Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов

На правах рукописи

КУДАШЕВА ЭЛЬВИРА ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ОТРАСЛЕВОГО СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ПЕРВОГО И ВТОРОГО ТИПОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-2005

Работа выполнена в Уфимском филиале «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Евгения Владимировна Бобкова; кандидат медицинских наук, с.н.с. Азамат Габдельахатович Исрафилов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Владимир Васильевич Сперанский; доктор медицинских наук, профессор Владимир Борисович Мальханов

Ведущая организация

Защита

Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича» Роспотребнадзора

«30» 2005 г. в fcP

на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии Наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская,105.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

К.А. Лукманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Всемирная организация здравоохранения относит герпесвирусные инфекции к группе болезней, определяющих будущее инфекционной патологии. Они занимают второе место среди вирусных поражений человека, уступая только гриппу [Никонов А.П., Асцатурова О.Р., 2003].

Герпес называют «многоликим» и «коварным», имея в виду многообразие проявлений болезни и сопутствующих симптомов.

По тератогенности вирус простого герпеса занимает второе место после вируса краснухи [Мельникова В.Ф., 1988; Макацария А,Д., Долгушина Н.В., 2004]. Внутриутробная герпетическая инфекция — неуправляемая причина перинатальной смертности, заболеваемости и ранней детской инвалидности [Кудашов Н.И., 1993].

Рецидивирующая герпетическая инфекция по существу является и болезнью иммунной системы, так как длительная персистенция вируса сопровождается продуктивной инфекцией в клетках иммунной системы, что приводит к их функциональной недостаточности и формированию иммунодефицита как по клеточному, так и по гуморальному типу [Барин-ский И.Ф., 1982; OhI S., 1985; Rinaldo С, 1990; Самгин М.А., Халдин А.А., 2004].

Современная медицина не располагает методами лечения, позволяющими элиминировать вирус простого герпеса из организма человека. Целью лечения является лишь подавление его репродукции в период обострения, а также формирование и длительное сохранение адекватного иммунного ответа для блокирования реактивации вируса в очагах персистенции.

Выделяют три основных подхода в лечении герпетической инфекции: этиотропная терапия - применение противовирусных химиопре-паратов, патогенетическая иммунотерапия и комбинация этих методов. Одним из компонентов иммунотерапии являются достаточно широко применяемые препараты иммуноглобулинов. Однако целесообразность их назначения для лечения и профилактики герпесвирусной инфекции до настоящего времени остается дискуссионной.

Существовавшая ранее возможность позволяла охарактеризовать коммерческие препараты иммуноглобулинов по иммунологическим показателям по результатам иммуноферментного анализа. При этом в России применялись иммуноферментные тест-системы различных производителей, для конструирования которых использовались только лизатные антигены вируса простого герпеса первого и второго типов. В последние два года получены рекомбинантные поверхностные гликопротеины gD и

gG вируса простого герпеса первого и второго типов. Доказано, что им принадлежит основная роль в проникновении вируса в клетку и распространении инфекции jDubin G.H, Fishman О., 1992; Whitbeck J.C., Mug-gcridge M.I., 1999; Sanna P.P., Burton D. R., 2000]. Их использование при конструировании диагностических иммуноферментных тест-систем позволяет определять наличие, как в сыворотках больных, так и в препаратах иммуноглобулинов вируснейтрализующих анти-gD и анти-gG антител, с которыми может быть связана защитная функция гуморального звена иммунитета при герпетической инфекции. Эффективность препаратов иммуноглобулинов в терапии герпетической инфекции может зависеть от содержания в них антител к этим эпитопам вируса. Косвенным доказательством этого положения служит использование именно этих поверхностных гликопротеинов D и G для создания субъединичных гликопротеи-новых вакцин за рубежом, эффективность которых доказана [Morrison L.A., 2002; Koelle D.M., Corey L., 2003].

Для стандартизации иммунобиологических препаратов, унификации данных биологических и иммунологических тестов, делающих возможным единое обозначение специфической активности и сравнение количественных и метрологических характеристик в различных образцах Всемирная организация здравоохранения настоятельно рекомендует использование отраслевых стандартных образцов (ОСО).

На сегодняшний день в мире существует единственный стандарт ВОЗ противогерпетических антител против вируса Varicella-Zoster, разработанный Национальным институтом биологической стандартизации и контроля в Великобритании, охарактеризованный по биологической активности, 1 мл которого содержит 1 ME специфических антител против вируса Varicella-Zoster.

На антитела к другим вирусам герпеса из подсемейства альфа-герпесвирусов стандартного образца не существует.

Цель исследования Получение отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов, его иммунологическая и биологическая характеристика

Задачи исследования

1 Анализ специфического гуморального иммунного ответа к разным структурным компонентам вируса простого герпеса первого и второго типов у больных в зависимости от частоты рецидивов и стадии инфекции.

2 Скрининг донорской плазмы на наличие антигликопротеиновых противогерпетических антител к антигенным эпитопам gD и gG вируса простого герпеса первого и второго типов.

3 Анализ коррелляционной зависимости между иммуноферментными титрами образцов и защитными титрами вируснейтрализующих антител на культуре клеток Vero В и на модели экспериментального герпетического энцефалита.

4 Получение отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов («ОСО IgG анти-ВПГ-1,2»), отвечающего требованиям ВОЗ, по иммунологическим показателям и его биологическая стандартизация.

Научная новизна

Впервые получен российский отраслевой стандартный образец ви-руснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов - «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» - регистрационный номер 42-28-377-05, отвечающий требованиям ВОЗ по признакам иммунологической стандартизации (линейности, параллельности, стабильности).

Впервые проведена биологическая стандартизация отраслевого стандартного образца противогерпетических антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов и определена 1 единица вируснейтрализующей активности, который содержит 40 НЕ (нейтрализующих единиц) для вируса простого герпеса первого типа и 5 НЕ для вируса простого герпеса второго типа.

Установлены очень высокие (г >0,7), статистически значимые (р<0,05) корреляционные взаимосвязи между иммуноферментным титром антигликопротеиновых противогерпетических IgG антител анти-gD и gG и их вируснейтрализующей активностью в двух биологических системах: на культуре клеток Vero В и модели экспериментального герпетического энцефалита.

Научно-практическая значимость работы

Отраслевой стандартный образец «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» рекомендован для оценки содержания вируснейтрализующих антител в донорском сырье, в препаратах нормальных иммуноглобулинов, для получения специфического иммуноглобулина. Он может быть применен для оценки эффективности проводимой иммунотерапии противогерпетиче-скими вакцинами и препаратами иммуноглобулинов. Высокая степень корреляции между иммуноферментным титром анти-gD и анти-gG — антител с защитным эффектом в биологических тестах позволяет проводить контроль специфической активности коммерческих препаратов иммуноглобулинов только иммуноферментным методом с использованием тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ-1,2-лС» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород).

Специфический иммуноглобулин с высоким содержанием вирус -нейтрализующих антител к эпитопам gD и gG вирусов простого герпеса может быть рекомендован для иммунотерапии больным с их дефицитом.

Получено свидетельство на отраслевой стандартный образец про-тивогерпетических антител ОСО 42-28-377-05, утверждена Инструкция по его применению ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 26.04.05.

Оформлена нормативно-техническая документация: изменение к регламенту производства иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения, проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и Инструкция по применению препарата противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения.

Оформлены две заявки на патентование: на «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» и «Препарат противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения».

Внедрение результатов исследования в практику

В результате выполнения работы получена серия «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» (3000 ампул). «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» использован для контроля специфической активности пяти экспериментально-производственных серий специфического противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения, которые прошли контроль в ОБТК («Иммуно-препарат»).

Основные положения, выносимые на защиту

1 Содержание в сыворотках больных хронической рецидивирующей герпетической инфекцией кожи антител (иммуноглобулинов G) к поверхностным гликопротеинам D и G является одним из ключевых моментов, определяющих частоту рецидивов.

2 Иммуноферментная тест-система нового поколения, определяющая антитела к гликопротеиновым эпитопам gD и gG является наиболее пригодной для отбора сырья и контроля специфической активности готовых препаратов иммуноглобулинов.

3 Разработанный отраслевой стандартный образец вируснейтрализую-щих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов соответствует требованиям ВОЗ к стандартам антител по иммунологическим показателям.

4 Биологическая стандартизация отраслевого стандартного образца по содержанию антигликопротеиновых антител, выраженная в единицах нейтрализующей активности, позволяет определить защитный потенциал выпускаемых препаратов иммуноглобулинов.

5 Отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих противо-герпетических антител может быть использован для оценки их содержания в донорском сырье, в препаратах нормальных иммуноглобулинов, для получения специфического иммуноглобулина.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на научных конференциях: Ш конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы детской инфектологии. Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004), Республиканской научной конференции «Применение иммунобиологических препаратов в практическом здравоохранении» (Уфа, 2004). Диссертация апробирована на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 33 от 26 мая 2005 года).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, оформлены две заявки на патентование.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 18 таблиц и 7 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 146 источников (50 отечественных и 96 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие материалы и методы.

Материалы:

- плазма 5000 доноров, не привитых герпетической вакциной;

- иммуноферментные тест-системы: «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ-1,2-ЛО» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород), «Герпес-скрин», (ЗАО «Биосервис», г. Боровск), «ЭКОлаб-ВПГ 1-IgG», «ЭКОлаб-ВПГ 2-IgG» (OOO «Эколаб», г. Электрогорск), «ETI-HSVK-G 1/2» (Diasorin, Италия);

- глицин («SERVA», ФРГ);

- мальтоза («MERCK», Германия);

- девять экспериментально-производственных серий препарата специфического противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения («Иммунопрепарат», г. Уфа);

- штамм "УС" - Herpes simplex virus type 1 - вирус простого герпеса, антигенный тип I (музей культур ГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН), адаптирован к клеткам Vero В;

- штамм "ВН" - Herpes simplex virus type 2 - вирус простого герпеса, антигенный тип II (музей культур ГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН), адаптирован к клеткам Vero В;

- культура клеток Vero В (музей ГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» РАМН), аттестованная согласно Методическим указаниям «Аттестация перевиваемых клеточных линий — субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (РД 42-28-10-89);

- аутбредные беспородные белые мыши массой 7-8 г (320 голов).

Методы:

— антитела IgG класса определяли методом непрямого иммунофер-ментного анализа, результаты регистрировали с помощью спектрофотометра «Multiskan Ascent» (Thermo Electron);

— экспериментально-производственные серии специфического проти-вогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения получены методом многостадийного низкотемпературного этанольного фракционирования белков плазмы по Кону;

- вируснейтрализующая активность антигликопротеиновых противо-герпетических антител (gD и gG) в образцах отраслевого стандартного образца и экспериментальных сериях специфического противо-герпетического иммуноглобулина определена по наличию цитопати-ческого действия (ЦПД) с использованием 4-крестовой шкалы (ФСП 42-71, ВС 93). Обработка результатов проведена по методу Спирме-на-Кербера (1975), по значениям логарифма разведения, дающего 50 %-ную защиту от цитопатогенного действия вируса;

- герпетический энцефалит вызывали интрацеребральным введением 100 ТЦДзо/мл вируса (штамм «УС» и «ВН»), соединенных с 0,03 мл каждого разведения препарата. Учет результатов проводили по проценту выживших животных. Обработку полученных данных проводили по методу Спирмена-Кербера (1975) по логарифму 50 %-ной эффективной дозы, обеспечивающей защиту животных от гибели (ED»,);

— для установления связей между параметрами полученные данные подвергались корреляционно-регрессионному анализу с вычислением статистических таблиц распределения, коэффициентов корреляции (парные линейные — г) при р не более 0,05, принятой в биологических исследованиях. Оценка коэффициентов корреляции проведена по Полякову Л.Е. (1971);

— для статистической обработки данных использованы программы «Statistica-6,0» Windows XP и программа «Paraline» (Петухов В.Г., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение специфического гуморального иммунного ответа у больных, страдающих герпетическим поражением кожных покровов в зависимости от частоты рецидивов

Предварительно предпринятое изучение специфического иммунного ответа у больных, страдающих герпесом кожи с различной частотой рецидивов, показало, что частота возникновения рецидивов находится1 в прямой зависимости от содержания в их сыворотках антител к поверхностным гликопротеинам gD и gG (рисунок 1). Для определения частоты рецидивов (частые, умеренные, редкие) использована классификация типов клинического течения простого герпеса (ПГ) М. А. Самгина и АЛ. Хал дина (2004).

Сыворотка крови лиц, никогда не имевших клинических проявлений герпетической инфекции, а также у больных с редкими рецидивами содержала антигликопротеинотеиновые антитела (gD и gG) в высоком титре, соответственно, 278,5 и 293,4, тогда как в сыворотках крови больных с частыми рецидивами содержание их было намного ниже -12,1.

Рисунок 1 — Среднегеометрический уровень антигликопротеиновых (gG, gD) и суммарных и противогерпетических антител у больных герпесом кожных покровов

Сравнительное изучение динамики накопления суммарных и анти-гликопротеиновых антител в двух группах показало, что у больных с умеренными рецидивами к моменту исчезновения клинических проявлений наблюдалось четырехкратное повышение уровня антигликопротеи-новых антител по сравнению с базовым уровнем (рисунок 2), тогда как у больных с частыми рецидивами, наоборот, отмечена отрицательная динамика - почти двукратное снижение их содержания к концу рецидива, по сравнению с базовым уровнем. Та же закономерность наблюдалась и по уровню суммарных антител. В то же время выявлено, что титр суммарных антител в группе больных с редко и умеренно рецидивирующей герпетической инфекцией был значительно ниже, чем в группе с частыми рецидивами. Это заставляет предположить, что определяемый титр суммарных противогерпетических антител не является прогностическим показателем, свидетельствующим об их положительной роли в купировании герпетического процесса.

кратность увеличения 8

группа В (умеренные рецедивы ПГ) ШЯШН 4 группа С (частые рецедивы ПГ)

_■—1 2

щ

базовый уровень 2 кратность уменьшения

1-1 ВАТдвО □ Суммарные АТ ■ ■■ 1

Рисунок 2 - Динамика титра суммарных и антигликопро геииовых (gG, D) противогерпетических антител в течение рецидива

и

Выявленная зависимость уменьшения рецидивности герпетической инфекции, от высокого содержания антигликопротеиновых антител (яБ и gG), позволяет заключить, что для получения препарата специфического противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения с высокой протективной активностью следует отбирать сырье, используя иммуноферментные тест-системы, выявляющие антитела к поверхностным гликопротеинам вируса простого герпеса яБ и gG, а в качестве источника сырья для получения специфического противогерпетического иммуноглобулина целесообразно использовать только лиц, имеющих в анамнезе редкие и умеренные рецидивы герпетической инфекции.

Получение и иммунологическая стандартизация отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов

Для приготовления отраслевого стандартного образца взят пул плазмы, полученной от 800 доноров. Содержание в нем противогерпети-ческих антител определено с использованием тест-системы с рекомби-нантными гликопротеинами яБ и gG — « ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ-1,2-IgG». Препарат после добавления стабилизаторов стерильно разлит в ампулы по 0,5 мл и лиофилизирован. Полученный отраслевой стандартный образец противогерпетических антител в лиофилизированной форме проконтролирован по иммунологическим показателям в соответствии с требованиями ВОЗ. Одним из них является наличие линейности и параллельности кривых титрования жидкой и лиофилизированной форм препарата. При построении графика использованы данные титрования, полученные на иммуноферментной тест-системе с гликопротеиновым антигенами яБ и gG (ось абсцисс), с проведением постановки анализа в различных разведениях, в четырех повторностях (ось ординат). Количественная статистическая обработка результатов иммуноферментного анализа осуществлена согласно требованиям ВОЗ методом параллельных линий с помощью программы «Паралайн»,

• — до лиофилизации • —после лиофилизации

Рисунок 3 - Кривые титрования «ОСО IgG анти-ВПГ 1,2»

(тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ 1,2-С», серия 7)

На графике (рисунок 3) показана линейная зависимость оптической плотности от разведения стандартного образца в жидкой и лиофилизиро-ванной форме. При этом кривая титрования, построенная для лиофилизи-рованной формы стандартного образца, сохраняет линейность и параллельность кривой для жидкого образца, что полностью соответствует требованиям ВОЗ. Аналогичные результаты, то есть сохранение линейности и параллельности, мы получили при титровании отраслевого стандартного образца на другой тест-системе «ETI-HSVK-G 1/2» фирмы Di-asoгin (Италия) с антителами к рекомбинантными антигенам вируса простого герпеса первого и второго типов (рисунок 4). Таким образом, полученный лиофилизированный отраслевой стандартный образец про-тивогерпетических антител обладал линейностью и параллельностью кривых титрования в иммуноферментном анализе при использовании двух образцов иммуноферментных тест-систем.

Одной из аттестуемых характеристик отраслевого стандартного образца антител является стабильность специфической активности препарата при хранении не менее пяти лет. Нами изучена стабильность специфической активности отраслевого стандартного образца с различными комбинациями стабилизаторов, включающих глицин, глюкозу, желатин, полиэтиленгликоль, мальтозу, сахарозу. Полученные результаты позволили отобрать наиболее эффективные из них - глицин и мальтозу, гарантирующие стабильность отраслевого стандартного образца в течение пяти лет.

Логарифм разведения

о,«.

—.—-

-3 Хв ✓ -2 -1,5 -1 -0,5

^ !

-1с

•— до лиофилизации ■—после лиофилизации

Рисунок 4 - Кривые титрования ОСО анти-ВПГ 1,2

на тест-системе «ЕП-НБУК-в 1/2» (Э^опп, Италия)

Определение стабильности ОСО противогерпетических антител проведено методом ускоренного старения согласно методическим рекомендациям «Определение стабильности ОСО и других МИБП ускоренным методом», разработанным ГИСК им. Л. А. Тарасевича (2003). Экспериментально определены константы скорости инактивации (К) стандартного образца при повышенных температурах хранения (52, 42, 32 С0). При отложении значений логарифмов констант инактивации (^ К) против соответствующих обратных значений абсолютной температуры (1/Т аба), получена прямая линия. Линейная зависимость позволила продолжить прямую методом экстраполяции до пересечения со значением, соответствующим предполагаемой температуре хранения 5 °С, то есть до точки 0,00359, которая соответствует логарифму константы скорости инактивации при этой температуре, равному (—5,29) (рисунок 5).

Обратная температура, 1/Т

Рисунок 5 -Зависимость логарифмов констант скоростей

инактивации ОСО IgG анти ВПГ 1,2- от обратной абсолютной температуры

Предполагаемый срок хранения отраслевого стандартного образца при температуре 5 С ° определили по уравнению:

Г- 2,303 ^О"1^',

Кх - константа скорости инактивации при данной температуре Т, Р0 - исходная активность ОСО (%),

Р1 — активность ОСО после хранения в течение времени 1, I - длительность хранения препарата, в сутках.

2,000 -1,996

I = 2,303

0,00000501

1 = 1838,7 суток или 5,03 лет. Он составил 1838 дней или 5 лет, при предельном изменении активности ОСО не более чем на 1 % от исходной величины.

Таблица 1 - Вируснейтрализующая активность ОСО IgG анти-ВПГ-1,2 по отношению к ВПГ-1 и 2 в условиях in vitro

Препарат № опыта ВПГ-1 ВПГ-2

Обратный титр Титр, 1од,0 Сред логариф титр (M±SD) Сред гео метрич титр Обратный титр Титр, log.o Сред логариф титр (M±SD) Сред гео-метрич титр

ОСО 1дС анти-ВПГ-1,2 1 20 1,301 1,602+0,213 (1,338-1,866) 39,9 5 0,699 0,759+0,135 (0,699-1,000) 5,74

2 40 1,602 10 1,000

3 40 1,602 5 0,699

4 80 1,903 5 0,699

5 40 1,602 5 0,699

Контрольная положительная сыворотка 1 40 1,602 1,662+0,135 (1,60-1,90) 45,9 20 1,301 1,241+0,135 (1,000-1,301) 17,42

2 40 1,602 10 1,000

3 80 1,903 20 1,301

4 40 1,602 20 1,301

5 40 1,602 20 1,301

Контрольная отрицательная сыворотка 1-5 Отриц Отриц - - Отриц Отриц - -

Биологическая стандартизация отраслевого стандартного образца

противогерпетических антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов

По требованиям ВОЗ (Серия технических докладов ВОЗ № 626, 1981) отраслевой стандартный образец должен давать информацию о биологической активности изучаемых препаратов. С этой целью совместно с ГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», в лаборатории сравнительной вирусологии проведена серия экспериментов на модели культуры клеток Vero В, зараженных вирусом простого герпеса первого и второго типов (штаммы «УС» и «ВЫ»), соответственно. Использована серия полученного отраслевого стандартного образца в различных разведениях, опыт повторен в пяти повторностях в различные дни исследования. Статистическая обработка результатов проведена методом Спирме-на-Кербера с использованием логарифмов разведений, обеспечивающих 50 %-ную защиту клеток от цитопатогенного действия вируса. В таблице 1 показаны обратные разведения отраслевого стандартного образца, при которых достигалась 50 %-ная защита клеток. Среднегеометрические титры, составили для ВПГ первого типа 39,9, против 45,9 в контрольной положительной сыворотке и для ВПГ второго типа - 5,7 против 17,4 в контрольной отрицательной сыворотке. Таким образом, установлено, что в отраслевом стандартном образце присутствуют ви-руснейтрализующие противогерпетические антитела, обуславливающие защитный эффект при заражении культуры тканей обоими типами вируса что может являться характеристикой его биологической

активности.

Совместно с главным метрологом ФГУН ГНИИСК МБП им. Л. А. Тарасевича д.б.н. В.Г. Петуховым определено значение 1 единицы ви-руснейтрализующей активности, которая соответствует содержанию нейтрализующих противогерпетических антител, для вируса простого герпеса первого типа в разведении 1/40 и для вируса простого герпеса второго типа в разведении 1/5.

Таким образом, разработанный отраслевой стандарт содержит 1 единицу вируснейтрализующей активности, которая равна 40 НЕ (нейтрализующих единиц) для вируса простого герпеса первого типа и 5НЕ для второго типа.

На основании данных, полученных в экспериментах с отраслевым стандартным образцом на культуре клеток, для подтверждения протек-тивной активности антигликопротеиновых антител, проведена серия опытов на модели экспериментального энцефалита, вызванного вирусами простого герпеса первого и второго типов на беспородных белых мышах. Использованы экспериментальные серии специфического противогерпе-тического иммуноглобулина, содержащие антигликопротеиновые и сум-

марные антитела в различных титрах по результатам иммуноферментно-го анализа и отличающиеся по индексу авидности (таблица 2). Таблица 2 - Результаты иммуноферментного анализа препаратов экспериментальных специфических иммуноглобулинов

Номер серии Среднегеометрический титр (M±SD) Удельный титр (ATgD, gG/AT суммарные) Индекс авидности, % ^ к gD.gG) Титр ВЫСОКО-авидных (ДГ № к gD.gG)

AT ДО к gD.gG AT суммарные

1-0304 459,2 + 0,135 12502,6 ±0,135 0,037 61,1 280,6

2-0304 1380,4 ±0,135 13931,6 ±0,135 0,099 65,7 906,9

3-0304 1819,7 ±0,135 27861,2 ±0,135 0,733 67,9 1235,6

4-0304 2754,2 ±0,135 25003,4 ±0,135 0,782 72,3 1991,3

5-0404 3672,8 + 0,135 55718,5 ±0,135 0,751 69,2 2541,6

6-0404 5572,9± 0,135 36728,3 ±0,135 0,821 75,7 4217,9

7-0404 7345,1 ±0,135 55718,5 + 0,135 0,815 77,4 5685,1

8-0404 11142,9 ±0,135 36728,2 ±0,135 0,887 82,6 9204,1

9-0404 14689,3 ±0,135 18365,4 ±0,135 0,977 83,4 12250,8

На начальном этапе осуществлен корреляционный анализ имму-ноферментных показателей (титров антигликопротеиновых, суммарных, удельного титра, авидности, титра высокоавидных антител) по методу Пирсона для выявления закономерных связей между ними и уменьшения количества значимых иммунологических признаков, по которым можно осуществить последующее изучение степени их корреляции. Полученные данные свидетельствуют о том, что титр антигликопротеиновых и суммарных антител, фактически никак не связаны между собой (таблица 3) -коэффициент корреляции стремится к нулю (г= — 0,022). В тоже время между титром антигликопротеиновых антител и иммуноферментными показателями второго уровня (удельный титр, индекс авидности) и третьего уровня (титр высокоавидных антител) получена статистически значимая (р<0,05) очень высокая (г>0,7) степень корреляции (таблица 3), что позволяет считать титр антигликопротеиновых антител к gD и gG эпитопам вируса простого герпеса первого и второго типов, определенных в ИФА, значимым показателем для оценки иммунобиологической активности препаратов иммуноглобулинов. Для оценки возможной значимости этого показателя в защитном эффекте, оказываемом препаратами иммуноглобулинов при герпетической инфекции, совместно с ГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН, проведена серия экспериментов на аутбредных беспородных мышах, которым интрацереб-рально вводили смесь вируссодержащей культуральной жидкости (штамм «УС» и «ВН») в дозе 100 ТЦД5()/Мл с различными разведениями препаратов специфического противогерпетического иммуноглобулина (экспериментально-производственные серии).

Таблица 3 - Корреляционные взаимосвязи иммуноферментных показателей противогерпетических антител в препаратах иммуноглобулинов

Коэффициент корреляции

менее 0,01 (отсутствие связи) 0,01-0,29 (слабая связь) 0,3 0,49 (умеренная связь) 0,5-0,69 (сильная связь) 0,7-1,0 (очень сильная связь)

Титр суммарных АТ - титр антигликопротеиновых АТ (г= - 0,002, р= 0,954) Титр суммарных АТ - титр высокоаведных АТ (г= - 0,050, р= 0,898) Титр суммарных АТ -удельный титр (г=-0,353, р-0,352) Титр антигликопротеиновых АТ - удельный титр (г=0,871, р=0,002)

Титр суммарных АТ-индекс авидности АТ(г=0,144, р=0,712) Титр антигликопротеиновых АТ -индекс авидности (г=0,954, р=0,000)

Титр антигликопротеиновых АТ -титр высоко-авидных АТ (г=0,999, р=0,000)

Результаты экспериментов на мышах обработаны по методу Спир-мена-Кербера с выведением среднелогарифмических титров, обеспечивающих 50 %-ную защиту мышей от гибели. Полученные данные свидетельствуют о том, что препараты иммуноглобулинов отличаются между собой не только содержанием антигликопротеиновых антител, определенных иммуноферментным методом, но различны и по протективным свойствам (таблица 4). Среднегеометрический титр антигликопротеиновых антител в них колебался от 459,2 до 14689,3. Защитный эффект варьировал от 64,7 до 297,9 для вируса простого герпеса первого типа и от 32,4 до 342 для вируса простого герпеса второго типа. Методом регрессионного анализа установлен линейный характер зависимости между титром антигликопротеиновых антител (gD и gG), определяемым имму-ноферментным методом и защитным эффектом препаратов иммуноглобулинов (рисунок 6). Показана высокая степень корреляции (r1 = 0,89 и Г2 = 0,79) между этими показателями в двух биологических системах: на культуре клеток Vero Вив условиях экспериментального герпетического энцефалита (рисунок 6) и слабая корреляция между титром суммарных антител и их защитным действием.

Таблица 4 — Среднегеометрические иммуноферментные

и протективные титры антигликопротеиновых антител в препаратах иммуноглобулинов

Среднегеометрический Защитный обратный титр,

Номер титр в Е1ЬКА (ЕБ50)

серии АТ к яБ^О ВПГ-1 ВПГ-2

к ВПГ-1 и 2, (М±8Б) (М±8Б) (М±8Б)

1-0304 459,2 ±0,14 64,7 ± 0,12 32,4 ± 0,13

2-0304 1380,4 ± 0,14 85,5 ± 0,13 64,9 ±0,13

3-0304 1819,7 ±0,14 98,2 ± 0,21 98,2 ±0,13

4-0304 2754, 2± 0,14 129,4 ± 0,21 129,7± 0,17

5-0404 3672, 8 ± 0,14 148,9 ± 0,17 148,6±0,13

6-0404 5572,9± 0,14 171,0 ±0,17 171,0±0ДЗ

7-0404 7345,1 ±0,14 196,3 ± 0,13 171,0±0,17

8-0404 11142,9 ±0,14 297,9 ±0,17 196,4± 0,13

9-0404 14689,3 ± 0,14 259,4 ± 0,13 342,0± 0,13

2,7

2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4

Титр АТ к дС.дР (1д) О т уНго (г = 0,89;р =0,001) \ /л \rivo (г* 0,79;р =0,01)

Рисунок 6 — Зависимость увеличения протективной активности от нарастания иммуноферментного титра антигликопрогеиновых (gG, gD) антител в препаратах иммуноглобулинов

Полученные экспериментальные данные и математический анализ результатов позволяют сделать заключение, что содержание в отраслевом стандарте вируснейтрализующих противогерпетических антигликопро-

теиновых антител позволяет судить о защитном потенциале вируснейт-рализующих антител к эпитопам gD и gG в препаратах нормальных и специфических иммуноглобулинов и количественно определять их содержание.

Отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов (ОСО IgG анти-ВПГ-1,2) утвержден ФГУН ГНИИСК МБП им. Л.А. Тарасевича, внесен в Реестр отраслевых стандартных образцов (№ 42-28-377-05), утверждена инструкция по его применению, он допущен к применению в системе здравоохранения РФ и на предприятиях других ведомств, выпускающих медицинские иммунобиологические препараты.

ОСО IgG анти- ВПГ-1,2 вируснейтрализующих противогерпетиче-ских антител предназначен для оценки иммуноферментным методом содержания вируснейтрализующих антител в донорском сырье, в препаратах иммуноглобулинов, для получения специфического иммуноглобулина, а также может быть использован для оценки эффективности проводимой иммунотерапии противогерпетическими вакцинами и препаратами иммуноглобулинов.

ВЫВОДЫ

1 Частота рецидивов заболевания у больных с хронической рецидивирующей герпетической инфекцией напрямую связана с наличием в сыворотке их крови вируснейтрализующих антигликопротеиновых (gD и gG) IgG антител. У лиц, не имеющих клинических проявлений герпетической инфекции, или имеющих в анамнезе редкие рецидивы обнаруживаются наибольшие титры антигликопротеиновых антител, что позволяет рекомендовать плазму таких доноров для получения специфического противогерпетического иммуноглобулина.

2 Установлена высокая степень корреляционной связи между титрами антигликопротеиновых антител (gD и gG) и их защитным действием по отношению к обоим типам вируса простого герпеса в двух биологических системах: на культуре клеток Vero В и на модели экспериментального герпетического энцефалита в препаратах иммуноглобулинов.

3 Контроль специфической противогерпетической вируснейтрализую-щей активности препаратов иммуноглобулинов необходимо осуществлять с использованием иммуноферментных тест-систем, предназначенных для определения антигликопротеиновых антител (gD и gG) к вирусу простого герпеса первого и второго типов.

4 Разработан отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов в

лиофилизированной форме («ОСО анти-ВПГ-1,2»), отвечающий требованиям предъявляемым ВОЗ к стандартам антител по иммунологическим критериям, который охарактеризован по наличию в нем вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и 2 типа. Определена единица вируснейтрализующей активности.

5 Определено значение 1 вируснейтрализующей единицы, которая содержит 40 НЕ для вируса простого герпеса первого типа и 5 НЕ для вируса простого герпеса второго типа.

6 Отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих антител класса против вируса простого герпеса первого и второго типов может быть использован для оценки их содержания с помощью имму-ноферментного анализа в донорском сырье, для получения специфического иммуноглобулина, а также в препаратах нормальных иммуноглобулинов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кудашева Э.Ю., Хабибуллина В.В., Кудашева Г.Б., Исрафилов А.Г. Кандидат в ОСО IgG антител к вирусу простого герпеса 1,2 // Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекции: Материалы Первой Всероссийской конференции по вакцинологии. - Москва, 2004, - С. 37-38

2. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Трофимов В.А., Кудашева Э.Ю., Корнилова ИА. Титры антител к различным возбудителям и аутоан-тигенам в препаратах внутривенного иммуноглобулина // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». - Уфа. - 2004. - С. 141-144.

3. Исрафилов А.Г., Кудашева Г.Б., Корнилова И.А., Алсынбаев М.М., Лютов А.Г., Кудашева Э.Ю Иммуновенин - первая отечественная стабильная лиофилизированная форма внутривенного иммуноглобулина в РФ // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. - Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО» «Микроген» МЗ и СР РФ, 2005. - Ч. 1. - С. 5-12.

4. Кудашева Э.Ю., Хабибуллина В.В., Исрафилов А.Г., Кудашев Н.Ю. Получение кандидата отраслевого стандартного образца IgG-антител к вирусу простого герпеса человека// Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. - Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО» «Микроген» МЗ и СР РФ, 2005. - Ч. 2. - С. 44-53.

5. Исрафилов А.Г., Кудашева Э.Ю. Различные точки зрения на безопасный уровень антикомплементарной активности внутривенных иммуноглобулинов // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. -Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО» «Микроген» МЗ РФ и СР РФ, 2005. - Ч. 2. - С. 172-178.

6. Кудашева Э.Ю., Исрафилов А.Г., Кудашева Г.Б., Хабибуллина В.В. Клиническое обоснование выбора иммуноферментной тест-системы для скрининга донорского сырья с целью получения противогерпе-тического иммуноглобулина // Медицинские иммунобиологические

препараты в XXI веке: разработка, производство и применение: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. — Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО» «Микроген» МЗ и СР РФ, 2005. - Ч. 2. - С. 190-196.

Кудашева Эльвира Юрьевна

Разработка отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов

Подписано в печать 27.05.05 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 693. Отп. на ризографе в РИО филиала «Иммунопрепарат»

ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472) 213-214

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ответственный за выпуск Р.К. Каримова

К* ,

* ¿»б4*,тм !