительно увеличивая их интенсивность. Таким образом, сигналы протонов Н-3, Н-6 и Н-8 кольца А флавоноида 3 имеют величины химических сдвигов 6,64 (1Н, с), 6,54 (1Н, д) и 6,25 (1Н, д) м.д. соответственно. Сигналы протонов Н-5' и Н-6 резонируют при величинах химических сдвигах 7,03(1Н, с) и 7,95 (1Н, д) м.д.

Следовательно, флавононд 3, содержание которого в смеси с флавонои-дом 1 образца 4 незначительно (около 7%), идентифицирован как 5,7,4'-тригидрокси-З'-метоксифлавона (хризоэриол) (рис. 8).

По данным ВЭЖХ образец 5 также содержит два вещества - флавоноид 4 (31,628 мин и X шах, нм: 213, 234, 280, 330) и флавоноид 5 (35,541 мин и X max, нм: 253,266,291,347).

Согласно данным ESl-масс-спектрометрии молекулярные массы флаво-ноидов 4 и 5 одинаковы и равны 286 а.е.м., что соответствует флавоноидам, содержащим четыре гидроксильные группы.

В спектре 'Н-ЯМР для образца 5 наблюдаются сигналы протонов с химическими сдвигами - 6,59 м.д. (1Н, с, Н-8), 6,74 м.д. (1Н, с, Н-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3' и Н-5', У= 9,0 Гц) и 7,91 м.д. (2Н, д, Н-2' и Н-6', J=9,0 Гц). Следовательно, флавоноид 4 имеет структуру 5,6,7,4'-тетрагидроксифлавона (скутел-ляреина) (рис. 8).

Согласно данным литературы максимумы поглощения и вид спектральной кривой УФ-спектра флавоноида 5 совпадают с максимумами поглощения и видом спектральной кривой УФ-спектра лютеолина. Кроме того хроматогра-фическое изучение на бумаге в сравнении с СОВС лютеолина также подтверждает наличие лютеолина в образце 5. Таким образом, флавоноид 5 является 5,7,3',4'-тетрагидроксифлавоном (лютеолином).

Образец 6 - перекристаллизовали из гексана и получили белые игольчатые кристаллы с т. пл. 184-186°С. В ИК-спектре образца 6 присутствуют валентные колебания гидроксильной группы (3418 см"1, е., широкая), мстильных и метиленовых групп (2959, 2935 и 2869 см"1), а также деформационные колебания 5(с_н) 1464, 1380, 1103, 1024 см"1. Таким образом, ИК-спектр указывает на наличие в соединении спиртового гидроксила, метальных групп, отсутствие оксо-группы, ароматического кольца и фенольного гидроксила.

Данные масс-спектра образца 6 по спектрометрической базе данных Оа-1аЬаге/ \Viley7n.L совпадают со спектром |3-ситостерола.

он

R=OH, Ri=H (флавоноид 4); R=H R,=OH (флавоноид 5).

R=H Ri=H (флавоноид 1); R=OCH3,Ri=H (флавоноид 2); R= H, Rj= OCH3 (флавоноид 3),

Рис. 8. Структура флавоноидов

Разработка параметров стандартизации надземной части василька шероховатого

В результате анатомического изучения надземной части василька шероховатого были определены диагностические микропризнаки надземной части, которыми являются 3 типа волосков: головчатые, очень мелкие, червеобразнои-зогнутые, имеющие маленькую шаровидную головку и ножку, состоящую из 3 - 4 клеток; простые волоски, состоящие из 3 - 5 клеток, с одноклеточным основанием и состоящие из 5 - 8 клеток, с многоклеточным основанием.

Подлинность и содержание действующих веществ предложено определять по двум группам веществ - ФЛ и ГКК, так как предполагается, что они имеют наибольшую значимость в проявлении антиоксидантной и гепатопро-тективной активностей экстракта ВШ. Для этого были разработаны следующие методики.

Для установления подлинности надземной части ВШ предложен метод ТСХ (система: этилацетат - муравьиная кислота - вода (10:2:3), детекторы -фильтрованный УФ-свет до и после обработки хроматограммы 10% этаноль-ным раствором алюминия хлорида). В УФ-свете на хроматограмме должно обнаруживаться не менее трех пятен коричневого цвета, а также пятна голубого и фиолетового цвета. Коричневое пятно с Яг 0,55, принадлежит рутину. При проявлении хроматограммы 10% этанольным раствором алюминия хлорида и последующем нагревании в течение 2-3 мин при температуре 100-105°С, проявляется не менее трех пятен желтого цвета в видимом и УФ-свете с Яг 0,45; 0,55 и 0,6.

Разработана методика последовательного количественного определения ФЛ и ГКК в надземной части ВШ из одной навески сырья. Для количественного определения ФЛ использовали метод дифференциальной спектрофотомет-рии на основе реакции с алюминия хлоридом в кислой среде. В качестве стандарта использовали ГСО рутина. Для количественного определения суммы ГКК в надземной части применили экстракционно-спектрофотометрический метод. Валидационную оценку методики проводили по показателям специфичность, повторяемость, правильность и воспроизводимость. Содержание суммы ФЛ в надземной части ВШ должно быть не менее 2,0% и ГКК - не менее 1,2%. При этом значение относительной погрешности не превышает 5% при доверительной вероятности 0,95.

Используя разработанные методики, выявлено, что содержание ГКК и ФЛ максимально в фазу цветения и составляет 1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту и 2,85±0,19% в пересчете на рутин соответственно.

Установлены показатели определения доброкачественности сырья, включенные в проект ФС: сумма ФЛ в пересчете на рутин - не менее 2,0%; сумма ГКК в пересчете на кофейную кислоту - не менее 1,2%; влажность - не более 9,0%; золы общей - не более 8%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, - не более 1,8%; экстрактивные вещества, извлекаемые 70% этанолом, - 26,1 ± 0,3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 6 мм, - не более 12%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, - не более 9%; органических примесей - не более 1%; минеральной примеси - не более 0,5%.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Василька шероховатого трава».

Разработка способа получения сухого экстракта из надземной части ВШ, полученного на 70% этаноле, и его стандартизация

При разработке рациональной технологии получения сухого экстракта установлены оптимальные параметры экстракционного процесса, позволившие предложить способ получения средства, обладающего гепатопротективным и антиоксидантным свойствами. Экстракцию надземной части ВШ, измельченной до размеров частиц 2-4 мм, предложено проводить 70% этанолом при температуре 80°С в течение 60 мин при соотношении сырье-экстрагент 1:20 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента при пониженном давлении и высушиванием досуха полученного экстракта.

Сухой экстракт ВШ представляет собой тёмно-коричневый сыпучий порошок со слабым специфическим запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI издания. Определены потеря в массе при высушивании (3,30±0,03%) и проведены испытания на тяжелые металлы (не более 0,01%). В основу стандартизации сухого экстракта положены методики определения подлинности и количественного содержания ФЛ и ГКК, описанные ранее для надземной части. Содержание ФЛ в сухом экстракте составило 10,60% (в пересчете на рутин) при относительной ошибке 2,89% и ГКК - 9,16% (в пересчете на кофейную кислоту) при относительной ошибке 1,98%.

выводы

1. Установлено, что основными группами биологически активных веществ надземной части С. зсаЫояа Ь. являются флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, полисахариды, сесквитерпеновые лактоны, аскорбиновая кислота и каротиноиды.

2. Хроматографией на бумаге в надземной части С. зсаЫоза Ь. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, л-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

3. Впервые из василька шероховатого выделены и идентифицированы физико-химическими методами флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютео-лин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, р-ситостерол, ранее описанные для данного растения.

4. Усовершенствована методика выделения полисахаридного комплекса из надземной части С. ясаЫоза Ь. (содержание ВРПС составило 6,70±0,12%, ПВ - 9,98±0,37%, гемицеллюлозы А - 18,77±0,30% и Б - 6,07±0,31%). Моносахаридный состав полисахаридных фракций представлен глюкозой, галактозой, рамнозой, арабинозой, глкжуроновой и галактуроновой кислотами. Предложены методики количественного определения ВРПС гравиметрическим и антроновым методами.

5. Установлено, что сухой экстракт из надземной части василька шероховатого, полученный на 70% этаноле, обладает выраженными антиоксидант-ными и гепатопротективными свойствами.

6. Разработан проект ФС «Василька шероховатого трава», в котором стандартизацию надземной части предложено проводить по содержанию ФЛ и ГКК.

7. Выявлено, что содержание ГКК и ФЛ максимально в фазу цветения и составляет 1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту и 2,85±0Д9% в пересчете на рутин соответственно.

8. Впервые предложен способ получения сухого экстракта из надземной части василька шероховатого, обладающего гепатопротекторной и анти-оксидантной активностью, при котором достигается наиболее полное извлечение ФЛ и ГКК (степень измельчения 2-4 мм, соотношение сырье-экстрагент 1:20, время экстракции 60 мин., температура 80°С, кратность экстракции - 3) и определены основные показатели его качества.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ларькина, М.С. Анатомическое строение василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, Е.Н. Сальникова // Фармация. -2008.-№1.-С. 14-16.

2. Ларькина, М.С. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова // Химия растительного сырья. - 2008. - №3. -С. 71-74.

3. Ларькина, М.С. Количественное определение флавоноидов в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, Е.А. Краснов // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - №4. - С. 14-17.

4. Кадырова, Т.В. Антиоксидантная активность экстрактов из надземной части Centaurea scabiosa L.(Asteraceae) / Т.В. Кадырова, М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Е.А. Краснов, О.А. Аврамчик // Раст. ресурсы. - 2010. -Вып. 1-С. 102-106.

5. Корнякова, А.В. Химико-фармакологическое исследование василька шероховатого / А.В. Корнякова, М.С. Ларькина // Тез. докл. Всероссийской 63-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. - Томск, 2004. - С. 201-202.

6. Ларькина, М.С. Химико-фармакогностическое изучение надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина, И.П. Каминский // Тез. докл. Всероссийской 65-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. -Томск, 2006. -С. 244-246.

7. Каминский, И.П. Исследование суммы сесквитерпеновых лактонов василька шероховатого / И.П. Каминский, М.С. Ларькина // Тез. докл. Всероссийской 65-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. -Томск, 2006. - С. 243-244.

8. Краснов, Е.А. Химико-фармакологическое исследование надземной части василька шероховатого / Е.А. Краснов, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, И.П. Каминский, М.С. Ларькина//Тез. докл. Всесоюз. науч. конф.: Химия и технология растительных веществ. - Сыктывкар, 25-30 июня 2006. - С. 106.

9. Краснов, Е.А. Химический состав перспективных растений, их антиоксидантная активность и фармакологическая активность / Е.А. Краснов, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, И.П. Каминский, М.С. Ларькина, В.В. Дудко // Тез. докл. Всесоюз. науч. Конф.: Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. - Барнаул, 23-27 апреля 2007. - С. 86.

10. Ларькина, М.С. Использование надземной части василька шероховатого в качестве источника полисахаридов / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, Е.А. Краснов // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф.: Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. -Барнаул, 23-27 апреля 2007. - С. 40-41.

11. Ларькина, М.С. Некоторые аспекты изучения химического состава Centaurea scabiosa L, / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова // Тез. докл. 2 международную научную конференцию, г. Алматы, 10-13 октября 2007. - Казахстан, 2007. - С. 199.

12. Ларькина, М.С. Разработка способа получения антиоксидантного средства на основе фенольного комплекса василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина // Науки о человеке: матер. IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, май 2008. - С. 113-115.

13. Ларькина, М.С. Разработка методики количественного определения водорастворимых полисахаридов в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова // Тез. докл. 5 Всероссийской науч. конф. «Химия и технология растительных веществ». - г.Уфа, 2008. - С. 187.

14. Ларькина, М.С. Углеводный состав некоторых представителей рода Centaurea флоры Сибири / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, Е.А. Краснов // Тез. докл. 4 Всерос. науч. конф.: Новые достижения в химии и химической технологии раст. сырья - Барнаул, апрель 2009. - С. 247-248.

15. Ларькина, М.С. Влияние экстракта василька шероховатого на содержание общих липидов и их отдельных компонентов у крыс с гепатитом / М.С. Ларькина, Э.В. Сапрыкина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова // Тез. докл. международн. Научно-практ. конф.: Фармация: современное состояние и перспективы. - Алматы, 2010. - С. 206-207.

Подписано в печать 1 апреля 2011 г. Формат 60x84. Печ. л. 1,0. Тираж 110 экз. Бумага офсетная. Печать оперативна*. Заказ 151. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоц-

развития России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08

Оглавление диссертации Ларькина, Мария Сергеевна :: 2011 :: Самара

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Перспективы изучения василька шероховатого и создания на его основе гепатопротективного средства

1.1 Василек шероховатый: систематическое положение, ботаническая характеристика, ареал, местообитание, сырьевые ресурсы.

1.2 Современное состояние исследований растений рода василек.

1.3 Проблема свободнорадикального окисления при заболеваниях гепатобилиарной системы и поиска новых фитосредств.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования.

2.2 Методы и методики химического исследования.

2.3 Методики анатомического исследования надземной части василька шероховатого.

2.4 Методики товароведческого исследования.

2.5 Статистическая обработка результатов.

Глава 3 Исследование комплекса биологически активных веществ василька шероховатого.

3.1 Изучение фенольного комплекса василька шероховатого.

3.2 Выделение и исследование полисахаридного комплекса василька шероховатого.

Глава 4 Исследование антиоксидантной активности сухих экстрактов василька шероховатого.

Глава 5 Химическое исследование сухого экстракта, полученного на 70% этаноле

5.1 Изучение химического состава фракций экстракта, полученного на 70% этаноле.

5.2 Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции и установление их строения.

Глава 6 Разработка проекта ФС «Василька шероховатого трава»

6.1 Результаты анатомического изучения надземной части василька шероховатого.

6.2 Товароведческая характеристика надземной части василька шероховатого.

6.3 Разработка методик определения подлинности надземной части василька шероховатого.

6.4 Разработка методик определения количественного содержания флавоноидов и гидроксикоричных кислот в надземной части василька шероховатого.

6.5 Изучение динамики накопления ФЛ и ГКК в различных органах, в зависимости от фазы развития и места сбора василька шероховатого.

Глава 7 Разработка способа получения сухого экстракта василька шероховатого и оценка его качества.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Ларькина, Мария Сергеевна, автореферат

Препараты из лекарственных растений, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, действуют на различные системы организма, в том числе и на систему антиоксидантной защиты. Это обеспечивает возможность использования препаратов для профилактики и комплексной терапии свободно-радикальных патологий. Ухудшение экологической обстановки, повышенное содержание нежелательных примесей в пище, растущее потребление медикаментов, алкогольная интоксикация - эти и другие факторы привели к увеличению частоты токсических поражений печени, которая является основным органом синтеза и депонирования антиоксидантов и центром детоксикации прооксидантных веществ. Таким образом, подавление процессов активации свободно-радикального окисления, играющих ключевую роль в повреждении липидов мембран гепатоцитов в патогенезе заболеваний органов гепатобилиарной системы, является важным свойством гепатозащитных препаратов.

Среди веществ с гепатозащитными свойствами выделяют сравнительно небольшую группу гепатопротекторов, обладающих терапевтическим влиянием на печень [98, 123, 136]. К ним относят легалон, карсил, силибор, катерген, эссенциале и некоторые другие препараты.

По популярности среди лекарственных средств растительного происхождения, применяемых per os, можно выделить группу препаратов расторопши (карсил, легалон, силибор и силимар). Важно отметить, что получение данных препаратов производится по трудоемкой технологии с использованием токсических и дорогих растворителей (хлороформ, тетрахлорметан и др.), что ведет к удорожанию продукции. Кроме того, целевые вещества - флаволигнаны по причине высокой гидрофобности обладают низкой биологической доступностью.

Поэтому актуальна проблема разработки новых отечественных гепатопротективных фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным действием, на основе растений Сибири и Дальнего Востока. Перспективным в этом плане является василек шероховатый (Centaurea scabiosa (L.) Maxim., сем. Asteraceae), применяемый в народной медицине при болезнях печени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Научная новизна. Впервые проведен общий фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучен компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений (фенольных соединений и полисахаридов). Хроматографией на бумаге в надземной части С. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, пкумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

Впервые из василька шероховатого выделены флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, Р-ситостерол, ранее описанные для данного растения.

Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения в надземной части василька шероховатого флавоноидов и гидроксикоричных кислот.

Впервые экспериментально обоснована возможность использования василька шероховатого в качестве источника гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантным действием, и целесообразность его стандартизации по флавоноидам и гидроксикоричным кислотам. Изучена динамика накопления указанных групп биологически активных веществ.

Практическая значимость. На основании проведенных фармакогностических исследований для медицинской практики предложен новый вид лекарственного растительного сырья в качестве гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантным действием.

Для углубленных фармакологических исследований в качестве гепатопротективного средства предложен сухой экстракт василька шероховатого, полученный на 70% этаноле.

Степень внедрения. Для студентов и аспирантов кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института ГОУ ВПО «Томский государственный университет» разработаны методические рекомендации на тему «Методика последовательного количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье», в которых использованы материалы диссертации. На защиту выносятся:

1. Результаты фитохимического изучения надземной части василька шероховатого.

2. Результаты изучения антиоксидантной активности экстрактов и фракций василька шероховатого.

Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета (№ государственной регистрации 01200602076 от 14. 02. 2006 г.).

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармацевтической химии СибГМУ г. Томск, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ) СибГМУ (отделение биохимии), НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск), НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), Томский политехнический университет (кафедра аналитической химии, г. Томск). Выражаем благодарность сотрудникам данных подразделений и научных учреждений.

Заключение диссертационного исследования на тему "Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства"

ВЫВОДЫ

Установлено, что основными группами биологически активных веществ надземной части С. scabiosa L. являются флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, полисахариды, сесквитерпеновые лактоны, аскорбиновая кислота и каротиноиды.

Хроматографией на бумаге в надземной части С. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, п-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

Впервые из василька шероховатого выделены и идентифицированы физико-химическими методами флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, ß-ситостерол, ранее описанные для данного растения.

Усовершенствована на методика выделения полисахаридного комплекса из надземной части С. scabiosa L. (содержание ВРПС составило 6,70±0,12%, ПВ - 9,98±0,37%, гемицеллюлозы А - 18,77±0,30% и Б - 6,07±0,31%). Моносахаридный состав полисахаридных фракций представлен глюкозой, галактозой, рамнозой, арабинозой, глюкуроновой и галактуроновой кислотами. Предложены методики количественного определения ВРПС гравиметрическим и антроновым методами. Установлено, что сухой экстракт из надземной части василька шероховатого, полученный на 70% этаноле, обладает выраженными антиоксидантными и гепатопротективными свойствами.

Разработан проект ФС «Василька шероховатого трава», в котором стандартизацию надземной части предложено проводить по содержанию ФЛ и ГКК.

Выявлено, что содержание ГКК и ФЛ максимально в фазу цветения и составляет 1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту и 2,85±0,19% в пересчете на рутин соответственно. Впервые предложен способ получения сухого экстракта из надземной части василька шероховатого, обладающего гепатопротективной и антиоксидантной активностью, при котором достигается наиболее полное извлечение ФЛ и ГКК (степень измельчения 2-4 мм, соотношение сырье-экстрагент 1:20, время экстракции 60 мин., температура 80°С, кратность экстракции - 3) и определены основные показатели его качества.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Ларькина, Мария Сергеевна

1. Абдуллаев, P.A. Влияние жидкого экстракта и суммы алкалоидов василька закавказского на мочеотделение // Сборник трудов азербайджанского медицинского института. - Азербайджан. - 1958. -С. 186-190.

2. Аврамчик, О. А. Вольтамперометрический метод определения антиоксидантной активности: Автореф. дис. канд. фарм. наук / О. А. Аврамчик. Томск. —2006. — 21 с.

3. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия / Г. Г. Автандилов. М. : Медицина, 1990.-384 с.

4. Айвазов, Б. В. Введение в хроматографию / Б. В. Айвазов. М. : Высш.шк., 1983.-240 с.

5. Айзенман, Б. Е. Фитонциды и антибиотики высших растений / Б. Е. Айзенман, В. В. Смирнов, А. С. Бондаренко. Киев, 1984. - 245 с.

6. Антиоксидантная активность некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / О. JI. Кулагин, В. А. Куркин, Н. С. Додонов, А. А. Царева и др. // Фармация. 2007. - №2. - С. 30-32.

7. Антиоксиданты в злокачественных опухолях человека и экспериментальных животных / Н. В. Никифорова, А. Е. Берман // Биомедицинская химия. 2003. — Т. 49, №3. - С. 250-262.

8. Антиоксиданты и инициированная хемилюминесценция / Т. С. Сейтембетов, С. М. Адекенов, Е. Д. Даленов. Акмала. - 1996. - 315 с.

9. Антиоксидантные свойства лекарственных растений, используемых в лечении сердечно-сосудистых заболеваний / М. А. Рыжикова, Р. Р. Фархутдинов, Ш. 3. Зигидулин // Тез. докл. : I Конгресс ассоциации кардиологов стран СНГ. Москва, 20-23 мая, 1997. - с. 78.

10. Арбузов, С. Я. Фармакологические средства, повышающие устойчивость к гипоксии / Я. С. Арбузов, JI. В. Пастушенков // Фармакология и токсикология. 1969. - № 1. - С. 115-120.

11. Атлас. Лекарственные растения Якутии / Под ред. Б. И. Иванова. -Якутск, 2003. Т. 1. - 436 с.

12. Атлас по анатомии растений / Под ред. Г. А. Бавлуто, В. М. Еремин, М. П. Жигар. Минск : Ураджай, 2001. - 243 с.

13. Бандюкова, В. А. Антибактериальная активность извлечений из некоторых видов цветковых растений / В. А. Бандюкова, А. Н. Андреева // Раст. ресурсы. 1990. - Т. 26, № 2. - С. 215-221.

14. Бандюкова, В. А. Гликозиды лютеонина в некоторых растениях сем. СотроБкае / В. А. Бандюкова, Н. В. Сергеева, С. Ф. Джумырко // Химия природ, соедин. 1970. - №4. - С. 470-471.

15. Бандюкова, В. А. Исследование флавонов и фенолкислот некоторых лекарственных растений семейства сложноцветных / В. А. Бандюкова, Н. В. Сергеева, Г. Н. Земцова // Изучение препаратов растительного и синтетического происхождения. — Томск. 1978. - С. 105.

16. Бандюкова, В. А. О вероятности обнаружения некоторых агликонов в семействах высших растений / В. А. Бандюкова, Э. Т. Аванесов // Растит, ресурсы. 1975. - Т. 11, № 3. - С. 334-342.

17. Бандюкова, В. А. Распространение флавоноидов в некоторых семействах высших растений: Сем. СотроБйае / В. А. Бандюкова // Раст. ресурсы. 1968. - Т. 4, № 3. - С. 429-441.

18. Бандюкова, В. А. Полиморфные соединения некоторых растений семейства сложноцветных / В. А. Бандюкова, Н. В. Сергеева // Актуальные вопросы фармации. — Ставрополь, 1974. № 2. — С. 79-81.

19. Бандюкова, В. А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге / В. А. Бандюкова // Растительные ресурсы. 1995. - Т. 31. вып. 4. - С. 591-596.

20. Бандюкова, В. А. Фенолокислоты растений и их эфиры и гликозиды / В. А. Бандюкова // Химия природ, соедин. 1983. - № 3. - С. 263-273.

21. Бандюкова, В. А. Флавоноиды Centaurea depressa / В. А. Бандюкова, X. X. Халматов, X. И. Алимов // Химия природ, соедин. 1969. — №4. - С. 324-325.

22. Барабой, В. А. Антиоксиданты и здоровье / В. А. Барабой // Валеология. Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. -Спб.: Наука, 1993.-С. 107-114.

23. Барабой, В. А. Биологическое действие растительных фенольных соединений / В. А. Барабой. Киев, 1976. - 234 с.

24. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека / В. А. Барабой. -М. : Наука, 1984. 160 с.

25. Беленький, М. JI. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л. : Наука, 1963. — 197 с.

26. Белобородова, Э. И. Эффективность растительных гепатопротекторов при хронических гепатитах / Э. И. Белобородова, А. А. Шаловай, Р. О. Гайсаев. Томск: Изд-во НТЛ, 2003. - 265 с.

27. Белоусов, Ю. Б. Фитопрепараты и печень / Ю. Б. Белоусов, К. Г. Гуревич // Фарматека. 2006. - № 1. - С. 85-88.

28. Биологически активные соединения Centaurea pseudomaculosa / С. М. Адекенов, Г. М. Кадирберлина, В. И. Садыкова и др. // Известия АН КазССР. Серия химическая. 1986. - № 3. - С. 65-69.

29. Биологически активные вещества некоторых видов флоры Сибири / Е. А. Краснов, Н. В. Алексеюк, В. В. Дудко и др. // Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1983.-С. 118-119.

30. Биофлавоноид кверцетин — высокоэффективный антиоксидант / Л. В. Савченко, 3. И. Мусатова, И. Ю. Высоцкий и др. Луганск, 1990. -60 с.

31. Биофлавоноиды : химия, пища, лекарства, здоровье / Под ред. Н. А. Тюкавкиной. — М., 2002. — 56 с.

32. Биохимия: Учебник / Под ред. Е. С. Северина. — 4-е изд., испр. М. : ГЭОТАР - Медиа, 2005. - С. 428-430.

33. Бубенчикова, В. Н. Антимикробная активность растений рода василёк // Фитонциды. Бактериальные болезни растений. Киев, 1990. — Ч. 1. -С. 27.

34. Бубенчикова, В. Н. Кумарины растения рода Centaurea / В. Н. Бубенчикова // Химия природного сырья. 1990. - № 6. - С. 839-830.

35. Бубенчиков, В. Н. Разработка показателей качества листьев земляники лесной / В. Н. Бубенчиков, И. JI. Дроздова // Фармация. № 6. — 2002. -С. 16-18.

36. Бубенчикова, В. Н. Фитохимическое исследование растений рода василек // 2-ая респ. конф. по мед. ботанике. Киев, 1988. - С. 205-206.

37. Бубенчиков, Р. А. Флавоноиды фиалки трехцветной / Р. А. Бубенчиков, И. JI. Дроздова // Фармация. № 2. - 2002. - С. 11-12.

38. Бурлакова, Е. Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е. Б. Бурлакова, Н. Г. Храпова // Усп. Химии. — 1985. -Т.54. -№9. С. 1540-1558.

39. Венгеровский, А. И. Лекции по фармакологии / Томск: STT, 2001. -576 с.

40. Венгеровский, А. И. Фармакологические подходы к регуляции функции печени / А. И. Венгеровский // Бюллетень сибирской медицины. 2002. - Т. 1, № 1. - С. 25-28.

41. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А. Владимиров // Вестник Российской Академии медицинских наук. -1998,-№7.-С. 43-50.

42. Владимиров, Ю. А. ПОЛ в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков. М. : Наука, 2000. - 321 с.

43. Вольтамперометрическое определение антиоксидантной активности растительного сырья и некоторых продуктов питания / Е. И. Короткова,

44. Ю. А. Карбаинов, О. А. Аврамчик // Химия и химическая технология. -2002.-Т. 45, №3.-С. 110-112.

45. Выделение гроссгемина из сибирской популяции Centaurea Scabiosa / Е. А. Краснов, В. А. Ралдугин, Т. В. Кадырова, И. П. Каминский // Химия природ, соедин. 2006. - №4. — С. 397.

46. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Е. А. Краснов, Т. П. Березовская, Н. В. Алексеюк и др. Томск: Издательство Томского Университета, 1987. - 184 с.

47. Выделение и анализ полисахаридной фракции из биомасс штаммов Panax ginseng С. A. MEY. и Panax quinquefolius L. с герматраном «LX -5» / Е. Г. Остроженкова, Е. С. Тулупова, Е. И. Саканян // Раст. ресурсы. 2002. - Т. 38, № 2. - С. 120-124.

48. Гаврилов, В. Б. Измерение диеновых конъюгатов в плазме крови по УФ поглощению гептан-изопропанольных экстрактов / В. Б. Гаврилов, А. Р. Гаврилова, Н. Ф. Хмара // Лабораторное дело. - 1988. -№2.-С. 60-63.

49. Ганенко, Т. В. Антиоксидантная активность экстрактивных веществ Pinus sylvestris (Pinaceae) / Т. В. Ганенко, С. А. Медведева // Раст. ресурсы. Т. 42, № 1. - с. 91-96.

50. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды / М. Б. Плотников, А. А. Колтунов, О. И. Алиев и др. // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34, № 1. - С. 87-91.

51. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений //В. П. Георгиевский, Н. Ф. Комиссаренко, С. Е. Дмитрук -Новосибирск : Наука, 1990. — 333 с.

52. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд. - М. : Медицина, 1987. - 337 с.

53. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё / МЗ СССР. 11-е изд. - М. : Медицина, 1990.-337 с.

54. Гринкевич, Н. И. Химический анализ лекарственных растений / Н. И. Гринкевич, Л. Н Сафронич. М., 1983. - 176 с.

55. Девясил высокий адаптоген и антигипоксант / Под ред. К. П. Зеленская, В. Г. Пашинский и др., Томск, 2004. - 312 с.

56. Дмитрук, С. Е. Антифунгинальные свойства биологически активных веществ некоторых представителей флоры Сибири : Автореф. дис. д-ра. фарм. наук / С. Е. Дмитрук. — Харьков, 1991. - 32 с.

57. Дудкин, М. С. Углеводы Symphytum asperum / М. С. Дудкин, Н. А. Денисюк // Химия природн. соедин. 1984. - № 1. - С. 15-20.

58. Дудко, В. В. Химическое исследование растений рода соссюрея и василек // 2-ая респ. конф. по мед. ботанике. Киев, 1988. - С. 234 -235.

59. Дурнев, А. Д. Антиоксиданты как средства защиты генетического аппарата / А. Д. Дурнев, С. Б. Серединин // Хим. фарм. журнал. 1990. - № 2. - с. 92-100.

60. Евстратова, Р. И. N-фенил-Р-нафтиламин из Centaurea salonitana / Р. И. Евстратова, Г. Г. Запесочная // Химия природных соединений. 1977. -№ 4. - С. 582.

61. Журова, И. П. Изучение биологически активных веществ василька шероховатого / И. П. Журова, О. Б. Спондарик // Актуальные вопросы клинич. и теор. медицины. Томск. - 1989. - С. 11-12.

62. Запесочная, Г. Г. Метоксифлавоны некоторых видов Centaurea / Г. Г. Запесочная, Р. И. Евстратова, М. Н. Мухамеджанона // Химия природн. соедин. № 5. - 1977. - С. 706-707.

63. Запрометов, Н. В. Основы биохимии фенольных соединений / Н. В. Запрометов. М., 1974.-235 с.

64. Ильин, М. М. Каучуконосность флоры СССР / М. Н. Ильин // Каучуки и каучуконосы. 1959. - Т. 2. - С. 9-14.

65. Использование алюминия хлорида для определения суммы флавоноидов в цветках боярышника / И. А. Самылина, О. В. Евдокимова, М. В. Кашникова // Фармация. № 6. - 1994. - С. 42-44.

66. Исследование флавоноидов некоторых видов растений семейства сложноцветных, бурачниковых и бересклетовых / В. А. Бандюкова, С. Ф. Джумырко, Н. В. Сергеева и др. // Тр. Первого всесоюз. съезда фармацевтов. М. : 1970. - С. 253-258.

67. Казицина, JI. А. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии / JI. А. Казицина, Н. Б. Куплетская. М. : Высш. Школа, 1971.-264 с.

68. Катикова, О. Ю. Влияние средств растительного происхождения на показатели ПОЛ при остром токсическом гепатите / О. Ю. Катикова // Вопросы медицинской химии. 2001. - Т. 47, № 6. - С. 593-598.

69. Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в надземной части Echinacea purpurea (L.) Moench / В. А. Куркин, О. И. Авдеева, Е. В. Авдеева, П. Г. Мизина // Растительные ресурсы. — 1998. -Т. 34.-Вып. 2.-С. 81-85.

70. Контроль качества биологически активных добавок методами вольтамперометрии / Г. Б. Слепченко, Л. С. Анисимова, В. Ф. Слипченко и др. // Хим.-фармац. журн. 2005. - Т. 39, № 3. - С. 54-56.

71. Контроль перекисного окисления липидов / В. Н. Ушкалова, Н. В. Иоанидис, Г. Д. Кадочникова, 3. М. Деева. Новосибирск : Изд-во Новосибирского университета, 1993. —250 с.

72. Короткова, Е. И. Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов / Е. И. Короткова // Журнал физической химии. 2000. - Т. 74, № 9. - С. 1704-1706.

73. Корулькин, Д. Ю. Природные флавоноиды / Д. Ю. Корулысин, Ж. А. Абилов, Р. А. Музычкина, Г. А. Толстиков. Новосибирск, 2007. - 232 с.

74. Костюченко, О. И. 6-Оксифлавоны в растительном мире // Раст. ресурсы. 1977. - Т. 13, № 2. - С. 403-417.

75. Косухин, А. Б. Экстракция липидов смесью гептан : изопропанол для определения диеновых конъюгатов / А. Б. Косухин, Б. С. Ахметова // Лабораторное дело. 1987. - № 5. - С. 335-337.

76. Крылов, Г. В. Зеленая аптека Кузбасса / Г. В. Крылов, Э. В. Степанов. Кемерово, 1975.-304 с.

77. Кузьменко, Д. И. Свободнорадикальное окисление липидов, активные формы кислорода и антиоксиданты: роль в физиологии и патологии клетки / Д. И. Кузьменко, В. Ю. Серебров, С. Н. Удинцев. Томск : Изд-во ТПУ, 2007. - 213 с.

78. Куркин, В. А. Современные аспекты химической классификации биологически активных соединений лекарственных растений / В. А. Куркин // Фармация. 2002. - № 2. - С. 8-16.

79. Курмаз, Б. В. Исследование флавоноидов василька скабиозовидного / Б. В. Курмаз // Материалы 2 научно-практической конф. Запорожье, 1963.-С. 16-17.

80. Курмаз, Б. В. Фитохимическое исследование некоторых васильков юго-востока Украины / Б. В. Курмаз. М., 1966. - 123 с.

81. Лабазник вязолистный в фитотерапии воспалительных процессов / Под ред. А. В. Головачевой, С. Г. Аксиенко, В. Г. Пашинский. -Томск, 2005. с. 304.

82. Лапинский, А. Г. Антирадикальная активность экстрактов из некоторых дикоросов северного охотоморья / А. Г. Лапинский, В. В. Горбачев // Хим.-фармац. журнал. 2006. - Т. 40. - № 6. - С. 27-29.

83. Лебедев, А. Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А. Т. Лебедев. М. : Бином. Лаборатория знаний, 2003. - 493 с.

84. Лекарственные препараты на основе диквертина / М. Б. Плотников, Н. А. Тюкавкина, Т. М. Плотникова. Томск : изд-во томского университета, 2005. — 224 с.

85. Лесников, Е. П. Антифунгинальные свойства высших растений / Е. П. Лесников. Новосибирск : Наука, 1969. — 194 с.

86. Литвиненко, В. И. Биологически активные вещества некоторых видов рода василек / В. Н. Литвиненко, В. Н. Бубенчикова // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тезисы Всесоюзной конференции. Томск, 1986. - С. 90-91.

87. Литвицкий, П. Ф. Патофизиология : учебник для медицинских ВУЗов / П. Ф. Литвицкий. — 4-е изд-е, перераб. и доп. — М. : ГЭОТАР Медиа, 2007. - 496 с.

88. Макаров, В. Г. Изучение механизма антиоксидантного действия витаминов и флавоноидов / В. Г. Макаров, М. Н. Макарова, А. И. Селезнева // Вопросы питания. 2005. - №1. - С. 10-13.

89. Максимов, О. Б. Антиоксидантная активность листьев и коры побегов деревьев и кустарников флоры приморского края / О. Б. Максимов, П. Г. Горовой // Растит, ресурсы. 1995. - Т. 31, Вып. 1. - С. 61-66.

90. Максимов, О. Б. Скрининг для обнаружения антиоксидантов в экстрактах из растений / О. Б. Максимов, Я. М. Ребачук, П. Г. Горовой // Растит, ресурсы. 1985. - Т. 21, Вып. 2. - С. 216-220.

91. Максимов, О. Б. Содержание антиоксидантов в семенах некоторых видов флоры Приморья / О. Б. Максимов, П. Г. Горовой // Растит, ресурсы. 1990. - Т. 26, Вып. 4. - С. 487-492.

92. Максютина, Н. П. Растительные антиоксиданты и пектины в лечении и профилактике лучевых поражений и детоксикации организма / Н. П. Максютина, Л. Б. Пилипчук // Фарм. Журнал. 1996. - № 2. - С. 35-41.

93. Марусин, А В. Общие представления об антиоксидантной системе организма / А. В. Марусин // Медицинская генетика: проблемы диагностики, профилактики и диспансеризации больных с наследственной потологией, Томск. 1998. - С. 48-54.

94. Марусин, А. В. Проблемы изучения антиоксидантной системы организма / А. В. Марусин // Медицинская генетика. 1998. - С. 52- 54.

95. Маршалл, В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл. М. -СПб. : Издательство Бином - Невский Диалект, 2002. - 273 с.

96. Матющенко, Н. В. Стандартизация плодов рябины / Н. В. Матющенко, Т. А. Степанов // Фармация. № 5. - 2003. - С. 16-18.

97. Машковский, М. Д. Лекарственные средства. В 2-х т. Т. 2 / М. Д. Машковский. — 14-е изд. Москва : «Новая волна», 2002. - 330 с.

98. Меньшикова, Е. Б. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков, С. М. Шергин. -Новосибирск, 1994. - 120 с.

99. Меркулов, В. А. Руководство по патолого-гистологической технике / В. А. Меркулов. М. : Медицина, 1995. - 245с.

100. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / Под ред. А. В. Арутюняна, Е. Е. Дубининой, Н. Н. Зыбина. Спб., 2000. - 103 с.

101. Мечикова, Г. Я. Количественное определение суммы фенольных соединений в листьях земляники / Г. Я. Мечикова, Т. А. Степанова, Е. В. Золузова // Химико-фармацевтический журнал. — 2007. Т. 41, № 2. -С. 38-41.

102. Морозов, С. В. Оценка эффективности природных антиоксидантов в экспериментах in vitro и in vivo: Автореф. дис. канд. фарм. наук / С.В.Морозов. Москва, — 2003. - 34 с.

103. Муравьева, Д. А. Полисахариды цветков василька синего / Д. А. Муравьева, В. Н. Чушенко // Фармация. 1987. - Т. 36, №'2. - С. 29-32.

104. Муравьев, И. А. Технология лекарств. В 2-х т. Т. 1 / И. А. Муравьев. М. : Медицина, 1980: - 402 с.

105. Немыкина, Т. А. Фитохимическое изучение васильков сибирского и шероховатого / Т. А. Немыкина, И. Д. Нешта // Материалы 4 Всероссийского съезда фармацевтов. Воронеж, 1984. - С. 446-447.

106. Никифоров, Ю. В. О некоторых растениях народной медицины Алтая // Успехи в изучении природ, и синтет. лек. ср-в. — Томск, 1982. — С. 60-61.

107. Новицкий, В. В. Патофизиология : учебник для медицинских ВУЗов / В. В. Новицкий, Е. Д. Гольдберг. 3-е изд-е, стереотип. - Томск : Изд-во Том. Ун-та, 2006. - 716 с.

108. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков / Под ред. Ю. А. Овчинникова. М. : Мир, 1974. - 162 с.

109. Оболенцева, Г. В. Растительные полисахариды — перспективный источник лекарственных средств / Г. В. Оболенцева // Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений. Тезисы всероссийской конференции. М., 1981. - С. 108109.

110. О влияние биологически активных веществ препарата на антиоксидантную активность фитопрепаратов / Е. И. Шкарина, Т. В. Максимова, И. Н. Никулина и др. // Хим.-фармац. журн. 2001. - № 6. -С. 40-47.

111. Окислительный стресс / Под ред. Н. К. Зенкова, В. 3. Ланкина, Е. Б. Менщикова. — М. : МАИК «Наука / интерпериодика», 2001. — 343 с.

112. Оковитый, С. В. Клиническая фармакология гепатопротекторов / С. В. Оковитый, С. Н. Шуленин. СПб., 2006. - 86 с.

113. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии / Е. И. Короткова, О. А.

114. Аврамчик, М. С. Юсубов // Хим.-фармац. журн. 2003. - Т. 37. № 9. -С. 55-56.

115. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по образованию гидрофобного комплекса с ферротиоционатом аммония / А. А. Пентюк, В. И. Гуцол, Н. Б. Яковлева и др. // Лабораторное дело. -1987,-№6.-С. 457-459.

116. Особенности применения стандартного образца рутина в анализе растительного сырья, витаминных и фитопрепаратах / А. П. Смирнова, С. С. Николаева, В. А. Быкова и др. // Хим.-фарм. журн. Т. 34, № 1. -2000.-С. 29-31.

117. Основы биохимии растений / Под ред. В. А. Кретович. М. : Наука, 1971.-304 с.

118. Основы фармацевтической ботаники / Под ред. Т. П. Березовской, С. Е. Дмитрук, Е. И. Гришина, М. В. Белоусова. Томск: изд-во "Печатная мануфактура". - 2004. - 294 с.

119. Оценка показателей антиоксидантной активности препаратов на основе лекарственного растительного сырья / А. П. Арзамасцев, Е. И. Шкарина, Т. В. Максимова и др. // Хим.-фармац. журнал. — 1999. Т. 33, №11.-С. 17-20.

120. Пахомов, В. П. Биоантиоксиданты в производстве лекарственных препаратов и пищевых продуктов / В. П. Пахомов, Я. И. Яшин, А. Я. Яшин, О. А. Чеча // Фармацевтическая промышленность. 2005. - №5. -С. 79-82.

121. Петриченко, В. М. Определение флавоноидов в траве марьянника лугового / В. М. Петриченко, Е. Е. Галишевская // Фармация. № 1. -2004-С. 24-25.

122. Петрович, Ю. Л. Свободно-радикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю. Л. Петрович, Д. В. Гуткин // Пат. физиол. и эксперим. терапия. 1986. — № 5. - С. 85-92.

123. Подымова, С. Ю. Болезни печени : рук-во для врачей / С. Ю. Подымова. 2-е изд., перераб. и. доп. - М. : Медицина, 1993. - 544 с.

124. Полезные растения Западной Сибири / Под ред. В. И. Верещагин. -М. : изд-во АН СССР. 1959. - 346 с.

125. Полиамидные сорбенты для разделения веществ флавоноидов с Р-витаминной активностью / Д. JL Рахманкулов, Ф. Н. Латыпова, В. С. Шмаков и др. // Хим.-фарм. журнал. 1997. - Т. 31, № 7. - С. 47-48.

126. Полиметоксилированные флавоноиды из кожуры плодов мандарина / И. Д. Чхиквишвили, И. Н. Гогия, А. Г. Шалашвили // Химия природных соединений. 1990. - № 4. - С. 545-546.

127. Полунина, Т. Е. Лекарственные поражения печени : патогенез, диагностика, лечение / Т. Е. Полунина // Фарматека. 2006. - № 6. - С. 50-55.

128. Пономарев, В. Д. Экстрагирование лекарственного сырья / В. Д. Пономарев. М. : Медицина, 1976. - 204 с.

129. Практикум по биохимии растений / Под ред. Б. П. Плешков. М. : изд-во «Колос». - 1968. — 436 с.

130. Практикум по фармакогнозии / Под ред. В. Н. Ковалева. Харьков: изд-во "Золотые страницы". - 2004. - 504 с.

131. Противосудорожные свойства экстрактов из centaurea scabiosa (Asteraceae) / Т. В. Кадырова, Е. А. Краснов, А. В. Корнякова и др. // Раст. ресурсы. 2006. - № 4. - С. 70-75.

132. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование; семейства Asteraceae / Под ред. А. А. Федорова. Ленинград : Наука, 1987. - 326 с.

133. Растительные лекарственные средства / Н. П. Максютина, Н. Ф. Комисаренко, А. П. Прокопенко и др. / Под ред. Н. П. Максютиной. -Киев: Здоровье, 1985. — 280 с.

134. Роллов, А. X. Дикорастущие растения Кавказа, их распространение, свойства и применение / А. X. Роллов. Тифлис, 1968. - 599 с.

135. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / Под ред. А. А. Долгова, Е. Я. Ладыгина. М. : Медицина. - 1977. - 256 с.

136. Руководство по экспериментальным (доклиническим исследованиям) новых фармакологических веществ / Под ред. члена — корр. РАМН проф. Р. У. Хабриева. 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 2005. - 836 с.

137. Рыбалко, К. С. Природные сесквитерпеновые лактоны / К. С. Рыбалко. М : Медицина, 1978. - 320 с.

138. Саратиков, А. С. Экстракт солянки холмовой (лохеин) эффективная защита печени / А. С. Саратиков, А. И. Венгеровский, B.C. Чучалин. -Томск: «STT», 2002. - 114 с.

139. Сафонов, В. В. Спектрофотометрический метод определения содержания суммы флавоноидов в лекарственном сырье Caragana spinosa (L.) // Раст. ресурсы. Т. 36, № 2. - 2000. - С. 129-131.

140. Сафонов, М. Ю. Спектрофотометрический метод определения содержания полисахаридов в слоевищах Cetraria islandica (L.) ACH / M. Ю. Сафонов, Е. И. Саканян, Е. Е. Лесиовская // Раст. ресурсы. — 1999. -Т. 35, №2.-С. 101-105.

141. Сейтембетов, Т. С. Природные фенольные соединения — перспективный источник антиоксидантов / Т. С. Сейтембетов, С. М. Адекенов. Акмала, 2001. — 281 с.

142. Сейфулла, Р. Д. Проблемы фармакологии антиоксидантов / Р. Д. Сейфулла, И. Г. Борисова // Фармакология и токсикология. 1990. - Т. 53, №6.-С. 3-10.

143. Сесквитерпеновые лактоны василька шероховатого (Centaurea Scabiosa L) / И. П. Каминский, Т. В. Кадырова, Е. А. Краснов, С. А. Ивасенко и др. // Тез докл. на 2 международную научную конференцию, г. Алмааты, 10-13 октября 2007. Казахстан, 2007. -С. 194.

144. Система аскорбиновой кислоты растений / Под ред. Г. П. Чупохина. -Калининград, 1997. — 120 с.

145. Современное состояние жидкостной хроматографии / Под ред. Дж. Киркленда. М. : Мир, 1974. - 325 с.

146. Сорокина, А. А. Разработка пищевого продукта, обогащенного аскорбиновой кислотой / А. А. Сорокина, Е. В. Сергунова, И. А. Самылина // Фармация. 2001. - № 2. - С. 35-36.

147. Спектрофотометрическое определение гидроксикоричной кислоты и ее производных в препаратах эхинацеи / О. А. Запорожец, Е. А. Крушинская, В. Н. Барвинченко и др. // Хим.-фармац. журнал. 2003. — Т. 37.-№ 12.-С. 11-13.

148. Спиричев, В. Б. Витамины, витаминоподобые и минеральные вещества: справочник / В. Б. Спиричев. М. : МЦФЭР, 2004. - 240 с.

149. Справочник биохимика / Перев. с англ. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Элиот, К. Джонс. М. : Мир, 1999. - 426 с.

150. Справочник по клинико- биологической лабораторной диагностике : В 2 т. / Под ред. В. С. Камышникова. Минск : Беларусь, 2002. - 2 т.

151. Суханова, Г. А. Биохимия клетки / Г. А. Суханова, В. Ю. Серебров. -Томск : Чародей, 2000. 183 с.

152. Структурно-функциональный анализ радиопротекторной а антиокислительной активности флавоноидов / Э. П. Кемертелидзе, В. Г. Цицишвили, М. Д. Алании и др. // Химия природных соединений. -2000. -№ 1.-С. 42-46.

153. Телятьев, В. В. Лекарственные растения Восточной Сибири / В. В. Телятьев. Иркутск, 1985. — 383 с.

154. Телятьев, В. В. Полезные растения центральной Сибири / В. В. Телятьев. Иркутск : Вост.-Сиб. книж. изд-во, 1971. - 395 с.

155. Теслов, А. С. Флавоноловые гликозиды надземной части Campanulla boloniensis / А. С. Теслов // Раст. ресурсы. 1997. - Т. 33, № 3. - С. 6872.

156. Технология лекарственных форм. В 2-х т. Т. 1 / Под ред. Т. С. Кондратьевой. М. : Медицина, 1991. - 495 с.

157. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии в 2-х частях / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. Москва : «Мир», 1980.

158. Турищев, С. Н. Фитотерапия заболеваний гепатобилиарной системы / С. Н. Турищев // Фармация. 2003. - №1. - С. 7.

159. Фармакогнозия. Учебник для ВУЗов / Под ред. В. А. Куркин. М., 2004. - 768 с.

160. Фармакология некрахмальных полисахаридов / Ю. С. Хотимченко, И. М. Ермак, А. Е. Бедняк и др. // Вестник ДВО РАН. 2005. - № 1. -С. 72-82.

161. Фенольные соединения растительного происхождения / А. А. Блажей. М. : Мир. - 1977. - 239 с.

162. Физико-химическое изучение производных коричной кислоты. 1. Взаимосвязь антиоксидантной активности с физико-химическими свойствами / H. Н. Богдашев, Н. А. Туховская, А. В. Погребняк // Хим.-фарм. журнал, 1998. №2. - С. 31-33.

163. Франчук, А. Е. Активность фермента супероксиддисмутазы и метаболитов ПОЛ при остром воспалительном процессе / А. Е. Франчук, А. В. Бойчук, В. Л. Купаненко // Врачебное дело. 1991. — № 5. - С. 95-101.

164. Фролова, Н. Ю. Возможные механизмы антигипоксического эффекта экстракта касатика / Н. Ю. Фролова, Т. Н. Меншикова // Тез.докл.: 2-я Всесоюз. конференция Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. Гродно, 1991. - С. 252-253.

165. Фрумин, Г. Т. Экспресс-метод определения эффективных и смертельных доз / Г. Т. Фрумин // Химико-фармацевтический журнал. 1991. - №6. - С. 15-18.

166. Хазиев, Р. Ш. Экстрагируемость флавоноидов травы зверобоя / Р. Ш. Хазиев, А. А. Тынчерова // Фармация. 2006. - №6. - С. 29-31.

167. Характеристика антирадикальной активности экстрактов из растительного сырья и содержание в них дубильных веществ и флавоноидов / М. Н. Макарова, В. Г. Макаров, Н. М. Станкевич и др. // Раст. ресурсы. 2005. - № 2. - С. 106-115.

168. Ходжаева, М. А. Полисахариды отходов Pinica granatum / М. А. Ходжаева, Н. П. Олдашев, А. У. Умаров и др. // Химия природ, соедин. -№ 5.- 1984. -С. 651-652.

169. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии / Под ред. Н. А. Тюкавкиной, В. И. Литвиненко, М. Ф. Шостаковского. -Новосибирск : изд-во «Наука», 1973. 176 с.

170. Царева, А. А. Антиоксидантная активность фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, при токсическом поражении печени : автореф. дис. . к-та мед. наук / А. А. Царева. Самара, 2007. - 22 с.

171. Цепалов, В. Ф. Метод количественного анализа антиоксидантов с помощью модельной реакции инициированного окисления / В. Ф. Цепалов // Исследование синтетический и природных антиоксидантов in vivo и in vitro: Сб. науч. ст. / МОИП. М., 1998. - С. 16-25.

172. Чалый, Г. А. Количественное определение каротиноидов и хлорифиллов в густом ацетоновом экстракте тысячелистника обыкновенного / Г. А. Чалый, Н. Т. Сурница, В. Я. Яцюк // Человек и его здоровье: Сб. науч. работ. Курск. - вып. 2. - 1999. - С. 261-263.

173. Чевари, С. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте / С. Чевари, Т. Андял, Я. Штренгер // Лабораторное дело. 1991. - № 10. - С. 638-641.

174. Чучалин, А. Г. Системы оксиданты-антиоксиданты и пути медикоментозной коррекции / А. Г. Чучалин // Пульмонология, 2004 — С. 111-115.

175. Шпицбер, В. Л. Диссоциация и реассоциация каталазы эритроцитов человека // В. Л. Шпицбер // Биофизика. 1998. - Т. 51, вып. 5. - С. 5560.

176. Шутова, А. Г. Оценка антиоксидантной активности экстрактов и эфирных масел пряно-ароматических и лекарственных растений / А. Г. Шутова // Растит, ресурсы. 2007. - № 1. - С. 112-125.

177. Эффективность пищевых некрахмальных полисахаридов при экспериментальном токсическом гепатите / Ю. С. Хотимченко, Э. И . Хасина, В. В. Ковалев и др. // Вопросы питания. 2000. - Т. 69, № 1-2. - С. 22-26.

178. Яковлев, А. И. Иммунологические свойства гетерополисахаридов из лекарственных растений семейства сложноцветных / А. И. Яковлев // Тез. докл. IV Российского национального конгресса: Человек и лекарство. -М., 1997. С. 306-307.

179. Advances of modern chromatographic and electrophoretic methods in separation and analysis of flavonoids / E-Hu Liu, Lian-Wen Qi, Jun Cao et al. // Molecules. 2008. - № 13. - P. 2521-2544.

180. Acetylation of 8-Bromo-5-hydroxy-6,7,4-trimethoxyflavone / E. K. Donbaeva, V. I. Yamovoi, В. I. Tuleuvov et al. // Translated from Zhurnal Obschei Khimii. 2005. - T. 75, № 6. - P. 999-1001.

181. Aglycone flavonoids of Centaurea tougourensis from Algeria / A. Nacer, A. Bernard, J. Boustie, R. Touzani, Z. Kabouche // Химия природных соединений. 2006. -№ 2. - С. 190-191.

182. Ahmed, Z. F. Flavonoid constituents of certain Centaurea species grown in Egypt / Z. F. Ahmed, H. Rimpler, A. M. Rizk, F. M. Hammouda, S. I. Ismail // Phytochemistry. 1970. - Vol. 9, № 7. - P. 1595-1601; Chem. Abstrs. - 1970. - Vol. 73, № 110061.

183. Analytical separation and detection methods for flavonoids / E. de Rijke, P. Out, Wilfried M. A. Niessen et al. // Journal of Chromatography A. -2006.-№ 1112.-P. 31-63.

184. Antioxydant activity of flavonoids and reactivity with peroxy radical / J. Topel, J. Cillard, P. Cillard // Phytochemistry. 1986. - V. 25. - № 2. - P. 383-385.

185. Antioxidant activity of plant phenolic flavonoids and phenolic acids / Neda M. Mimica Rukic, Miijana M. Budincevic, Biserka A. Mihajlovic, Olga S. Gasic // J. Serb. Chem. Soc. 1994. - V. 59, № 2. - P. 823-828.

186. Antioxydant activity of plant-leaves in relation to their alpha-tocopherol content / J. Mallet, C. Cerrati, E. Ucciani, J. Gamisans, M. Gruber // Food. Chem.- 1994.-V. 49.-№ l.-P. 61-65.

187. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: Structure-activity relationships / G. Cao, B. Sofic, R. L. Prior // J. Free Radic. Biol. Med. -1997. V. 22, № 5. - P. 749-760.

188. Biological activity of lignans from the seads of Centaurea scabiosa / Y. Kumavasamy, L. Nahar, P. Cox, L. Dinar, C. Ferguson, D. Finnie // Pharm. Biol. 2003. - V. 41. - P. 203-205.

189. Bruno, M. Sesquiterpene lactones and flavonoides from Centaurea cineraria Subsp. Umbrosa / M. Bruno, W. Herz // Phytochemistry. 1988. -T. 27, №6.-P. 1873-1875.

190. Budzianowski, I. Studies on the antioxydative activity of some С -glycosylflavones / I. Budzianowski, I. Pakulski, I. Robak // Pol. J. Pharmacol, and Pharm. 1991. - V. 43, №5. - P. 395-401.

191. Chemical constituents of Centaurea cadmea / C. Karameneres, E. Bedir, H. Abou-Gazar et al. // Химия природных соединений. 2007. - № 6. — С. 575-576.

192. Comparison of antooxidative activity of, some acidphenols : Structure-activity relationship / M. Cuvelier, R. Hubert, C. Berset // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1992. - V. 56, № 2. - P. 324-325.

193. Composition of the essential of Centaurea dichroa / A. Altintas, Y. B. Kose, E.Yucel et al. // Химия природных соединений. 2004. - № 6. - С. 496-497.

194. Constituents of Centaurea chilensis / S. Sepulveda, S. Delhvi, B. Koch // Fitoterapia. 1994. - № i. p. 88-89.

195. Constituents of Centaurea rothmalerana / S. M. Santos, В. P. Brito Palma, M. Grande // Fitoterapia. 1995. - № 3. - P. 285-289.

196. Constituents of the roots of plants species Centaurea scabiosa / T. Vele, D. Dejan, V. Vlatka et al. // J. Serb. Chem. Soc. 1994. - V. 59, № 12. - P. 979-981.

197. Cynaropicrin: a sesquiterpene lactone from Centaurea americana / N. Ohno, H. Hirai, Н. Yoshioka // Phytochemistry. 1973. - V. 12, № 3. - P. 221.

198. Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography-mass spectrometry / Т. H. Kao, S. C. Huang, B. S. Inbaraj et al. // Analitica chimica acta. 2008. - № 626. -P. 200-211.

199. Evaluation of propolis polyphenols absorption in humans by liquid chromatography/tandem mass spectrometry / C. Gardana, P. Simonetti, C. Berti // Rapid communications in mass spectrometry. 2007. - № 21. - P. 3849-3854.

200. Flavonoid aglycones from Centaurea napifolia / S. Akkal, F. Benayache, K. Medjroubi et al. // Химия природных соединений. 2003. - № 2. - С. 165-166.

201. Flavonoid aglycones from Centaurea sphaerocephala / A. Bentamene, M. Baz, R, Boucheham et al. // Химия природных соединений. 2008. - № 2.-С. 185-186.

202. Flavonoids as antioxidants / S. V. Jovanovic, S. Steenken, M. Tosic et al. //J.Am. Chem. Soc. 1994. - V. 116.-P. 4846-4851.

203. Flavonoid constituents of Chorizonthe diflusa with potential cances cemopreventive activity / S. Chung, L. Chang, S. Lee, L. Scomon, B. Van // J. Agr. and Food Chem. 1999. - № 1. - P. 36-41.

204. Flavonoids, coumarins and cinnamic acids as antioxidants in a micellar system. Structure-activity relationship / M. Foty, M. Piatelli, M. T. Baratta, G. Ruberto // J. Agr. and Food Chem. 1996. - V. 44, № 2. - P. 497-501.

205. Flavonoids from Centaurea clementei / G. Collado, F. A. Massanet, F. Roodricuz // Plantes medicinales et Phytotherapie. 1989. - Т. 23, № 4. - P. 819-822.

206. Flavonoids of the aerial part of Centaurea pullata / K. Medjroubi, S. Mezhouol, F. Benayache, E. Sequin, F. Tillequin // Химия природных соединений. 2005. - № 2. - С. 180-182.

207. Flavonoids, sesquiterpene lactones and glucoside from Centaurea aspera / Maria Teresa Picher, Eliseo Seoane, Amparo Tortajada // Phytochemistry. -Vol. 23, №9.-P. 1995-1998.

208. Folch, I. A simple method for the isolation and purification of total from animal tissues /1. Folch, M. Jees, Sloane Stanley g. H. // The Journal boil. Chemistry. 1957. - № 1. - P. 497-509.

209. Harbome J. B. Comparativ biochemistry of the flavonoids. VIII. Gossypetin and herbacetin as taxonomic markers in higher plants / J. B. Harbome // Phytochemistry. 1969. - V. 8, № 1. - P. 177-183.

210. Harborne, J. B. Comparativ biochemistry of the flavonoids / J. B. Harborne. London-New-Yore: Academic Press. - 1967.

211. Harborne, J. B. Phytochemical methods. A guide to modern techniques of plant analysis / J. B. Harborne // Sec. Ed. London, N. Y. : Chapman and Hall, 1984.-288 p.

212. Hatano, T. Chromatography of tannins / T. Hatano, T. Yoshida, T. Okuda // Journal of Chromatography A. 1988. - № 435. - P. 285-295.

213. Hegnauer, R. Chemotaxonomie der pflanzen : Bol. 1-6, Basel, Stuttgart: 1966.-Bd. 4.-S. 882.

214. Hodi§an, V. Qualitative and quantitative analysis of flavonoids in plant products of cosmetic intrest / V. Hodi§an, M. Tamas, I. Mester // Clujul med. 1985. - Vol. 58, № 4. - P. 378-381; Chem. Abstrs. - 1986. - Vol. 105, № 11828.

215. Hoppe, H. A. DrogenKunde. Bd 1-2. - Berlin; New York, 1975. - Bd 1. - 1311 s.

216. Identification and quantificatuion of phenolic compounds in grapes by HPLC-PDA-ESI-MS on a seminicro separation scale / I. Nicoletti, C. Bello,

217. A. de Rossi et al. // Yournal of agricultural and food chemistry. 2008. - № 56.-P. 8801-8808.

218. Induction of anthocyani synthesis and related enzyme activites cell cultures of Centaurea cyanus by UV-light irradiation / Kokedawa Koichi, Hattorf Emiko, Koike Kinn, Tokeda Kosaku // Phytochemistry. 1991. - V. 30.-№7.-P. 2271-2273.

219. Inhibition of low density lipoprotein oxidation by Mirigalone B, a naturally occurring flavonoid / L. Mathiesen, K. E. Malterud, M. S. Newseter et al. // Pharmacol. Toxicol. 1996. - V. 78, № 3. - P. 143-146.

220. Kamanzi, K. Flavonoid C-glycosides from the flowers of Centaurea solstitialis L. (Compositae) / K. Kamanzi, J. Raynaud, B. Voirin // Pharmazie. 1983. - Bd 38, H. 7. - S. 494-495; Chem. Abstrs. - 1983. -Vol. 99, № 191719.

221. Kamanzi, K. Flavonoid O-heterosides from the flowers of Centaurea solstitialis L. (Compositae) / K. Kamanzi, J. Raynaud, B. Voirin // Plant, med. et phytother. 1983. - Vol. 17, № 1. - P. 57-60; Chem. Abstrs. -1984.-Vol. 100, № 117791.

222. Kamanzi, K. Methoxylated flavonoids from flowers of Centaurea solstitialis L. (Compositae) / K. Kamanzi, B. Voirin, J. Raynaud // Plant, med. et phytother. 1983. - Vol. 17, № 1. - P. 52-56; Chem. Abstrs. -1984.-Vol. 100, № 117790.

223. Kandaswami, C. Flavonoids as antioxidants / C. Kandaswami, E. Midleton // Natural antioxidans. Chemistry, health effects, and applications. Ed. Shahidi F. Champaign, Illinois, 1997. - P. 174-203.

224. Korkina, L. G. Antioxidant and helating properties of flavonoids / L. G. Korkina, I. B.Afanaser // Adv. Pharmacol. V. 38. - 1997. - P. 151-163.

225. Kubo, S. Effect of Gomisin A (TJN) on liver regeneration / S. Kubo, Y. Ohkura, Y. Mizoguchi // Planta Med. 1992. - Vol. 58, №. 6. - P. 487492.

226. Mabry, T. J. Systematic identification of flavonoids / T. J. Mabry, K. P. Marcham, S. Thomas. Berlin - Heidelberg - New-York, 1970. - 354 p.

227. MALDI-TOF mass spectrometry of oligomeric food polyphenols / J. D. Reed, C. G. Krueger, M. M. Vestling // Phytochemistry. 2005. - № 66. -P. 2248-2263.

228. March, R. Analysis of flavonoids: Tandem mass spectrometry, computational methods, and NMR / R. March, J. Brodbelt // J. of mass spectrometry. 2008. -№ 43. - P. 1581-1617.

229. Markham, K. R. Techniques of flavonoid identification / K. R. Markham. London, N. Y., Paris: Academic Press, 1982. - 114 p.

230. Molnar-Perl, I. Chromatographic, capillary electrophoretic and capillary electrochromatographic techniques in the analysis of flavonoids / I. MolnarPerl, Zs. Fuzfai // Journal of Chromatography A. 2005. - № 1073. - P. 201-227.

231. Monya, M. Continutul de derivati cafei-chnici de plonte apartininol genului Centaurea L. / M. Monya // Farmacia (RSR). 1971. - V. 19, № 1. -P. 45-50.

232. Neue Polyinepoxde aus Centaurea deusta Ten. / F. Bohlmann, H. Monch // Chemiche berichte. 1967. - № 100. - S. 1944-1948.

233. Neue Polyine der Gattung Centaurea L. / F. Bohlmann, K. Rode, C. Zdero // Chemiche berichte. 1966. -№ 11. - S. 3544-3551.

234. Non-reductive Scavenging of l,l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) by Peroxyradical: A Useful Method for Quantitative Analysis of Peroxyradical

235. М. Nishizawa, M. Kohno, M. Nishimura, A. Kitagawa, Y.Niwano // Chem. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 53, № 6. - P. 714-716.

236. Oksuz, S. A quaianolide from Centaurea behen / S. Oksuz, A. Ulubelen, Y. Aynechi, H. Wagner // Phytochemistry. 1982. - Vol. 21, № 11. - P. 2747-2749.

237. On terpenes: Isolation and structure of Scabiolide. Further sesquiterpene lactone with a ten-membered ring in molecule / M. Suchy, V. Herout, F. Sorm // Collect. Czech. Chem. Comm. 1962. - Vol. 27. - P. 1905-1910.

238. On terpenes: The structure and absolute configuration of scabiolide / M. Suchy, Z. Samek, V. Herout, F. Sorm // Collect. Czech. Chem. Comm. -1962.-Vol. 27.-P. 1905-1910.

239. On terpenes: The structure of salonitolide, a sesquiterpene lactone of germacrane type from Centaurea salonitana Vis. / M. Suchy, V. Herout, F. Sorm // Collect. Czech. Chem. Comm. 1965. - V. 30, № 8. - P. 28632864.

240. Phenolic compounds from Centaurea africana / R. Seghiri, R. Mekkiou, O. Boumaza, S. Benayache, J. Bermijo, F. Benayache // Химия природных соединений. 2006. - № 5. - С. 491-492.

241. Phenolic compounds from Centaurea pseudomaculosa / V. N. Bubenchikov, V. I. Kitvinenko, T. P. Popova // Химия природных соединений. 1992. - № 5. - С. 580.

242. Pietta, P. J. Flavonoids as antioxidants / P. J. Pietta // J. Nat. Prood. -2000. V. 63, № 7. - P. 1035-1042.

243. Plant flavonoids, especially tea flavonols, are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease / J. A. Vinson, Y. A. Pabbagh, M. M. Serry et al. // J. Agr. and Food Chem. 1995. - V. 43, № 11. - P. -2800-2802.

244. Plouvier, V. Sur la recherché des heterosides flavoniques dans quelques groupes botaniques / V. Plouvier // С. r. Acad. Sci. 1963. - T. 257, № 25. -P. 4061-4063.

245. Polrunsaturated compounds of Centaurea scabiosa / B. Annie, J. Lam, Per Wrang // Phytochemistry. V. 16. - Issue 11.- 1977. - 1823-1831 p.

246. Polyenes from Centaurea scabiosa / Lars P., Christensen, Jargen Lam, Tove Thomasen // Phytochemistry. V. 30. - Issue 10. - 1991. - P. 34573458.

247. Polyphenol screening of pomace from red and white grape varieties (Vitis vinifera L.) by HPLC-DAO-MS/MS / D. Kammerer, A. Claus, R. Carle et al. // Journal of Chromatography A. 2004. - № 52. - P. 4360-4367.

248. Prasain, J. Mass-spectrometric methods for the determination of flavonoids in biological samples / J. Prasain, C. Wang, S. Barnes // Free radical biology et medicine. 2004. - Vol. 37, № 9. - P. 1324-1350.

249. Prouviez, V. Structure d'heterosides flavoniques pasresonanse nucleaise. Recherches de ees compases dans les gences Centaurea, Kerria, Rhus et Scabiosa / V. Prouviez // Comptes rendus, Academie des Sciences. 1970. -№22.- P. 270-271.

250. Quantitative analysis of flavonoids by reversed-phase high-performance liquid chromatography / A. Crozier, E. Jensen, Michael E. J. Lean et al. // Journal of Chromatography A. 1997. -№ 761. - P. 315-321.

251. Recent contribution to the Study of Egyptian medicinal flora / Z. F. Ahmed, A. M. Rizk, F. M. Hammouda // 'Internacional Symposium Progress in The Field of plant Drugs", Poznan. 1970. - P. 29-30.

252. Robak, J. Bioactivity of flavonoids / J. Robak, R. J. Gryglewski // Pol. J. Pharmacol. 1996. -V. 48. - P. 555-564.

253. Sesquiterpene lactones and phenolic compounds from Centaurea maroccana / A. Bentamene, S. Benayache, J. Bermejo et al. // Химия природных соединений. 2007. - № 6. - С. 621.

254. Sesquiterpene lactones of Centaurea derventana and Centaurea kosaninii / V. Tesevic, V. Vajs, P. Janackovic et al. // Planta medica. — 1998. № 64. -P. 448.

255. Sesquiterpene lactones of Centaurea nicaensis / K. Medjroubi, N. Bouderdora, F. Benayache et al. // Химия природных соединений. 2003 -№5.-С. 415-416.

256. Stalikas, С. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids / C. Stalikas // J. Sep. Sci. 2007. - № 30. - P. 32683295.

257. Steroids, a lignanand a flavonoid from Centaurea melitensis L. / R. E. Negrete, N. Backhouse, P. Prieto et al. // Plantes medicinales et phytotherapie. 1989. - T. 23, № 4. - P. 293-304.

258. Structure and Chemistry of Secondary metabolites from Compositae Part. 5 Flavonoids from Centaurea chementei / С. I. Yonzalez, F. A. Macias, U. M. Massanet //1. Natur. Prad. 1985. - № 48. - P. 819-822.

259. The determination, of the content of the polyphenols in the areal parts of the species Centaurea rupestris L. and Centaurea fritschii Hauek (Asteracaea) / C. Rusak, D. Kustrak, M. Zellan // Aeta pharm. (Crat.). -1993.-№2.-P. 121-125.

260. Torel, J. Antioxidant activity of flavonoids and reactivity with peroxy radical / J. Torel, J. Cillard, P. Cillard // Phytochemistry. 1986. - V. 25, № 2.-P. 383-385.

261. Two derivatives of costic acid from Centaurea arcuta / E. Gadeshci, Z. D. Jorge, G. M. Massanet et al. // Phytochemistry. 1989. - T. 28, № 8. -P.2204-2206.

262. Two flavonoids and other compounds from the aerial parts of Centaurea bracteata from Italy / G. Flamini, E. Antognoli, I. Morelli // Phytochemistry. 2001. - № 57. - P. 559-564.