Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител

□ ОЗС15Э7ТЗ

На правах рукописи

ВЯЗНИКОВА Татьяна Владимировна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АВИДИН-БИОТИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ (ДИФТЕРИЙНЫХ, СТОЛБНЯЧНЫХ, КОКЛЮШНЫХ, АНТИ-НВЭ)

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7ГГП 2007

Екатеринбург - 2007

003059773

Работа выполнена в Филиале Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации «Пермское ППО «Биомед»

Научный руководитель

доктор биологических наук Николаева Алевтина Максимовна

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук Родионов Сергей Юрьевич

кандидат биологических наук Орлова Екатерина Григорьевна

Ведущая организация ФГУН Государственный научно-исследовательский инс гитут стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л А Тарасевича Роспотребнадзора, г Москва

нии диссертационного совета Д 004 027 01 при Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу 620041, г Екатеринбург, ул Первомайская, 91

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г Екатеринбург, ул С Ковалевской-Академическая, 22/20), с авторефератом можно ознакомиться на официальном сайте Института иммунологии и физиологии УрО РАН - http //www up uran ru Автореферат диссертации разослан « 2t » (Z^yt-cU-J? 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета _

Защита состоится « » и.

2007 г в /О часов на заседа-

доктор медицинских наук, профессор

И А Тузанкина

Актуальность проблемы

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран (Бектимиров Т А, 2001, Медуницын Н В , 2004, Онищенко Г Г, 2006) Успех программ вакцино-профилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического антиинфекционного иммунитета (Семенов Б Ф , 1996, Покровский В И , 1999, Фельдблюм И В , 2005)

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др ) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики (Селезнева Т С , 2004)

Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет организовать эффективную систему диагностики иммунитета на основе точной инструментальной оценки уровня специфических антител (АуЬау С , 2003)

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, используются варианты твердофазного ИФА, основанные на фиксации антител на нерастворимой основе (обычно полистироловых планшетах с иммобилизованным антигеном) с последующим тестированием связанных антител при помощи индикаторной системы - конъюгатов антивидовых антител (против иммуноглобулина О человека) с ферментами-маркерами

Однако технология приготовления антивидовых антител, связанная с использованием животных, очень сложна, длительна по времени, трудоемка и вследствие этого высокозатратна Кроме того, к недостаткам систем с антивидовыми конъюгатами относятся и неспецифические взаимодействия, которые могут иметь место между антиглобулином, меченным ферментом, и гетероло-

гичным иммуноглобулином, присутствующим в клиническом образце, либо с антителом, фиксированным на твердой фазе (Yolken R Н , 1985)

В связи с этим актуален поиск новых эффективных и технологичных путей синтеза ферментных конъюгатов

Перспективным направлением в ИФА является использование амплифи-цирующей системы авидин-биотин Исследователи отмечают, что при применении авидин-биотиновых конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции (Lynn F ,1996, Aybay С , 2003)

Цель исследования - экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе амплифици-рующего комплекса авидин-биотин

Задачи исследования

1 Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата

2 Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса

3 Оценить качество разработанных тест-систем по следующим критериям линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами

4 Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем

Научная новизна

1 Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на основе белка А золотистого стафилококка, меченного биотином Показана возможность эффективного применения сконструированного конъюгата для определения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови человека и животных

2 Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция иммуноферментпой тест-системы для выявления анти-НВв с использованием биотинилированного конъюгата на основе рекомбинантного НВзА§ (патент № 2206095 от 10 06 03 г)

3 Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилированного белка А (приоритетная справка № 2006127549 от 31 07 2006 г.),

Практическая значимость работы

1 Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка А и рекомбинантного НВвАд, не требующая больших экономических затрат

2. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 420504656005, Производственный регламент № 04862997-79-06) Получено регистрационное удостоверение (ЛС-000884 от 03 11 2005 г) и лицензия на производство (99-04-000097 от 27 10 2005 г )

3 Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител

4 Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией»

Положения, выносимые на защиту

1 Получены универсальные конъюгаты и сконструированы на их основе иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-НВэ)

2. Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и парал-

лелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами)

3 Определена область применения разработанных иммуноферментных тест-систем

Апробация диссертации

Результаты проведенных исследований были доложены и обсуждены на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г Москва, 2002), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г Пермь, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г Москва, 2004), Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика проблемы и перспективы развития» (г Пермь, 2005), Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцино-логия 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006)

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» в 2006 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК -1,1 методические рекомендации, получен 1 патент Российской Федерации и 1 приоритетная справка по заявке на патент

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу материалы и методы, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение Указатель литературы содержит 276 источников, из них 185 отечественных и 91 иностранных Текст иллюстрирован 23 рисунками и 33 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Препараты и реагенты При конструировании иммуноферментных тест-систем были использованы препараты производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (анатоксин дифтерийный очищенный концентрированный, анатоксин столбнячный очищенный концентрированный, нативная коклюшная суспензия (взвесь убитых формалином коклюшных микробов 1 фазы), антивидовой конъюгат ^(аЪ'^-фрагменты аффинноочищенных антител лошади против IgG человека, меченные пероксидазой хрена), белок А золотистого стафилококка); поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) производства ЗАО НПК «Комбиотех» (г Москва), а также реагенты производства фирмы «Sigma», США (пероксидаза хрена высокоочищенная, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, авидин-пероксидаза; диметилсульфоксид, N-гидроксисукцинимидобиотин), полистироловые планшеты однократного применения фирмы «Costar» (США), а также конъюгат белок А, меченный пероксидазой хрена, полученный по методу Накане (Nakane Р К, 1974)

Тест-системы сравнения Определение анти-HBs проводили с помощью тест-систем MONOLISA® anti-HBs 3 0 (Франция) и "AUSAB® EIA" (США) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам

Контрольные образцы Контрольные положительные образцы (К+) - сыворотки крови с известным содержанием специфических антител, установленным в прецизионном тесте (дифтерийные и столбнячные антитела - в реакции нейтрализации in vivo, коклюшные антитела - в реакции агглютинации, а для «ИФА анти-В» - сыворотка, откалиброванная по ОСО 42-28-320-00 «Иммуноглобулин человека против вируса гепатита В»)

Контрольные отрицательные образцы (К-) - сыворотки крови, не содержащие специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, ан-ти-НВв)

Образцы сывороток крови, исследованные на наличие специфических

антител _

Группы обследованных Количество проб

Здоровые взрослые и дети 466

Дети и взрослые, иммунизированные комбинированными вакцинами (АКДС, АДС-М, Бубо-М, Бубо-Кок) и вакциной гепатита В (ВГВ) 612

Взрослые и дети, контактные с источником возбудителя НВУ-инфекции в эпидемических очагах 337

Дети с подозрением на коклюш (группа наблюдения) и дети с заболеванием не коклюшной этиологии (группа сравнения) 100

Больные с легким и среднетяжелым течением острой формы гепатита В 679

Кролики, иммунизированные вакциной гепатита В (ВГВ) и иммуноглобулином человека против гепатита В (Антигеп) 220

Морские свинки, иммунизированные комбинированными вакцинами (АКДС, АДС-М, Бубо-М, Бубо-Кок, Инфанрикс) и вакциной гепатита В (ВГВ) и не иммунизированные морские свинки (контрольная группа) 165

Мыши, иммунизированные комбинированными вакцинами (Бубо-М, АКДС-Геп В) и вакциной гепатита В (ВГВ) и не иммунизированные мыши (контрольная группа) 712

В работе были использованы также иммуноглобулины (нормальный, противостафилококковый, противоэнцефалитный, противостолбнячный, против гепатита В (Антигеп)) производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (г Пермь) - 20 серий

Методы

Реакция нейтрализации (РН). Определение титра дифтерийных и столбнячных антител в сыворотках крови людей и животных проводили с помощью биологического теста - реакции нейтрализации дифтерийного токсина на морских свинках, столбнячного токсина - на белых мышах (Методическое

руководс гво по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов, 1972)

Реакция агглютинации (РА). Проводили по общепринятой методике с помощью диагностикума коклюшного жидкого для реакции агглютинации производства АООТ «Биомед» им И.И Мечникова (Моек обл, Петрово-Дальнее)

Учет результатов реакции штуноферментного анализа (ИФА). Результаты ИФА регистрировали на спектрофотометре PR 2100 производства фирмы "Sanofi Diagnostics Pasteur" (Франция) при двух длинах волн 450/620 нм

Определение концентрации специфических антител проводили по градуировочному графику, построенному в координатах у - lg оптической плотности положительного контрольного образца, х - log2 кратности его разведения (рис 1)

Рис 1 Градуировочный график

Далее находили концентрацию антител в исследуемом образце по следующей формуле

Т| х В

Т =-, где

Ах 100

Т - концентрация антител в исследуемом образце, МЕ/мл; Т: - концентрация антител в положительном контрольном образце, А - кратность разведения положительного контрольного образца, Ах 100 - разведение положительного кон-

трольного образца, В - разведение исследуемого образца, в котором определялась оптическая плотность

Кроме того, была использована компьютерная программа количественного определения специфических антител, созданная на основании разработанного алгоритма обработки результатов ИФА (Николаева А М , 2003)

Следует отметить, что учет результатов иммуноферментной реакции стандартизован таким образом, что позволяет оценить содержание дифтерийных и столбнячных антител в исследуемых образцах в МЕ/мл, анти-HBs - в мМЕ/мл, коклюшных антител - в ИЕ/мл (иммуноферментные единицы)

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики В работе использовали электронные таблицы Excel для Windows (Microsoft), пакет статистических программ "DIASTA" (МГУ, Россия), являющегося версией пакета "STADIA", программу статистической обработки результатов ИФА методом параллельных линий (ГИСК им Л А Тарасевича), программу БИОСТАТ для Windows (Microsoft), версия 4 03 (Гланц С , 1999)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Одним из важнейших моментов в программе конкретных инженерных разработок иммуноферментного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест-систем - конъюгатов

В своих исследованиях мы пошли по пути создания конъюгата на основе белка А, обладающего уникальной способностью образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих (Акатов А К , 1983, Азаренок К С , 1987) Выбор этого реагента в значительной степени был обусловлен тем, что в Пермском НПО «Биомед» разработана оригинальная промышленная технология получения белка А, не уступающего по своим качественным характеристикам препаратам зарубежных фирм (Sigma, Pharmacia)

Известно, что один из наиболее эффективных методов введения ферментной метки основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М"1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело (Bayer А , 1980).

В связи с этим были проведены эксперименты по отработке оптимальной методики биотинилирования белка А, в результате которых была обоснована технология приготовления стандартных препаратов белка А, меченных биотином

Основные физико-химические параметры ИФА, а именно чувствительность, точность и воспроизводимость, могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента, что обусловливает необходимость оптимизации каждой стадии анализа

Для определения оптимальных условий проведения иммуноферментной реакции были исследованы варианты возможных реагентов и параметры их применения выбор антигенов, блокирующего агента, системы детекции, субстрата, определены оптимальные концентрации реагентов, состав, pH буферных растворов, а также оптимальная температура и время проведения отдельных этапов реакции

На первом этапе работы были определены условия иммобилизации каждого из исследованных антигенов на твердую фазу (табл 1)

Таблица 1

Оптимальные условия приготовления иммуносорбента_

Определяемые антитела

анти-HBs | дифтерийные | столбнячные | коклюшные

Твердая фаза 9б-луночные полистироповые планшеты

Имчобилизирую-щий буферный раствор фосфатно-солевой, pH 7,2-7,4 карбоиатно-бикарбонатный, pH 9,6

Антиген рекомби-нантный HBsAg дифтерийный анатоксин столбнячный анатоксин взвесь убитых формалином коклюшных микробов 1 фазы

Концентрация белка 1 мкг/мл 10 мкг/мл 10 мкг/мл 5 млрд кл/мл

Условия сорбции 2 суток при температуре 2-8 °С

Срок хранения 12 месяцев при температуре 2-8 °С

В следующей серии модельных экспериментов была проведена сравнительная оценка полученного конъюгата на основе биотинилированного белка А и конъюгатов, меченных пероксидазой хрена (антивидовой и белок А-пероксидаза)

При оценке различных конъюгатов использовали коэффициент позитивности (КП) - отношение средней оптической плотности положительных контрольных образцов к средней оптической плотности отрицательных контрольных образцов (ОП К+ / ОП К-) Оптимальным считали конъюгат, при использовании которого КП составлял не менее 10,0, а оптическая плотность К- была не более 0,150 (табл 2)

Таблица 2

Сравнительная оценка конъюгатов_

Опре- Конъюгат

деляе- антивидовой белок А-биотин белок А-пероксидаза

мые ан- КП ОП К- чувст- КП ОП к- чувств КП ОП К- чувств

титела витель- итель- итель-

ность* ность* ность*

дифте- 27,3 0,053 0,2-0,5 18,8 0,045 0,3-0,5 15,5 0,084 0,3-0,5

рийные ±2,4 ±0,005 мМЕ/мл ±1,4 ±0,003 мМЕ/мл ±1,8 ±0,009 мМЕ/мл

столб- 30,2 0,054 0,2-0,5 28,4 0,055 0,2-0,5 30,7 0,062 0,2-0,5

нячные ±3,0 ±0,006 мМЕ/мл ±2,1 ±0,004 мМЕ/мл ±3,0 ±0,006 мМЕ/мл

коклюш 19,0 0,061 0,01-0,05 19,8 0,061 0,01-0,05 7,6 0,211 0,1-0,5

ные ±0,7 ±0,002 ИЕ/мл ±1,1 ±0,003 ИЕ/мл ±0,3 ±0,009 ИЕ/мл

анти- 5,1 0,265 25,0-50,0 6,5 0,275 25,0-50,0 4,9 0,325 25,0-50,0

НВэ ±0,2 ±0,012 мМЕ/мл ±0,3 ±0,013 мМЕ/мл ±0,3 ±0,019 мМЕ/мл

* Примечание минимальный защитный уровень дифтерийных антител составляет 30 мМЕ/мл, столбнячных и анти-НВя - 10 мМЕ/мл

Из представленных данных видно, что все исследованные конъюгаты обеспечивали достаточную чувствительность анализа при определении дифтерийных и столбнячных антител При использовании конъюгата белок А-пероксидаза при определении коклюшных антител наблюдался высокий уровень фоновых реакций (ОП К- более 0,150), тогда как при применении конъюгатов белок А-биотин и антивидового уровень фоновых реакций был низким (ОП К- менее 0,150)

Кроме того, было установлено, что все исследованные конъюгаты не обеспечивали необходимой чувствительности анализа при определении анти-НВэ в сыворотках крови человека

В связи с этим были проведены эксперименты по созданию конъюгата для определения анти-НВБ на основе биотинилированного рекомбинантного НВзА§ Результаты оценки полученного конъюгата представлены в таблице 3

Таблица 3

Оптимизация параметров проведения ИФА с помощью тест-системы _на основе конъюгата HBsAg-биoтин _

Раствор для разведения сывороток и конъюгата Оптическая плотность Чувствительность*, мМЕ\мл

К+ К-

Фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,2-7,4 1,057 0,311 25,0-50,0

Раствор отрицательной сыворотки в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2-7,4 1,024 0,055 3,1-5,5

* Примечание оценку чувствительности проводили с помощью ОСО 42-28-320-00 «Иммуноглобулин человека против вируса гепатита В»

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана конструкция ИФТС, основанная на взаимодействии антигена (дифтерийного, столбнячного, коклюшного или НВ$А£), иммобилизованного на полистироловом планшете с антителами, содержащимися в сыворотке крови человека или животных После фиксации на твердой фазе специфических реагирующих антител не прореагировавшие компоненты системы удаляют из сферы реакции путем последовательных промывок белково-солевым раствором с детергентом Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью ам-плифицирующей авидин-биотиновой системы, состоящей из белка А или HBsAg, меченных биотином и авидина, меченного пероксидазой хрена, которая обусловливает гидролиз перекиси водорода, регистрируемой по изменению окраски индикатора (ТМБ) (рис 2)

^ инкубации (1—

|Р°

отмывка (I—<0

о — Ц-о

определений ферментативной

отмывка

1—со>

инкубация

а-►

активности

Рис.2. Схема проведения твердофазного авидин-биотинового ИФА

■Условные обозначения: —АГ антиген; О - АТ - антитело; В - биотип; • - авидин;

* конъюгат (белок А (или НВг^), меченный биотином + авидин, меченный игроке идазой).

Важно отметить, что всс разработанные ИФТС содержат универсальные реагенты (табл. 4), а Методика постановки ИФА основана на одинаковом наборе манипуляций, что существенно упрощает их применение-

Таблица 4

Компонент ИФТС

ИФА анти-В* ИФА анти-Д ИФА апти-С ИФА анти-К

Иммуносорбеит рекомбинан Т1ШЙ дрожжевой HBsAg дифтерийный анатоксин столбнячный анатоксин взвесь убитых формалином коклюшных микробов 1 фазы

Раствор для промывания планшетов, разведения сывороток и конькната Фосфатн о-солевой буферный раствор с твином-20 рН 7,0-7,4

Блокатор Белково-солевой раствор на основе казеина

Положительный контрольный образен Сыворотка крови, содержащая специфические антитела

Отрицательный контрольный образец Сыворотка крови, не содержащая специфических антител

Конъюгат Белок А, меченный биотином, и авидип-перокендаза

Субстратный буферный раствор Цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода

Хромотеч 3,3' ,5,5' -т етрам етилб ензн дин

Стоп-реагент Серная кислота

Примечания: * используется также конструкция ИФТС, содержащая я качестве конъюгата биотинилированный рекомбинантшй НВ5А$,

При создании любой ИФТС необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики позволяют использовать ее для решения конкретных задач Подобная оценка должна быть проведена в форме валидации, которая является важной частью системы обеспечения и контроля качества тест-систем (Давлетбасва Л Р , 2006)

Валидационные исследования были проведены в соответствии с требованиями ВОЗ, предъявляемыми к наборам для иммунологических испытаний Дисперсионный анализ показал наличие линейности и параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольного образца (калибрователя) (табл 5, рис 3)

Таблица 5

Результаты сравнения положительного и исследуемого образцов, _содержащих анти-HBs, с ОСО 42-28-320-00_

ДИСПЕРСИОННЫМ А Н А Л И 3

Источник вариации Степень свободы Сумма квадратов Средний квадрат F-теор F- экспер Вывод

Измерения(дозы) Препараты Линейная регрессия ПАРАЛЛЕЛИЗМ ЛИНЕЙНОСТЬ Остаточная ошибка Total 24 4 1 4 15 20 44 7,3102 0,0985 7,1770 0,0065 0,0282 0,0205 7,3307 0,3046 0,0246 7,1770 0,0016 0,0019 0,0010 2,0825 2,8661 4,3513 2,8661 2,2033 297,7154 24,0637 7014,997 1,5874 1,8379 Значимо Значимо Значимо ДА ДА

Рис 3 Сравнение контрольного положительного и исследуемого образцов с ОСО 42-28-320-00

Полученные нами данные указывают, что все исследованные образцы обладают общепринятыми критериями стандартов антител - линейным участком кривой «доза-ответ» (прямая линия) в пяти точках и параллелизмом кривых при смещении разведения при тестировании в ИФА Аналогичные результаты были получены для всех разработанных ИФТС

Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена в тесте блокирования Предварительная инкубация положительных контрольных образцов с различными антигенами приводила к существенному блокированию их активности в ИФА только при использовании антигена, специфичного для тестируемых антител (табл 6)

Таблица 6

Оценка специфичности тест-систем в тесте блокирования

Блокатор Определяемые антитела

реакции Дифтерийные Столбнячные Коклюшные анти -НВэ

ОПК+ ОПК+ ОПК+ ОПК+ ОПК+ ОПК+ ОПК+ ОПК+

опыт контроль опыт контроль опыт контроль опыт контроль

Дифтерий- 0,062 0,954 0,975 0,931 0,870 0,905 1,009 1,062

ныи анаток-

син

Столбняч- 0,921 0,943 0,072 0,986 0,904 0,947 0,963 0,985

ный анаток-

син

Коклюш- 0,941 0,912 0,904 0,914 0,087 0,923 1,079 1,030

ная суспен-

зия

НВбАЙ 0,944 0,932 0,992 0,934 0,951 0,969 0,086 1,054

Точность результатов измерений в пределах одной серии испытаний (внутрипостановочный коэффициент вариации - ВКВ) и разных серий испытаний (межпостановочный коэффициент вариации - МКВ) для разработанных тест-систем была весьма высокой - коэффициенты вариации не превышали 10 % Была установлена также высокая степень корреляции результатов параллельного исследования сывороток с помощью разработанных ИФТС и регла-

ментированных методов (реакцией нейтрализации при определении дифтерийных и столбнячных антител, реакции агглютинации при определении коклюшных антител, а также с импортными тест-системами при определении анти-НВБ) (табл 7)

Таблица 7

Характеристика разработанных тест-систем

ИФТС Точность (коэффициент вариации), % Коэффициент корреляции

Образец 1 Образец 2 Образец 3

ВКВ МКВ ВКВ МКВ ВКВ МКВ

ИФА анти-В 3,3 4,3 5,0 7,6 5,7 , 9,5 0,93

ИФА анти-Д 7,0 7,5 5,5 7,8 3,8 5,9 0,92

ИФА анти-С 6,2 6,7 6,1 5,4 8,7 8,2 0,93

ИФА анти-К 9,3 9,5 7,5 8,1 7,1 8,7 0,86

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанные ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител и анти-НВз обеспечивают достаточно высокую степень достоверности результатов иммуноферментного анализа

Экспериментальные разработки позволили провести исследования в направлении решения ряда практических задач использования предлагаемых ИФТС

В частности, была проведена оценка возможности использования разработанных тест-систем для контроля иммуногенности комбинированных вакцин по содержанию соответствующих антител в сыворотках крови иммунизированных морских свинок (табл 8)

Таблица 8

Сравнительная оценка эффективности вакцин

в опытах на морских свинках

Вакцина* Определяемые антитела (средняя геометрическая титра)

столбнячные, МЕ/мл дифтерийные, МЕ/мл анти-НВв, мМЕ/мл коклюшные, ИЕ/мл

Бубо-М 7.1 Г5,1-9,91 7,3 Г5,7-9,21 5769,1 [1801,1-18479,41 отр

АДС-М 3.5 Г 1,7-7,21 4,8 [3,0-7,61 отр отр

АКДС 7,9 [5,3-11,61 11,7 [6,2-22,41 отр 104,4 Г73,2-148,91

Бубо-Кок 14,0 ГШ,6-18,3] 12,9 [6,4-25,71 2661,5 Г813,0-8712,31 73,2 [54,8-97,7]

ВГВ 5 мкг отр отр 112,4 Г50,6-249,61 отр

ВГВ 10 мкг отр отр 343,3 [231,0-510,21 отр

Примечание Бубо-М - вакцина для профилактики ди( >терии, столбняка и гепатита В

АДС-М - вакцина для профилактики дифтерии и столбняка

АКДС - вакцина для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка

Бубо-Кок - вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В

ВГВ - вакцина гепатита В

Как видно из представленных данных, в случае использования вакцин Бу-бо-М и Бубо-Кок по сравнению с АДС-М и АКДС наблюдался более высокий уровень дифтерийных и столбнячных антител При этом выявлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов, так и коклюшного компонента на формирование иммунного ответа против HBsAg

В наблюдениях на детях подтвердился потенцирующий эффект совместного введения антигенов, обнаруженный ранее в опытах на животных (табл 9)

Таблица 9

Сравнительная оценка эффективности вакцин в наблюдениях на детях

Вакцина* Определяемые антитела (средняя геометрическая титра)

столбнячные, МЕ/мл дифтерийные, МЕ/мл анти-НВэ, мМЕ/мл коклюшные, ИЕ/мл

Бубо-М 39,1 ГЗ 1,5-48,41 19,6 Г15,3-25,Ц 12557 [6298-250351 отр

АДС-М 14,3 Г11,3-18,01 13,5 [10,4-17,51 отр отр

АКДС 3,4 [2,5-4,51 1,8 П,3-2,41 отр 66,3 [44,9-97,71

Бубо-Кок 3,7 [2,8-4,7] 2,5 [1,8-3,41 453,7 [268,3-766,91 64,9 [31,5-133,61

* Примечание вакцинами Бубо-М и АДС-М привиты дети 6 лет, вакцинами АКДС и Бубо-Кок привиты дети первого года жизни

1 аким образом, в экспериментах на животных и наблюдениях на людях была обоснована возможность использования разработанных ИФТС для контроля эффективности иммунизации, при этом тест-сисгемы дают возможность выявлять уровень специфических антител на любой стадии цикла вакцинации, что может служить основанием для определения дальнейшей тактики иммунизации

Тест-система для определения анти-НВБ была успешно применена для обоснования тактики экстренной специфической профилактики гепатита В в эксперименте и наблюдениях на людях (табл 10, 11) При этом было показано, что оптимальной схемой экстренной специфической профилактики является одномоментное введение препарата Антигеп (иммуноглобулин человека против гепатита В) и вакцины гепатита В, обеспечивающее быстрое появление антител в концентрации, значительно превышающей протективную с последующим развитием иммунного ответа на HBsAg

Таблица 10

Определение концентрации анти-HBs в сыворотках крови _иммунизированных кроликов_

Груп- Средняя геометрическая титра анти-HBs, мМЕ/мл

1-Зч 24 ч 72 ч 7 сут 14 сут 21 сут 4 нед 6 нед 8 нед 10 нед

Irp 40,0 340,0 450,0 160,0 30,0 8,5 0 0 0 0

[20,0- [230,0- [350,0- [100,0- [10,0- [2,0-

80,0] 510,0] 570,0] 250,0] 80,0] 33,0]

Игр 0 0 5,7 220,0 780,0 180,0 190,0 9750,0 5490,0 120620,0

[3,0- [10,0- [160,0- [20,0- [80,0- [3130,0- [3210,0- [51870,0-

10,0] 370,0] 3830,0] 1430,0] 420,0] 30300,0] 9380,0] 280490,0;

III гр 25,0 240,0 240 0 650,0 1120,0 470,0 330,0 12010,0 5060,0 75800,0

[16,0- [180,0- [190,0- [130,0- [450,0- [180,0- [50,0- [6490,0- [3100,0- [33300,0-

37,0] 320,0] 310,0] 3320,0] 2780,0] 1220,0] 2030,0] 22230,0] 8200,0] 172500,0]

IV гр 20,0 330,0 300,0 70,0 13,0 5,6 0 490,0 330,0 4130,0

[11,0- [50,0- [290,0- [60,0- [0,5- [2,0- [240,0- [270,0- [2950,0-

35,0] 990,0] 780,0] 80,0] 18,0] 7,0] 1010,0] 3990,0] 5770,0]

* Примечание схема иммунизации I - Антиген 100 ME,

II - ВГВ по схеме 0-1-2, Ш - ВГВ (I доза) + Лнтигеп, IV - «Антиген», через месяц ВГВ

Таблица 11

Иммуноло1 ическая эффективность разных схем иммунизации детей _ закрытых организованных коллективов_

Группы* Средняя геометрическая титра анти-HBs, мМЕ/мл

Через 1 месяц после введения 1 дозы препаратов Через 1 месяц после введения 3 дозы вакцины Через 1 год после введения 1 дозы препаратов Через 1 месяц после введения 4 дозы вакцины

I 14,3 [11,7-17,6] 422,7 [169,4-1054,5] 421,6 [55,0-3230,9] 5446,8 [1086,3-27309,81

II 7,05 [2,2-22,6] 1063,4 [511,7-2209,9] 584,2 [166,8-2045,41 5451,2 [1451,2-20476,11

III 1,69 [0,92-3,06] 1586,5 [871,8-2887,11 280,7 [145,8-540,51 Не вводилась

* Примечание схема иммунизации I - 0 - Антигеп ■+ ВГВ, 1-2-12 мес - ВГВ,

II - 0- Антигеп, 1-2-3-12 мес - ВГВ, III-0-1-6 мес - ВГВ

Далее была исследована возможность применения разработанных ИФТС для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов (табл 12)

Таблица 12

Определение концентрации специфических антител

в препаратах иммуноглобулинов_

Иммуноглобулины Определяемые антитела (СГТ)

столбнячные, МЕ/мл дифтерийные, МЕ/мл коклюшные, ИЕ/мл анти-НВв, МЕ/мл

Противостафи-лококковый 13,6 ПО, 3-17,91 7,3 [4,9-11,01 405,0 [199,1-824,01 1,5 [1,3-1,81

Противоэнце-фалитный 10,8 [9,5-12,31 6,2 [4,9-7,9] 335,1 [291,7-384,91 1,6 [1,4-2,01

Противостолбнячный 63,8 Г53,5-75,81 12,3 [11,5-13,11 380,4 [340,2-425,41 1,5 [1,1-2,0]

Нормальный 12,0 [8,8-16,41 7,0 [4,8-10,2] 350,1 [259,4-471,81 1,7 [1,4-2,01

Антигеп 12,2 [8,8-17,91 6,7 Гб,1-7,21 354,1 [300,2-417,6] 72,5 [65,2-89,41

Разработанные ИФТС били успешно использованы также для определения концентрации анти-НВБ в сыворотках крови людей, больных гепатитом В при клинических испытаниях препарата Антигеп (ИФА анти-В), диагностики коклюшной инфекции (ИФА анти-К), оценки популяционного иммунитета. При этом основными преимуществами разработанных ИФТС являются автоматизация анализа, стандартизация результатов, исключение субъективизма в интерпретации, и, самое главное, возможность количественной оценки

В заключение следует отметить, что разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обследований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и групп повышенного риска, а также оценки качества иммунобиологических препаратов

Выводы

1 Разработан эффективный и технологичный способ получения конъю-гатов на основе белка А и HBsAg, меченных биотином

2 Впервые с применением амплифицирующей системы авидин-биотин разработаны конструкции иммуноферментных тест-систем для определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови, как людей, так и животных

3 Качество разработанных тест-систем соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний, по следующим критериям линейность и параллелизм, специфичность, чувствительность, точность, сравнение с референс-методами

4 Научно обоснована возможность использования разработанных иммуноферментных тест-систем в реальной практике для серологического мониторинга за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В), а также для оценки качества профилактических препаратов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Казьянин А В Симультанная экстренная специфическая профилактика в очагах HBV-инфекции / А В Казьянин, С В Пленкина, Т В Вязникова, В Н. Борисова, Н С Гурьянова // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов -М,2002 -Т2 - С 180-181

2 Исаева Н В. Распространенность и эффективность специфической иммунопрофилактики гепатита В среди медицинских работников / Н В Исаева, И В Фельдблюм, Т В Вязникова и др // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке матер Всерос науч конф - Пермь, 2003 - С 40-43

3 Казьянин А В Изучение фармакодинамики анти-HBs при разных схемах введения препарата «Антигеп®» и вакцины против гепатита В в эксперименте / А В Казьянин, Н В Ведерникова, Т В Вязникова, С В Пленкина //

Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке матер Все-рос науч конф -Пермь, 2003 - С 86-89.

4 Николаева А М Сравнительная оценка отечественной ИФТС и зарубежных тест-систем для выявления антител к HBsAg / А М Николаева, В Н Борисова, Т В Вязникова // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке матер Всерос науч конф - Пермь, 2003 -С 157-159.

5 Вязникова Т В Оценка валидности рабочих характеристик иммуно-ферментной тест-системы для выявления анти-НВз / Т.В Вязникова, А М Николаева // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке матер Всерос науч конф - Пермь, 2003 - С 159-161

6 Казьянин А В Экстренная специфическая профилактика в очагах гепатита В с использованием различных медицинских иммунобиологических препаратов / А В Казьянин, С В Пленкина, ТВ Вязникова // Человек и лекарство сб тез докл XIРос национал конгресса -М,2004 - С 441

7 Вязникова Т В Опыт использования иммунофермснтного анализа для оценки противококлюшного иммунитета /ТВ Вязникова, Е В Гореликова // Современная вакцинопрофилактика проблемы и перспективы развития матер науч -практ конф - Пермь, 2005 - С 18-23

8. Казьянин А В Результаты динамического наблюдения за состоянием поствакцинального иммунитета взрослых и детей, привитых вакциной «Бубо-М» / А В Казьянин, А М Николаева, Т В Вязникова и др // Современная вакцинопрофилактика проблемы и перспективы развития матер науч -практ конф - Пермь, 2005 -С 51-57

9 Вязникова ТВ Конструирование иммуноферментных тест-систем для определения дифтерийных, столбнячных, коклюшных и анти-НВБ антител /ТВ Вязникова, А М Николаева // Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней матер Всерос науч - практ конф - М , 2006 - С 32

10 ФельдблюмИВ Оптимизация эпидемиологического надзора и контроля за коклюшной инфекцией /ИВ Фельдблюм, А М Николаева, В Н

Сперанская, Т В Вязникова // Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней матер Всерос науч - практ конф - М , 2006 - С 97-98

11 Николаева А М Использование тест-системы «ИФА анти-В» для определения антител к HBsAg / А.М Николаева, Т В Вязникова, Н Б Казья-нина // Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий матер междунар науч конф -Томск, 2006 — Т2 - С 409-410

12 ФельдблюмИВ Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией /ИВ Фельдблюм, Е В Гореликова, Т В Вязникова и др // Методические рекомендации - Пермь, 2006 - 28 с

13 Вязникова ТВ Изучение возможности использования иммунофер-ментного анализа в системе эпиднадзора за инфекциями, управляемыми вак-цинопрофилактикой // Пермский медицинский журнал - 2006 - Т 23, № 5 -С 78-81

14 Николаева АМ Тест-система для определения антител к НВэ-антигену и блокатор в тест-системе / А М Николаева, А В Казьянин, Т В Вязникова, В Н Борисова, М В Буданов, И А Яковлева, В А Мельников // Патент на изобретение № 2206095 РФ от 10 06 2003 г

15 Николаева А М Тест-система для определения противококлюшных антител в сыворотке крови человека и животных и универсальный конъюгат в тест-системе / А М Николаева, Т В Вязникова, А В Казьянин, В Н. Сперанская // Приоритетная справка № 2006127549 от 31 07 2006 г

ВЯЗНИКОВА Татьяна Владимировна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АВИДИН-БИОТИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ (ДИФТЕРИЙНЫХ, СТОЛБНЯЧНЫХ, КОКЛЮШНЫХ, АНТИ-НВБ)

14 00 36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 18 04 2007 г Формат 60 х 84 х 16 Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 41 -к/2007 Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм», Адрес 614025, г Пермь, ул Г Хасана, 105

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 16, 17, 39, 112].

Цели и задачи массовой иммунизации в национальных масштабах и в масштабе планеты определяет в настоящее время расширенная программа иммунизации (РПИ), которую сформулировала в 1974 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). В реализации данной программы участвуют 169 стран мирового сообщества.

В рамках РПИ предусмотрен контроль целого ряда инфекционных болезней с помощью средств специфической профилактики [80, 141, 161, 163].

В системе эпидемиологического надзора за этими инфекциями (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В) важной составной частью является серологический мониторинг. Этой точки зрения придерживаются и эксперты Консультативной группы ВОЗ по проблемам РПИ, которые более 15 лет назад при подготовке рекомендаций и инструкций по целевым национальным программам иммунизации для Европейских стран включили использование в системе эпидемиологического надзора выборочного серологического мониторинга [143].

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].

Сыворотка крови служит источником комплексной информации о наличии в ней спектра антител к возбудителям болезней. Способы определения специфических антител могут быть различными. Так, реакция нейтрализации токсина является весьма чувствительным методом и остается «золотым стандартом» при определении дифтерийных и столбнячных антитоксинов. Однако, данный метод весьма дорог, длителен, сложен и требует наличия квалифицированного персонала.

Для определения специфических антител используются также реакции пассивной гемагглютинации и агглютинации, которые также имеют некоторые недостатки, в частности, невозможность получения точного количественного результата, так как учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен [107].

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы иммунофер-ментного анализа, которые по сравнению с другими способами детекции антител обладает следующими преимуществами:

- высокой чувствительностью, которая определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

- возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

- экспрессностыо;

- полной безопасностью определений;

- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;

- простотой проведения реакции;

- наличием как визуального, так и инструментального учета.

Высокая производительность метода, возможность унификации и стандартизации диагностических тест-систем, а также автоматизация учета результатов делают ИФА предпочтительным при проведении массовых серологических исследований.

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, а опосредованно и антигенов, применяют конъюгаты антивидовых антител (против иммуноглобулина в человека) с ферментами-маркерами. Однако способ получения антивидовых антител, включающий использование животных, достаточно трудоемок и длителен по времени.

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин-биотин [107, 221, 233, 240]. Исследователи отмечают, что при использовании этих конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [107, 275].

В качестве универсального детектора в ИФА используется белок А стафилококка, меченный ферментом. Универсальность этого конъюгата объясняется уникальной способностью белка А образовывать прочный комплекс с Рс-фрагментом иммуноглобулина О человека и различных млекопитающих [1,2].

В этой связи актуальны исследования по получению конъюгатов (простых в исполнении и доступных по цене) и создания на их основе иммуно-ферментных тест-систем, пригодных для массовых серологических исследований.

Цель исследования - экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-ИВв) на основе ампли-фицирующего комплекса авидин-биотин.

Задачи исследования

1. Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата.

2. Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса.

3. Оценить качество разработанных тест-систем по следующим критериям: линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Научная новизна

1. Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на основе белка А золотистого стафилококка, меченного биотином. Показана возможность эффективного применения сконструированного конъюгата для определения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-НВБ) в сыворотках крови человека и животных.

2. Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для выявления анти-НВБ с использованием биотинилированного конъюгата на основе рекомбинантного HBsAg (патент № 2206095 от 10.06.03 г.).

3. Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилированного белка А (приоритетная справка № 2006127549 от 31.07.2006 г.).

Практическая значимость работы

1. Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка А и рекомбинантного HBsAg, не требующая больших экономических затрат.

2. Разработана и утверждена иормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 420504656005, Производственный регламент № 04862997-79-06). Получено регистрационное удостоверение (ЛС-000884 от 03.11.2005 г.) и лицензия на производство (99-04-000097 от 27.10.2005 г.).

3. Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител.

4. Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией».

Положения, выносимые на защиту

1. Получены универсальные коныогаты и сконструированы на их основе иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-НВз).

2. Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами).

3. Определена область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

11

Выводы

1. Разработан эффективный и технологичный способ получения конъюгатов на основе белка А и НВбА£, меченных биотипом.

2. Впервые с применением амплифицирующей системы авидин-биотин разработаны конструкции иммуноферментных тест-систем для определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-НВз) в сыворотках крови, как людей, так и животных.

3. Качество разработанных тест-систем соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний, по следующим критериям: линейность и параллелизм, специфичность, чувствительность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Научно обоснована возможность использования разработанных иммуноферментных тест-систем в реальной практике для серологического мониторинга за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В), а также для оценки качества профилактических препаратов.

Заключение

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время ие только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 110]. Успех программ вакцинопрофилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического антиинфекционного иммунитета [129,141, 160].

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].

Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет организовать эффективную систему диагностики иммунитета на основе точной инструментальной оценки уровня специфических антител [189].

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, используются варианты твердофазного ИФА, основанные на фиксации антител на нерастворимой основе (обычно полистироловых планшетах с иммобилизованным антигеном) с последующим тестированием связанных антител при помощи индикаторной системы - конъюгатов антивидовых антител (против иммуноглобулина в человека) с ферментами-маркерами.

Однако технология приготовления антивидовых антител, связанная с использованием животных, очень сложна, длительна по времени, трудоемка и вследствие этого высокозатратна. Кроме того, к недостаткам систем с антивидовыми конъюгатами относятся и неспецифические взаимодействия, которые могут иметь место между антиглобулином, меченным ферментом, и гетерологичным иммуноглобулином, присутствующим в клиническом образце, либо с антителом, фиксированным на твердой фазе [274].

В связи с этим актуален поиск новых эффективных и технологичных путей синтеза ферментных конъюгатов.

Перспективным направлением в ИФА является использование амплифи-цирующей системы авидин-биотин. Исследователи отмечают, что при применении авидин-биотиновых конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [189, 234].

Все вышесказанное предопределило цель исследования - экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе амплифицирующего комплекса авидин-биотин.

Одним из важнейших моментов в программе конкретных инженерных разработок иммуноферментного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест-систем - конъюгатов.

В своих исследованиях мы пошли по пути создания конъюгата на основе белка А, обладающего уникальной способностью образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих [1, 2]. Выбор этого реагента в значительной степени был обусловлен тем, что в Пермском НПО «Биомед» разработана оригинальная промышленная технология получения белка А, не уступающего по своим качественным характеристикам препаратам зарубежных фирм (Sigma, Pharmacia).

Известно, что один из наиболее эффективных методов введения ферментной метки основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М"1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело [193].

В связи с этим были проведены эксперименты по отработке оптимальной методики биотинилирования белка А, в результате которых была обоснована технология приготовления стандартных препаратов белка А, меченных биотипом.

Основные физико-химические параметры ИФА, а именно чувствительность, точность и воспроизводимость, могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента, что обусловливает необходимость оптимизации каждой стадии анализа.

Для определения оптимальных условий проведения иммуноферментной реакции были исследованы варианты возможных реагентов и параметры их применения: выбор антигенов, блокирующего агента, системы детекции, субстрата; определены оптимальные концентрации реагентов, состав, рН буферных растворов, а также оптимальная температура и время проведения отдельных этапов реакции.

На первом этапе работы были определены условия иммобилизации каждого из исследованных антигенов на твердую фазу. Было установлено, что оптимальной сенсибилизирующей дозой для столбнячного и дифтерийного анатоксинов является 10 мкг/мл (по белку), для коклюшной суспензии - 5 млрд. кл/мл. в 0,1 моль/л карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6, а для HBsAg - 1 мкг/мл (по белку) в 0,01 моль/л фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2-7,4.

При выборе оптимального температурного режима и сроков инкубации антигенов на планшетах были использованы следующие параметры: 2, 24, 48 часов при температуре 4 и 37 °С. Результаты изучения влияния температуры и времени фиксации антигена на интенсивность реакции показали, что оптимальными условиями являются: температура 4 °С и время инкубации 48 часов.

Изменения свойств иммобилизованных антигенов не наблюдалось при хранении в течение 12 месяцев при температуре 2-8 °С.

В следующей серии модельных экспериментов была проведена сравнительная оценка полученного конъюгата на основе биотинилированного белка

А и коныогатов, меченных пероксидазой хрена (антивидовой и белок А-пероксидаза).

При оценке различных коныогатов использовали коэффициент позитивности (КП) - отношение средней оптической плотности положительных контрольных образцов к средней оптической плотности отрицательных контрольных образцов (ОП К+ / ОП К-). Оптимальным считали конъюгат, при использовании которого КП составлял не менее 10,0; а оптическая плотность К- была не более 0,150.

Было установлено, что все исследованные конъюгаты обеспечивали достаточную чувствительность анализа при определении дифтерийных и столбнячных антител. При использовании коныогата белок А-пероксидаза при определении коклюшных антител наблюдался высокий уровень фоновых реакций (ОП К- более 0,150), тогда как при применении коныогатов белок А-биотин и антивидового уровень фоновых реакций был низким (ОП К- менее 0,150).

Кроме того, было показано, что все исследованные конъюгаты не обеспечивали необходимой чувствительности анализа при определении анти-HBs в сыворотках крови человека.

В связи с этим были проведены эксперименты по созданию коныогата для определения анти-HBs на основе биотинилированного рекомбинантного HBsAg.

В результате проведенных исследований была разработана конструкция ИФТС, основанная на взаимодействии антигена (дифтерийного, столбнячного, коклюшного или HBsAg), иммобилизованного на полистироловом планшете с антителами, содержащимися в сыворотке крови человека или животных. После фиксации на твердой фазе специфических реагирующих антител не прореагировавшие компоненты системы удаляют из сферы реакции путем последовательных промывок белково-солевым раствором с детергентом. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью амплифици-рующей авидин-биотиновой системы, состоящей из белка А или HBsAg, меченных биотином и авидина, меченного пероксидазой хрена, которая обусловливает гидролиз перекиси водорода, регистрируемой по изменению окраски индикатора (ТМБ).

Важно отметить, что все разработанные ИФТС содержат универсальные реагенты, а методика постановки ИФА основана на одинаковом наборе манипуляций, что существенно упрощает их применение.

При создании любой ИФТС необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики позволяют использовать ее для решения конкретных задач. Подобная оценка должна быть проведена в форме валидации, которая является важной частью системы обеспечения и контроля качества тест-систем [41].

Валидационные исследования были проведены в соответствии с требованиями ВОЗ, предъявляемыми к наборам для иммунологических испытаний.

Дисперсионный анализ показал наличие линейности и параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольного образца (калибрователя).

Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена в тесте блокирования. Предварительная инкубация положительных контрольных образцов с различными антигенами приводила к существенному блокированию их активности в ИФА только при использовании антигена, специфичного для тестируемых антител.

Точность результатов измерений в пределах одной серии испытаний (внутрипостановочный коэффициент вариации - ВКВ) и разных серий испытаний (межпостановочный коэффициент вариации - МКВ) для разработанных тест-систем была весьма высокой - коэффициенты вариации не превышали 10 %. Была установлена также высокая степень корреляции результатов параллельного исследования сывороток с помощью разработанных ИФТС и регламентированных методов (реакцией нейтрализации при определении дифтерийных и столбнячных антител, реакции агглютинации при определении коклюшных антител, а также с импортными тест-системами при определении анти-ИВя) - коэффициенты корреляции составили 0,86-0,93.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанные ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител и анти-НВБ обеспечивают достаточно высокую степень достоверности результатов иммуноферментного анализа.

Экспериментальные разработки позволили провести исследования в направлении решения ряда практических задач использования предлагаемых ИФТС.

В экспериментах на животных и наблюдениях на людях была обоснована возможность использования разработанных ИФТС для контроля эффективности иммунизации, при этом тест-системы дают возможность выявлять уровень специфических антител на любой стадии цикла вакцинации, что может служить основанием для определения дальнейшей тактики иммунизации.

Тест-система для определения анти-НВБ была успешно применена для обоснования тактики экстренной специфической профилактики гепатита В в эксперименте и наблюдениях на людях. При этом было показано, что оптимальной схемой экстренной специфической профилактики является одномоментное введение препарата Антигеп (иммуноглобулин человека против гепатита В) и вакцины гепатита В, обеспечивающее быстрое появление антител в концентрации, значительно превышающей протективную с последующим развитием иммунного ответа на HBsAg.

Была исследована возможность применения разработанных ИФТС для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов.

Разработанные ИФТС били успешно использованы также для определения концентрации анти-НВБ в сыворотках крови людей, больных гепатитом В при клинических испытаниях препарата Антигеп (ИФА анти-В); диагностики коклюшной инфекции (ИФА анти-К); оценки популяционного иммунитета. При этом основными преимуществами разработанных ИФТС являются автоматизация анализа, стандартизация результатов, исключение субъективизма в интерпретации, и, самое главное, возможность количественной оценки.

В заключение следует отметить, что разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обследований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и групп повышенного риска, а также оценки качества иммунобиологических препаратов.