Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Сесквитерпеновые лактоны Centaurea scabiosa L. Химическое исследование и разработка методов их анализа

На правах рукописи

КАМИНСКИМ ИЛЬЯ ПЕТРОВИЧ

Сесквитерпеновые лаптопы Centaurea scabiosa L. Химическое исследование и разработка методов их анализа

4841709

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

I Uk? 2GÍ1

Улан-Удэ-2011

4841709

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшег профессионального образования «Сибирский государственный медицински университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российско Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Краснов Ефим Авраамови

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Анцупова Татьяна Петровн

кандидат фармацевтических наук Олейников Даниил Николаеви

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессиональног образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 14 апреля 2011 г в 14 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, д.б.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан 11 марта 2011 г Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Актуальной проблемой сибирского региона является заболеваемость местного населения описторхозом, ареал встречаемости которого простирается от бассейна Енисея до западных границ Европы. Крупнейший в мире очаг описторхоза находится в Обь-Иртышском речном бассейне. Инвазированпость сельского населения в Среднем Приобье достигает 90-95%, причем нередко заражены и дети первого года жизни, пораженность которых к 14 годам может составлять 50-60%. Заболеваемость описторхозом населения разных регионов представляет собой тяжелую гигиеническую, экологическую и общественную проблемы [Завойкин, 2005].

В терапии описторхоза в большинстве случаев назначают синтетический протквопаразитарный препарат бильтрицид, обладающий рядом побочных эффектов и противопоказаний, особенно в детской практике [Лекарственные, 2000]. Это обстоятельство ограничивает область применения указанного препарата и приводит к необходимости прохождения комплексного курса лечения под наблюдением специалистов в условиях стационара. В связи с этим, возрастает актуальность поиска высокоэффективных альтернативных лекарственных средств растительного происхождения, дополняющих основную терапию бильтрицидом или заменяющих ее в случаях непереносимости данного препарата.

Среди биологически активных соединений растительного происхождения антигельминтным действием обладают сесквитерпеновые лактоны, продуцируемые растениями семейства Asteraceae [Рыбалко, 1978; Tesevic, 1998]. Перспективным источником сесквитерпеновых лактонов является представитель семейства Asteraceae - Centaurea scabiosa L. (василек шероховатый), который распространен на всей территории Западной Сибири и находит широкое применение в народной медицине [Телятьев, 1985]. В результате скрининговых исследований установлено наличие выраженной антигельминтной активности экстрактов данного вида, которая обусловлена присутствием сесквитерпеновых лактонов.

Сведения о терпеновых соединениях С. scabiosa и их биологической активности ограничены в связи с чем исследование сесквитерпеновых лактонов С. scabiosa и создание на его основе антигельминтного фитопрепарата является актуальной задачей.

Цель работы: Определение химического строения сесквитерпеновых лактонов Centaurea scabiosa L., разработка способа получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, и его стандартизация.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести химическое исследование сесквитерпеновых лактонов надземной части С. scabiosa;

2. Разработать методику количественного определения сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa-,

3. Изучить динамику содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa в зависимости от фазы вегетации и места сбора сырья;

4. Разработать способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью;

5. Установить параметры и разработать методики стандартизации средства, обладающего противоописторхозной активностью.

Научная новизна. Из надземной части С. scabiosa впервые выделено три сесквитерпеновых лактона гвайанового структурного типа - гроссгемин, цинаропикрин и репин. Впервые изучена динамика содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa в течение вегетационного периода. Разработан способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, и определены параметры его стандартизации. Разработаны методики количественного анализа сесквитерпеновых лактонов в сырье и сухом экстракте С. scabiosa с использованием методов ТСХ-денситометрии и ВЭЖХ.

Практическая значимость. 1. Разработан лабораторный регламент получения экстракта василька шероховатого сухого.

2. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на экстракт василька шероховатого сухой.

3. Получен патент РФ №2366443 на изобретение «Средство, обладающее противоописторхозной активностью, и способ его получения».

Степень внедреншь Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармацевтической химии ГОУ ВПО Сибирского государственного медицинского университета. Подготовлен к рассмотрению проект ФСП на экстракт василька шероховатого сухой. На защиту выносятся:

1. Результаты химического исследования сесквитерпеновых лактонов С. всаЫоэа.

2. Результаты исследований динамики содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. зсаЬша.

3. Результаты исследований по разработке способа получения средства, обладающего противоописторхозной активностью.

4. Методики стандартизации сухого экстракта из надземной части С. хсаЫоза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 65-ой международной студенческой научной конференции им Н.И. Пирогова (Томск, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), И Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009), VI Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (Уфа 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010), а также на заседаниях кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2005-2010).

Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По результатам работы опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, и патент РФ на изобретение (№2366443).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 167 источников литературы, из которых 95 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть С. scabiosa, собранная в 2004-2008 гг. в Томской и Кемеровской областях, а также в Алтайском и Красноярском краях.

Фракционирование экстрактивных веществ и выделение индивидуальных соединений проводили с использованием методов жидкофазной экстракции, адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле и метода дробной кристаллизации. Выбор элюентов, контроль за ходом элюции проводили с помощью

тех.

При установлении структуры выделенных веществ использовали методы УФ-, ИК-, МС-, ЯМР-спектрометрического и ГХ-МС анализов. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 (Ломо, Россия); ИК-спектры - на ИК-Фурье-спектрометре Nikolel 5700 (Intertech Corp., США; в таблетках с КВг и в пленке с СНС13); масс-спектры - на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8200 (Thermo

Scientific, США; ЭУ 70 эВ, Тисгот 200°С, диапазон сканирования 28-1024 а.е.м., прямой ввод); спектры *Н- и "С-ЯМР - на спектрометре DRX-500 [Bruker, Германия; рабочая частота 500.13 МГц ('Н-ЯМР), 125.76 МГц (иС-ЯМР)]. ГХ-МС анализ проводили на хромато-масс-спектрометре Finnigan Trace DSQ (Thermo Electron Corp., США; колонка: OV-1, 30 м x 0.32 мм, толщина 0.50 мкм; газ-носитель - гелий, гпотока - 1.2 мл/мин; ЭУ 70 эВ, диапазон сканирования 10-400 а.е.м.). ТСХ-денситометрический анализ проводили на хроматографичсских пластинах Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ (Имид, Россия) с использованием пакета программ Видеоденситометр Sorbfil v. 1.9 (Имид, Россия). Анализ ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе 1100 Series (Agilent Technologies, США); условия: колонка - Zorbax SB-C,8 (4.6 х150 мм, диам. 5 мм; Agilent Technologies, США), Т 20°С; подвижная фаза - Ме0Н-Н20 1:1, vII0T0Ka - 0.5 мл/мин; УФ-детектор 1100 Series (Agilent Technologies, США), X 204 нм.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом вариационно-статистического анализа. Достоверность результатов оценивали, используя критерии Стыодента и Вилкоксона. Расчеты проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica 6.0.

Исследование противоописторхозной активности проводили на золотистых хомяках с использованием модели экспериментального описторхоза, рекомендованной Фармакологическим комитетом Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ [Руководство, 2005]. Заражение животных производили путем внутрижелудочного введения жизнеспособных метацеркариев описторхов, выделенных из рыб карповых пород, преимущественно ельца и плотвы. Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей.

Результаты исследования Исследование сесквитерпеновых лактонов С. scabiosa

Учитывая возможность наличия в С. scabiosa сесквитерпеновых лактонов (CJI) с различными физико-химическими свойствами, для их извлечения использовали три метода:

(1) экстракция сырья хлороформом;

(2) экстракция сырья водой (1:10, 90°С) с последующей жидкофазной экстракцией водного извлечения хлороформом [Рыбалко, 1978];

(3) экстракция сырья смесью этанол-хлороформ, с последующей обработкой извлечения этанолом, водой, петролейным эфиром и хлороформом [Nowak, 1986]

Выделение индивидуальных веществ из суммы СЛ проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии (КХ) на силикагеле с использованием в качестве элюентов градиентных систем растворителей хлороформ-ацетон, бензол-метанол, петролейный эфир-этилацетат. В результате хроматографического разделения было выделено три соединения -1,2 и 3.

Гроссгемин (1). Выделен из суммы СЛ, полученной методом 1 (КХ, элюент-хлороформ). Выход 0.038%. Белый кристаллический порошок. Т. пл. 200-20ГС. ИК (V, см"'): 3600-3400, 1740, 1690-1650, 1420-1410. MC (m/z, отн. инт., %): 262 (45) М+, 244 (43), 234 (5), 216 (7), 165 (32), 137 (48), 136 (45), 97 (22), 69 (100). 'Н-ЯМР (ТМС, мл.): 0.60 (д, Н-3); 1.69 (дд, Н-9а); 1.73 (м, Н-4); 1.84 (дт, Н-5); 1.88 (ддд, Н-2а); 2.03 (дд, Н-2в); 2.21 (дд, Н-9в); 2.58 (дд, Н-7); 2.62 (дт, Н-1); 3.18 (дд, Н-8); 3.56 (дд, Н-6); 4.19 (уш.м, Н-13); 4.48 (м, Н-13); 5.60 (дд, Н-14); 5.71 (дд, Н-14). 13С-ЯМР (DMS04, (5, м.д.): 14.47 (д, С-15); 39.33 (д, С-1); 42.69 (т, С-2); 46.11 (д, С-4); 47.36 (т, С-9); 48.82 (д, С-7); 49.78 (д, С-5); 71.82 (д, С-8); 82.34 (д, С-6); 114.07 (т, С-14); 123.56 (т, С-13); 137.90 (с, С-13); 144.62 (с, С-10): 169.56 (с, С-12); 218.76 (с, С-3).

Цинаропикрин (2). Выделен из суммы СЛ, полученной методом 2 (КХ, элюент - бензол-метанол 95:5). Выход 0.108%. Маслянистая масса изумрудно-зеленого цвета. ВЭЖХ (/R, мин): 10.87. ИК (v, см"'): 3600-3510, 1762, 1690-1650,

1420-1410. 'Н-ЯМР (ТМС, 8, м.д.): 4.28 (т, Н-6); 4.35 (м, Н-8); 4.84 (с, Н-15); 5.27 (с, Н-15); 5.34 (с, Н-14); 5.43 (с, Н-14); 5.63 (д, Н-13в); 5.95 (с, Н-ЗЬ); 6.19 (д, Н-13а); 6.35 (с, Н-3 Ь).

Репин (3). Выделен из суммы СЛ, полученной методом 3 (КХ, элюент -гсксан). Выход 0.002%. Белый кристаллический порошок. Т.пл. 153-155°С. ИК (у, см"1): 3500, 1767, 1730, 1690-1650, 1420-1410. 'Н-ЯМР (ру-¿5, 8, м.д.): 1.55 (с, Н-19); 1.99 (ддд, Н-2); 2.21 (дд, Н-5); 2.36 (ддд, Н-2); 2.40 (дд, Н-9); 2.77 (д, Н-18); 2.82 (дд, Н-9); 3.12 (дддц, Н-7); 3.20 (д, Н-15); 3.21 (д, Н-18); 3.28 (ддд, Н-1); 3.38 (д, Н-15); 4.22 (дд, Н-3); 4.90 (дд, Н-6); 4.96 (уш.д., Н-14); 5.12 (уш.д., Н-14); 5.24 (ддд, Н-8); 5.55 (д, Н-13); 6.15 (д, Н-13). 13С-ЯМР фМБСМ, <5, м.д.): 17.44 (кв, С-19); 36.31 (т, С-9); 38.80 (т, С-2); 45.93 (д, С-7); 47.72 (д, С-1); 48.90 (т, С-15); 53.01 (т, С-18); 54.1 (с, С-17); 55.03 (д, С-5); 69.11 (с, С-4); 75.25 (д, С-3); 75.43 (д, С-8); 77.40 (д, С-6); 117.99 (т, С-14); 121.09 (т, С-13); 138.57 (с, С-10); 142.69 (с, С-11); 169.03 (с, С-12); 170.18 (с, С-16).

Таким образом, в результате хроматографического разделения СЛ С. хсаЫача выделены три гвайанолида - гроссгемин (1), цинаропикрин (2) и репин (3) (рис. 1). Все соединения выделены из данного растительного вида впервые.

Рис. 1. Сесквитерпеновые лактоны, выделенные из С. scaЫosa.

Методика количественного определения цинароиикрина и гроссгемина в надземной части С зсаЬШа методом ТСХ-денситометрии

В рамках решения данной задачи нами был применен метод ТСХ-денситометрии (ТСХ-ДМ). Применительно к объекту исследования были выбраны оптимальные условия анализа: пластинки БогЬШ ПТСХ-П-А-УФ (Имид, Россия),

Гроссгемин

Цинаропикрин

Репин

подвижная фаза - гексан-ацетон-уксусная кислота 20:10:0.1, вертикальный вариант, высота подъема - 80 мм, проявитель - 20% раствор калия перманганата. В качестве PCO использовали образцы гроссгемина и цинаропикрина со степенью чистоты > 99.0% (по данным ГХ-МС, ВЭЖХ). Для построения градуировочных графиков использовали растворы цинаропикрина и гроссгемина с концентрациями 1153.847500 и 715.38-4650 мкг/мл, соответственно.

Методика количественного анализа цинаропикрина и гроссгемина в надземной части С. scabiosa. Исследуемый раствор. Около 2.0 г (точная навеска) сырья помещают в колбу со шлифом, приливают 20 мл хлороформа, присоединяют обратный холодильник и нагревают при температуре кипения растворителя в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтруют в колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Объединенное извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл через безводный сульфат натрия, который промывают 10 мл хлороформа. Органический растворитель удаляют в вакууме досуха, сухой остаток переносят хлороформом в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят до метки тем же растворителем.

Раствор сравнения. Около 0.010 г гроссгемина и 0.010 г цинаропикрина (точные навески) переносят в стеклянную виалу вместимостью 2 мл и растворяют в 1 мл хлороформа (точный объем, раствор А). По 5 мкл раствора А переносят в пять стеклянных виал вместимостью 1 мл и приливают 5,15, 30,45 и 60 мкл хлороформа (растворы Б).

Хроматографический анапиз. На стартовую линию хроматографической пластинки Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ размером 10*15 см на расстоянии 10 мм от краев наносят по 2 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения (растворы Б). Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе в течение 5 минут, помещают в вертикальную хроматографическую камеру, предварительно насыщенную в течение 20 мин смесью растворителей гексан-ацетон-уксусная кислота 20:10:0.1, и хроматографируют восходящим способом на высоту 80 мм. После этого пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 10 мин и проявляют путем погружения а 20% водный раствор калия перманганата. Остатки проявителя

смывают проточной водой через 10 сек, и высушивают пластину в токе теплого воздуха. После высушивания пластинку сканируют на планшетном сканере при разрешении 300 dpi (рис. 2).

Количественное содержание цинаропикрина (гроссгемина) в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

с. 5 100 100

х=-

0.002- т 10б Р 100 -IV

•100,

где с - содержание цинаропикрина (гроссгемина) вычисленное по градуировочному графику, мкг/мл; Р - содержание цинаропикрина (гроссгемина) в PCO, %; т -навеска сырья, г; IV- влажность сырья, %.

0,1 0J ОД 0.4 Di 0.S V о .В 0,9- :.о

ft ":' V - . ¡7

А

М-/ц B.I

0,0 u.ML 0,1 сл с.з

,> Чй 0,9

Рис. 2. Денситограммы хроматограмм исследуемого раствора (1, 7) и растворов сравнения (2-6 - гроссгемин; 8-12 - цинаропикрин).

Исследование специфичности методики показало, что она позволяет селективно разделять определяемые соединения, что подтверждают данные ТСХ-УФ- и ТСХ-ИК-спектрометрических анализов (рис. 3). Спектры хроматографических зон разделяемых соединений показали полное совпадение с таковыми спектров PCO цинаропикрина и гроссгемина.

Метрологический анализ разработанной методики показал, что относительная ошибка не превышает 3%, а отклонение от среднего результата в серии из трех независимых определений не превышает 4% (табл. 1).

Табл. 1. Метрологические характеристики методики определения цинаропикрина и

F S2 5 Р t CV) Ах е,%

9 (цинаропикрин) 0.3941 78.22 -10'5 0.0280 0.95 2.26 0.0091 2.309

9 (гроссгемин) 0.0530 22.36-10"6 0.0047 0.95 2.26 0.0015 2.830

в

0 •200

Б

Рис. 3. Результаты исследования специфичности методики хроматографического (ТСХ) разделения цинаропикрина и гроссгемина. А - хроматограмма С. scabiosa после проявления КМп04. Б - денситограмма хроматограммы (1 - цинаропикрин, 2 -гроссгемин). Спектры с участков хроматограмм: В - УФ-спектры (без обработки; 1 -элюаты зон хроматограммы, 2 - PCO), Г - ИК-спектры.

Исследование количественного содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa в зависимости от фазы вегетации и места

произрастания

При изучении динамики накопления СЛ в надземной части С. scabiosa было установлено, что наибольшее содержание цинаропикрина (8.03±0.49 мг/г), в

пересчете на воздушно-сухое сырье, приходится на период массовой бутонизации (рис. 4). Максимальное содержание гроссгемина (0.7310.03 мг/г) отмечено в фазе начала цветения. Содержание СЛ в течение последующих фаз вегетации постепенно снижается по сравнению с наибольшими значениями в 2 раза.

0.37*0.02

зз4±о,:э

3,96+0,21

™ 5,92±0,41 '

0,23±0,06

ГГТЗ 8,03 ±0,49

0.11±0.02

ГЗ 1 83± 0 13

1 2 3 4 5 6

фосстемим, мг/г за цинаропикрин, мг/г

Рис. 4. Содержание цинаропикрина и гроссгемина в надземной части С. БсаЬша, в течение вегетационного периода (1 - начало бутонизации; 2 - массовая бутонизация; 3 - конец бутонизации - начало цветения; 4 - массовое цветение; 5 - конец цветения - начало плодоношения).

Содержание цинаропикрина в С. ¿саЫоза в сырье различных мест сбора (табл. 2) варьирует от 1.61+0.15 мг/г (Алтайский край) до 4.55±0.45 мг/г (Томская обл.).

Табл. 2. Содержание цинаропикрина и гроссгемина в надземной части С. всаЫоха, собранного в различных местах обитания*

Место сбора сырья Цинаропикрип, мг/г Гроссгсмип, мг/г

1. пос. Заварзино (Томская обл.) 3.96±0.21 0.53+0.02

Ы56°27.543';Е85°07.310'

2. р.ц. Кожевниково (Томская обл.) 4.55+0.45 1.67+0.12

Ы56°12.3105 Е83°55.430'

3. г. Барнаул (Алтайский край) 1.61+0.15 1.96+0.38

N5348.669', Е83°51.659'

4. г. Ачинск (Красноярский край) 4.52+0.30 0.92±0.03

№5°50.281' Е93°12.810'

5. пос. Новобалахоновка (Кемеровская обл.) 3.46+0.63 0.31 ±0.02

N55=29.022'; Е86° 17.362'

* - фаза массового цветения.

Разница в содержании гроссгемина более существенна и находится в интервале от 0.31+0.02 мг/г (Кемеровская обл.) до 1.96±0.38 мг/г (Алтайский край).

Разработка способа получения средства, обладающего противоописторхозной активностью

Фармакологические исследования показали, что наибольшей противоописторхозной активностью обладает экстракт С. зсаЫояа, полученный с использованием в качестве экстрагента 40% этанола (табл. 3). Эффективность цинаропикрина и суммы СЛ близки к таковой экстракта на 70% этаноле.

Табл. 3. Противоописторхозная активность экстрактов и фракций С. ясаЫоза

Препарат Показатель интснс-эффективности, %

Сухой экстракт (70% этанол) 64.11+2.14

Сухой экстракт (40% этанол) 83.90±2.32

Сухой экстракт (вода очищенная) 53.13±1.84

Сумма сесквитерпеиовых лактонов 64.20±2.84

Цинаропикрип 61.42±1.06

Бильтрицид* 75.31±1.24

* - препарат сравнения

Учитывая полученные сведения, 40% этанол был выбран в качестве экстрагента для получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, в виде сухого экстракта. Способ получения сухого экстракта заключается в экстракции измельченной надземной части С. ■гсай/ага с размером частиц 1-4 мм 40% этанолом при температуре 60-80°С в течение 1-1.5 ч, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20 и трехкратной экстракции с последующим упариванием и сушкой.

Сухой экстракт С. scaЫosa представляет собой аморфный коричневый порошок со специфическим запахом. Гигроскопичен, комкуется. Выход - 23.4% от массы возд.-сух. сырья. Насыпная масса при свободной засыпке - 0.5 г/см3, при уплотнении - 0.63 г/см3. Угол естественного откоса - 35.5°. Согласно дериватограмме основное удаление влаги происходит при температуре от 40 до 55°С. При температуре свыше 120°С происходит термическое разложение и карамелизация. Растворим в воде, в водно-спиртовых смесях (10-40%),

Методика количественного определения цинаропикрина в сухом экстракте С. scabiosa методом ВЭЖХ

Для анализа сухого экстракта С. scabiosa разработана методика ВЭЖХ-анализа с использованием в качестве PCO цинаропикрина.

Методика количественного анализа цинаропикрина в сухом экстракте С. scabiosa. Около 0.50 г (точная навеска) препарата помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, приливают 10 мл смеси хлороформ-этанол в соотношении 4:1, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают при 50°С в течение 15 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Объединенное извлечение концентрируют в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в 10 мл смеси метанол-вода 1:1 и переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем раствора доводят до метки тем же растворителем и перемешивают (раствор А). В хроматограф вводят 20 мкл раствора А.

Количественное содержание цинаропикрина в пересчете на абсолютно-сухой препарат в процентах (X) вычисляют по формуле:

у 5-25 т0 -0.02 100 100

0.02'И!' V25 * Р 100-w" '

где S- площадь пика цинаропикрина на хроматограмме исследуемого раствора; S0 -площадь пика на хроматограмме раствора PCO цинаропикрина; т - навеска препарата, г; т0 - навеска PCO цинаропикрина, г; Р - содержание цинаропикрина в PCO, %; W - потеря в массе при высушивании сухого экстракта CS, %

Приготовление раствора PCO цинаропикрина. Около 0.05 г (точная навеска) PCO цинаропикрина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл смеси метанол-вода 1:1 и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 0.02 мл раствора А микрошприцом вводят в хроматограф.

Пригодность хроматографической системы. Эффективность хроматографической колонки по пику цинаропикрина - не менее 3800 т.т. Относительное стандартное отклонение площади пика - менее 1.0%. Фактор

симметрии пика - близок к 1. Степень разделения пиков цинаропикрина и сопутствующих примесей - не ниже 1.4.

Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик - специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость.

Специфичность (селективность). Идентификация цинаропикрина подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента и PCO цинаропикрина (рис. 5). На хроматограмме растворителя сухого экстракта С. scabiosa отсутствуют пики, мешающие определению цинаропикрина. Пики сопутствующих и родственных соединений, входящих в состав сухого экстракта С. scabiosa, хорошо разделяются с пиком цинаропикрина, время удерживания которого 12.76 мин, и не влияют на аналитическое определение.

Линейность. Исследования показали, что наблюдается линейная зависимость между величинами площадей хроматографических пиков и содержанием цинаропикрина в испытуемых растворах в интервале содержания 70-130% от принятой за 100% величины (рис. 6). Этот интервал можно определить как аналитическую область методики.

WOI A.№wleng!te204nmCie[)£0SCSD]

5

■ 1

у - Э242х + 10,676

Г- = 0.99S LOD~9.7MKriu UK? = 24.1 чм »¡л

Рис. 5. Хроматограмма (ВЭЖХ) сухого Рис. 6. Зависимость площади пика ог

экстракта С. ¡саЬ^а. 1 - цинаропикрин. концентрации цинаропикрина.

По оси абсцисс - время удерживания, мин; По оси абсцисс - концентрация, мкг/мл; по

по оси ординат - высота пика, гаАУ. оси ординат - высота пика, тА11.

Правильность (точность). Согласно представленным данным (табл. 4), методика обладает удовлетворительной точностью. Средний процент регенерации

составляет для цинаропикрина 99.8%. Все полученные данные находятся в интервале 98-101%.

Табл. 4. Оценка правильности методики

Количество действующего вещества от заявленного в экстракте, % Количество действующего вещества, мг Найдено*, мг Регенерация*, %

70 0.210 0.209 99.3

80 0.240 0.235 98.2

90 0.270 0.272 100.9

100 0.300 0.303 101.0

110 0.330 0.326 98.9

120 0.360 0.3607 100.2

130 0.390 0.389 99.8

* Среднее из 3 определений.

Воспроизводимость. Согласно полученным данным разработанная методика обладает удовлетворительной воспроизводимостью (табл. 5). Относительная ошибка среднего результата определения цинаропикрина составляет 0.52 %.

Табл. 5. Метрологические характеристики методики определения содержания цинаропикрина в сухом экстракте С. ¡саЫоза _____

мг п / S Р t(P,j) £Ер, %

0.300; 0.298; 0.303; 0.299; 0.302; 0.297; 0.301; 0.299; 0.300 9 8 0.002 0.95 2.36 0.2999± 0.00157 0.52

Стандартизация сухого экстракта С. scabiosa В результате проведенных исследований разработаны методы контроля качества сухого экстракта С. scabiosa и определены основные показатели. Выбор показателей качества и стандартизацию сухого экстракта С. scabiosa проводили в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001.00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения". Эти данные легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия на экстракт василька шероховатого сухой (табл. 6).

Табл. б. Спецификация на «экстракт василька шероховатого сухой»

Показатель Норма Метод

Описание Порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета со специфическим запахом и горьким вкусом. Гигроскопичен, комкуется. Органолептический

Подлинность После проявления на хрома-тограмме должны обнаруживаться два коричневых пятна с Rf около 0,34 (цинаропикрин) и 0,50 (гросс-гемин), совпадающими по значению с Rf пятен PCO цинаро-пикрина и гроссгемина. Допускается наличие пятен других экстрактивных веществ. тех

Потеря в массе при высушивании Не более 6.0 % Гравиметрический, ГФ XI

Тяжелые металлы Не более 0.01% ГФ XII. ОФС 42-0059-07

Микробиологическая чистота Категория ЗА ГФ XII. ОФС 42-0067-07

Количественное определение Цинаропикрина не менее 0.13% ВЭЖХ

Упаковка По 1.0; 2.0 и 5.0 кг в двойные пакеты из пленки полиэтиленовой. Для герметизации горловины пакетов запаивают сварным швом и вкладывают в мешок бумажный или в коробки из картона гофрированного

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирование В соответствии с ГОСТ 17768-90Е

Хранение В сухом, прохладном, защищенном от света месте

Срок годности 3 года

ВЫВОДЫ:

1. Из надземной части С. зсаЫоза впервые выделено 3 соединения, идентифицированных как сесквитерпеновые лактоны гвайапового типа -гроссгемин, цинаропикрин и репин.

2. Разработана методика количественного анализа цинаропикрина и гроссгемина в надземной части С. зсаЫояа с использованием ТСХ-денситометрического метода; метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 3%.

3. С использованием методов ТСХ-денситометрии и ВЭЖХ установлено, что максимальное накопление сесквитерпеновых лактонов наблюдается в период начала массовой бутонизации - начала массового цветения (8.03 мг/г); наибольшее содержание сесквитерпеновых лактонов установлено в сырье Томской обл. (4.55 мг/г).

4. Разработан способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, заключающийся в экстракции измельченной надземной части С. $саЫо$а с размером частиц 1-4 мм 40% этанолом при температуре 60-80°С в течение 1-1.5 ч, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20 и трехкратной экстракции с последующим упариванием и сушкой.

5. Разработана и валидирована методика количественного анализа цинаропикрина в сухом экстракте С. зсаЫова с использованием метода ВЭЖХ; метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 1%; определены показатели качества и разработан проект ФСП на сухой экстракт С. ьсаЫоза.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каминский, И. П. Исследование состава сесквитерпеновых лактонов василька шероховатого / И. П. Каминский, М. С. Ларькина // "Актуальные вопросы фармакологии и фармации": мат-лы 65-ой меиодунар. студ. научн. конф. им Н. И. Пирогова.- Томск, 2006,- С. 243-244.

2. Ларькина, М. С. Химико-фармакогностическое изучение надземной части василька шероховатого / М. С. Ларькина, И. П. Каминский // "Актуальные вопросы фармакологии и фармации": мат-лы 65-ой междунар. студ. научн. конф. им Н. И. Пирогова.- Томск, 2006,- С. 244-246.

3. Кадырова, Т. В. Химико-фармакологическое исследование надземной части василька шероховатого / Т. В. Кадырова, Е. А. Краснов, Е. В. Ермилова, М. С. Ларькина, И. П. Каминский // "Химия и технология растительных веществ": мат-лы IV Всеросс. научн. конф.- Сыктывкар, 2006,- С. 86.

4. Krasnov, Е. A. Isolation of grosheimin from the Siberian population of Centaurea scabiosa / E. A. Krasnov, V. A. Raldugin, Т. V. Kadyrova, I. P. Kaminskii // Chemistry of Natural Compounds.- 2006,- Vol. 42.- № 4.- P. 495-496.

5. Каминский, И. П. Сесквитерпеновые лактоны василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / И. П. Каминский, Т. В. Кадырова, Е. А. Краснов, С. А. Ивасенко, С. М. Адекенов // "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений": мат-лы II междунар. научн. конф.- Алма-Ата, Казахстан, 2007,-С. 194.

6. Каминский, И. П. Химико-фармакологическое исследование экстрактов василька шероховатого / И. П. Каминский // "Науки о человеке": мат-лы IX конгр. молодых учен, спец.- Томск, 2008.- С. 112-113.

7. Каминский, И. П. Разработка методики экспресс-анализа сесквитерпеновых лактонов в экстрактах василька шероховатого / И. П. Каминский, Е. А. Краснов, В. В. Балыкин, Т. В. Кадырова // "Химия и технология растительных веществ": мат-лы IV Всеросс. научн. конф.- Уфа, 2008.- С. 147.

8. Краснов, Е. А. Химический состав некоторых перспективных видов флоры Сибири и возможности их практического использования / Е. А. Краснов, Я. В. Горина, И. П. Каминский, Т. В. Кадырова // "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья": мат-лы IV Всеросс. научн. конф,- Барнаул, 2009.- С. 181-182.

9. Каминский, И. П. Исследование сезонной динамики сесквитерпеновых лактонов Centaurea scabiosa методом ВЭЖХ / И. П. Каминский, Е. А. Краснов, Т. В. Кадырова, С. А. Ивасенко, Б. Б. Рахимова, С. М. Адекенов // "Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009": мат-лы VI Всеросс. научн. конф.- Уфа, 2009,- С. 179.

10.Патент РФ 2366443. Средство, обладающее противоописторхозным действием, и способ его получения / Е.А. Краснов, Т.В. Кадырова, И.П. Каминский. № 2008122105/15 (заявл. 02.06.2008; опубл. 10.09.2009. Бюл. №25).

П.Каминский, И. П. Противоописторхозные свойства экстрактов из Centaurea scabiosa L. / И. П. Каминский, Е. А. Краснов, Т. В. Кадырова, А. Э. Сазонов, Б. Б. Рахимова, С. А. Ивасенко, С. М. Адекенов // Растительные ресурсы. - 2010. -Т. 46.- №1,- С. 106-112.

12.Каминский, И. П. Динамика накопления сесквитерпеновых лактонов в надземной части василька шероховатого / И. П. Каминский, Е. А. Краснов, Т. В. Кадырова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2010.- № 2.- С. 39-41.

13.Каминский, И. П. Исследование противоописторхозной активности василька шероховатого / И. П. Каминский, Э. В. Сапрыкина, Е. А. Краснов, Т. В. Кадырова, Е. А. Аносова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2010,-№ 8.- С. 20-24.

14.Краснов, Е. А. Флора Сибири - перспективный источник новых лекарственных средств / Е. А. Краснов, И. П. Каминский, Я. В. Горина, Т. В. Кадырова, М. С. Ларькииа, Е. Ю. Авдеева // "Актуальные проблемы химии природных соединений": мат-лы междунар. научн. конф.- Ташкент, 2010,- С. 20.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДМ — денситометрия;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГХ-МС - газовая хроматография - масс-спектрометрия;

ИК - инфракрасная спектроскопия;

КХ - колоночная хроматография;

РСО - рабочий стандартный образец;

CJ1 - сесквитерпеновый лактон;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

УФ - ультрафиолетовый;

ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность зам. директора

ЦНИЛ СибГМУ, д.м.н. Сазонову А.Э. и к.б.н., с.н.с. ЦНИЛ СибГМУ Сапрыкиной Э.В. за руководство фармакологическими и биохимическими исследованиями; к.х.н., доценту Томского государственного университета Дычко К.А. за помощь в проведении ГХ-МС анализа; д.х.н., проф. НИИОХ СО РАН Ралдугину В.А. и д.х.н., проф. НИИОХ СО РАН Шульц Э.Э. за установление структуры СЛ методами масс-и ЯМР-спектроскопии; д.х.н., академику НАН РК, президенту ОАО «НПЦ «Фитохимия» Адекенову С.М. и к.х.н., с.н.с. ОАО «НПЦ «Фитохимия» Ивасенко С.А. за руководство и помощь в выполнении ВЭЖХ-анализа.

Подписано в печать 04.03.2011 г. У сл. печ. листов 1,5 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ №85 Тираж 120 экземпляров

Актуальность проблемы. Сесквитерпеновые у-лактоны, широко распространенные в цветковых растениях семейства АБ1егасеае, являются ценными веществами для получения самых разнообразных биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Эти вещества с середины прошлого века привлекают внимание как отечественных, так и зарубежных ученых ввиду разнообразного спектра фармакологической активности [157].

Для сибирского региона наибольший интерес представляет антигельминтная активность сесквитерпеновых лактонов, т.к. именно здесь актуальной проблемой является массовая пораженность местного населения описторхозом. Ареал заболевания простирается от бассейна Енисея до западных границ Европы [28]. Крупнейший в мире очаг описторхоза сформировался в Обь-Иртышском речном бассейне. Инвазированность сельского населения в Среднем Приобье достигает 90-95%, причем нередко заражены и дети первого года жизни. К 14 годам пораженность детей этим гельминтом составляет 50-60%, а у взрослого населения она поголовная. Очаги этого заболевания меньшей напряженности встречаются в бассейнах Волги и Камы, Урала, Дона, Днепра, Северной Двины и др. [13, 30, 63].

Известно, что описторхозная инвазия вызывает значительные изменения в гепатобилиарной системе, приводит к развитию хронического холангиохолецистита, панкреатита, пилородуоденита, гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и др. [9, 50, 119] Кроме того, по заключению Международного агентства по изучению рака (МАИР, 1А11С), возбудитель описторхоза отнесен к первой группе канцерогенов [142].

Указанная огромная инвазированность населения разных регионов представляет собой тяжелую гигиеническую, экологическую и общественную проблемы.

При терапии описторхоза в большинстве случаев назначают синтетический противопаразитарный препарат бильтрицид, обладающий рядом побочных эффектов и противопоказаний, особенно в детской практике [14, 29, 75]. Это обстоятельство весьма ограничивает область применения указанного препарата и приводит к необходимости прохождения комплексного курса лечения под наблюдением специалистов в условиях стационара.

В связи с этим возрастает актуальность поиска высокоэффективных альтернативных лекарственных средств растительного происхождения, дополняющих основную терапию бильтрицидом или заменяющих ее в случаях непереносимости данного препарата.

Перспективным источником сесквитерпеновых лактонов является типичный представитель семейства Asteraceae — Centaurea scabiosa L. (василек шероховатый), который широко распространен на всей территории Западной Сибири и находит весьма разнообразное применение в народной медицине. Скрининговыми исследованиями установлена выраженная антигельминтная активность экстрактов растения, которая, обусловлена наличием сесквитерпеновых лактонов [37].

Таким образом, изучение сесквитерпеновых лактонов Centaurea scabiosa L., а также обусловленной ими биологической активности, и создание на его основе нового эффективного антигельминтного фитопрепарата является актуальной задачей.

Цель работы. Определение химического строения сесквитерпеновых лактонов Centaurea scabiosa L., разработка способа получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, и его стандартизация. Задачи исследования.

1. Провести химическое исследование сесквитерпеновых лактонов надземной части С. scabiosa;

2. Разработать методику количественного определения сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa L.;

3. Изучить динамику содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa L. в зависимости от фазы вегетации и места сбора сырья;

4. Разработать способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью;

5. Установить параметры и разработать методики стандартизации средства, обладающего противоописторхозной активностью.

Научная новизна. Из надземной части Centaurea scabiosa L. впервые выделено три сесквитерпеновых лактона гвайанового структурного типа -гроссгемин, цинаропикрин и репин. Впервые изучена динамика содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части Centaurea scabiosa L. в течение вегетационного периода. Разработан способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, и определены параметры его стандартизации. Разработаны методики количественного анализа сесквитерпеновых лактонов в сырье и сухом экстракте С. scabiosa с использованием методов ТСХ-денситометрии и ВЭЖХ.

Практическая значимость.

1. Получен патент РФ №2366443 на изобретение «Средство, обладающее противоописторхозной активностью, и способ его получения» (Приложение 1)

2. Разработан лабораторный регламент на получение экстракта василька шероховатого сухого (ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава) (Приложение 2).

3. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на экстракт василька шероховатого сухой (Приложение 3).

На защиту выносятся:

1. Результаты химического исследования сесквитерпеновых лактонов С. scabiosa L.

2. Результаты исследований динамики содержания сесквитерпеновых лактонов в надземной части С. scabiosa L.

3. Результаты исследований по разработке способа получения средства, обладающего противоописторхозной активностью.

4. Методики стандартизации сухого экстракта из надземной части С. scabiosa L.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 65-ой международной студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009), VI Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (Уфа 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010), а также на заседаниях кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2005-2010).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО РАМН «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01200602076).

Публикации. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, патент РФ на изобретение (№2366443).

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедре фармацевтической химии СибГМУ г.Томск, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ) СибГМУ (отделение биохимии), Центр коллективного пользования Томского государственного университета, НИИ органической химии СО РАН (г.Новосибирск), ОАО «НПЦ «Фитохимия» (Республика Казахстан, г.Караганда). Выражаем искреннюю благодарность сотрудникам указанных подразделений и научных учреждений, под руководством которых были выполнены некоторые элементы работы, а 9 именно: д.м.н. Сазонову А.Э.; к.б.н., с.н.с. Сапрыкиной Э.В.; к.х.н., доценту Дычко К.А.; д.х.н., профессору Ралдугину В.А.; д.х.н., профессору Шульц Э.Э.; д.х.н., академику HAH PK Адекенову С.М.; к.х.н., с.н.с. Ивасенко С.А.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 167 источников литературы, из которых 95 зарубежных.

ВЫВОДЫ:

1. Из надземной части С. БсаЫоза Ь. впервые выделено 3 соединения, идентифицированных как сесквитерпеновые лактоны гвайанового типа -гроссгемин, цинаропикрин и репин.

2. Разработана методика количественного анализа цинаропикрина и гроссгемина в надземной части С. БсаЫоБа с использованием ТСХ-денситометрического метода; метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 3%.

3. С использованием методов ТСХ-денситометрии и ВЭЖХ установлено, что максимальное накопление сесквитерпеновых лактонов наблюдается в период начала массовой бутонизации - начала массового цветения (0,803 %); наибольшее содержание сесквитерпеновых лактонов установлено в сырье Томской обл. (0,455 %).

4. Разработан способ получения средства, обладающего противоописторхозной активностью, заключающийся в экстракции измельченной надземной части С. БсаЬюБа с размером частиц 1-4 мм 40% этанолом при температуре 60-80°С в течение 1-1.5 ч, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20 и трехкратной экстракции с последующим упариванием и сушкой.

5. Разработана и валидирована методика количественного анализа цинаропикрина в сухом экстракте С. БсаЫоБа с использованием метода ВЭЖХ; метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 1%; определены показатели качества и разработан проект ФСП на сухой экстракт С. хсаЫоза.